TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
Giới thiệu về cây Chùm Ngây
Cây Chùm ngây hay còn gọi là cây Chùm Ngây Cải Ngựa, tên khoa học là Moringa oleifera Lam, thuộc hệ thống phân loại nhƣ sau[1]:
Chi Moringa, thuộc họ Chùm ngây Moringaceae, bao gồm 13 loài cây thân gỗ thích hợp với khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới Loài phổ biến nhất trong chi này là Chùm ngây (Moringa oleifera Lam), được trồng rộng rãi ở các khu vực nhiệt đới và là loài duy nhất của chi Moringa được trồng tại Việt Nam.
1.1.2 Đặc điểm thực vật và phân bố
Cây Chùm Ngây, hay còn gọi là cây nhỡ, có chiều cao từ 5-10m với thân cây dày và có rãnh Thân non của cây có lông, lá kép mọc so le, dài từ 30-60cm, với 6-9 đôi lá chét hình trứng mọc đối Hoa của cây có màu trắng, thơm và tương tự như hoa họ Đậu, nở vào tháng 1-2 Quả Chùm Ngây có dạng nang treo, hình tam giác, dài từ 25-30cm, mở ra thành 3 mảnh, với hạt có 3 cạnh và màu trắng, dạng màng.
Chùm Ngây là cây nhiệt đới và cận nhiệt đới, thích hợp với đất cát khô và có khả năng chịu hạn tốt Cây này phát triển lý tưởng trong khoảng nhiệt độ từ 18,7 đến 28,5 độ C và pH từ 4,5 đến 8.
Cây Chùm Ngây, có nguồn gốc từ Tây Bắc Ấn Độ, hiện nay được trồng phổ biến ở nhiều quốc gia như Ấn Độ, Hy Lạp, Philippines, Thái Lan, Malaysia và Cuba Ngoài ra, cây còn được phát hiện có mặt ở Châu Phi và Madagascar.
Cây Chùm Ngây mọc tự nhiên hoặc được trồng rộng rãi ở nhiều tỉnh phía Nam Việt Nam, từ Đà Nẵng, Nha Trang, Phan Thiết cho đến Kiên Giang và các đảo Phú Quốc.
Hình 1.1: Một số hình ảnh về hình thái cây Chùm Ngây
A Thân cây Chùm Ngây C Lá cây Chùm Ngây
B Hoa cây Chùm Ngây D Quả cây Chùm Ngây
1.1.3 Thành phần hóa học của lá cây Chùm Ngây
Chùm Ngây là nguồn cung cấp dồi dào các chất khoáng quan trọng, amino acid, vitamin, beta-carotene và nhiều hợp chất phenolic Ngoài ra, nó còn chứa hỗn hợp phong phú các hợp chất như zeatin, quercetin và kaempferol.
Kết quả phân t ch hàm ượng dinh dưỡng của quả, á tươi và bột khô của lá Chùm Ngây có thể đƣợc tóm tắt nhƣ Bảng 1.1 [11]:
Bảng 1.1: Một số thành phần hóa học của cây Chùm Ngây
STT Thành phần dinh dƣỡng/100g
Lá cây Chùm Ngây chứa hàm lượng dinh dưỡng phong phú và cao, được các nhà khoa học nghiên cứu và so sánh với các thực phẩm và trái cây nổi bật như cam, cà rốt, sữa, cải bó xôi, yaourt và chuối Các kết quả cho thấy dinh dưỡng của bột lá Chùm Ngây vượt trội hơn so với những thực phẩm này khi so sánh trên cùng trọng lượng.
Hình 1.2: So sánh hàm lƣợng dinh dƣỡng của lá Chùm Ngây và một số thực phẩm giàu dinh dƣỡng thông dụng [3]
Lá Chùm Ngây chứa hàm lượng vitamin C gấp 7 lần cam, giúp tăng cường hệ miễn dịch và chống oxi hóa, hỗ trợ điều trị cảm cúm Ngoài ra, hàm lượng canxi trong Chùm Ngây cao gấp 4 lần sữa, giúp bổ sung canxi cho xương và ngăn ngừa loãng xương Lá Chùm Ngây cũng có hàm lượng kali gấp 3 lần chuối, rất cần thiết cho não và hệ thần kinh Vitamin A trong lá cao gấp 4 lần cà rốt, giúp bảo vệ sức khỏe mắt, da và tim, đồng thời ngăn ngừa tiêu chảy Cuối cùng, lượng protein trong Chùm Ngây cao gấp 2 lần sữa, đóng vai trò quan trọng trong cấu trúc cơ thể của con người và động vật.
1.1.4.Tác sụng sinh học của lá Chùm Ngây
Lá cây Chùm Ngây có khả năng phòng ngừa bệnh ung thư, thoái hóa và xơ nang nhờ vào 46 loại chất chống oxy hóa, đặc biệt là vitamin C và vitamin A Những chất này rất quan trọng cho sức khỏe con người, giúp trung hòa tác động của các gốc tự do, từ đó bảo vệ cơ thể khỏi ung thư và các bệnh thoái hóa như thoái hóa điểm vàng và xơ nang Ngoài ra, lá Chùm Ngây còn tốt cho cơ bắp, xương, da và máu, vì chúng rất giàu amino acid, chứa 18 loại amino acid, trong đó có 8 amino acid thiết yếu, góp phần tạo nên protein hoàn chỉnh.
Cây Chùm Ngây là một loại thực vật hiếm có nhiều tác dụng tích cực cho sức khỏe Nó hỗ trợ điều trị tăng cholesterol, tăng lipid máu, và giảm uric acid, đồng thời giúp ổn định huyết áp và đường huyết, bảo vệ gan và trị suy nhược Với hàm lượng canxi và magie phong phú, Chùm Ngây rất tốt cho xương, giúp phòng ngừa bệnh loãng xương Canxi là dưỡng chất thiết yếu cho xương và răng, trong khi magie giúp cơ thể hấp thụ canxi hiệu quả hơn Ngoài ra, Chùm Ngây còn chứa cytokinin, một hormone thực vật giúp tăng trưởng và làm chậm quá trình lão hóa tế bào, với các nghiên cứu lâm sàng cho thấy nó có đặc tính chống lão hóa ở người.
1.1.5 Tình hình nghiên cứu về Chùm Ngây trên thế giới và trong nước
1.1.4.1 Tình hình nghiên cứu về Chùm Ngây trên thế giới
Nhiều nghiên cứu trên thế giới đã chỉ ra tiềm năng của Chùm Ngây trong việc trích ly và ứng dụng các hoạt chất sinh học Theo nghiên cứu của Suphachai Charoensin đăng trên tạp chí Medicinal Plant Research (2012), bột lá Chùm Ngây được trích ly với 350 mL methanol cho hàm lượng phenolic và flavonoid tổng cộng đạt 261,45 và 65,38 mg đương lượng axit gallic trên mỗi gram chiết xuất.
Boonyadist Vongsak và CS (2013) đã nghiên cứu chiết xuất lá Chùm Ngây, phát hiện hàm lượng phenolic và flavonoid tổng số lớn nhất khi sử dụng dung môi cồn ethanol 70%, với kết quả đạt 13,23g phenolic và 6,20g flavonoid trên 100g chiết xuất.
Nghiên cứu tại Đại học Baroda, Gujarat, Ấn Độ, đã chỉ ra rằng việc cho ăn Chùm Ngây (200mg/kg mỗi ngày) hoặc uống lovastatin (6mg/kg/ngày) trong một chế độ ăn giàu cholesterol trong 120 ngày có tác dụng tích cực trong việc giảm cholesterol, phospholipid và triglycerid Kết quả cho thấy cả hai phương pháp đều hiệu quả trong việc hạ tỷ số lipid trong cơ thể.
Dịch chiết thô lá Chùm Ngây đã cho thấy khả năng giảm cholesterol trong huyết thanh của chuột thí nghiệm ăn chế độ giàu chất béo Hiệu quả này được cho là nhờ vào sự hiện diện của β-sitosterol, một thành phần hóa học quan trọng.
Nghiên cứu tại Viện Khoa học Nông nghiệp Sinh học, Academia Sinica, Đài Bắc (Đài Loan) cho thấy dịch chiết từ lá và hạt Chùm Ngây bằng ethanol có khả năng diệt các nấm gây bệnh như Trichophyton rubrum, Trichophyton mentagrophyte, Epidermophyton floccosum và Microsporum canis.
Hợp chất chống oxi hóa
Chất chống oxi hóa là những hợp chất có khả năng nhường điện tử cho các gốc tự do, giúp đưa chúng về trạng thái cân bằng Điều này làm giảm tính thiếu ổn định của gốc tự do, từ đó ngăn chặn các phản ứng hóa học không mong muốn với các phân tử khác.
Chất chống oxy hóa đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ cơ thể khỏi tác hại của gốc tự do bằng cách đưa chúng về trạng thái cân bằng Hệ thống bảo vệ chống oxy hóa bao gồm nhiều thành phần, và sự thiếu hụt bất kỳ thành phần nào có thể dẫn đến giảm khả năng chống oxy hóa tổng thể.
1.2.2 Phân loại các hợp chất có tác dụng chống oxy hóa
Chất chống oxy hóa có bản chất enzyme và không phải enzyme:
Hệ thống chống oxy hóa trong cơ thể bao gồm các enzyme có khả năng bảo vệ tế bào khỏi tác động của gốc tự do Những enzyme này, như superoxyd dismutase, glutathione, glutathione peroxydase và catalase, có khả năng trung hòa hàng ngàn gốc tự do, giúp duy trì sự cân bằng trong cơ thể Chúng tồn tại từ trước khi có sự hình thành gốc tự do và tham gia vào các phản ứng khác nhau để bảo vệ tế bào Tuy nhiên, sự gia tăng quá mức của gốc tự do có thể gây ra tổn thương cho tế bào và dẫn đến nhiều vấn đề sức khỏe.
Có 13 tác động từ các yếu tố bên ngoài có thể làm mất cân bằng giữa các chất oxy hóa và khả năng thu dọn của hệ thống enzym trong cơ thể Những yếu tố này bao gồm ô nhiễm môi trường, chế độ ăn uống không lành mạnh, căng thẳng, thiếu ngủ, và lối sống ít vận động Khi sự cân bằng này bị phá vỡ, cơ thể sẽ gặp phải các vấn đề về sức khỏe, như viêm nhiễm và lão hóa sớm Việc hiểu rõ những tác động này giúp chúng ta có biện pháp phòng ngừa hiệu quả hơn.
Hệ thống chống oxy hóa phi enzyme hoạt động bằng cách ngăn chặn các phản ứng chuỗi của gốc tự do, với những ví dụ tiêu biểu như carotenoid, flavonoid, vitamin C, vitamin E, polyphenol thực vật và glutathione Phần lớn các chất chống oxy hóa trong thực phẩm bổ sung thuộc loại phi enzyme, chúng hỗ trợ các chất chống oxy hóa enzyme bằng cách trung hòa các gốc tự do ngay từ đầu, từ đó giúp bảo vệ và ngăn ngừa sự cạn kiệt của các enzyme chống oxy hóa trong cơ thể.
Hợp chất Flavonoid
Hợp chất phenolic trong Chùm Ngây có chứa nhiều các flavonoid, các flavonoid có hoạt tính sinh học cao vì vậy chất ƣợng của dịch tách chiết cao
Flavonoid là một nhóm hợp chất tự nhiên phong phú có mặt chủ yếu trong thực vật, thường mang màu vàng Về mặt cấu trúc hóa học, flavonoid có công thức cơ bản kiểu C6.
C3 C6 (2 vòng benzene A và B nối với nhau qua một mạch 3 carbon) và đƣợc chia làm nhiều nhóm khác nhau và hầu hết flavonoid là các chất phenolic [7]
Flavonoid được phát hiện bởi Albert Szent-Gyorgyi, một trong những nhà sinh hóa nổi tiếng nhất thế kỷ XX, người đã nhận giải Nobel năm 1937 nhờ những khám phá quan trọng về vitamin C và flavonoid.
1.3.2 Cấu trúc chung và phân loại
Flavonoid là một chuỗi polyphenolic gồm 15 nguyên tử carbon và hai vòng benzene liên kết bởi một đường thẳng có 3 carbon [7]
Hình 1.3 Cấu trúc chung của các chất thuộc nhóm flavonoid
Flavonoid có cấu trúc mạch C6 C3 C6 với 2 v ng thơm, tùy thuộc vào cấu tạo của mạch C trong bộ khung C6 C3 C6, flavonoid đƣợc phân thành 3 phân nhóm chính sau [7]:
+ Flavonoids: gồm các chất flavon, flavonol, flavanon, flavanol, chalcon, anthocyanin, anthocyanidin
+ Isoflavonoid: gồm các nhóm phụ isolavon, isoflavanon, rotenoid
+ Neoflavonoid: nhóm phụ nhƣ calophylloid,…
1.3.2.1 Các chất thuộc nhóm flavonoids
Flavon có cấu trúc gồm hai vòng benzen A và B, với vòng B kết nối với vòng C (pyran) tại vị trí C2 và có nối đôi ở vị trí 2-3 Các dẫn chất flavon rất phổ biến trong thực vật, thường có màu từ không màu đến vàng nhạt Bài viết này chỉ đề cập đến các flavon có nhóm thế.
Flavon là một nhóm hợp chất thực vật phổ biến, với hơn 300 chất đã được xác định, trong đó apigenin và lutelin là hai flavon thường gặp nhất, được phân lập từ cây Anh thảo (Primula) Các flavon này cũng có mặt trong nhiều loại thực vật khác như Thông, Hoàng cầm (rễ) và Mè (lá).
Flavonol là một hợp chất thực vật khác với flavon nhờ có nhóm OH ở vị trí C3, tạo ra màu vàng nhạt đến vàng Các dẫn xuất flavonol rất phổ biến trong nhiều loại thực vật, đặc biệt là trong hành, hoa hòe, lúa mạch và diếp cá.
Flavonoid có khả năng tạo phức với các ion kim loại, đóng vai trò là xúc tác trong nhiều phản ứng oxy hóa Mỗi phân nhóm flavonoid có cấu trúc riêng, dẫn đến sự khác biệt về tính chất vật lý và hóa học, trong khi vẫn giữ được một số tính chất chung Trong tự nhiên, các hợp chất này thường tồn tại trong thực vật.
15 dạng hỗn hợp của các dẫn suất, với tỷ lệ khác nhau, tuỳ thuộc nguồn gốc thực vât
Chalcon chủ yếu có mặt trong một số cây thuộc họ cúc (Asteraceae), với sự tập trung nhiều nhất ở các loài cây gỗ như keo, bạch đàn, dẻ, đậu tương, trinh nữ hoàng cung và dương xỉ Đáng chú ý, chalcon không được tìm thấy ở động vật.
Chalcon có độ bền kém trong môi trường kiềm và khi tác dụng với dung dịch FeCl3, nó sẽ tạo ra kết tủa có màu xanh thẫm hoặc xanh nhạt, tùy thuộc vào số lượng nhóm hydroxyl có trong phân tử.
Chalcon dễ tan trong nước nóng và rượu, tạo ra dung dịch không màu, nhưng không tan trong các dung môi không phân cực hoặc ít phân cực như benzen hoặc chloroform Dưới tác dụng của ion H+ hoặc OH-, chalcon có thể chuyển đổi thành flavanon Khi tạo liên kết glycosid, phần đường sẽ nối vào vị trí 4, và một số trường hợp sẽ nối vào vị trí 2 thành rượu.
Anthocyanidin có khả năng tạo thành muối bền với acid vô cơ, cho dung dịch màu đỏ trong môi trường acid và màu xanh da trời trong môi trường kiềm Ở dạng base tự do, anthocyanidin là đồng phân với flavanon, là dẫn xuất của flavon với nhóm carbonyl bị khử Các dẫn xuất flavan-3,4-dio không màu nhưng có tính quang hoạt, trong khi anthocyanidin không màu nhưng có khả năng tương tác.
Anthocyanidin thường tồn tại dưới dạng glycozit, được gọi là anthocyanin Khi tiếp xúc với dung dịch acid vô cơ, anthocyanin có màu sắc đặc trưng, dễ bị oxi hóa và trùng hợp, điều này gây khó khăn trong việc phân lập chất tinh khiết.
1.3.2.2 Các chất thuộc nhóm isoflaconoid
Nhóm hợp chất này bao gồm isoflavon, isoflavanon và rotenoid, với đặc điểm chung là không có màu sắc Isoflavonoid được hình thành từ axetat thông qua cơ chế đóng vòng với phenylalanin, trong đó cinnamate dẫn xuất được tích hợp vào vòng B và C, cụ thể là ở vị trí 2,3 và 4 của dạng vòng.
1.3.2.3 Các chất thuộc nhóm neoflavonoid
Các hợp chất trong các phân nhóm này đều có cấu trúc phân tử với hai vòng thơm và nhóm hydroxyl, với số lượng và vị trí khác nhau tùy thuộc vào từng chất Chúng có cấu trúc mạch C6C3C6, nhưng cầu nối C3 giữa hai nhân lại khác nhau tùy thuộc vào loại hợp chất Cầu nối này có thể là mạch hở (chalcon), một vòng đơn (flavanon), hoặc vòng có nối đôi (flavon, flavono).
1.3.3 Tính chất lý hóa của flavonoid
Flavonoid trong thực vật tồn tại dưới hai dạng: aglycon (dạng tự do) và glycoside (dạng liên kết với đường) Khi glycoside bị thủy phân bằng acid hoặc enzyme, chúng sẽ giải phóng đường và aglycon Các loại đường phổ biến bao gồm D-glucose, D-galactose, L-rhamnose, L-arabinose, D-xylose và D-apiose Về tính tan, aglycon có độ tan kém trong dung môi kém phân cực như n-hexan và benzen, nhưng tan tốt trong dung môi phân cực vừa và mạnh như ethyl acetate, dimethyl ether, methanol và ethanol, cũng như trong kiềm loãng Glycoside tan trong ethanol và methanol, và chúng càng có nhiều nhóm đường và mạch đường dài thì càng tan tốt trong nước nóng Các flavonoid glycoside với nhóm -OH tại vị trí C7 có khả năng tan trong dung dịch NaOH.
Na 2 CO 3 , NaHCO 3 do có tính acid Các flavonoid dạng ag ycon thường dễ kết tinh, trong hi các g ycoside thường khó kết tinh hơn
Các f avonoid thường có màu Flavon có màu vàng nhạt hoặc màu cam; f avono có màu vàng đến vàng nhạt; cha con có màu vàng đến cam đ Các
18 isoflavon, flavanon, flavanonol, leucoanthocyanidin, catechin kết tinh không màu Anthocyanidin thường hiện diện ở dạng glycoside: pelargonidin, cyanidin, de phinidin…tạo màu xanh dương, đ , tím cho hoa và trái
Các flavonoid có khả năng tạo muối tan trong nước khi phản ứng với hydroxyd kiềm và rất nhạy cảm với pH, nhiệt độ cũng như ánh sáng Chúng cũng có khả năng tạo phức với các ion kim loại, mang lại màu sắc đặc trưng cho sản phẩm.
NỘI DUNG, MỤC TIÊU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Mục tiêu nghiên cứu
Nghiên cứu tách chiết hợp chất flavonoid và xác định hàm ƣợng vitamin C của lá cây Chùm Ngây.
Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu xác định đƣợc độ ẩm của lá và bột lá cây Chùm Ngây và xác định hàm ƣợng vitamin C trong lá Chùm Ngây
- Nghiên cứu tách chiết hợp chất flavonoid trong bột lá Chùm Ngây theo phương pháp của B.C.Talli và xác định một số điều kiện tách chiết thích hợp
- Xác định sự có mặt của flavonoid trong dịch chiết bằng các phản ứng màu đặc trƣng và chạy sắc ký lớp m ng
- Xác định hoạt tính kháng một số vi sinh vật kiểm định của flavonoid
Vật liệu nghiên cứu
Lá cây Chùm Ngây được lấy tại thị trấn Xuân Mai, huyện Chương Mỹ - Hà Nội
Hình 2.1: Hình ảnh lá và bột lá của cây Chùm Ngây
- Vi khuẩn E.coli Gram (-) , vi khuẩn Salmonella
Do phòng vi sinh – hoá sinh, Viện công nghệ sinh học Lâm Nghiệp cung cấp.
Thiết bị, dụng cụ, hóa chất nghiên cứu
Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu gồm:
- Các dụng cụ tủy tinh nhƣ bình trụ, đũa thủy tinh, đĩa peptri, bình tam giác nh
- Kẹp gỗ, pipetman, đầu côn các loại, ống cuvet, ống eppenandorf, ống fancol, ống nghiệm, giấy lọc
- Giấy sắc ký silica gel 60G c Hóa chất
Các loại hóa chất cần thiết: n-hexan, etyl acetat, ethanol 96°, methanol, dung dịnh NaOH 10%, KOH 10%, hệ dung môi chạy TLC(ethyaxetat :to uen:axit fomic:nước = 7:3:1,5:1)
Phương pháp nghiên cứu
2.5.1 Xác định độ ẩm của lá và bột lá cây Chùm Ngây
- Độ ẩm à ượng nước tự do có trong mẫu, có thể được xác định bằng phương pháp sấy khô
Nguyên lý của phương pháp này là sử dụng nhiệt để loại bỏ hoàn toàn hơi nước trong mẫu Bằng cách cân trọng lượng mẫu trước và sau khi sấy khô, chúng ta có thể tính toán phần trăm nước có trong mẫu.
Để xác định độ ẩm của lá Chùm Ngây, trước tiên cần cân khối lượng lá đã được ngắt b cành và đặt vào khay đĩa đã sấy khô Sau đó, cho khay vào tủ sấy và điều chỉnh nhiệt độ ở 80°C trong 3 giờ Khi quá trình sấy hoàn tất, lấy khay ra và để nguội đến nhiệt độ phòng trước khi cân lại trên cân phân tích Lặp lại quy trình này cho đến khi khối lượng giữa ba lần cân liên tiếp không thay đổi hoặc sai số không vượt quá 0,5mg cho mỗi gam mẫu ban đầu, lúc đó có thể dừng quá trình sấy Độ ẩm của mẫu sẽ được tính theo công thức phù hợp.
Để tính độ ẩm (%), ta sử dụng công thức: H = [(mo - m1) / m] x 100, trong đó m là khối lượng của cốc cân (g), mo là khối lượng của cốc cân và mẫu trước khi sấy (g), và m1 là khối lượng cốc cân và mẫu sau khi sấy (g).
2.5.2 Xác định làm lượng vitamin C trong lá Chùm Ngây
Vitamin chủ yếu được tổng hợp trong cơ thể thực vật và vi sinh vật, trong khi con người và động vật hầu như không thể tự sản xuất vitamin Tuy nhiên, vitamin cũng có mặt trong thực vật.
Nhu cầu vitamin trong cơ thể rất quan trọng và cần được cung cấp đầy đủ từ thực phẩm có nguồn gốc động vật, thực vật và vi sinh vật Thiếu vitamin có thể dẫn đến bệnh tật ở cả con người và động vật.
Vitamin C (acid ascorbic) là một hợp chất chưa no, chứa nhóm endiol và có khả năng bị phá hủy nhanh chóng bởi các chất oxy hóa, nhưng lại bền vững trong môi trường axit Nguyên tắc hoạt động của acid ascorbic dựa trên khả năng oxy hóa thuận nghịch nhờ vào sự hiện diện của nhóm endiol trong cấu trúc phân tử của nó.
Phản ứng khử oxy hóa hiệu quả hơn so với phương pháp chuẩn độ axit-bazo, vì việc thêm axit vào dịch chiết có thể gây cản trở quá trình oxy hóa axit ascorbic bởi Iốt Mặc dù Iốt tương đối không tan trong nước, nhưng tính tan của nó có thể được cải thiện bằng cách kết hợp Iốt với iođua để tạo thành triiođua.
I 2 + I - < > I 3 - Triiođua oxy hóa vitamin C tạo acid dehydroascorbic:
Sau đó xảy ra phản ứng:
KIO3 + 5KI + 6HCl + 3C6H8O6 3C6H6O6 + 6KI + 3H2O + 6HI
Khi vitamin C còn tồn tại trong dung dịch, triiođua nhanh chóng chuyển thành ion iođua Tuy nhiên, khi vitamin C đã bị oxy hóa hoàn toàn, iốt và triiođua sẽ xuất hiện trong dung dịch, phản ứng với tinh bột tạo ra hỗn hợp màu xanh đen, đánh dấu điểm dừng cho phản ứng chuẩn độ.
- Acid ascorbic (vitamin C) tinh khiết
- Dung dịch hồ tinh bột 0,5%
Thêm 10ml HCl 2% vào cối sứ và nghiền nhuyễn, sau đó chắt dịch chiết sang bình 50ml Tiếp tục thêm 10ml HCl 2% vào cối sứ, nghiền nhuyễn và chắt dịch chiết sang bình Lặp lại quá trình này đến lần thứ tư Cuối cùng, sử dụng 10ml HCl 2% để rửa cối và chày sứ, chuyển toàn bộ dịch chiết và nước rửa vào bình.
- Để yên bình 10-15 phút để tách axit ascobic và protein hoặc lọc qua giấy lọc nhanh vào bình hay cốc
- Dẫn nước cất đến vạch mức 100ml
- Lấy 10ml dịch chiết cho vào bình tam giác, thêm 1 giọt hồ tinh bột 0,5% lắc nhẹ Chuẩn độ bằng Iốt 0,001N đến xuất hiện màu xanh lam nhạt
- Lặp lại thí nghiệm 3 lần và lấy trị số trung bình
Hàm ƣợng vitamin C(mg/100g) đƣợc tính theo công thức:
V:Số ml dung dịch Iot 0,001N đã d ng để chuẩn độ
V1:Thể tích tổng số dung dịch mẫu
V 2 :Thể tích dịch mẫu lấy để chuẩn độ
23 m : Số gam mẫu d ng để xác định hàm ƣợng vitamin C 0,000088:Số gam vitamin C tương ứng với 1 ml I2 0,01N
2.5.3 Tách chiết hợp chất flavonoid theo phương pháp của B.C.Talli
Tách chiết Flavonoid theo qui trình của B.C Talli [9,5], gồm các bước chính nhƣ Sơ đồ 2.1:
Bột nguyên liệu chiết bằng n-hexan sấy khô ở 60ºC
Chiết bằng nước cất nóng( chỉnh Ph=3-4)
Sơ đồ 2.1: Quy trình chiết xuất flavonoid toàn phần (theo B.C.Talli) [5, 9]
2.5.4 Tối ưu một số điều kiện trong quá trình tách chiết theo quy trình a) Xác định ảnh hưởng của điều kiện nhiệt độ đến hiệu quả trích ly
Loại tinh dầu, lipit bằng n-hexan
Bột nguyên liệu sau sấy Dịch chiết n-hexan
Hoạt chất trong dịch chiết nước
Hợp chất flavonoid hòa tan trong ethanol
Flavonoid thô ở dạng bột khô
Cân 2g bột nguyên liệu và chiết xuất bằng n-hexan trong tủ ấm 8 giờ để loại bỏ tinh dầu, chất béo và carotenoid Sau khi thu được dịch chiết n-hexan, loại bỏ phần bã nguyên liệu và sấy khô để bay hết n-hexan Tiếp theo, chiết xuất bằng ethanol 60% và ngâm trong tủ ấm ở 60°C trong 8 giờ Cuối cùng, thu dịch chiết ethanol và cô cạn bằng phương pháp đun các thủy, thu được cao ethanol.
Sau khi thu được cao ethanol, tiến hành chiết lại bằng 10ml nước cất nóng Dịch chiết sau khi lọc được trộn với 20ml ethyl acetate Cuối cùng, dịch chiết ethyl acetate được thu nhận và cô cạn bằng phương pháp đun cách thủy.
Để đạt hiệu quả cao nhất trong việc chiết xuất flavonoid, cần xác định trọng lượng flavonoid ở các nồng độ khác nhau và tìm ra công thức với nồng độ ethanol phù hợp.
Tương tự, thực hiện trích ly flavonoid ở nhiệt độ phòng và nhiệt độ lạnh (4 0 C) b) Xác định ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến hiệu quả trích ly
Dung môi chiết là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất hợp chất tự nhiên trong thực vật, với hiệu quả chiết xuất và hoạt tính của chất chiết phụ thuộc vào loại và nồng độ dung môi Việc lựa chọn dung môi thường dựa trên mục đích chiết xuất, khả năng phân cực của chất cần chiết, độ phân cực của các thành phần không mong muốn, chi phí, cũng như vấn đề an toàn và môi trường Ethanol là dung môi phổ biến để chiết xuất flavonoid từ thực vật, vì nhiều hợp chất flavonoid tan tốt trong dung môi này, đồng thời ít độc hại và có chi phí thấp hơn so với các dung môi khác Do đó, nghiên cứu này tiến hành chiết xuất và định lượng flavonoid tổng số từ lá Chùm Ngây theo quy trình B.C Talli.
9] ở các điều kiện dung môi hác nhau nhƣ: ethanol 96%, ethanol 80%, ethanol 60% và nước c) Xác định ảnh hưởng của tỷ lệ mẫu/dung môi ethanol
Thay đổi tỷ lệ bột lá khô và dung môi tách chiết trong quy trình ngâm 10 giờ với các tỷ lệ bột lá Chùm Ngây và dung môi ethanol là 1/10, 1/15 và 1/20.
Lọc và cô cạn để thu hồi flavonoid, sau đó cân khối lượng flavonoid thu nhận được nhằm xác định tỷ lệ giữa mẫu và dung môi tối ưu Đồng thời, nghiên cứu cũng xác định ảnh hưởng của thời gian ngâm mẫu trong ethanol đến hiệu quả thu hồi flavonoid.