Tách dòng đoạn gen mã hóa kháng nguyên hemagglutinin của chủng vi rút cúm a h5n1 tạo nguồn nguyên liệu sản xuất vắc xin cúm gia cầm

Theo quy trình chuẩn của Tổ chức Y tế Thế giới World Health Organization- WHO về sản xuất vắc-xin dựa trên kỹ thuật di truyền ngược cùng với tính chất kháng nguyên đặc trưng của vi-rút c

TRƯỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LÂM NGHIỆP

- -

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Đề tài:

“TÁCH DÒNG ĐOẠN GEN MÃ HÓA KHÁNG NGUYÊN

HEMAGGLUTININ CỦA CHỦNG VI-RÚT CÚM A/H5N1 TẠO NGUỒN

NGUYÊN LIỆU SẢN XUẤT VẮC-XIN CÚM GIA CẦM”

NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

MÃ NGÀNH: D420201

Giảng viên hướng dẫn : TS Nguyễn Trung Nam

Th.S Nguyễn Hùng Chí Sinh viên thực hiện : Đỗ Thị Tươi

HÀ NỘI, 2018

LỜI CẢM ƠN

Để có được điều kiện thực hiện hoàn thành tốt Khóa Luận Tốt Nghiệp trước hết em xin gửi đến thầy TS Nguyễn Trung Nam - Trưởng phòng Công nghệ ADN ứng dụng, Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam; Th.S Nguyễn Hùng Chí – phòng Công nghệ ADN ứng dụng Viện Công nghệ Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam lời cảm ơn chân thành và lòng biết ơn sâu sắc vì đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ em trong suốt quá trình hoàn thiện đề tài

Em xin gửi lời cảm ơn đến các anh chị trong phòng công nghệ ADN ứng dụng, cùng với ban lãnh đạo viện Công nghệ Sinh học, viện Hàn Lâm và Khoa học Công nghệ Việt Nam đã tạo ra môi trường trường nghiên cứu và học tập tốt cho sinh viên chúng em

Em xin gửi đến quý thầy, cô giáo trong Viện Công Nghệ Sinh Học trường Đại Học Lâm Nghiệp lời cảm ơn chân thành Đặc biệt, em xin gởi đến cô Th.S Nguyễn Thị Thu Hằng – trưởng bộ môn Vi Sinh - Hóa sinh người đã nhiệt tình giúp đỡ và giải đáp những khúc mắc khó khăn cho em trong quá trình thực hiện

đề tài này

Em xin gửi lời cảm ơn đến Ban lãnh đạo Trường Đại học Lâm Nghiệp đã tạo tạo điều kiện cho em hoàn thành quá trình học tập và rèn luyện sau 4 năm học

Cuối cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới những người thân trong gia đình và bạn bè, những người đã luôn ở bên em, chăm sóc, động viên em trong suốt quá trình học tập và hoàn thành khóa luận

Trong quá trình thực hiện đề tài em đã không ngừng cố gắng phấn đấu và

nỗ lực Nhưng vì kiến thức bản thân còn hạn chế, trong quá trình học tập, hoàn thiện đề tài này khó tránh khỏi những sai sót, kính mong nhận được những ý kiến đóng góp từ thầy cô để bài khóa luận của em được hoàn thành tốt hơn

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 09 tháng 02 năm 2018

Sinh viên thực hiện

Tươi

Đỗ Thị Tươi

MỤC LỤC

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC HÌNH

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU 2

1.1 Cúm A/H5N1 2

1.1.1 Giới thiệu chung 2

1.1.2 Thực trạng dịch bệnh cúm A/H5N1 3

1.2 Vi-rút cúm A/H5N1 4

1.2.1 Nguồn gốc phát sinh 4

1.2.2 Đặc điểm hình thái, cấu trúc và bộ gen của vi-rút cúm 5

1.2.4 Cấu trúc, đặc tính và vai trò của gen HA-H5 trong sự xâm nhiễm và tái bản của vi-rút cúm A/H5N1 10

1.3 Tách dòng gen và kỹ thuật di truyền ngược trong sản xuất vắc-xin 13

1.4 Tình hình nghiên cứu và sử dụng vắc-xin cúm gia cầm ở Việt Nam 14

1.5 Ứng dụng công nghệ gen trong nghiên cứu tách dòng gen của vi-rút cúm A/H5N1 15

1.5.1 Tin sinh trong phân tích di truyền 15

1.5.2 Vector sử dụng trong kỹ thuật di truyền 17

1.5.3 Một số phương pháp giải trình tự gen 18

CHƯƠNG 2: MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 Mục tiêu 20

2.2 Nội dung nghiên cứu 20

2.3 Đối tượng và vật liệu nghiên cứu 20

2.4 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 21

2.5 Phương pháp nghiên cứu 22

2.5.1 Phương pháp thiết kế và sinh tổng hợp gen HA-H5 của vi-rút cúm A/H5N1 23

2.5.2 Phương pháp tách dòng đoạn gen HA đã loại bỏ đoạn độc vào vector pHW2000 24

2.5.3 Phương pháp biến nạp ADN plasmid vào tế bào Escherichia coli 25

2.5.4 Phương pháp chọn lọc, nuôi cấy khuẩn lạc 26

2.5.5 Phương pháp tách chiết và tinh sạch ADN tái tổ hợp 27

2.5.6 Phương pháp kiểm tra kết quả tách dòng gen HA-H5 bằng phản ứng cắt với enzyme giới hạn 27

2.5.7 Phương pháp giải trình tự gen bằng máy giải trình tự gen tự động 28

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 29

3.1 Kết quả sử dụng phần mềm tin sinh học thiết kế gen HA-H5 không chứa đoạn độc của vi-rút cúm A/H5N1 clade 2.3.2.1 C 29

3.2 Kết quả tách dòng đoạn gen HA-H5 không chứa đoạn độc của chủng vi-rút cúm A/H5N1 clade 2.3.2.1C vào vector pHW2000 31

3.2.1 Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E coli chủng DH5α 31

3.2.2 Kết quả kiểm tra sự có mặt của gen HA-H5 bằng phản ứng PCR với mồi đặc hiệu 32

3.2.3 Kết quả kiểm tra sự có mặt của gen HA-H5 bằng phản ứng cắt với enzyme giới hạn 33

3.4 Kết quả giải trình tự đoạn gen HA-H5 trong vector tách dòng 34

PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 36

4.1 Kết luận 36

4.2 Kiến nghị 36

TÀI LIỆU THAM KHẢO 37

Tài liệu tham khảo Tiếng Việt 37

Tài liệu tham khảo Tiếng Anh 38

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Bản đồ bùng phát của dịch cúm H5N1 ở gia cầm trong giai đoạn

2004-2013 2

Hình 1.2: Hình thái vi-rút cúm A/H5N1 dưới kính hiển vi (A); mô hình (B) 6

Hình 1.3: Các phân đoạn gen và các protein của vi-rút cúm A 7

Hình 1.4: Cơ chế xâm nhiễm, tổng hợp, nhân lên của vi-rút cúm 9

Hình 1.5: Cấu trúc hemagglutinin glycoprotein của vi-rút cúm 11

Hình 1.6: Sự tách dòng và biểu hiện của vector 17

Hình 1.7: Vector pHW2000 18

Hình 2.1: Trình tự nucleotide và amino acid của gen HA clade 2.3.2.1C trước và sau khi xử lý loại vùng độc và tránh lại độc 23

Hình 3.1: Trình tự nucleotide (a) và amino acid (b) của gen HA clade 1.1 và clade 2.3.2.1c không chứa vùng độc 30

Hình 3.2: Hình thái khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp khi nuôi cấy trên môi trường LB 31

Hình 3.3: Kết quả tách dòng và kiểm tra sự có mặt của gen đích trong vector pHW2000 bằng PCR 32

Hình 3.4 Kết quả kiểm tra bằng cắt với cặp enzyme NheI và SmaI 33

DANH MỤC BẢNG Bảng 1.2: Bảng thống kê thiệt hại về người do bệnh cúm A/H5N1 gây ra ở các nước trên thế giới 3

Bảng 2.1 Trình tự mồi đặc hiệu của gen HA và trình tự mồi đặc hiệu của vector pHW2000 24

Bảng 2.2: Thành phần phản ứng PCR với mồi đặc hiệu gen HA-H5 24

Bảng 2.3: Thành phần phản ứng PCR với mồi đặc hiệu vector pHW2000 25

Bảng 2.4: Thành phần phản ứng cắt với enzyme giới hạn 28

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

ADN : Acid Deoxyribo Nucleic

ARN : Acid Ribonucleic

cDNA : Complementary DNA

Bp : Base pair

Cs : Cộng sự

E coli : Escherichia coli

Gen HA : Hemagglutinin gene

Gen M : Matrix gene

Gen NA : Neuraminidase gene

Gen NP : Nucleoprotein gene

Gen NS : Non-structural gene

Gen PA : Polymerase A gene

Gen PB1 : Polymerase B1 gene

Gen PB2 : Polymerase B2 gene

IPTG : Isopropyl – β- D Thiogalactoside

PCR : Polymerase Chain Reaction

Pfu : Pyrococus furiosis

Protein HA : Hemagglutinin

Protein M : Matrix protein

Protein NA : Neuraminidase

Protein NP : Nucleocapsid protein

Protein NS : Non- structural protein

Protein PA : Polymerase A protein

Protein PB1 : Polymerase B1 protein

Protein PB2 : Polymerase B2 protein

RE : Restriction endonuclease (Enzyme cắt giới hạn) RNP : Ribonucleoprotein

ssRNA : Negative single trand RNA (RNA sợi đơn âm)

Taq : Thermus Aquaticus

WHO : World Health Organization (Tổ chức Y tế Thế giới) µg/l : Microgram/lit

µl : Microlit

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Vi-rút cúm A/H5N1 là chủng vi-rút động lực cao, thường gây chết gia cầm với tỷ lệ lớn Từ khi xuất hiện ở Việt Nam đã có hơn 59.829 dịch cúm gây ra trên gia cầm và 127 ca bệnh ở người làm 64 người tử vong Dịch cúm gia cầm đã gây

ra thiệt hại không ít về người, kinh tế và xã hội Tuy từ năm 2015 trở lại đây cúm A/H5N1 không xuất hiện ở Việt Nam, nhưng lại đang lưu hành rộng rãi ở Châu Á Cho tới nay vi-rút cúm A/H5N1 vẫn không ngừng tiến hóa, do đó mà nó mang tính

đe dọa lớn đến nền nông nghiệp Việt Nam và tính mạng con người

Điều trị các ca nhiễm cúm A/H5N1 ở người là biện pháp thụ động thực chất không đem lại hiệu quả bằng việc tiêm vắc-xin phòng bệnh Vắc-xin sử dụng trong phòng chống cúm A/H5N1 được sản xuất bằng các phương pháp truyền thống có tác dụng yếu đối với chủng vi-rút động lực cao Thêm vào đó một số loại vắc-xin cúm chưa được bảo hộ nên khả năng gây độc đối với cơ thể khó kiểm soát, thường mang tính chất gây bệnh cao Mặt khác, vi-rút cúm A/H5N1 có mức độ hoạt động lây nhiễm lớn nhất, khả năng tiến hóa nhanh, tạo nhiều biến chủng mới, nên việc nghiên cứu sản xuất vắc-xin có hiệu quả phòng vệ cao với các chủng vi-rút đang lưu hành đáng quan tâm

Hiện nay, với sự phát triển của công nghệ ADN ứng dụng, vắc-xin thế hệ mới được tạo ra bằng kỹ thuật di truyền ngược mang tính an toàn và hiệu quả cao Theo quy trình chuẩn của Tổ chức Y tế Thế giới (World Health Organization- WHO) về sản xuất vắc-xin dựa trên kỹ thuật di truyền ngược cùng với tính chất kháng nguyên đặc trưng của vi-rút cúm thì việc thiết kế, tách dòng thành công gen

mã hóa cho kháng nguyên bề mặt của chủng vi-rút cúm A/H5N1 thuộc clade 2.3.2.1C đang lưu hành ở phía Bắc Việt Nam là cần thiết

Dựa trên những vấn đề đặt ra, đề tài: “Tách dòng đoạn gen mã hóa kháng

nguyên hemagglutinin của chủng vi-rút cúm A/H5N1 tạo nguồn nguyên liệu sản xuất vắc-xin cúm gia cầm” được đưa ra để đáp ứng nhu cầu sử dụng vắc-xin

cũng như có tính bảo hộ cao với các chủng vi-rút đang lưu hành tại Việt Nam

Khóa luận được thực hiện tại Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, hoàn thành một phần từ nguồn kinh phí từ đề

tài: “Nghiên cứu tạo giống gốc để sản xuất vắc-xin cúm A/H5N1” Mã số:

SPQG.05b.03

2

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU

1.1 Cúm A/H5N1

1.1.1 Giới thiệu chung

Bệnh cúm gia cầm (avian influenza) là một bệnh truyền nhiễm được gây ra

bởi vi-rút có bộ gen là ARN, thuộc họ Othomyxoviridae, bộ Mononegavirales

trong hệ thống phân loại chung (Basic Taxomomy) (Murphy, Webster, 1996) Họ vi-rút này là tác nhân chủ yếu gây bệnh đường hô hấp ở người, động vật, gia cầm

và chim

Bệnh lúc đầu có tên dịch tả gà (Fowl plague) (Stubb, 1965) Từ Hội nghị Quốc tế lần thứ nhất về bệnh cúm gia cầm tại Beltsville, Mỹ năm 1981 tên bệnh được gọi là bệnh cúm truyền nhiễm cao ở gia cầm (Highly Pathogenic Avian Influenza viết tắt là HPAI: vi-rút cúm type A có độc lực cao) (Beard C.W., 1998)

Bệnh cúm A/H5N1 xuất hiện từ nhiều năm trước đây Ngay từ khi tái xuất hiện trên ngỗng ở vùng Quảng Đông, Trung Quốc năm 1996 đã lan ra hơn 60 nước trên thế giới ở Châu Á, Châu Âu, Châu Phi và đặc biệt phổ biến ở khu vực Đông Nam Á (Hình 1.1)

Hình 1.1: Bản đồ bùng phát của dịch cúm H5N1 ở gia cầm trong giai đoạn 2004-2013

*Chú thích: Vùng màu đen biểu thị 8 quốc gia đã đưa ra báo cáo có tới 97% tất cả các ca bệnh nhiễm rút cúm A/H5N1 ở người và 90% số dịch cúm gia cầm A/H5N1 bùng nổ ở Bangladesh, Campuchia, Trung Quốc, Ai Cập, Thái Lan, Thổ Nhĩ Kỳ và Việt Nam

vi-3

1.1.2 Thực trạng dịch bệnh cúm A/H5N1

Từ năm 2003 trở lại đây, dịch cúm gia cầm ở Việt Nam có diễn biến ngày càng phức tạp vì nguồn tàng trữ và lây lan bệnh là chim di cư, vịt, gà rất khó kiểm soát và khống chế Đáng lưu ý là dịch cúm A/H5N1 vẫn thường xuyên bùng phát hàng năm tại nước ta Mặc dù không có sự thay đổi về cấu trúc, nhưng xét về độc lực, vật chủ nhiễm bệnh, mức độ lây truyền có nhiều nét đặc trưng hơn và khác nhiều so với những biến chủng vi-rút cúm A/H5N1 được phát hiện trước đây

Theo thống kê của tổ chức Y tế thế giới (World Health Organization- WHO)

từ năm 2003 đến năm 2017 có 860 trường hợp mắc bệnh cúm gia cầm ở người tại

16 quốc gia, trong đó có tổng số 454 trường hợp tử vong, chiếm 52,7% (Bảng 1.2) Trong tổng số ca nhiễm và chết vì dịch cúm A/H5N1 khi tiếp xúc với gia cầm thì

có thể thấy Ai cập, Indonesia và Việt Nam là các nước có thiệt hại nặng nề nhất

Bảng 1.2: Bảng thống kê thiệt hại về người do bệnh cúm A/H5N1 gây ra ở các nước trên thế

Dịch bệnh bùng phát ở Việt Nam đã gây thiệt hại rất lớn về người và tài sản khi mà nước ta là một nước nông nghiệp, đáng kể đến là đầu 2004 vụ dịch cúm đã làm giảm tăng trưởng GDP quốc gia đến khoảng 0,5%, tương đương trên 3.000 tỷ đồng Đợt dịch cuối năm 2004 - 2005 thiệt hại ước tính 500 tỷ đồng

Trong 10 năm qua, kể từ khi dịch cúm A/H5N1 bùng phát tại Việt Nam, một

số chủng vi-rút cúm A/H5N1 chỉ xuất hiện rồi biến mất trong vòng một năm và chỉ trao đổi nguồn gen trong quá trình tiến hoá; một số khác chỉ tồn tại vài năm rồi sau

đó không phát hiện được Một số khác mới xâm nhập gần đây, chẳng hạn như clade 7 chỉ phát hiện trong năm 2007; clade 2.3.4 có nguồn gốc từ Phúc Kiến và clade 2.3.2 phát hiện năm 2009 có thể có nguồn gốc từ vùng hồ Thanh Hải (Trung Quốc), hiện nay đang có xu hướng tiến hoá nội bộ tạo nên nhiều chủng biến đổi khác nhau (Nguyen và cs, 2009 ; Davis và cs, 2010 ; Li và cs, 2011) Trong số các phân nhánh chủng cúm A/H5N1, clade 2.3.2.1 mới xuất hiện ở tỉnh phía Bắc, Việt Nam (FAO, 2011), sau xâm nhập vào các tỉnh phía Nam và gây bệnh thay cho nhánh 1.1 lưu hành phổ biến tại các tỉnh phía Nam trong những năm trước đây (Ban chỉ đạo Quốc gia, 2014) Các vi-rút thuộc nhánh này có sự khác biệt lớn về kháng nguyên so với các nhánh xuất hiện trước đó, và có tính kháng vắc-xin với các loại vắc-xin sản xuất trước đây

1.2 Vi-rút cúm A/H5N1

1.2.1 Nguồn gốc phát sinh

Vi-rút cúm A/H5N1 được phát hiện lần đầu tiên trên gà ở Scotland vào năm

1959, có thể coi đây là chủng vi-rút cổ điển Vi-rút này xuất hiện ở Đông Nam Á, gồm cả Việt Nam, vào năm 2003 Vi-rút gây bệnh trên nhiều loài động vật khác

NA (từ N1 đến N11), sự tái tổ hợp giữa các phân type này đã tạo ra nhiều phân nhánh chủng cúm khác nhau về độc tính và khả năng gây bệnh

Dựa vào khả năng gây bệnh của vi rút trên gia cầm, vi rút cúm A được chia thành 2 nhóm là nhóm có độc lực cao (Highly Pathogenic Avian Influenza - HPAI)

và nhóm có độc lực thấp ( ow Pathogenic Avian Influenza - PAI) Nhóm PAI thường chỉ gây ra các bệnh nh ở đường hô hấp, giảm sức đ và/hoặc giảm trọng lượng, mặc dù đôi khi có thể gây bệnh với tỉ lệ cao nhưng tỉ lệ chết thường thấp Trái lại, vi-rút HPAI thường gây chết gia cầm với tỷ lệ cao, ít nhất 75% gia cầm nhiễm đều bị chết Cho đến nay, tất cả các chủng HPAI đã biết đều thuộc phân typ H5 hoặc H7, tuy nhiên không phải tất cả mà chỉ có một số ít các chủng vi-rút thuộc phân typ H5 và H7 là HPAI Trong nhóm vi-rút động lực cao thì chủng vi-rút cúm A/H5N1 gây lo ngại nhiều nhất vì đây là chủng vi-rút đang lưu hành có mức độ nguy hiểm, tốc độ lây lan cao, có khả năng lây nhiễm từ động vật sang người và gây tử vong ở người

1.2.2 Đặc điểm hình thái, cấu trúc và bộ gen của vi-rút cúm

Các hạt vi-rút cúm A (virion) có hình cầu hoặc hình khối đa diện, đường kính 80 -120 nm, hoặc hình sợi dài 200 – 300 nm, đường kính 20 nm, khối lượng phân tử khoảng 250 triệu Da Phân tích thành phần hóa học một virion có chứa khoảng 0,8 - 1,1% ARN; 70 - 75% là protein; 20 - 24% lipid và 5 - 8% là carbonhydrate (Murphy, 1996) Hạt vi-rút có cấu tạo đơn giản gồm vỏ (capsid), vỏ bọc ngoài (envelope) và lõi là ARN sợi đơn âm - negative single strand, riêng rẽ, với khoảng 13.588 base (Hình 1.2)

6

Hình 1.2: Hình thái vi-rút cúm A/H5N1 dưới kính hiển vi (A); mô hình (B)

A: Lõi của vi-rút là ARN (acid ribonucleic, màu đỏ); vật chất di truyền được bao quanh bởi

một nucleocapsid và một lớp vỏ lipid (màu trắng);

B: Mô hình cấu tạo hạt vi-rút cúm A;

Nguồn: < https://www.goalfinder.com/proteomics.asp >

Vỏ vi-rút có chức năng bao bọc và bảo vệ vật chất di truyền ARN của vi-rút,

bản chất cấu tạo là màng lipid kép, có nguồn gốc từ màng tế bào nhiễm được đặc

hiệu hóa gắn các protein màng của vi-rút Trên bề mặt có khoảng 500 “gai mấu”

nhô ra và phân bố dày đặc, mỗi gai mấu dài khoảng 10 - 14 nm có đường kính 4 - 6

nm, đó là những kháng nguyên bề mặt vỏ vi-rút, bản chất cấu tạo là glycoprotein

gồm: HA, NA và M2 nằm xen kẽ với nhau (Hình 1.2B) Sự phân bố của các kháng

nguyên trên bề mặt của hạt vi-rút không đồng đều, tỉ lệ HA/NA khoảng 1NA/4HA,

đây là hai loại protein kháng nguyên có vai trò quan trọng trong quá trình xâm

nhiễm của vi-rút ở tế bào cảm nhiễm

Bên trong hạt virion, mỗi sợi ARN đều liên kết với nucleoprotein (NP) và 3

tiểu đơn vị của enzyme polymerase (bao gồm PB1, PB2, and PA) hình thành nên

các phức hợp ribonucleoprotein (viral ribonucleoprotein - vRNP) (Zheng and Tao,

2013) Bao gồm tám phân đoạn gen mã hóa cho 11 protein khác nhau (HA, NA,

M1, M2, NS1, NS2, NP, PA, PB1, F2, PB2) của vi-rút (Hình 1.3)

7

Hình 1.3 ác ph n đoạn gen và các protein của vi-r t c m

Nguồn: < http://www.virology.ws/2009/05/01/influenza-virus-rna-genome/>

Phân đoạn 1 có kích thước 2431 bp, mã hóa tổng hợp protein enzyme PB2,

là tiểu đơn vị thành phần trong phức hợp enzyme polymerase của vi-rút, chịu trách nhiệm khởi đầu phiên mã ARN vi-rút

Phân đoạn 2 cũng có kích thước 2431 bp, mã hóa tổng hợp enzyme PB1 - tiểu đơn vị xúc tác của phức hợp enzym polymerase trong quá trình tổng hợp ARN vi-rút, chịu trách nhiệm gắn mũ ARN (Murphy, Webster, 1996)

Phân đoạn 3 có kích thước 2233 bp, là phân đoạn gen bảo tồn cao, mã hóa tổng hợp protein enzyme PA - là một tiểu đơn vị của polymerase chịu trách nhiệm kéo dài sự phiên mã ARN trong quá trình tổng hợp ARN của vi-rút

Phân đoạn 4 có độ dài thay đổi tuỳ theo từng chủng vi-rút cúm A (ở H5N1 là khoảng 1704 - 1707 bp) Đây là gen chịu trách nhiệm mã hóa tổng hợp protein HA

- kháng nguyên bề mặt vi-rút cúm, gồm hai tiểu phần là HA1 và HA2 Cho phép vi-rút gắn, hòa màng và xâm nhiễm vào tế bào chủ

Phân đoạn 5 kích thước khoảng 1556 bp, mã hóa tổng hợp nucleoprotein (NP) - thành phần của phức hệ phiên mã, chịu trách nhiệm vận chuyển ARN giữa nhân và bào tương tế bào chủ

Phân đoạn 6 là một gen kháng nguyên của vi-rút, có chiều dài thay đổi theo từng chủng vi-rút cúm A (ở A/H5N1 thay đổi khoảng từ 1350 - 1410 bp) (Nguyễn

Phân đoạn 8 là gen mã hóa protein không cấu trúc (non structural protein), kích thước khoảng 890 bp, mã hóa tổng hợp hai protein là NS1 và NS2 (còn gọi là NEP, nuclear export protein), có vai trò bảo vệ hệ gen của vi-rút nếu thiếu chúng vi-rút sinh ra sẽ bị thiểu năng NS1 chịu trách nhiệm vận chuyển ARN thông tin của vi-rút từ nhân ra bào tương tế bào nhiễm, và tác động lên các ARN vận chuyển cũng như các quá trình cắt và dịch mã của tế bào chủ NEP hay NS2 đóng vai trò vận chuyển các RNP của vi-rút ra khỏi nhân tế bào nhiễm để lắp ráp với capsid tạo nên hạt vi-rút mới

Trên tám phân đoạn ARN của vi-rút cúm đều có những trình tự nucleotide bảo tồn Đầu tận cùng của tất cả các đoạn ARN đều có chung một trình tự gồm 13 nucleotide ở đầu 5’ và một trình tự gồm 12 nucleotide ở đầu 3’ Hai vùng bảo tồn này có trình tự ngược nhau và bổ sung một phần cho nhau Đặc điểm này có vai trò trong quá trình phiên mã và sao chép ARN: polymerase có thể nhận biết trình tự bảo tồn ở đầu 3’của sợi RNA (-) và ở đầu 3’của sợi RNA (+) để khởi đầu quá trình tổng hợp Một trình tự phổ biến thứ ba có ở cả tám phân đoạn ARN là trình tự nucleotide cách đầu 5’ khoảng 15-21 nucleotide, đây là tín hiệu khởi đầu cho quá trình gắn chuỗi polyA trong quá trình tổng hợp sợi ARN thông tin (mARN)

(Hofmann et al., 2001)

9

1.2.3 Cơ chế lây nhiễm và tiến hóa của vi-rút cúm A/H5N1

Vi-rút cúm A/H5N1 kí sinh nội bào bắt buộc, quá trình xâm nhiễm và nhân lên của vi-rút xảy ra chủ yếu ở các tế bào biểu mô đường hô hấp, đường tiêu hóa của cơ thể nhiễm, có những nét đặc trưng như sau:

Quá trình xâm nhiễm của vi-rút cúm A được mở đầu bằng sự kết hợp của

HA và thụ thể thích ứng của nó trên bề mặt các tế bào này, và giải phóng hệ gen của vi-rút vào trong bào tương của tế bào nhiễm, sử dụng bộ máy sinh học của tế bào tổng hợp các protein của vi-rút và các ARN vận chuyển phụ thuộc ARN (ARN-dependent ARN transcription) Phức hợp protein – ARN của vi-rút được vận chuyển vào trong nhân tế bào Trong nhân tế bào các ARN hệ gen của vi-rút tổng hợp nên các sợi dương từ khuôn là sợi âm của hệ gen vi-rút, từ các sợi dương này chúng tổng hợp nên ARN hệ gen của vi-rút mới nhờ ARN-polymerase Các sợi này không được Adenine hóa (gắn thêm các Adenine - gắn mũ) ở đầu 5’- và 3’-, chúng kết hợp với nucleoprotein (NP) tạo thành phức hợp ribonucleoprotein (RNP) hoàn chỉnh và được vận chuyển ra bào tương tế bào Đồng thời, các ARN thông tin của vi-rút cũng sao chép nhờ hệ thống enzyme ở từng phân đoạn gen của vi-rút, và được enzyme PB2 gắn thêm 10 - 12 nucleotide Adenin ở đầu 5’-, sau đó được vận chuyển ra bào tương và dịch mã tại lưới nội bào có hạt để tổng hợp nên các protein của vi-rút (Hình 1.4)

Hình 1.4: ơ chế xâm nhiễm, tổng hợp, nhân lên của vi-rút cúm

A - Mô hình cơ chế xâm nhiễm và nhân lên của vi-rút cúm A ở tế bào chủ;

B - Sự tổng hợp các thành phần của vi-rút ở tế bào chủ;

Nguồn: < http://www.influenzareport.com/ir/pathogen.htm>

10

Các phân tử NA và HA của vi-rút sau khi tổng hợp được vận chuyển gắn lên mặt ngoài của màng tế bào nhiễm nhờ bộ máy Golgi, gọi là hiện tượng “nảy chồi” của vi-rút NP sau khi tổng hợp được vận chuyển trở lại nhân tế bào để kết hợp với ARN thành RNP của vi-rút Sau cùng các RNP của vi-rút được hợp nhất với vùng

“nảy chồi”, tạo thành các “chồi” vi-rút gắn chặt vào màng tế bào chủ bởi liên kết giữa HA với thụ thể chứa sialic acid Các NA phân cắt các liên kết này và giải phóng các hạt vi-rút trưởng thành tiếp tục xâm nhiễm các tế bào khác Sự tạo thành các hạt vi-rút mới không phá tan tế bào nhiễm, nhưng các tế bào này bị rối loạn hệ thống tổng hợp các đại phân tử, và rơi vào quá trình chết theo chương trình (apoptosis) làm tổn thương mô của cơ thể vật chủ (Webster, 1998; Uiprasertkul et al., 2007) Thời gian một chu trình xâm nhiễm và giải phóng các hạt vi-rút mới của vi-rút cúm chỉ khoảng vài giờ (trung bình 6 giờ)

Một đặc điểm quan trọng làm cho vi-rút A/H5N1 có khả năng tiến hóa, tạo biến chủng rất nhanh đó là hệ gen được cấu trúc từ 8 phân đoạn riêng biệt và không có gen mã hóa enzyme sửa chữa ARN Đây là điều kiện thuận lợi cho sự xuất hiện các đột biến điểm trong các phân đoạn gen/hệ gen qua quá trình sao chép nhân lên của vi-rút, hoặc trao đổi các phân đoạn gen giữa các chủng vi-rút cúm đồng nhiễm trên cùng một tế bào, rất có thể dẫn đến thay đổi đặc tính kháng nguyên tạo nên các chủng vi-rút cúm A mới (Suarez, Schultz-Cherry, 2000; Doherty et al., 2006)

1.2.4 Cấu trúc, đặc tính và vai trò của gen HA-H5 trong sự xâm nhiễm và tái

bản của vi-rút cúm A/H5N1

Protein HA là một glycoprotein màng type I – một kháng nguyên bề mặt quan trọng của vi-rút cúm (Hình 1.5) Glycoprotein HA giúp vi-rút có thể gắn với các thụ thể sialic acid đặc hiệu trên bề mặt tế bào, hòa màng và xâm nhiễm tế bào chủ Về mặt miễn dịch học, HA là kháng nguyên chủ yếu của vi-rút cúm A, là đích quan trọng của các kháng thể trung hòa; do đó HA là cơ sở để điều chế các vắc-xin phòng cúm hiện nay Về mặt y tế, gen mã hóa cho kháng nguyên HA là một

11

glycoprotein có khả năng gây ngưng kết hồng cầu gà trong ống nghiệm (in vitro)

Do vậy, HA được sử dụng trong chẩn đoán sự có mặt của vi-rút Kháng thể đặc hiệu với HA có thể ngăn cản sự ngưng kết hồng cầu này, gọi là kháng thể ngăn trở

sự liên kết hồng cầu (HI – hemagglutinin inhibitory test)

Về cấu trúc, kháng nguyên HA của vi-rút cúm A/H5N1 có dạng hình trụ, dài khoảng 130 ăngstrom (Å), có kích thước khoảng 1704 - 1707 bp, cấu tạo gồm 3 đơn phân (trimer), mỗi đơn phân (monomer) được tạo thành từ hai tiểu đơn vị HA1

có khối lượng phân tử là 36 kDa và HA2 có khối lượng phân tử là 27 kDa nối với nhau bằng một đoạn oligopeptide ngắn giàu các amino acid kiềm arginine (R) và lysine (K) ở vị trí amino acid 338 - 345/346 Vị trí này là điểm nhận biết của các protease do tế bào tiết ra (protease sẽ cắt ở vị trí giữa hai amino acid (-RG-) ngay sau điểm nhận biết) Do vậy, vùng giàu các amino acid kiềm giữa HA1 và HA2 còn gọi là “vùng độc” vì có liên quan trực tiếp đến tính độc của vi-rút: các chủng H5N1 độc lực thấp chỉ chứa 1 amino acid kiềm arginine ở vị trí cắt, trong khi đó các chủng H5N1 độc lực cao chứa một nhóm amino acid kiềm ở trước điểm cắt của protease

Hình 1.5: Cấu trúc hemagglutinin glycoprotein của vi-rút cúm

A – Cấu trúc không gian (Bouvier và cs., 2008)

B – Mô hình: Màu xanh lá: tiểu phần HA1; Màu vàng: tiểu phần HA2;

Màu xanh dương và tím biểu thị các khu vực có đột biến có thể thay đổi khả năng của vi-rút

gắn với tế bào chủ và gây nhiễm trùng

Phân tử protein HA có nhiều vị trí quyết định kháng nguyên (epitope) và vị trí bám dính thụ thể, do đó dễ biến đổi (receptor – binding site), nếu có đột biến

12

(thay đổi amino acid) hoặc/và gắn kết carbon hydrate, tính kháng nguyên và độc lực có thể bị thay đổi tuỳ theo mức độ khác nhau Dạng tiền thân của protein HA là một phân tử polyprotein HA0, sau đó được cắt thành hai tiểu đơn vị là HA1 và HA2 nhờ các protease của tế bào nhiễm Sau khi bị phân cắt, HA1 bao gồm 324 amino acids với các nhóm carbohydrate khác nhau và mang các quyết định kháng nguyên, HA2 gồm 222 amino acid và cũng liên kết với các nhóm carbohydrate Sự phân cắt HA có vai trò quan trọng đối với độc lực của vi-rút, giúp cho đầu N tận ưa nước của HA2 được bộc lộ và nhờ đó vi-rút có thể hòa màng với màng túi thực bào

và giải phóng ARN vi-rút vào tế bào chất để thực hiện quá trình nhân lên trong tế bào cảm nhiễm

Quá trình kết hợp của HA và thụ thể đặc hiệu (glycoprotein chứa axit sialic) phụ thuộc vào sự phù hợp cấu hình không gian của chúng HA của phân type vi-rút cúm chim và vi-rút cúm ngựa nhận diện và gắn axit sialic chứa liên kết α – 2,3 với thụ thể tế bào đích, HA của phân type cúm người thì nhận diện và gắn axit sialic chứa liên kết α – 2, 6 Riêng HA của phân type vi-rút cúm lợn thì nhận diện và gắn axit sialic chứa cả 2 liên kết này Vì đặc điểm này mà người và gia cầm đều có thể nhiễm vi-rút cúm lợn và khi có hiện tượng đồng nhiễm vi-rút cúm người và vi-rút cúm gia cầm ở lợn, thông qua tái tổ hợp di truyền có thể hình thành nên các chủng vi-rút với các đặc tính kháng nguyên mới

Mức độ gây bệnh của vi-rút cúm A phụ thuộc rất lớn đến chức năng hoạt động của vùng tiếp nhận enzyme protease để cắt HA khỏi thụ thể sialic acid Vi-rút cúm A không có gen tổng hợp enzyme protease, mà phải nhờ vào hỗ trợ của tế bào

cơ thể bị nhiễm Càng có nhiều điểm cắt protease hoàn chỉnh, cắt đặc hiệu, càng có nhiều enzyme tham gia cắt thụ thể thì sự hình thành vi-rút mới và mức độ gây bệnh cũng nặng hơn

13

1.3 Tách dòng gen và kỹ thuật di truyền ngược trong sản xuất vắc-xin

Tách dòng gen là tập hợp các kỹ thuật nhằm đưa một gen, một đoạn ADN cần thiết vào một vector bằng phương pháp hóa sinh Sau đó đưa phân tử lai này vào tế bào chủ (host cell), tạo điều kiện thích hợp để các tế bào chủ phân chia, tạo nên vô số các tế bào cùng mang một đoạn ADN insert giống nhau, tạo nên một dòng tế bào tái tổ hợp mang gen cần tách dòng

Di truyền ngược là cách thức phục hồi chức năng của gen khi đã biết trình tự nucleotide đầy đủ của gen (full length) Kĩ thuật di truyền ngược được áp dụng để nghiên cứu sự thay đổi chức năng gen khi thay đổi trình tự nucleotide trên gen Ứng dụng kỹ thuật di truyền ngược đối với vi-rút để nghiên cứu sự thay đổi về kháng nguyên; thay đổi độc tính của virus khi thay đổi kiểu gen; hiện nay được ứng dụng để sản xuất vắc-xin

Kỹ thuật di truyền ngược trong sản xuất vắc-xin là kỹ thuật thao tác với các phân đoạn genome của vi-rút, tái tạo hạt vi-rút từ các cDNA tách dòng sau khi chuyển nạp vào tế bào động vật Với vi-rút cúm A, các sợi ARN của vi-rút là sợi đơn âm, khác với các sợi đơn dương của một số các vi-rút khác như poliovirus Các gen của vi-rút ARN sợi âm không có khả năng tự lây nhiễm Do đó việc phiên

mã và tái bản rút sợi âm đòi hỏi sự đồng biểu hiện của phức hệ polymerase rút và sự tạo thành phức hệ giữa ARN và nucleoprotein Các vi-rút hỗ trợ cùng với

vi-kỹ thuật đột biến điểm đã được sử dụng để chọn lọc vi-rút đã cải biến và tìm ra vai trò của một số nucleoprotein cần và đủ cho quá trình tái bản của vi-rút (như PB2, PB1, PA và NP của vi-rút cúm)

Do toàn bộ hệ gen của vi-rút cúm A bao gồm tám phân đoạn ARN, nên việc sản xuất vắc-xin bằng kỹ thuật di truyền ngược thực chất là sự kết hợp 6 plasmid chứa cDNA bộ khung của vi-rút có nguồn gốc từ một dòng suy giảm trước đó với hai plasmid mang các gen HA, NA từ vi-rút cúm gia cầm đang lưu hành Sự tái tổ hợp hệ gen của vi-rút cho phép tạo ra một chủng vi-rút hoàn chỉnh, một loại vắc-xin phù hợp

14

Việc sử dụng kỹ thuật di truyền ngược trong sản xuất vắc-xin có một số ưu điểm như: (i) kỹ thuật di truyền ngược tránh được nhiễm các chủng vi-rút hoang dại ban đầu do sử dụng các dòng tế bào đã được kiểm định cho mục đích sản xuất vắc-xin, (ii) Ở giai đoạn plasmid, các HA của vi-rút có thể được tạo đột biến hoặc cắt bỏ đoạn độc nhằm loại bỏ độc tính Các chủng vi-rút sau khi được tạo ra bằng

kỹ thuật di truyền ngược có thể được sử dụng như một loại vi-rút gốc để tạo thêm vắc-xin

1.4 Tình hình nghiên cứu và sử dụng vắc-xin cúm gia cầm ở Việt Nam

Từ khi dịch cúm A/H5N1 xuất hiện ở Việt Nam, các công trình nghiên cứu của các nhà khoa học Việt Nam đã tập trung vào việc giám sát dịch tễ học của các chủng vi-rút cúm A/H5N1 ở mức độ phân tử, định dạng genotype, biến đổi di truyền, sự tiến hóa hệ gen, kháng nguyên, miễn dịch, các phương pháp chuẩn đoán bệnh, vắc-xin (các nghiên cứu ứng dụng, sản xuất thử nghiệm vắc-xin)

Trong điều kiện thích ứng và tiến hóa bộ gen làm xuất hiện nhiều biến chủng A/H5N1 mới có các mức độ nguy hiểm khác nhau Sự xuất hiện của clade 2.3.2.1 hiện nay, đặc biệt có sự đa nhiễm các clade 2.3.2.1A; 2.3.2.1B, 2.3.2.1C ở Việt Nam đã làm ảnh hưởng và phức tạp hóa chương trình sử dụng vắc-xin trong nước Các clade mới của cúm A/H5N1 xuất hiện với các đặc tính kháng nguyên biến đổi làm cho các vắc-xin sản xuất từ chủng vắc-xin thuộc clade 1 không còn khả năng bảo vệ hoặc bảo vệ với tỷ lệ rất thấp (Dau Huy Tung và cs, 2013) và chủng vắc-xin NIBRG-14 là không có hiệu quả đối với clade 2.3.2.1b (Đậu Huy Tùng và cs, 2015) Nghiên cứu về đặc điểm lâm sàng của các trường hợp nhiễm A/H5N1 trên người ở Việt Nam đã được các nhà khoa học Việt Nam quan tâm nghiên cứu (Liem và cs, 2009; Tran và cs, 2004) Việc phân lập được các chủng A/H5N1 kháng thuốc oseltamivir cũng một điều rất đáng báo động (Le và cs, 2005) Tuy nhiên, biện pháp phòng chống đại dịch cúm hiệu quả nhất vẫn là nghiên cứu sản xuất vắc-xin

15

Dưới sự chỉ đạo của Bộ Khoa học và công nghệ và Bộ Y tế trong chiến lược phòng chống dịch cúm A/H5N1 đến nay, các đề tài nghiên cứu sản xuất vắc-xin cúm A/H5N1 cho người và cho gia cầm trên cơ sở các chủng vắc-xin được các tổ chức có thầm quyền của WHO cung cấp đã được đồng loạt triển khai Để có thể sản xuất vắc-xin cúm cho người, hai đề tài nghiên cứu sản xuất vắc-xin cúm đã được Bộ khoa học và công nghệ giao trực tiếp cho Viện Pasteur TP Hồ Chí Minh

và Công ty vắc xin và Sinh phẩm số 1 (VABIOTEC), trong đó, Viện Pasteur TP

Hồ Chí Minh dùng công nghệ nuôi cấy vi-rút cúm chủng vắc-xin trên tế bào Vero

và trứng gà có phôi còn Công ty vắc-xin và Sinh phẩm số 1 dùng công nghệ nuôi cấy vi-rút cúm chủng vắc-xin trên tế bào thận khỉ tiên phát (Nguyễn Thị Kim Tiến, 2010; Nguyễn Thu Vân, 2010)

Mới đây các nghiên cứu hộ trợ sản xuất vắc-xin bằng kỹ thuật di truyền ngược thông qua việc nhân dòng vector chứa các phân đoạn gen khung bảo thủ của vi-rút vào vector pHW2000, và tách dòng thành công phân đoạn gen mã hóa kháng nguyên HA của clade 1.1; clade 2.3.2.1C vào vector pHW2000 sẵn sàng cho sự tái tạo vi-rút chủng làm giống gốc cho sản xuất vắc-xin (Nguyễn Thị Thu Hằng và cs, 2017) đã đóng góp phần nào cho công tác phòng chống các chủng virus mới lưu hành

1.5 Ứng dụng công nghệ gen trong nghiên cứu tách dòng gen của vi-rút

và độ sai khác qua bảng ma trận, thiết lập sơ đồ hình cây

BioEdit mang giao diện vẽ plasmid để tự động tạo ra đồ hoạ plasmid từ một chuỗi ADN; Giúp căn chỉnh trình tự axit nucleic mã hóa protein thông qua dịch axit amin; Sắp xếp các dãy theo tên, locus, định nghĩa,…; Đọc và viết Genbank, Fasta, Phylip 3.2, Phylip 4, và các định dạng NBRF / PIR;…

d, Phân tích di truyền bằng công cụ BLAST trong NCBI

NCBI (National Center for Biotechnology Information) cho phép cung cấp các dữ liệu về trình tự gen, nó cũng là công cụ giúp khai thác, phân tích dữ liệu về nucleotide và cung cấp miễn phí các thông tin cần thiết

B AST (Basic ocal Alignmet Tools) là chương trình so sánh cấu trúc chuỗi ADN, chuỗi amino acid cần phân tích với các chuỗi tương ứng lưu giữ trong ngân hàng dữ liệu nhằm tìm kiếm chuỗi tương đồng với chuỗi kiểm tra Người phân tích sẽ khai thác các thông tin đã biết của các chuỗi trong ngân hàng gen để

dự đoán xác định cấu trúc hay đặc tính của chuỗi cần phân tích Mục đích của việc phân tích là nhằm tìm kiếm xác định vùng tương đồng và mức độ phân ly về cấu trúc của chuỗi phân tích với các chuỗi khác trên ngân hàng gen Chương trình

B AST cho phép xác định sự tương đồng cấu trúc ở hai mức độ là: mang tính cục

bộ hay mang tính tổng thể giữa hai chuỗi với nhau