Nghiên cứu phát triển bệnh viêm ruột hoạt tử ở lợn và gà do chủng vi khuẩn clostridium perfringens bằng kỹ thuật PCR

Ở Việt Nam, công tác chẩn đoán bệnh trên gia xúc, gia cầm áp dụng các kĩ thuật chẩn đoán truyền thống là chủ yếu, hầu hết đều dựa vào những triệu chứng và các vết bệnh tích ở vật chủ, h

TRƯỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LÂM NGHIỆP



KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

“NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN BỆNH VIÊM RUỘT HOẠT TỬ Ở LỢN

VÀ GÀ DO CHỦNG VI KHUẨN CLOSTRIDIUM PERFRINGENS

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành bài khóa luận tốt nghiệp này, em xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới giáo viên hướng dẫn TS Hà Bích Hồng đã tận tình hướng dẫn, chỉ

bảo trong suốt quá trình thực hiện khóa luận

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến quý thầy cô Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp – Trường Đại học Lâm nghiệp đã giúp đỡ, chỉ bảo hết sức tận tình cho em không chỉ quá trình làm khóa luận mà cả quá trình học tập, bồi dưỡng tại Trường Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn

bè và người thân đã động viên, giúp đỡ và tạo điều kiện thuân lợi trong quá trình học tập, sinh hoạt, làm nghiên cứu khoa học và hoàn thành bài Khóa

luận tốt nghiệp này

Vì điều kiện thời gian, khả năng của bản thân còn có những hạn chế nên bài Khóa luận tốt nghiệp này còn có những thiếu sót, em rất mong nhận được ý kiến đóng góp quý báu của thầy cô giáo, các nhà khoa học cũng như

các bạn sinh viên để bài khóa luận của em được hoàn thiện hơn

Em xin trân trọng cảm ơn!

Hà Nội, ngày tháng năm 2020

Nguyễn Lê Nhật Trang

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

MỤC LỤC ii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT iv

DANH MỤC CÁC BẢNG v

DANH MỤC CÁC HÌNH vi

MỞ ĐẦU vi

CHƯƠNG I TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 2

1.1 Bệnh truyền nhiễm 2

1.1.1 Khái niệm bệnh truyền nhiễm 2

1.1.2 Một số nhóm tác nhân gây bệnh truyền nhiễm 4

1.2 Bệnh viêm ruột hoại tử (NE) ở gà và lợn 6

1.2.2 Yếu tố ảnh hưởng đến bệnh viêm ruột hoại tử ở gà và lợn 9

1.2.3 Bệnh viêm ruột hoại tử trên gà 11

1.3 Một số phương pháp chẩn đoán bệnh truyền nhiễm trên gia súc, gia cầm 15

1.3.1 Phương pháp truyền thống 15

1.3.2 Phương pháp hiện đại 16

1.3.3 Chẩn đoán bằng kĩ thuật PCR 19

CHƯƠNG II MỤC TIÊU, NỘI DUNG, ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28

2.1 Mục tiêu của đề tài 28

2.1.1 Mục tiêu tổng quát 28

2.1.2 Mục tiêu cụ thể 28

2.2 Đối tượng nghiên cứu 28

2.3 Phạm vi nghiên cứu 28

2.3 Nội dung nghiên cứu 28

2.4 Mẫu bệnh phẩm, hóa chất và các trang thiết bị sử dụng nghiên cứu 29

2.4.1 Mẫu bệnh phẩm 29

2.4.2 Hóa chất thí nghiệm 29

2.4.3 Trang thiết bị nghiên cứu 29

2.4.4 Dụng cụ thí nghiệm 29

2.5 Phương pháp nghiên cứu 30

2.5.1 Thu nhận, bảo quản mẫu bệnh phẩm 30

2.5.2 Tách chiết DNA từ mẫu bệnh phẩm 30

2.5.3 Kỹ thuật PCR 30

2.5.4 Kỹ thuật điện di 32

CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33

3.1 Kết quả tách chiết DNA 33

3.1.1 Kết quả tách chiết DNA từ mẫu bệnh phẩm của lợn 33

3.1.2 Kết quả tách chiết DNA từ mẫu bệnh phẩm của gà 34

3.2 Kết quả phát hiện bệnh viêm ruột hoại tử ở lợn 35

3.2 Kết quả phát hiện bệnh viêm ruột hoại tử ở gà 38

CHƯƠNG IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42

4.1 Kết luận 42

4.2 Kiến nghị 42

TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

1 AC-ELISA Antigen Capture Enzyme-Linked

Immunosorbent Assay

2 AIDS Acquired Immunodeficiency Syndrome

3 DNA Deoxyribonucleic Acid

4 ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay

5 FA Flourescence Assay

6 ILT Infectious Laryngotracheitis

7 ILTV Infectious Laryngotracheitis Virus

8 IP Immunoperoxidase

9 ITS Internal Strancribed Spacer

10 NE Necrotic Enteritis

11 ORT Ornithobacterium Rhinotracheale

12 PCR Polymerase Chain Reaction

13 RNA Ribonucleic Acid

14 SARS Severe Acute Respiratory Syndrom

15 SDS Sodium Dodecyl Sulfate

16 Ta Temperature annealing

17 Tm Temperature melting

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1: Các typ độc tố chính của vi khuẩn C perfringens 7

Bảng 1.2: Các type Clostridium perfringens gây bệnh viêm ruột hoại tử ở lợn 13

Bảng 2.1: Thành phần phản ứng PCR 31

Bảng 2.2: Mồi sử dụng trong đề tài 31

Bảng 2.3 : Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR 32

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1: Clostridium perfringens qua kính hiển vi 9 Hình 3.1: Kết quả kiểm tra DNA tổng số được tách chiết từ các mẫu bệnh phẩm khác nhau của lợn chẩn đoán bệnh viêm ruột hoại tử trên gel agarose 1% 33 Hình 3.2: Kết quả kiểm tra DNA tổng số được tách chiết từ các mẫu bệnh phẩm khác nhau của gà chẩn đoán bệnh viêm ruột hoại tử 34 Hình 3.3: Kết quả tối ưu nhiệt độ gắn mồi của cặp mồi 16S_F/R trên mẫu DNA tách từ phân của Heo chẩn đoán bệnh viêm ruột hoại tử 36 Hình 3.4: Kết quả PCR với cặp mồi 16S_F/R 37 Hình 3.5: Kết quả nhân bản đoạn gen 16S-rRNA của vi khuẩn C perfringens

từ các mẫu bệnh phẩm của gà 38 Hình 3.6: Quy trình phát hiện bệnh ở gia súc, gia cầm bằng phương pháp PCR 41

MỞ ĐẦU

Trong lĩnh vực chăn nuôi gia xúc, gia cầm, bệnh truyền nhiễm được xem như là trở ngại lớn nhất ảnh hưởng đến sự tăng trưởng và phát triển bền vững của ngành chăn nuôi ở nước ta Những tác hại mà bệnh truyền nhiễm mang đến như, bệnh nhẹ: vật chủ kém tăng trưởng – chất lượng thịt kém, giảm sản lượng trứng, bệnh nặng: tử vong hàng loạt – gây ô nhiễm môi trường Để kiểm soát và giảm thiểu những hậu quả bệnh truyền nhiễm mang lại, chúng ta cần phải xác định được tác nhân nào gây bệnh làm cơ sở để lựa chọn và hoàn thiện những giải pháp nhằm hạn chế sự sinh trưởng và phát triển của tác nhân gây bệnh

Bệnh viêm ruột hoại tử (Necrotic Enteritis) là một bệnh truyền nhiễm

điển hình thường gặp ở ngành chăn nuôi do chủng vi khuẩn Clostridium perfringens gây ra Bệnh đã được thừa nhận trên toàn cầu như một trong

những thách thức bệnh dẫn đầu, ước tính phí tổn trong ngành gia cầm gần 2 tỷ USD chỉ riêng năm 2015 Ở Việt Nam, công tác chẩn đoán bệnh trên gia xúc, gia cầm áp dụng các kĩ thuật chẩn đoán truyền thống là chủ yếu, hầu hết đều dựa vào những triệu chứng và các vết bệnh tích ở vật chủ, hình thái, cấu tạo

và hoạt tính sinh học của các tác nhân gây bệnh, điều đó ảnh hưởng đến hiệu quả sử dụng thuốc và thuốc kháng sinh đối với những bệnh có bệnh lý và triệu chứng tương đồng nhau Tình trạng sử dụng thuốc kháng sinh không hiệu quả dẫn đến bệnh không được tiêu diệt triệt để, hình thành những ổ dịch

tự nhiên, và thúc đẩy tích lũy các đột biến ở các tác nhân gây bệnh

Với sự phát triển của lĩnh vực sinh học phân tử, tiêu biểu là kỹ thuật polymerase chain reaction (PCR) đã kéo theo hàng loạt các thành tựu khoa học mang tính thực dụng cao Ưu điểm của phương pháp này: đơn giản, giá thành thấp

và nhanh chóng Do đó, trong lĩnh vực chẩn đoán bệnh, PCR được xem là phương pháp chẩn đoán chính xác tác nhân gây bệnh, phát hiện được đến từng phân chủng, áp dụng được với nhiều dạng và hàm lượng mẫu bệnh phẩm khác nhau Xuất phát từ tính chất vượt trội của kỹ thuật PCR trong lĩnh vực chẩn đoán bệnh,

tôi đã thực hiện đề tài: “Nghiên cứu phát hiện nhanh bệnh viêm ruột hoạt tử ở

CHƯƠNG I TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Bệnh truyền nhiễm

1.1.1 Khái niệm bệnh truyền nhiễm

Bệnh truyền nhiễm là loại bệnh có khả năng lây lan nhanh chóng (từ một quần thể nhỏ đến cả một cộng đồng), thời gian ủ bệnh tương đối dài nên việc phát hiện và kiểm soát bệnh là một vấn đề khó khăn trong y tế dự phòng Bên cạnh đó một số bệnh có những biểu hiện, triệu chứng bệnh có điểm tương tự nhau, bệnh xâm nhiễm ở một loài hay nhiều loài nhất định, mức độ phát tán

và bệnh trạng phụ thuộc vào đặc tính hình thái, cấu tạo và cấu trúc sinh học của những tác nhân gây bệnh

Bệnh truyền nhiễm là nguyên nhân chủ yếu làm trì trệ sự phát triển bền vững của lĩnh vực chăn nuôi, không chỉ thiệt hại về kinh tế, mà còn ảnh hưởng đến môi trường, và sức khỏe cộng đồng Một số bệnh truyền nhiễm gây thiệt hại ngành chăn nuôi gia cầm ở Việt Nam như: dịch cúm gia cầm (12/2003), nước ta đã phải thiêu hủy 38 triệu con tương đương với hơn 380

tỷ đồng (https://www.nhandan.com.vn/kinhte/item/8045602-.html), hàng năm phải tiêu hủy hàng nghìn gia cầm do các trận dịch nhỏ, lẻ xảy ra thường xuyên rải rác khắp cả nước; hay bệnh viêm ruột hoại tử (NE), ORT (Vi khuẩn

Ornithobacterium rhinotracheale), viêm thanh khí quản (Gallid herpesvirus 1), tiêu chảy (Vi khuẩn Escherichia Coli), thương hàn (Salmonella Gallinarum), đều là những bệnh phổ biến ở Việt Nam, bệnh xảy ra thường

xuyên nếu gặp điều kiện thời tiết và dinh dưỡng thích hợp trong năm Điển

hình là những trận dịch lợn tai xanh (Arterivirus), lở mồm long móng (Aphthovirus) và gần đây nhất là dịch tả lợn Châu Phi (African swine fever virus) đã gây thiệt hại vô cùng lớn cho ngành chăn nuôi (Đỗ Tiến Duy, 2015,

2016; Nguyễn Đình Quát, 2015) Một số bệnh không gây tử vong nhưng thiệt hại kinh tế do chúng mang đến thậm chí còn nghiêm trọng hơn các bệnh gây

tử vong, bởi hậu quả của những căn bệnh đó là làm vật chủ chậm phát triển và

giảm sản lượng trứng

Các tác nhân gây bệnh hầu hết đều là sinh vật nhân sơ, chúng chính là những sinh vật đơn bào có tần số đột biến cao, lợi thế về vòng đời ngắn ngủi giúp cho các tác nhân gây bệnh có thể dễ dàng hình thành nên một quần thể kháng kháng thể (hoặc kháng thuốc kháng sinh) mới thông qua tích lũy đột biến và các yếu tố chọn lọc Ngoài ra, ở sinh vật nhân sơ cũng không có những yếu tố sửa sai hệ gen như ở sinh vật nhân thực, điều này dẫn đến tỉ lệ đột biến ở sinh vật nhân sơ tăng cao Thứ yếu, sự phát tán bệnh từ một quần thể cách ly và nhỏ, bệnh lan truyền qua đường vận chuyển quốc tế, truyền máu, Thứ ba, sự phát tán của các virus có sẵn ở các sinh vật khác địa vực (sống cách ly), các nhà khoa học ước lượng rằng ba phần tư các bệnh mới bắt nguồn theo cách này Các loài sinh vật được xem như là ổ chứa tự nhiên của các chủng virus, như bệnh SARS bùng phát năm 2002 ở Trung Quốc, nguyên nhân là dơi, ổ chứa bệnh SARS được bán làm thức ăn cùng thời điểm đó (World Health Organization) Một cách thức quan trọng khác là sự tái tổ hợp di truyền nếu một vật chủ bị lây nhiễm nhiều chủng virus cùng một thời điểm Cụ thể hơn là virus cúm, được xem như là nguyên nhân dẫn đến bùng phát đại dịch cúm Tây Ban Nha năm

1918, virus 1918 gây ra đại dịch được cho là hậu đại của 02 chủng virus cúm từ động vật có vú và loài chim thông qua sự trôi dạt kháng nguyên (antigenic drift), (https://www.cdc.gov/flu/about/viruses/change.htm)

Bệnh phát tán thường thông qua đường sol khí, hoặc tiếp xúc trực tiếp với dịch thể nhiễm bệnh (máu, nước bọt , ), các dụng cụ ô nhiễm (kim tiêm,

đồ dùng sinh hoạt , ), hay vật trung gian (côn trùng, thức ăn ô nhiễm , ) Các tác nhân gây bệnh có thể phá hủy hay giết các tế bào bằng việc giải phóng enzyme thủy phân từ lysosome làm phân giải màng tế bào vật chủ, hoặc bản thân tác nhân có thành phần phân tử là độc tố như phần protein của lớp áo virus, phần lipid của vi khuẩn…

Mức độ phá hủy tế bào chủ mà các tác nhân có thể gây ra phụ thuộc vào khả năng tái sinh của mô bị lây nhiễm qua quá trình phân chia tế bào Nhiều

triệu chứng tạm thời liên quan đến sự lây nhiễm (như virus, ), bao gồm sốt cao, đau nhức thường là do các nỗ lực đáp ứng của chính cơ thể nhằm chống lại virus hơn là do các tế bào bị chết bởi virus

1.1.2 Một số nhóm tác nhân gây bệnh truyền nhiễm

Những tác nhân gây bệnh chính gồm virus, vi khuẩn, động vật nguyên sinh, vi nấm; ngoài ra còn có viroid (hiện vật chủ là thực vật) và prion (gây tổn hại đến hệ thần kinh động vật) được xem như là hai tác nhân gây bệnh nguy hiểm đơn giản nhất (Campbell, 2008) Bệnh do virus và vi khuẩn gây ra

có tỉ lệ tử vong cho vật chủ cao hơn so với các tác nhân gây bệnh khác Hiện chưa có một loại thuốc hay kháng sinh nào tác động hữu hiệu đến virus, chỉ

có thể chủng ngừa virus thông qua tiêm phòng vaccin

Virus gây độc vật chủ bằng cách tiết enzyme thủy phân làm ly giải màng

tế bào, hoặc bản thân lớp vỏ capsid của virus là độc tố có thể gây độc tế bào ảnh hưởng đến các quá trình sinh hóa trong tế bào

Hình thức sinh sản

Chu kỳ sinh tan: virus sẽ xâm nhập tế bào chủ thông qua thụ thể đặc

hiệu tồn tại trên tế bào chủ và tiêm vật chất di truyền (DNA, RNA) vào trong

tế bào chủ Virus sẽ trưng dụng hệ enzyme và nguyên vật liệu (dNTPs, ) của

tế bào chủ để sao chép (tạo vật chất di truyền) và phiên mã, dịch mã (tạo vỏ capsid) Hàm lượng vật chất di truyền và vỏ capsid đủ lớn, chúng sẽ tự đóng gói lại với nhau hoàn thiện thành các hạt virus hoàn chỉnh Sau quá trình đóng gói chúng sẽ làm chết tế bào bằng cách ồ ạt phá vỡ tế bào và di chuyển sang

các tế bào lân cận hay thay đổi trạng thái sinh lý của tế bào

Chu kỳ tiềm tan: virus sẽ chèn vật chất di truyền của chúng vào trong

hệ gen tế bào chủ và cùng sao chép, phiên mã, dịch mã với hệ gen tế bào chủ Virus ở dạng tiềm tan sẽ không gây chết đến tế bào Bên cạnh đó, khi gặp một

số điều kiện kích thích nhất định, virus ở dạng tiềm tan sẽ chuyển sang dạng sinh tan và làm chết tế bào

1.1.2.2 Vi khuẩn

Vi khuẩn được xem như là bậc thầy về khả năng thích nghi từ

Deinococcus radiodurans có thể sống ở bức xạ 3 triệu rads đến Picrophilus oshimae sinh trưởng ở pH 0.03 (Campbell, 2008) Một số vi khuẩn có khả

năng hình thành nội bào tử khi gặp điều kiện môi trường bất lợi Vi khuẩn hay còn gọi là vi trùng (sinh vật nhân sơ) vừa là sinh vật gây hại vừa là sinh vật có ích hoặc trung lập, vi khuẩn gây hại phần lớn là những vi khuẩn có dạng sống

dị dưỡng (ký sinh) và có ích gồm các dạng sống cộng sinh (hệ vi sinh đường ruột, ) hoặc một số vi khuẩn có dạng sống tự dưỡng Vi khuẩn có cấu tạo phức tạp hơn virus, gồm màng tế bào, vùng nhân, plasmid và ribosome

Hệ gene vi khuẩn có từ vài trăm đến vài nghìn gene Có 3 hình dạng phổ biến gồm hình cầu, hình que và hình xoắn Dựa vào cấu trúc trên bề mặt tế bào, vi khuẩn có thể được chia làm 2 loại gồm khuẩn Gram (-) và khuẩn Gram (+) Bên cạnh khả năng kháng kháng sinh nhờ cấu trúc màng ngoài, vi khuẩn còn có plasmid R (DNA sợi đơn, dạng vòng) là một loại plasmid chứa các gen kháng kháng sinh

Khả năng sinh sản nhanh chóng là một ưu thế của vi khuẩn, vi khuẩn sinh sản bằng cách phân đôi, từ một tế bào mẹ tạo thành hai tế bào con y hệt nhau và cứ thế chúng tiếp tục phân đôi Trong những điều kiện tối thích hợp, nhiều chủng vi khuẩn cứ 1-3 tiếng lại phân chia, một số loài có thể tạo ra thế

hệ mới chỉ trong thời gian 20 phút

Vi khuẩn gây bệnh bằng cách tạo ra các chất độc gồm ngoại độc tố và nội độc tố Ngoại độc tố là các protein được tiết ra bởi vi khuẩn như độc tố botulinum được tạo ra thông qua lên men nhiều loại thức ăn Nội độc tố là các thành phần lớp màng ngoài lipopolysaccharide của nhóm khuẩn Gram (-)

Hình thức sinh sản của nhóm động vật nguyên sinh khá là phức tạp, một

số chỉ sinh sản vô tính, số khác còn có thể sinh sản hữu tính hoặc ít nhất sử dụng các quá trình hữu tính của giảm phân và thụ tinh Hoặc vừa sinh sản vô

tính vừa sinh sản hữu tính Chi Eimeria thuộc nhóm động vật nguyên sinh vừa

sinh sản hữu tính vừa sinh sản vô tính

Động vật nguyên sinh gây bệnh bằng cách phá hủy tế bào, mô hay các tổ chức cơ quan bằng enzyme thủy phân, các ngoại tiết tố làm mất cân bằng nội môi và ly giải màng tế bào

1.2 Bệnh viêm ruột hoại tử (NE) ở gà và lợn

NE là bệnh nhiễm trùng ruột cấp tính; bệnh gây ra bởi vi khuẩn

Clostridium perfringens, do mức độ hiện diện cao của C perfringens trong

môi trường bên trong lẫn bên ngoài cơ thể dẫn đến bệnh khá phổ biến trên khắp thế giới và bệnh có tỷ lệ tử vong cao trong đàn

C perfringens là một loại vi khuẩn gần như có mặt ở khắp mọi nơi, từ

trong đất, bụi, thức ăn cho đến đường ruột của động vật Bệnh xảy ra do sự thay đổi hệ vi sinh đường ruột hoặc một tình trạng dẫn đến tổn thương niêm

mạc ruột (chẳng hạn, bệnh cầu trùng, hay nhiễm khuẩn Salmonella thường là

những tác nhân chính dẫn đến viêm ruột hoại tử) Tóm lại, bất cứ yếu tố nào

thúc đẩy sự phát triển quá mức của C perfringens trong đường ruột cũng làm

xuất hiện bệnh viêm ruột hoại tử (Vijay Durairaj, 2007)

1.2.1 Một số hiểu biết về vi khuẩn Clostridium perfringens

Vi khuẩn Clostridium perfringens (thuộc giống Clostridium) được phát

hiện đầu tiên vào năm 1892, với tên gọi lúc đầu là Bacillus aerogenes capsulatus Sau này, vi khuẩn được đổi tên thành Bacillus enteritidis sporogenes, Bacillus perfringens, Bacterium welchii và Clostridium welchii Mặc dù tên gọi không chính thức là C welchii, nhưng được sử dụng từ năm 1939 và hiện nay vẫn có thể

tìm thấy trong cách viết của người Anh Từ năm 1980, tên khoa học chính thức

của vi khuẩn là Clostridium perfringens (C perfringens)

Phân loại khoa học

Tên khoa học: Clostridium perfringens (C perfringens)

1.2.1.1 Phân loại các typ độc tố

Trong quá trình sinh trưởng, C.perfringens sản sinh hơn 17 loại độc tố

khác nhau, dựa vào khả năng sản sinh 4 loại độc tố chính là độc tố alpha (a),

beta (β), epsilon (ε), lota (ι) các chủng vi khuẩn C.perfringens được phân

thành 5 typ khác nhau, gọi là typ độc tố (toxinotype: A, B, C, D, E) Typ A sinh độc tố α; typ B sinh độc tố α, β, ε; typ C sinh độc tố α, β; typ D sinh độc

tố α, ε; typ E sinh độc tố α, ι (xem bảng 1)

Bảng 1.1: Các typ độc tố chính của vi khuẩn C perfringens

C perfringens typ A thường có ở trong đường ruột của gà, lợn khoẻ với

số lượng nhỏ, khi gặp những điều kiện bất lợi như thay đổi chế độ chăm sóc nuôi dưỡng, mật độ chăn nuôi cao hoặc nhiễm cầu trùng, vi khuẩn nhân lên nhanh chóng và sản sinh độc tố (chủ yếu là độc tố α) gây viêm ruột hoại tử

C perfringens typ C hiếm khi phân lập được từ gà khỏe, lợn khỏe và

độc tố α và β được xác định là yếu tố độc lực chủ yếu trong quá trình sinh

bệnh của C perfringens typ C

Type là C perfringens A và C perfringens C liên quan đến khả năng gây bệnh trên gia cầm của chi C perfringens (H To, 2017) C perfringens không

hoạt động trên 74oC và dưới 4oC

Ở nước ta, C.perfringens typ A và D đóng vai trò quan trọng trong bệnh

viêm ruột tiêu chảy ở dê, cừu, trâu, bò; một số chủng có độc lực rất mạnh (Lê Lập và cs, 2009; Nguyễn Quang Tính, 2008; Huỳnh Thị Mỹ Lệ, 2010)

1.2.1.2 Đặc điểm hình thái

C perfringens là vi khuẩn yếm khí không triệt để (thường phải bổ sung

2 - 10% CO2), không di động, hình thành giáp mô trong mô bào; là trực khuẩn

to, thẳng, hai đầu tròn, đứng riêng lẻ hoặc thành đôi, có kích thước từ 0,6 - 0,8

x 2 - 4 µm, bắt màu Gram dương Có dạng hình que và sinh nội bào tử yếm khí có khả năng gây bệnh ở vật nuôi, động vật hoang dã và ở người Khuẩn lạc tròn, nhẵn và bóng được bao bởi một vòng bên trong dung huyết hoàn toàn ( do độc tố beta) và một vòng bên ngoài không dung huyết hoàn toàn( do độc tố alpha) Người ta gọi hiện tượng này là hiện tượng dung huyết beta trên môi trường nuôi cấy có bổ sung máu động vật

Hình 1.1: Clostridium perfringens qua kính hiển vi 1.2.2 Yếu tố ảnh hưởng đến bệnh viêm ruột hoại tử ở gà và lợn

1.2.2.1 Chế độ dinh dưỡng

Chế độ ăn uống tạo thành một yếu tố nguy cơ chính có tác động mạnh mẽ đến tỷ lệ mắc bệnh viêm ruột hoại tử ở gà công nghiệp Protein chế độ ăn khó tiêu, chẳng hạn như protein có trong động vật như thịt và bột xương hoặc bột cá, không thể được tiêu hóa và hấp thụ ở phần trên của đường ruột Thay vào đó, protein tích tụ ở phần dưới của đường ruột, sau đó có thể hoạt động như một chất nền cho hệ vi sinh vật đường ruột Quá trình lên men của protein tạo ra các sản phẩm sản phẩm phụ gây bất lợi cho đường ruột như amin, amoniac, tạo điều kiện thuận lợi cho sự tăng sinh của vi khuẩn gây bệnh

Một loạt các thành phần thức ăn và các yếu tố tiêu hóa có thể khiến vật nuôi bị viêm ruột hoại tử, bao gồm:

 Protein khó tiêu hóa

 Viêm ruột / kích thích / tổn thương

 Chế độ ăn nhiều chất xơ, tăng trưởng nhanh, năng lượng cao, độ nhớt cao và chế độ ăn giàu protein

 Axit amin (mức độ thấp Arginine và glutamine)

 Mức độ cao của axit lactic

1.2.2.2 Độc tố nấm mốc

Mycotoxin - chất chuyển hóa nấm độc hại Độc tố nấm mốc hay còn gọi là độc tố chuyển hóa thứ cấp được sản xuất bởi một số loại nấm mốc phổ biến lẫn trong khẩu phần ăn của gia cầm có thể trực tiếp làm giảm tính toàn

vẹn của ruột Do đó dẫn đến giảm hấp thu và tiêu hóa các chất dinh dưỡng trong chế độ ăn uống và tăng tính thấm ở ruột, hậu quả là làm mất chức năng của hàng rào biểu mô ruột Giảm sự hấp thu chất dinh dưỡng và rò rỉ protein huyết tương vào lòng do sự vi phạm này dẫn đến tăng nồng độ protein trong

lòng ruột, tạo cơ chất cho sự tăng sinh C perfringens

Mycotoxin cũng ảnh hưởng xấu đến khả năng miễn dịch và có mối tương quan chặt chẽ với nhiễm trùng đường ruột Với vô số tác hại của mycotoxin, phát triển một quy trình kiểm soát tác hại của độc tố mycotoxin là điều cần thiết để bảo vệ sự toàn vẹn của đường ruột trong lĩnh vực chăn nuôi nói riêng và y tế nói chung

Sự ô nhiễm của thức ăn ở gà công nghiệp với độc tố nấm Fusarium như deoxynivalenol hoặc fumonisin hoặc sự kết hợp của cả hai là một yếu tố ảnh hưởng đến viêm ruột hoại tử ở gà thịt

1.2.2.3 Bệnh cầu trùng

Những trường hợp nhiễm trùng cầu trùng phần lớn là do sự thay đổi của các yếu tố tự nhiên (nhiệt độ, độ ẩm, ) Bên cạnh đó, vaccine cũng là nguyên nhân gây nhiễm cầu trùng nếu không được sử dụng đúng cách (chẳng hạn như tình trạng sức khỏe của vật chủ khi được tiêm phòng) hoặc sử dụng những vaccine không đạt tiêu chuẩn Bệnh cầu trùng thường dẫn đến những tổn thương ở biểu mô ruột, chính những tổn thương này gây ra sự mất cân bằng nội môi bên trong cơ quan ruột, tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển

của C perfringens Sự tăng sinh mất kiểm soát của C perfringens dẫn đến

bệnh viêm ruột hoại tử ở vật chủ mắc phải

1.2.2.4 Paratyphoid

Nhiễm khuẩn Salmonella thyphimurium ở gà con là yếu tố ảnh hưởng

đáng kể đối với viêm ruột hoại tử ở gà thịt

1.2.3 Bệnh viêm ruột hoại tử trên gà

Viêm ruột hoại tử thường thấy ở gà thịt 2 đến 5 tuần tuổi được nuôi trên lứa và ở gà tây 7 đến 12 tuần tuổi Bệnh sẽ tồn tại trong đàn từ 5 đến 10 ngày, gây tử vong từ 2% đến 50% (Cẩm nang thú y Merck, 1998)

Viêm ruột hoại tử thường được mô tả ở gà thịt Tuy nhiên, các lớp và

gà tây cũng bị ảnh hưởng bởi tình trạng này (Broussard et al., 1984; Gazdzinski và Julian, 1991; Droual et al., 1994, 1995; Dhillon et al., 2004)

1.2.3.1 Triệu chứng lâm sàng

Viêm gan và viêm đại tràng liên quan đến viêm ruột hoại tử đã được

mô tả (Randal et al, 1983; Hutchincon và Ridell 1990, Loveland và Kaldhusdal 1999; Sasaki et al 2000) Viêm đường mật gây ra bởi thắt ống mật

và viêm C perfringens (Onderka et al 1990, và Sasaki et al 2000), viêm gan hoại tử do C perfringens ở gà con mới nở (Sasaki et al 2003), viêm túi mật, lá

lách và mề cũng có thể xảy ra

Bệnh có 02 dạng độc lực gồm: dạng độc lực cao có các triệu chứng như trầm cảm nặng, bỏ ăn, tiêu chảy sẫm màu và lông xù, tỷ lệ chết cao Triệu chứng ở dạng độc lực thấp thường không mấy rõ ràng, chúng chỉ ủ rũ, ăn ít, lông xù và giảm sản lượng trứng (Vijay Durairaj, 2007)

Thời gian ủ bệnh từ 6 đến 24 (thường là 10-12) giờ sau khi ăn thực phẩm

bị ô nhiễm, bệnh kéo dài từ 5 – 10 ngày, tỉ lệ tử vong 2 – 50%

Bệnh xảy ra với thể cấp tính và thể mãn tính Thể cấp tính gà bệnh giảm

ăn, chậm chạp, ỉa phân khô có màu đen, đôi khi lẫn máu và nhầy gần giống triệu chứng bệnh Cầu trùng Gà hay nằm sấp gục đầu, xã cánh, không thể tự đứng và di chuyển Trong thể mãn tính triệu chứng lâm sàng không điển hình

Gà chậm lớn, giảm cân, trong khi vẫn ăn uống bình thường và bị chết do gầy Bệnh xảy ra ở thể cấp tính với tỷ lệ mắc bệnh và tỷ lệ chết cao Bệnh có tính dịch địa phương, và thường xảy ra ở đàn gà thịt 4-8 tuần tuổi

1.2.3.2 Bệnh tích trên gà

Gà nhiễm bệnh viêm ruột hoại tử thường có những biểu hiện như sau:

- Gà gầy ốm

- Niêm mạc đường ruột sưng có nhiều đốm đỏ tấy, xuất huyết thành vệt, thành mảng Rất nhiều trường hợp khi mổ ra đã thấy các vùng viêm hoại tử tạo vết loét hoặc đám loét phủ một lớp màu vàng ngà

- Đặc biệt ở phần ruột già, chất chứa trong đường tiêu hóa có màu đậm, dính chặt và thối

- Bệnh viêm loét kéo dài có thể thủng ruột, phân tràn ra ngoài gây viêm dính phúc mạc

- Gan, lách không to nhưng màu sắc lại thay đổi Màu của gan có thể thâm hoặc vàng hơn bình thường.Trên bề mặt gan có nhiều điểm lấm tấm hoại tử màu vàng

- Thân và lách sưng to biến màu, khó quan sát được các điểm hoại tử

1.2.3.3 Đường truyền bệnh

Vi khuẩn C perfringens là một loại vi khuẩn yếm khí sống trong đường

ruột và ít gây bệnh cho gà nếu không có các yếu tố thúc đẩy

Các yếu tố nguy cơ stress có hại như gà quá đói, quá khát, thay đổi đột ngột nguồn thức ăn, nước uống, thức ăn bị ôi thiu, nấm mốc làm thay đổi môi sinh trong đường ruột như cầu trùng, giun sán, rối loạn tiêu hóa Hay do chuồng trại ẩm thấp, chất độn chuồng không sạch không khô, cắt mỏ, Những

lí do đó rất có lợi cho việc phát triển C perfringens và gây bệnh

Nguy hiểm hơn là một số chủng có khả năng sinh tồn cao, ô nhiễm bên ngoài trường, các dụng cụ thiết bị và con người vì lí do đó mang mầm bệnh vào đàn gà thì bệnh xảy ra với quy mô lớn

1.2.1.4 Cơ chế sinh bệnh

Cũng giống như vi khuẩn E.coli, vi khuẩn C perfringen kí sinh bình

thường trong đường ruột mà không gây bệnh Chúng tham gia vào quá trình lên men, phân hủy thức ăn giúp gà đồng hóa và tăng trưởng tốt Thế nhưng khi có các bệnh và các yếu tố thúc đẩy(đã nêu trên) làm cho nhu động đường

ruột thay đổi và tạo điều kiện thuận lợi cho C perfringens sinh trưởng nhanh,

phá vỡ thế cân bằng vi sinh có lợi cho vật chủ

Trên cơ sở của rối loạn tiêu hóa, hoặc các bệnh cầu trùng, giun sán,… đã

phá vỡ cấu trúc niêm mạc ruột tạo điều kiện cho C perfringens bám vào long

mao niêm mạc ruột gây viêm xuất huyết hoại tử ruột Chúng không dừng lại ở

đây mà tiếp tục vào đường huyết gây nên hiện tượng nhiễm trùng máu C perfringens không thể tồn tại quá lâu trong môi trường của dịch thể máu, cơ thể

chúng sẽ bị phân hủy nhanh chóng sau khi chết và giải phóng nội độc tố vào vật chủ, dẫn đến tình trạng bệnh của vật chủ trở nên trầm trọng hơn hoặc tử vong

1.2.4 Bệnh viêm ruột hoại tử trên lợn

Bảng 1.2: Các type Clostridium perfringens gây bệnh

viêm ruột hoại tử ở lợn

Clostridium perfringens type A Viêm ruột hoại tử (sinh ngoại độc tố) Clostridium perfringens type C Viêm ruột hoại tử xuất huyết

Clostridium difficile Viêm đại tràng

1.2.4.1.Triệu chứng lâm sàng

Thể quá cấp tính: xảy ra rất nhanh trong vòng 8 giờ đầu tiên sau khi sinh, heo con trở nên yếu ớt dần dần rồi chết Thường không biểu hiện triệu chứng

gì bên ngoài, đôi khi quan sát sẽ thấy tiêu chảy ra máu

Thể cấp tính: thường thấy trên heo con khoảng 2 – 5 ngày tuổi Dấu hiệu đầu tiên là chết bất thình lình và kèm theo tiêu chảy ra máu, bệnh xảy ra rất nhanh, heo chết nhanh sau khi tiêu chảy ra máu Heo con đi ngoài phân thường có màu nâu đỏ, ngà vàng, phân có chứa những mảng nhầy do niêm mạc ruột hoại tử hoặc màu nâu vàng có bọt, heo con trở nên yếu dần rồi chết sau 2 – 3 ngày mắc bệnh

Thể mãn tính: Lợn tiêu chảy dai dẳng khoảng hơn một tuần Phân nhiều nước, màu vàng xám có lẫn chất nhày Heo gầy còm nhợt nhạt, có thể chết sau vài tuần hoặc còi cọc sau khi khỏi triệu chứng

1.2.4.2 Bệnh tích trên lợn

Lợn nhiễm bệnh viêm ruột hoại tử thường có những biểu hiện cụ thể như sau:

- Heo con gầy còm, yếu ớt rõ rệt trước khi chết

- Phù vùng bụng

- Cả hệ thống tiêu hoá ở heo con xung huyết hoặc xuất huyết

- Ruột non xuất huyết, thành ruột non mỏng, chứa đầy khí, sinh hơi thường ở vùng không tràng và hồi tràng

- Ruột già giãn, nhợt nhạt, chất chứa nhão

- Tổn thương niêm mạc (màu đỏ hoặc màu đen), với xuất huyết dữ dội

và bọt khí (hoặc sợi huyết + bọt khí)

- Hạch bạch huyết màng treo ruột sung huyết hay xuất huyết

- Biểu mô có thể bị hoại tử, xuất huyết khắp niêm mạc và lớp dưới niêm

1.2.4.3 Đường truyền bệnh

Bệnh có thể lan truyền qua đường tiêu hóa, thông qua nguồn nước và thực phẩm bị ô nhiễm Do vi khuẩn Clostridium perfringens , chúng sống

trong ruột già của heo mọi lứa tuổi Bình thường Clostridium perfringens hiện

diện ở các cơ quan tiêu hoá của tất cả các heo con trước khi cai sữa

Vi khuẩn xâm ngập vào heo qua những tổn thương trên da và tổ chức mô, cơ dưới da, đặc biệt trong giai đoạn nái nuôi con là nguồn truyền bệnh cho heo con Nếu chăm sóc nuôi dưỡng không tốt, yếu tố ngoại cảnh xấu, sức đề kháng của heo con yếu vì thể heo con dễ phát bệnh

1.2.4.4 Cơ chế gây bệnh

Vi khuẩnC perfringens có trong hệ vi sinh vật đường ruột bình thường

của động vật Vì vậy thường có 2 yếu tố gây nên bệnh tiêu chảy ở gia súc: thứ nhất là do vi khuẩn sẵn có trong đường ruột, thứ hai là do thức ăn bị nhiễm

khuẩn C perfringens, cùng với một số thay đổi đột ngột về môi trường, khẩu

phần thức ăn, thức ăn chứa nhiều protein, dẫn tới cơ thể bị giảm hấp thu ruột, giữ lại vi khuẩn trong cơ thể và cuối cùng thì cơ thể hấp thu các độc tố

gây bệnh Cacbon hydrate không tiêu hóa được là môi trường thuận lợi cho vi

khuẩn C perfringens sinh trưởng và phát triển nhanh chóng

Bình thường vi khuẩn này có nhiều ở ruột già nhưng khi sức đề kháng của cơ thể giảm, vi khuẩn lại xâm nhập lên ruột non và sản sinh ra một lượng lớn độc tố, gây nhiễm độc huyết đường ruột Trong đường tiêu hóa, với sự bội

nhiễm về số lượng, vi khuẩn C perfringens tấn công vào lớp màng nhầy rồi

vào lớp biểu mô ruột, dưới tác dụng của độc tố gây xuất huyết, hoại tử tổ chức nhung mao ruột, từ đó lan dần vào sâu tới các lớp niêm mạc ruột Trong nhiều trường hợp, vi khuẩn xâm nhập sâu vào thành ruột tạo thành những ổ viêm nhiễm, gây khí thũng dưới lớp niêm mạc hoặc lớp cơ hay đi sâu vào trong các

tổ chức hay các hạch lympho lân cận

1.2.4.5 Chẩn đoán bệnh

Chẩn đoán sơ bộ thông qua các tổn thương có thể quan sát được và nhuộm Gram, từ đó rút ngắn phạm vi và tiến hành làm tan máu do

C.perfringens có khả năng làm tan máu Hoặc có thể chẩn đoán bằng cách

nuôi cấy trên một số môi trường thích hợp và kiểm định kết quả thông qua phương pháp hóa sinh,

1.3 Một số phương pháp chẩn đoán bệnh truyền nhiễm trên gia súc, gia cầm

1.3.1 Phương pháp truyền thống

1.3.1.1 Hóa sinh phân tích

Hóa sinh phân tích là phương pháp định tính và định lượng các sản phẩm

do tác nhân gây bệnh tiết ra Phương pháp này xác định tác nhân gây bệnh bằng cách đưa vào môi trường nuôi cấy các hợp chất tương ứng để các enzyme mà những tác nhân gây bệnh tiết ra sẽ phân giải hoặc chuyển hóa các hợp chất đó, người làm thí nghiệm thu nhận kết quả thông qua xử lý những dữ liệu thu được Phương pháp này chủ yếu được sử dụng trên vi khuẩn và vi nấm, những vi sinh vật có dạng sống tự dưỡng

1.3.1.2 Chẩn đoán bệnh dựa trên đặc điểm lâm sàng và bệnh lý

Trong quá trình mang bệnh, vật chủ sẽ biểu hiện một số triệu chứng (đáp ứng của cơ thể chống lại tác nhân lạ) nhất định do sự ảnh hưởng của các tác nhân gây bệnh (nội độc tố, ngoại độc tố, ) mang đến Mặt khác, sự kéo dài thời gian mang bệnh sẽ hình thành những tổn thương và những vết bệnh tích trên một số mô và cơ quan bị nhiễm bệnh; hình dạng, màu sắc, kích thước vết bệnh tích phụ thuộc vào tác nhân gây bệnh Dựa vào những yếu tố trên, người làm công tác chẩn đoán bệnh có thể chẩn đoán sơ bộ cá thể, quần thể đó nhiễm bệnh do tác nhân nào gây ra, nhưng độ chính xác thì không được đảm bảo

1.3.1.3 Chẩn đoán bệnh dựa trên cấu tạo và hình thái bằng kính hiển vi

Chẩn đoán bệnh dựa trên cấu tạo và hình thái là phương pháp quan sát hình thái và đặc điểm cấu tạo của các tác nhân gây bệnh thông qua kính hiển

vi quang học, từ kết quả quan sát người làm thí nghiệm có thể nhận dạng tác nhân gây bệnh và tình trạng bệnh nhiễm Phương pháp này thường được dùng trong chẩn đoán bệnh do ký sinh trùng gây ra, phần lớn các ký sinh trùng có đường kính khá lớn nên dễ dàng quan sát dưới kính hiển vi hơn các tác nhân còn lại Ưu điểm của phương pháp này là giá thành thấp, đơn giản và tiết kiệm thời gian Nhược điểm là hình thái, kích thước của một số phân loài trong cùng một chi có độ tương đồng cao nên khó mà phân biệt chính xác

1.3.2 Phương pháp hiện đại

1.3.2.1 Phản ứng huyết thanh học ELISA

ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay – Xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme) dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, trong đó kháng thể được gắn với một enzyme

Phương pháp này được thiết kế cho việc phát hiện và định lượng vật chất như peptide, protein, kháng thể, hormone ELISA được dùng để xác định nhiều tác nhân gây bệnh như virus, vi khuẩn, nấm, ký sinh trùng

Kĩ thuật ELISA gồm 3 thành phần tham gia phản ứng (kháng thể, kháng

nguyên và cơ chất - chất tạo màu), kĩ thuật được tiến hành qua hai bước:

- Phản ứng miễn dịch học: là sự kết hợp giữa kháng thể và kháng nguyên

- Phản ứng hóa học: sau khi sự kết hợp giữa kháng thể và kháng nguyên diễn ra, quan sát và đọc kết quả thông qua hoạt tính xúc tác của enzyme làm giải phóng oxy nguyên tử O từ H2O2 để oxy hóa cơ chất chỉ thị màu, do đó làm thay đổi màu của hỗn hợp trong dung dịch thí nghiệm

Phân loại ELISA

ELISA trực tiếp: kháng nguyên cần phát hiện được gắn trực tiếp với giá

thể và sẽ được phát hiện bằng một kháng thể duy nhất (kháng thể đã được gắn enzyme) Tuy nhiên độ đặc hiệu bị giới hạn vì thường kháng nguyên có ít nhất

2 epitop, trong khi đó ở dạng này chỉ sử dụng một kháng thể

ELISA gián tiếp: kháng nguyên cần phát hiện gắn vào giá thể sau đó

được kết hợp với kháng thể đặc hiệu (không được gắn enzyme), cuối cùng chúng sẽ được ủ với kháng kháng thể (có gắn enzyme) hình thành phức trên giá thể KN-KT-KKT Nhược điểm độ đặc hiệu của từng kháng huyết thanh (kháng kháng thể) là khác nhau Do đó cần phải thử nghiệm với nhiều kháng huyết thanh khác nhau để có kết quả tin tưởng được

ELISA Sandwich trực tiếp: “Sandwich” là do kết quả thí nghiệm được

đánh giá thông qua sự kết hợp của hai loại kháng thể là kháng thể bắt (capture antibodies) và kháng thể phát hiện (detection antibodies) ELISA Sandwich gồm sự dính thụ động của kháng thể bắt vào pha rắn, những kháng thể này sau đó được kết hợp với kháng nguyên, rồi bổ sung kháng thể phát hiện (có gắn enzyme) vào phức KT-KN

ELISA Sandwich gián tiếp: Ngoài phức KT-KN-KT(không gắn

enzyme) như ELISA sandwich trực tiếp, ở dạng gián tiếp sẽ được bổ sung kháng kháng thể (được gắn enzyme) kết hợp với phức KT-KN-KT hình thành

phức KT-KN-KT-KKT

Hạn chế của phương pháp ELISA

- Không phản ánh chính xác độc lực của chủng virus phân lập

- Kết quả chẩn đoán là dương tính giả (kháng thể từ mẹ và thức ăn ảnh hưởng đến kết quả)

- Kết quả chẩn đoán là âm tính giả (bệnh ở giai đoạn mới nhiễm)

1.3.2.2 Phản ứng miễn dịch huỳnh quang IFA

Phương pháp IFA (Immunoflourescence Assays - Xét nghiệm miễn dịch huỳnh quang) là phương pháp dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng thể và kháng nguyên, cùng với một số yếu tố khác như là chất đánh dấu huỳnh quang (thường là FITC – Flourescein Isothiocynate), nguồn sáng huỳnh quang (tia UV) Đồng dạng với kỹ thuật ELISA, phức chất xuất hiện màu chứng tỏ mẫu ta chẩn đoán là dương tính (không loại trừ khả năng nhận dương tính giả)

Ở kĩ thuật này, kháng thể sẽ được gắn với kháng nguyên đã đánh dấu huỳnh quang, khi phức KT – KN – Chất đánh dấu huỳnh quang, được kiểm tra dưới kính hiển vi bằng nguồn sáng UV, phức sẽ phát sáng

Phản ứng miễn dịch huỳnh quang trực tiếp: sử dụng duy nhất một

kháng thể đã được liên kết hóa học với flourophore, kháng thể sẽ nhận dạng kháng nguyên đích và hình thành liên kết tại thụ thể đặc hiệu, hay còn gọi là epitop Sau đó, ta có thể quan sát thấy được những bước sóng cụ thể khi bị kích thích dưới kính hiển vi huỳnh quang Nhược điểm: ít nhạy hơn so với phản ứng gián tiếp, và tốn kém

Phản ứng miễn dịch huỳnh quang gián tiếp: sử dụng một kháng thể và

một kháng huyết thanh (kháng kháng thể), kháng thể sẽ tạo liên kết với kháng nguyên đích, kháng kháng thể đã được gắn flourophore sẽ hình thành liên kết với kháng thể Nhược điểm: phức tạp, mất nhiều thời gian

1.3.2.3 Phát hiện trình tự DNA đặc hiệu bằng lai với mẫu dò acid nucleic

Phương pháp lai với mẫu dò axit nucleic là phương pháp cho phép người làm thí nghiệm xác định một trình tự DNA đặc hiệu từ hỗn hợp nhiều phân tử

DNA khác nhau Ở đây, các tế bào sẽ được đưa lên một màng nylon, màng nylon này sau đó sẽ được xử lý để phá vỡ tế bào và biến tính DNA nhằm thu được các mạch đơn DNA dính kết trên màng Sau đó màng được ủ trong dung dịch chứa phân tử mẫu dò đánh dấu phóng xạ có trình tự bổ sung với gen đích Màng sau đó được đặt lên phim cho phép điểm phát phóng xạ tự chụp

1.3.3 Chẩn đoán bằng kĩ thuật PCR

Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction – Phản ứng chuỗi trùng hợp)

là kĩ thuật cho phép người làm thí nghiệm khuếch đại đoạn nucleotide đích (DNA hay RNA) mà không qua tạo dòng, nhằm mục đích lưu trữ hay sử dụng trong lĩnh vực sinh học phân tử Phương pháp này được Kary Mullis đưa ra năm 1985 và Saiki hoàn thiện năm 1988

Kỹ thuật PCR có thể được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực: chẩn đoán, xét nghiệm các tác nhân vi sinh vật gây bệnh, xác định giới tính của phôi,

Nguyên tắc của kỹ thuật PCR

Kỹ thuật PCR là một phương pháp tổng hợp DNA dựa trên mạch khuôn

là một trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng bản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme polymerase và một cặp mồi (primer) đặc hiệu cho đoạn DNA này Primer là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một mạch của đoạn DNA khuôn

và nhờ hoạt động của DNA polymerase đoạn primer này được kéo dài để hình thành mạch mới (trích dẫn bởi Hồ Huỳnh Thuỳ Dương, 2003)

Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lăp lại nối tiếp nhau Mỗi chu kỳ gồm

3 bước như sau :

Bước 1: (Biến tính tách đôi sợi DNA, denaturation)

Tiến hành gia nhiệt để tách sợi DNA kép thành 2 sợi đơn

Bước 2: (bắt cặp, annealing)

Mồi sẽ bắt cặp bổ sung với những sợi DNA đơn theo chiều 5' → 3' khi

ủ ở trong điều kiện nhiệt độ thích hợp

Bước 3: (kéo dài, elongation – extension)

DNA polymerase sẽ trượt trên phức mồi – DNA sợi đơn để bắt cặp các loại Nu tương thích vào sợi DNA, hoàn thiện sợi DNA kép

1.3.3.1 Tối ưu hóa phản ứng PCR

a) Thành phần của phản ứng PCR

DNA khuôn

Sử dụng các mẫu DNA chất lượng cao, DNA được tinh khiết nhất có thể Nồng độ khuôn DNA từ 30 – 50ng (cho phản ứng 25µl), độ tinh khiết DNA tốt nhất là 1.77 – 1.89 (OD 260-280nm) Trong phản ứng PCR, nồng độ DNA cao có xu hướng làm giảm tính đặc hiệu của đoạn DNA đích được khuếch đại

Mồi (Primer)

Mồi là một đoạn oligonucleotide ngắn, được sử dụng nhiều trong các kỹ thuật như chẩn đoán, phân loại, giải trình tự, Các đoạn mồi với vai trò là bắt cặp bổ sung với một đoạn gene hoặc một đoạn DNA (RNA) đích, từ đó người làm thí nghiệm có thể khuếch đại chúng theo chu kỳ PCR Chiều dài mồi nên

từ 17 – 28 bazơ nitơ Tỷ lệ G – C của đoạn mồi 50% – 60% Nhiệt độ nóng chảy (Tm) thường trong khoảng 55 – 65oC Nồng độ lý tưởng của mồi là 10pM

- MgCl2 là cofactor của DNA polymerase; nồng độ MgCl2 từ 1.0 – 2.0µM (tối đa là 5.0µM) đối với các phản ứng PCR

- Đệm (buffer) đóng vai trò là dung dịch đệm tạo môi trường tối ưu cho phản ứng PCR