TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
Diacylglycerol acyltransferase (DGAT) và các nghiên cứu ứng dụng
1.2.1 Giới thiệu về diacylglycerol acyltransferase
Theo Bộ Nông nghiệp Mỹ, sản lượng nhiên liệu sinh học toàn cầu đã tăng gấp ba lần, từ 4,8 tỷ ga lông (18,16 tỷ lít) vào năm 2000 lên khoảng 16 tỷ ga lông (60,56 tỷ lít) vào năm 2007 Tuy nhiên, con số này vẫn chỉ chiếm chưa đến 3% tổng cung ứng nhiên liệu cho phương tiện giao thông toàn cầu.
Thế hệ nhiên liệu sinh học hiện tại chủ yếu được chiết xuất từ ngô, mía và đậu tương, mang lại lợi ích về môi trường so với nhiên liệu hóa thạch Tuy nhiên, nhiên liệu sinh học đang gặp phải một số vấn đề không lường trước, như giá thực phẩm toàn cầu tăng cao do diện tích canh tác chuyển sang trồng cây nhiên liệu Hơn nữa, việc phá rừng ở Brazil và Indonesia để lấy đất trồng cây nhiên liệu cũng gây ra nhiều hệ lụy Các nhà khoa học đang nỗ lực tìm kiếm phương pháp nâng cao sản lượng từ cây trồng nhiên liệu sinh học hiện tại để gia tăng hiệu suất dầu.
Gen DGAT1 mã hóa cho protein định vị trên màng, có khối lƣợng khoảng 20kDa (Heping Cao.,2011)
DGAT mã hóa một enzyme đóng vai trò quan trọng trong sinh tổng hợp triacylglycerol (Cases et al.,1998)
Hình 1: Sơ đồ tổng hợp triacylglycerol
DGAT là “một mục tiêu đầy hứa hẹn để làm tăng hàm lƣợng dầu và axit oleic ở các loại cây trồng khác nữa”
1.2.2 Những nghiên cứu ứng dụng về diacylglycerol acyltransferase
Các nhà khoa học nông nghiệp tại Mỹ đã phát hiện một gen then chốt quyết định hàm lượng dầu trong ngô, điều này có thể ảnh hưởng lớn đến ngành công nghiệp nhiên liệu sinh học đang phát triển nhanh Gen này được xác định nằm ở nhiễm sắc thể.
Nghiên cứu đăng trên Tạp chí Nature Genetics đã chỉ ra rằng có 6 gen trong cây ngô, trong đó mã hóa enzym DGAT1-2, đóng vai trò quan trọng trong việc thực hiện bước cuối cùng của quá trình tổng hợp lipid.
Sơ đồ tổng hợp triacylglycerol trong quy trình sản xuất dầu ở cây trồng cho thấy rằng một biến thể axit amin nhỏ trong gen này có khả năng tăng sản lượng dầu lên 41% và axit oleic, một loại chất béo có lợi, lên 107% (Heping Cao, 2011).
Tại Viện nghiên cứu bệnh tim mạch Gladstone, Mỹ, các nhà khoa học đã phát hiện enzym diacylglycerol acyltransferase 1 (DGAT1), liên quan đến tổng hợp chất béo và phát triển khỏe mạnh của da và tóc Thí nghiệm trên chuột cho thấy, những con thiếu enzym này không có lông, không bị béo phì và nhạy cảm với insulin và leptin Thiếu DGAT1 làm tăng nồng độ acid retinoic (RA) trên da, dẫn đến hiện tượng rụng lông Tương tự, ở người, sự thiếu hụt DGAT1 giảm khả năng tổng hợp chất béo, làm da nhạy cảm với tetinol, dễ nổi mụn và có nguy cơ ung thư da, đồng thời gây rụng tóc.
MỤC TIÊU, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Mục tiêu
Phân lập gen diacylglycerol acyltransferase (DGAT) ở loài cây cây Trẩu nhăn (Vernicia montana).
Nội dung nghiên cứu
- Thu thập, tìm thông tin về gen DGAT
- Thiết kế cặp mồi đặc hiệu để khuyếch đại gen DGAT
- Xác định trình tự nucleotide của gen DGAT.
Đối tượng, phương pháp nghiên cứu
- Gen DGAT1 ở Cây Trẩu núi Luốt
2.3.2.1 Đối tượng, phạm vi nghiên cứu
- Đối tƣợng nghiên cứu: loài Cây Trẩu
- Phạm vi nghiên cứu: Phân lập và xác định trình tự nucleotide của gen DGAT1 của Cây Trẩu
2.3.2.2 Dụng cụ, hóa chất sử dụng
- Các loại đệm tách A và B
Bảng 2.1 Thành phần đệm tách A (100ml)
2 100mM Tris (pH 8,0) (use 1M stock) 10ml
3 20mM EDTA (use 0,5M stock) 1ml
7 10mM β-mereaptoethanol (BME) (use 14,3M stock) 70μl
Bảng 2.2 Thành phần đệm tách B (100ml)
1 100mM Tris HCl (pH 8,0) (use 1M stock) 10ml
2 50mM EDTA (use 0,5M stock) 2,5ml
4 10mM β-mereaptoethanol (BME) (use 14,3M stock) 70μl
- Bộ hóa chất PCR: 2X PCR Master Mix solution và hóa chất sử dụng trong điện di Redsafe
Máy PCR, máy điện di, máy ly tâm, và bể ủ nhiệt là những thiết bị quan trọng trong lĩnh vực công nghệ gen và di truyền phân tử tại Viện công nghệ sinh học Lâm nghiệp Các trang thiết bị này hỗ trợ nghiên cứu và phát triển trong ngành sinh học, góp phần nâng cao hiệu quả trong việc phân tích và xử lý gen.
2.3.3.2 Tách chiết ADN tổng số
1 Cõn 0,2g mẫu lỏ cho vào cối chày sứ, bổ sung 600àl Đệm tỏch
A, 1800àl EBB và 200àl SDS, nghiền mẫu bằng cối chày sứ để phá vỡ tế bào
2 Hút 1,5ml mẫu cho vào ống eppendorf 1,5ml sạch
3 Ủ mẫu ở 65°C trong bể ổn nhiệt, thời gian 10 phút
4 Ly tâm 12000vòng/ phút trong 10 phút ở 4°C
5 Hút 1,0ml dung dịch nổi chuyển sang ống eppendorf 1,5ml
6 Bổ sung 410àl CH3COOK Trộn đều, đặt ống trong đỏ 5 phỳt
7 Ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút ở 4°C để thu dịch nổi
8 Thu dịch nổi và bổ sung isopropanol lạnh theo tỷ lệ Vmẫu : Visopropanol = 1:1, đảo nhẹ và ủ ở -20°C trong 20 phút
9 Ly tâm thu tủa 12000 vòng/phút trong 10 phút ở 4°C Loại bỏ dịch nổi, thu tủa
10 Rửa tủa bằng 500àl ethanol 70% (cồn 70% để rửa cỏc cặn bẩn kết tủa cùng DNA)
11 Ly tâm 12000 vòng/phút trong 5 phút ở 4°C, loại bỏ dịch nổi rồi làm khô tủa (ít nhất 30 phút)
12 Hũa tan tủa trong 100àl đệm elution
13 Kiểm tra kết quả bằng điện di trên gel agarose 1% 14.Soi gel trên máy soi gel
2.3.3.3 Tiến hành phản ứng PCR
- Sử dụng bộ kit 2X PCR Master solution để thực hiện PCR
- Các cặp mồi sử dụng cho các đoạn gen cần nhân:
DGAT1 Tên mồi Trình tự mồi
VfF1 5’- ATG ACA ATC CCT GAA ACG-3’
54 VfF2 5’- AGT CCG CTT AGC TCT GAT-3’
VfF3 5’ - CCG AAT TTA TAT GTC TGG CTT - 3’ 54
VfR1 5’ - ATA GAA CTC TCT ATC ACC AAA – 3’ 54
VfR3 5’ - GAA GAT CAT GTT CCC CAC – 3’ 54
- Vị trí các mồi trên gen DGAT1 của cây Trẩu đƣợc minh họa nhƣ sau:
- Bước 1: Chuẩn bị các hóa chất theo thành phần của một phản ứng
STT Thành phần Thể tớch (àl)
1 Nước cất 2 lần khử ion 7,0
Mg 2+ dNTPs Taq DNA polymerase
- Bước 2: Trộn đều các thành phần trên với nhau sau đó bằng pipet, sau đó làm lắng hỗn hợp đó
- Lập trình trên máy PCR theo chương trình nhƣ sau: 94°C: 2 phút
Sau khi thực hiện phản ứng PCR, chạy điện di để kiểm tra, so sánh với thang chuẩn marker 1 kb
Kiểm tra kết quả bằng điện di trên gel agarose 1%
100ml TAE1X Đun nóng bằng lò vi sóng
Bổ sung 5àl Redsafe sau đú lắc đều
Tra vào mỗi giếng 5àl sản phẩm PCR
Chạy điện di trong dung dịch TAE 1X, 100V trong 30 phút Soi gel bằng tia UV
Sản phẩm PCR phải đƣợc tinh sạch
2.2.3.4 Tinh sạch sản phẩm PCR
Sản phẩm PCR đƣợc tinh sạch bằng bộ kit PCR purification kit của Norgen Các bước tinh sạch tiến hành như sau:
- Thêm 5V binding solution vào sản phẩm PCR, mix và ly tâm nhẹ
- Lắp cột, chuyển dịch sang cột
- Ly tâm 8000vòng/phút trong 1 phút
- Thờm 500àl wash solution A Ly tõm 10000 vũng/phỳt trong 1 phỳt
- Loại bỏ dịch, lắp lại cột
- Ly tâm 14000 vòng/phút trong 2 phút để làm khô
- Lắp cột vào ống eppendorf
- Bổ sung 50àl elution buffer
- Ly tâm 14000 vòng/phút trong 2 phút
- Sản phẩm PCR sau khi tinh sạch đƣợc đƣa đi giải trình tự
2.2.3.5 Phương pháp xác định trình tự DNA
Sau khi tinh sạch sản phẩm PCR, mẫu được gửi đến phòng thí nghiệm 1st Base tại Malaysia để thực hiện giải trình tự Trình tự nucleotide của đoạn ADN được xác định bằng máy giải trình tự, sử dụng bộ Kit BigDye ® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kết quả trình tự nucleotide sau đó được xử lý và phân tích thông qua các phần mềm chuyên dụng như DNAClub, Biohit và Mega6.