Nghiên cứu trích ly flavonoid và xác định hàm lượng vitamin c trong hoa súp lơ xanh

LỜI CẢM ƠN Sau khi kết thúc khóa học tại Viện Công Nghệ Sinh Học Lâm Nghiệp, Trường Đại Học Lâm Nghiệp Việt Nam, được sự giúp đỡ của quý thầy cô trong Viện, năm học 2018-2019 này em đã c

LỜI CẢM ƠN

Sau khi kết thúc khóa học tại Viện Công Nghệ Sinh Học Lâm Nghiệp, Trường Đại Học Lâm Nghiệp Việt Nam, được sự giúp đỡ của quý thầy cô trong Viện, năm học 2018-2019 này em đã có thể tiến hành làm bài khóa luận với đề

tài “ Nghiên cứu trích ly flavonoid và xác định hàm lượng vitamin C trong hoa Súp lơ xanh”

Đầu tiên em xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến cô giáo trực tiếp giúp em rất nhiều trong quá trình thực hiện khóa luận – Thạc sỹ Nguyễn Thị Thu Hằng, người đã định hướng và chỉ bảo em rất nhiều kiến thức và những điều em còn sai sót trong quá trình thực hiện, cô đã truyền đạt cho em rất nhiều kiến thức và những kinh nghiệm quý báu, cách tiếp cận với vấn đề, cách giải quyết những vấn đề đang còn bị khúc mắc

Ngoài ra để có thể hoàn thành tốt bài khóa luận này không thể không kể đến sự giúp đỡ của các Thầy Cô trong Viện Công Nghệ Sinh Học Lâm Nghiệp, Trường Đại Học Lâm Ngiệp Việt Nam, gia đình cũng như các bạn đã ở bên giúp

đỡ em rất nhiều trong quãng thời gian qua

Em xin chân thành cảm ơn đến Thầy Cô giáo và th.s Nguyễn Thị Hồng Nhung của Bộ môn Công nghệ Vi Sinh - Hóa Sinh đã hỗ trợ và tạo điều kiện cho em về trang thiết bị một cách tốt nhất để em có thể hoàn thành được khóa luận

Dù được sự chỉ bảo tận tình của ThS Nguyễn Thị Thu Hằng và các Thầy

Cô trong viện, cùng với sự nỗ lực của bản thân em đã cố gắng hoàn thiện khóa luận Tuy nhiên em trong quá trình thực hiện, em còn rất nhiều sai sót, kiến thức còn hạn chế Em kính mong nhận được sự đóng góp ý kiến đánh giá của Thầy

Cô để khoá luận của em được hoàn thiện hơn

Em xin chân thành cảm ơn

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

MỤC LỤC ii

DANH MỤC BẢNG iv

DANH MỤC HÌNH v

MỞ ĐẦU 1

1.1 Giới thiệu về cây Súp lơ xanh 2

1.1.1.Tên khoa học, nguồn gốc, phân loại 2

1.1.2 Đặc điểm hình thái 2

1.1.3 Thành phần dinh dưỡng của hoa Súp lơ xanh[5] 3

1.1.4 Tác dụng sinh học của hoa Súp lơ 5

1.2 Tổng quan về flavonoid 7

1.2.1 Khái niệm 7

1.2.2 Cấu trúc chung và phân loại 8

1.2.3 Tính chất lý hóa 13

1.2.4 Tính chất sinh học của flavonoid 14

1.3 Tình hình nghiên cứu, ứng dụng và sản xuất ở trong nước 16

1.4 Tình hình nghiên cứu, ứng dụng và sản xuất trên thế giới 17

CHƯƠNG 2 : NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1 Mục tiêu nghiên cứu 18

2.2 Nội dung nghiên cứu 18

2.3 Vật liệu nghiên cứu 18

2.3.1 Vật liệu thực vật 18

2.3.2 Vật liệu vi sinh vật 18

2.3.3 Môi trường nghiên cứu vi sinh vật 19

2.4 Thiết bị dụng cụ, hóa chất nghiên cứu 19

2.5 Phương pháp nghiên cứu 19

2.5.1 Xác định độ ẩm của hoa Súp Lơ 19

2.5.2 Yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết flavonoid 20

2.5.3 Xác định sự có mặt của flavonoid trong dịch chiết 23

2.5.4 Xác định hoạt tính kháng vi sinh vật của hợp chất flavonoid tách chiết từ hoa Súp lơ xanh 24

2.5.5 Xác định hàm lượng Vitamin C trong hoa Súp Lơ xanh 25

PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28

3.1 Xác định độ ẩm 28

3.2 Xác định loại dung môi thích hợp cho quá trình trích ly 29

3.3 Tách chiết flavonoid từ hoa Súp lơ xanh bằng phương pháp siêu âm và theo

quy trình ngâm chiết bằng ethanol 30

3.4 Tối ưu một số điều kiện trong quá trình tách chiết flavonoid từ hoa Súp lơ xanh 30

3.4.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu quả trích ly 30

3.4.2 Ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến khả năng trích ly 31

3.4.3 Ảnh hưởng của thời gian chiết bằng ethanol 32

3.4.4 Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu /dung môi ethanol 33

3.5.. Xác định sự có mặt của flavonoid trong cao chiết 34

3.5.1 Định tính flavonoid bằng phản ứng màu đặc trưng 34

3.5.2 Định tính flavonoid bằng sắc ký lớp mỏng 35

3.6 Xác định hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của flavonoid chiết suất từ hoa Súp lơ xanh 36

3.7 Xác định hàm lượng vitamin C 38

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 39

4.1 Kết luận 39

4.2 Kiến nghị 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Giá trị dinh dưỡng của hoa Súp lơ 5

Bảng 3.1 Độ ẩm của hoa Súp Lơ 28

Bảng 3.2 Trị số đo OD của dịch chiết cồn 29

Bảng 3.3 Kết quả tách chiết Flavonoid 30

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng trích ly 31

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của nồng ethanol độ đến hiệu suất trích ly 32

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của thời gian chiết bằng ethanol đến hiệu suất trích ly 33

Bảng 3.7 Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi ethanol đến hiệu suất trích ly 34

Bảng 3.8 Định tính xác định sự có mặt của flavonoid 34

Bảng 3.9 Tính kháng các chủng vi sinh vật kiểm định của dịch Flavonoid 37

Bảng 3.10 Hàm lượng viatamin C của hoa Súp lơ 38

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Cây Súp lơ xanh 2

Hình 1.2 Cấu trúc của flavonoid [2] 8

Hình 1.3 cấu tạo các flavonoid 9

Hình 1.4 Cấu tạo flavan 3,4 diol 9

Hình 1.5 Cấu tạo flavanon 10

Hình 1.6 Dẫn chất của taxifolin 10

Hình 1.7 cấu tạo appogenin và lutelin 11

Hình 1.8 Câu tạo flavon 3-ol 11

Hình 1.9 cấu tạo chalcon 11

Hình 1.10 Cấu tạo auron 12

Hình 2.1 Hoa Súp lơ 18

Hình 2.2: Sơ đồ quy trình chiết xuất flavonoid của hoa Súp lơ xanh theo phương pháp ngâm chiết 22

Hình 3.1 Hình ảnh hoa Súp Lơ trước (A) và sau khi sấy (B) 28

Hình 3.2 Dịch chiết các loại cồn 29

Hình 3.3 Định tính flavonoid trích ly từ hoa Súp lơ xanh 35

Hình 3.4 Kết quả chạy sắc ký bản mỏng flavonoid quan sát dưới ánh sáng thường và ánh sáng tử ngoại 36

Hình 3.5 Hoạt tính kháng một số chủng vi sinh vật kiểm định của Flavonoid chiết suất từ hoa Súp lơ xanh 37

MỞ ĐẦU

Từ hàng thế kỉ trước, con người chúng ta đã biết sử dụng thực vật vào rất nhiều lĩnh vực khác nhau, áp dụng trong nông nghiệp, công nghiệp và áp dụng vào y học như sử dụng thực vật có hoạt tính dược liệu để phòng và chữa bệnh

Hiện nay nhờ sự phát triển của khoa học công nghệ nên việc nghiên cứu

về các thành phần và hoạt tính dược liệu có trong thực vật ngày càng được thuận lợi và hiệu quả hơn Vấn đề sức khỏe con người ngày càng được đầu tư và phát triển hơn

Flavonoid là hợp chất có nhiều tác dụng trong y học: điều trị một số bệnh như viêm nhiễm, dị ứng, một số bệnh liên quan đến dạ dày giúp cơ thể chúng

ta điều hòa quá trình trao đổi chất, chống lão hóa, làm bền thành mạch máu, giảm hàm lượng cholesterol trong máu Flavonoid không chỉ có trong thực vật bậc cao mà còn xuất hiện trong những loại thực vật bậc thấp, là rất nhiều loại rau củ quả có chứa flavonoid và flavonoid có tính dược liệu, đến nay đã có khoảng 11000 hợp chất flavonoid được biết về cấu trúc và vẫn không ngừng nghiên cứu và tìm ra thêm nhiều cấu trúc khác

Flavonoid được phân lập từ rất nhiều nguồn thực vật khác nhau, là thực phẩm khá phổ biến và có hàm lượng flavonoid khá cao Hoa Súp lơ xanh là một loại thực vật thiên nhiên giàu flavonoid, có tác dụng làm chậm quá trình lão hóa

và làm cân bằng quá trình trao đổi chất trong cơ thể, kích hoạt hệ thống thải độc, bảo về tế bào loại bỏ các chất gây ung thư ra khỏi cơ thể

Việt Nam là một nước đa dạng sinh học, nguồn tài nguyên dồi dào là môi trường lý tưởng để trồng các loại rau củ quả Súp lơ xanh là loại cây chịu được lạnh (nhiệt độ thích hợp để trồng là từ 15-180C) thích hơp với khí hậu ở Việt Nam đặc biệt ở miền bắc và các vùng cao như Tây Nguyên, Đà Lạt, Lâm Đồng Hiện nay lĩnh vực nghiên cứu các hoạt tính sinh học có trong thực vật được các nhà khoa học quan tâm rất nhiều, nhận thấy sự quan trọng của loài tôi đã tiến

hành thu nhận flavonoid từ Sup lơ Xanh với đề tài khóa luận là “Nghiên cứu trích ly flavonoid và xác định hàm lượng vitamin C trong hoa Súp lơ xanh”

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

1.1 Giới thiệu về cây Súp lơ xanh

1.1.1.Tên khoa học, nguồn gốc, phân loại

Súp lơ xanh có tên tiếng Anh: Broccoli, tên khoa học: Brassica

oleracea.italica Plenck, thuộc họ thập tự: Cruciferaceae, thuộc nhóm Italica

Italia là nước đầu tiên sử dụng Súp lơ xanh làm rau khoảng 2000 năm về trước Cây trở thành loại rau thông dụng ở Mỹ sau khi giống Súp lơ Xanh

thương mại đầu tiên được thu hoạch ở Broollyn, New York Ngày nay Súp lơ xanh được trồng nhiều ở Anh, Châu Âu và Châu Á [10]

Hình 1.1 Cây Súp lơ xanh

Súp lơ xanh được chia phân loại thành 2 nhóm chính là:

Súp lơ đơn: Thường được trồng ở vụ sớm Giống cây có đặc điểm là lá nhỏ, dài trên mặt lá có lớp phấn trắng, mỏng, ngù hoa trắng, gạo nhỏ, mặt mịn, mỏng, ăn ngon, trọng lượng hoa phần sử dụng làm thực phẩm từ 1-2kg

Súp lơ kép: Thường được trồng ở vụ chính và muộn, cây thấp, trọng lượng hoa sử dụng làm thực phẩm từ 1,5-3kg, lá mỏng và bầu, màu nõn tía

1.1.2 Đặc điểm hình thái

Cây Súp lơ xanh có các đặc điểm hình thái như sau:

Hệ rễ: Cây thuộc loại rễ chùm, phân nhánh, khi bộ lá phát triển phía trên thì hệ rễ tiếp tục ăn sâu xuống đất các rễ ngang bắt đầu phát triển mạnh mẽ hơn,

Lá: Súp lơ có bộ lá phát triển, có cuống và mặt phiến lá rộng, có lớp bảo

vệ, lá xẻ thùy và chỉ số diện tích lá cao

Hoa: Hoa Súp lơ giống như các loại hoa của họ Thập tự, hoa tập trung thành chùm Hoa nở đầu tiên ở thân chính, sau đó nở tiếp ở cành cấp I rồi tiếp tục cấp II và cấp III Hoa nở từ dưới lên vào buổi sáng trong khoảng 8-10 giờ Hoa thường thụ phấn nhờ côn trùng, nhiệt độ thích hợp cho thụ phấn là 12-22ºC,

ở nhiệt độ dưới 10ºC sự xâm nhập của hạt phấn bị kìm hãm, còn ở nhiệt độ trên 30ºC thì hạt phấn xâm nhập nhanh nhưng khó thụ tinh Tính trạng chín sớm một năm là trội so với tính trạng hai năm và được kiểm tra bởi hàng loạt các gen chính

Quả: Quả Súp lơ thuộc dạng quả giác, có hai ngăn chứa hạt nằm dọc theo rãnh quả Tùy thuộc vào giống Súp lơ mà trong mỗi quả có số lượng hạt khác nhau Sau khi hoa nở được 3-4 tuần thì quả đạt kích thước lớn nhất và chuyển vào giai đoạn chín

Hạt: Hoa Súp lơ thường có dạng trứng hoặc hơi tròn, màu nâu hoặc hơi nâu xám, hoặc nâu đỏ [10]

1.1.3 Thành phần dinh dưỡng của hoa Súp lơ xanh[5]

Trong hoa Súp lơ xanh, nước chiếm khoảng 75-95% trọng lượng Nước chứa các chất dinh dưỡng vận chuyển vật chất từ cơ quan này sang cơ quan khác trong các tổ chức tế bào Khi lượng nước giảm, Súp lơ sẽ bị héo và vàng hoa, rút ngắn thời hạn bảo quản

Các thành phần chính có trong hoa Súp lơ xanh gồm:

Gluxit bao gồm: Các loại đường đơn, đường kép như sucrose, fructose, glucose, maltose, galactose.,

Các polysaccaride: tinh bột, celllulose,hemixenlulose

Tinh bột: lượng tinh bột trong hoa Súp lơ thấp khoảng 0,1% Dưới tác

dụng của môi trường acid hoặc enzyme, tinh bột bị phân giải thành dextrin,

maltose và glucose

Cellulose:

Trong hoa Súp lơ có khoảng 0,9% cellulose Phân bố trong khắp các cơ quan của hoa Súp lơ nhưng có nhiều nhất là ở lớp vỏ của cuống hoa Lượng cellulose trong Súp lơ càng nhiều thì hoa càng già, chất lượng càng thấp

Chất xơ

Chất sơ trong Súp lơ bao gồm cellulose, hemixenlulose, pectin chiếm khoảng 2,5%

Axit hữu cơ

Hàm lượng acid hữu cơ trong hoa Súp lơ thường nhỏ hơn 1%, có khả năng hạn chế tốc độ hoạt động của các enzyme gây biến màu các sản phẩm cắt

Vitamin

Trong Súp lơ xanh có rất nhiều vitamin nhưng nhiều nhất vẫn là vitamin

C còn gọi là axit ascorbic, tồn tại ở 3 dạng: Dạng tự do là acid ascorbic, dạng oxi hóa là hehydro ascorbic và dạng liên kết với protid là ascorbigen

Vitamin C bền vững trong môi trường axit và dễ bị thủy phân trong môi trường kiềm, O2, ánh sáng, nhiệt độ cao.Vitamin C là một trong những chất quý

có trong Súp lơ xanh

Ngoài ra, trong Súp lơ còn có các thành phần vitamin có giá trị cao như có chứa vitamin A, vitamin nhóm B, niacin, pantothenic, acid tartric và acid folic

Sau đây là bảng thành phần dinh dưỡng của hoa Súp lơ xanh

Bảng 1.1 Giá trị dinh dưỡng của hoa Súp lơ STT Thành phần dinh dưỡng Hàm lượng trong 100g

1.1.4 Tác dụng sinh học của hoa Súp lơ

Hoa Súp lơ xanh thường chứa rất nhiều hợp chất tốt cho sức khỏe như: Bảo vệ tế bào, chống lão hóa, Súp lơ xanh chứa glucosinolates và vitamin C những chất đã được chứng minh là có tác dụng chống lại sự mất cân bằng oxy hóa (oxidative stress - OS) Sự mất cân bằng oxi hóa là hậu quả của sự mất cân bằng giữa sự hình thành các gốc tự do có oxy và cơ chế kháng oxy hóa của cơ thể [11, 12, 13]

Sự mất cân bằng oxi hóa được xem là có liên quan đến nguyên nhân của nhiều bệnh lý ở người như xơ vữa động mạch, ung thư, tiểu đường, tổn thương gan, thấp khớp, đục thủy tinh thể, rối loạn thần kinh trung ương, thần kinh vận động, Parkinson, hiếm muộn, bệnh lý phụ khoa, bệnh lý trong thai kỳ…

Chống oxi hóa

Hoa Súp lơ xanh có thành phần chống ung thư, giúp cải thiện hệ miễn dịch ở người già và làm chậm quá trình lão hóa Sulforaphane có khả năng hoạt hóa những gene và enzyme chống oxy hóa trong tế bào miễn dịch Thành phần này sẽ ngăn các gốc tự do hủy hoại tế bào Tiến trình chuyển hóa trong cơ thể sinh ra các sản phẩm phụ là gốc tự do, nếu không ngăn ngừa hoạt động của gốc

tự do này có thể gây tổn hại mô dẫn tới bệnh tật và sự lão hoá [13, 11, 12]

Bệnh tim mạch vành

Nghiên cứu thành phần hóa học trong hoa Súp lơ xanh đã phát hiện hợp chất sulforaphane đã làm cho cơ thể tăng cường hình thành các enzyme bảo vệ các mạch máu, giảm các loại phân tử gây tổn hại tế bào Chất sulforaphane có trong bông cải xanh có thể chống lại sự phát triển bệnh mạch máu do tiểu đường

Động vật ăn bông cải xanh cải thiện được chức năng tim và ít bị tổn thương về cơ tim hơn khi thiếu oxy Các nhà nghiên cứu cho rằng những lợi ích của bông cải xanh chính là việc bổ sung các chất mà giúp tăng cường các protein bảo vệ tim có tên là thioredoxin Một chế độ ăn nhiều bông cải xanh sẽ mang lại lợi ích cho tim mạch [6]

Cải thiện hệ miễn dịch

Súp lơ xanh rất giàu vitamin C, chất dinh dưỡng thiết yếu giúp duy trì và tăng cường hệ thống miễn dịch Giúp cơ thể tránh được bệnh tật và luôn khỏe mạnh [11,12 ]

Cải thiện hoạt động của tế bào

Flavonoid giúpcải thiện hoạt động của tế bào, có hoạt tính chống oxy hóa mạnh, có tác dụng làm giảm các viêm nhiễm trong cơ thể [13, 12]

Chống lại quá trình lão hóa

Hoa Súp lơ xanh cũng có đặc tính chống lão hóa, vì vậy còn được gọi là loại

thực phẩm giúp làm chậm quá trình lão hóa cơ thể Cần thường xuyên bổ sung Súp

Phòng ngừa ung thư

Khi ở dạng tươi sống, thực phẩm hoa Súp lơ chứa một lượng nhỏ chất có khả năng bảo vệ ADN trước sự tấn công của các enzyme oxy hóa - tác nhân gây ung thư Khi tiêu hóa, tế bào trong hoa Súp lơ bị đứt gãy và giải phóng một loại enzyme đặc biệt Nhờ enzyme này, một chất hóa học gọi là sulphoraphanes được hình thành Bên cạnh đó, trong bông cải xanh còn có thêm protein ESP với nhiệm vụ tạo ra sự cân bằng cho các sulphoraphane kém sulphur [4, 5]

Ung thư dạ dày: Tiêu diệt vi khuẩn helicobacter pylori (HP) đây là loại vi

khuẩn chính gây loét dạ dày và phần lớn tác nhân gây ung thư ở đây

Ung thư da: Chống lại các tác động của tia cực tím, hoa Súp lơ có thể

giúp ngăn ngừa ung thư da Một bài viết trong Kỷ yếu của Viện hàn lâm Khoa học phát hiện ra rằng các tác hại của bức xạ tia UV (tia cực tím) có thể được

giảm đáng kể với việc bôi tại chỗ chiết xuất hoa Súp lơ xanh [4, 5]

Ung thư bàng quang: Một nhóm chất từ hoa Súp lơ xanh có khả năng

ngăn ngừa và làm chậm phát triển của bệnh ung thư bàng quang, tiêu thụ từ 2 bữa hoa Súp lơ mỗi tuần có tỷ lệ mắc ung thư bàng quang thấp hơn 44% so với những người ăn không quá 1 bữa/tuần Hợp chất này có tên là glucosinolate từ mầm hoa Súp lơ Trong quá trình thái nhỏ, nhai và tiêu hóa, glucosinolate sẽ chuyển thành chất isothiocyanate, có vai trò ngăn ngừa ung thư Isothiocyanate

ngăn chặn phát triển của các tế bào ung thư bàng quang [4, 5]

3 carbon (vòng pyron - vòng C) Phần lớn flavonoid có màu vàng nhạt, một số

có màu đỏ, xanh tía và các dạng không màu [2]

Hình 1.2 Cấu trúc của flavonoid [2]

1.2.2 Cấu trúc chung và phân loại

Dựa trên mức độ oxy hóa của mạch 3C và vị trí của gốc aryl (vòng B) liên kết với vòng benzopyrano, flavonoid được phân loại như sau:

Flavonoids (2- phenylbenzopyrans): gồm các nhóm phụ flavan, flavan 3ol (catechin), flavan 4-ol, flavan 3,4-diol, anthocyanidin, flavanone, flavone, flavonol, 3-hydroxy flavanon, chalcon, dihidrochalcon, aurone

Isoflavonoid (3-benzopyrans) gồm các nhóm phụ: iso flavan, iso flavan-4-ol, isoflavon, isoflavanon, rotenoid…

Neoflavonoid ( benzopyrans) gồm các nhóm phụ aryl-chroman, arylcoumarin, dalbergion

4-Ngoài ra, các nhà khoa học còn phân loại flavonoid thành flavonoid, biflavonoid (những flavonoid dimer), triflavonoid (cấu tạo bởi 3 monomer flavonoid) và flavonlignan (những flavonoid mà phân tử có cấu trúc lignan [9]

đỏ, ở môi trường kiềm (pH>6) là anion cũng tạo được muối với các chất kiềm có màu xanh Dung dịch anthocyanidin mất màu bởi bisulfit kiềm và dễ bị oxi hóa nên ít được dùng làm phẩm màu [2, 8, 12]

Flavan 3-ol: tùy theo các nhóm thế đính vào 2 vòng A và B mà có những dẫn chất flavan 3-ol khác nhau Catechin, gallocatechin và những đồng phân của chúng là những dẫn chất của flavan 3-ol nhiều trong thực vật như hoa Súp lơ

Hình 1.3 cấu tạo các flavonoid

Các nhà khoa học đã xác định được những dẫn xuất của flavan 3-ol ở dạng dimer, trimer, tetramer, pentamer và được gọi là tannin, thường có trong

loại trà Camellia sinensis CV viridis [3, 5, 15]

Flavan 3,4-diol: các dẫn chất flavan 3,4-diol đều không màu, có tính quang hoạt, khi đun sôi với acid thì dễ chuyển thành anthocyanidin có màu đỏ

Vì dễ bị oxi hóa và trùng hợp nên việc phân lập chất tinh khiết gặp khó khăn Phần lớn chúng thường ở dạng dimmer Các đơn phân được xác định bằng cách chuyển thành các dẫn chất anthocyanidin tương ứng [2, 8, 31]

Hình 1.4 Cấu tạo flavan 3,4 diol

Flavanon: flavanon là những chất không màu nhưng khi làm phản ứng cyaniding thì cho màu rõ hơn flavon, ngoài ra flavanon có điểm nóng chảy thấp hơn flavon tương ứng Nhóm này thường có nhiều trong cây cam thảo (liquiritin

và isoliquiritin) Hesperidin, naringin là những flavanon gặp nhiều trong một số

vỏ cây Citrus Naringin có vị đắng bằng 1/5 quinin, tuy nhiên aglycon thì không đắng ngoài ra nếu thay đường neohesperidose bằng đường rutinose thì lại mất vị đắng Nếu mở vòng C của naringin để tạo thành chalcon rồi hydrogen hóa tạo thành dihydro chalcon thì dẫn chất này có vị ngọt bằng saccharin [11, 15, 32, 36]

Hình 1.5 Cấu tạo flavanon

3- Hydroxyflavanon (dihydroflavanol = flavanonol): có 2 carbon bất đối

ở C2 và C3 Phần lớn dihyroflavonol ở dạng aglycon, cũng có một số ở dạng glycoside Dihydroflavonol khó phân lập vì kém bền, dễ bị oxi hóa Trong đó có dẫn chất của taxifolin hay gặp nhất

Hình 1.6 Dẫn chất của taxifolin

Flavon: có cấu trúc 2 vòng benzen A và B, với vòng B gắn vào vòng C (pyran) tại vị trí C2, có nối đôi ở vị trí 2-3 Các dẫn chất flavon rất phổ biến trong thực vật, kết tinh không màu đến vàng nhạt Chỉ tính đến các flavon có nhóm thế OH và/ hoặc OCH3 đã có tới hơn 300 chất Chất flavon đơn giản nhất không có nhóm thế đã được phân lập từ cây anh thảo (Primula) Hai flavon hay gặp nhất trong cây là apigenin và lutelin

Hình 1.7 cấu tạo appogenin và lutelin

Flavonol (flavon 3-ol): khác với flavon thì flavonol có thêm nhóm OH ở C3 Flavonol kết tinh màu vàng nhạt đến vàng Những dẫn chất flavonol rất phổ biến trong thực vật, đặc biệt là hành, hoa hòe, lúa mạch, diếp cá Cho đến năm

1992 đã có tới 380 chất flavonol có nhóm thế hydroxyl và hoặc methoxyl đã được biết tới Các chất thường gặp ở thực vật là: kaempferol, quercetin, myricetin [21, 32, 37]

H nh 1.8 Câu tạo flavon 3-ol

Chalcon: có 2 vòng A và B nối với nhau bởi một mạch hở 3C không có

dị vòng C như các flavonoid khác Đây là những chất có màu vàng đến vàng cam Chalcon có chủ yếu trong một số hoa thuộc họ Cúc–Asteraceae Để nhận biết chalcon có thể dùng hơi ammoniac hoặc khói kiềm của thuốc lá, màu sẽ chuyển sang đỏ cam hoặc cam đỏ hay đỏ Chalcon cũng có thể ở trong các bộ phận khác như vỏ, lá, rễ, quả (ví dụ: isoliquiritigenin trong rễ cam thảo)

H nh 1.9 cấu tạo chalcon

Dihydrochalcon: các chất này ít gặp trong tự nhiên Ví dụ như phloridin

có trong một loài Malus, chất này có độc tính ngăn sự hấp thu glucose ở ruột non và ngăn sự tái hấp thu glucose ở tiểu quản thận Một số dihydrochalcon có

vị rất ngọt ví dụ như neohesperidosid có vị ngọt gấp 2000 lần đường mía

Auron: là nhóm flavonoid có màu vàng sáng Khung của auron cũng có

15 C như các flavonoids khác nhưng dị vòng C có 5 cạnh Số lượng cũng như sự phân bố trong cây cũng bị hạn chế Chất điển hình là auresidin gặp phổ biến trong hoa của một số họ: Asteraceae, Scrophulariaceae, Plumbaginaceae, Oxalidaceae và ở dạng 4- glucosid hay 6-glucosid

H nh 1.10 Cấu tạo auron

1.2.2.2 Các isoflavonoid

Các flavonoid có gốc aryl ở vị trí C-3, gồm nhiều nhóm khác nhau như isoflavan, isoflava-3-ene, isoflavan 4-ol, isoflavanon; isoflavon, rotenoid, pterocarpan, coumestan, 3-arylcoumarin, coumaronochromen, coumaronochromon, các chất này thường gặp trong các cây họ đậu- Fabaceae

 Isoflavan: glabridin là một thành phần flavonoid gặp trong rễ cam thảo

 Isoflavan-3-ene: flabren có trong cam thảo

 Isoflavon: là nhóm lớn nhất của isoflavonoid Hiện nay, hơn 364 chất

đã được xác định, chúng có nhiều tác dụng trong y học thường gặp trong các họ

Rosaceae, Amranthaceae, Iridacea, ví dụ daizein trong sắn dây, forrmonometin trong cam thảo [2, 8, 12, 21]

Rotenoid: cho đến nay hơn 75 chất thuộc nhóm chất này đã được phân lập

và xác định được cấu trúc Cấu trúc của nhóm rotenoid là C6-C4-C6 vì có thêm

Tính tan: aglycon kém tan trong dung môi kém phân cực (hexan, benzen, ether dầu hỏa), tan trong dung môi phân cực vừa và mạnh (ethyl acetate, dimethyl ether, methanol, ethanol), tan trong kiềm loãng, kém tan trong dung dịch acid Glycoside: tan trong ethanol, methanol Các glycoside càng có nhiều nhóm đường và mạch đường càng dài thì tan tốt trong nước nóng Các flavonoid glycoside có nhóm -OH tại vị trí C7 còn tan được trong dung dịch NaOH,

Na2CO3, NaHCO3 do có tính axit Các flavonoid dạng aglycon thường dễ kết tinh, trong khi các glycoside thường khó kết tinh hơn [9]

Các flavonoid thường có màu Flavon có màu vàng nhạt hoặc màu cam, flavonol có màu vàng đến vàng nhạt, chalcon có màu vàng đến cam đỏ Các isoflavon, flavanon, flavanonol, leucoanthocyanidin, catechin kết tinh không màu

Anthocyanidin thường hiện diện ở dạng glycosid: pelargonidin, cyanidin, delphinidin…tạo màu xanh dương, đỏ, tím cho hoa và trái [7, 9]

Các flavonoid dễ tạo muối tan trong nước với các hydroxyd kiềm, nhạy cảm với pH, nhiệt độ và ánh sáng Có khả năng tạo phức với các ion kim loại cho sản phẩm có màu đặc trưng Hệ thống nối đôi liên hợp tạo ra bởi 2 vòng benzen và vòng pyron làm cho flavonoid có khả năng hấp thụ tia tử ngoại Flavonoid thường thu được 2 dải hấp thu cực đại, dải 1 có λmax = 320 - 380 nm, dải 2 có λmax = 240 - 280 nm [9]

1.2.4 Tính chất sinh học của flavonoid

Khả năng chống oxi hóa của flavonoid có thể được giải thích dựa vào các đặc điểm cấu trúc phân tử của chúng:

 Trong phân tử flavonoid có chứa các nhóm hydroxyl liên kết trực tiếp với vòng thơm có khả năng nhường hydro giúp chúng có thể tham gia vào các phản ứng oxi hóa khử, bắt giữ các gốc tự do;

 Chứa các vòng thơm và các liên kết bội (liên kết C=C, C=O) tạo nên hệ liên hợp giúp chúng có thể bắt giữ, làm bền hóa các phần tử oxi hoạt động và các gốc tự do

 Chứa nhóm có thể tạo phức chuyển tiếp với các ion kim loại như

catechol…giúp làm giảm quá trình sản sinh ra các phần tử oxi hoạt động [17, 21]

Tác dụng ức chế vi sinh vật, chống viêm nhiễm

Dịch chiết flavonoid từ quả mơ cho thấy khả năng ức chế đối với sự phát

triển của S.aureus, Shigella sonnei, Shigella flexneri, Candida albicans với

đường kính vòng ức chế tương ứng là 23, 21, 26 và 29 mm [13] Kết quả tương

tự đối với dịch chiết flavonoid của cây diếp cá trên sự phát triển của E.coli, P.aeruginosa, B.subtilis và S.aureus với giá trị MIC lần lượt là 100, 200, 200 và

peroxyd lipid gây ra bởi Helicobacter pylori trong niêm mạc dạ dày của chuột

bạch [10]

Tác dụng đối với enzyme

Flavonoid cùng với acid ascorbic tham gia trong quá trình hoạt động của enzym oxi hóa- khử Flavonoid còn ức chế các tác động của hyaluronidase Enzym này làm tăng tính thấm của mao mạch Khi enzym này thừa thì gây xuất huyết dưới da mà y học gọi là bệnh thiếu vitamin P Các chế phẩm của flavonoid chiết từ các loài Citrus như Cemaflavone, Circularine,…, flavonoid từ lá bạc hà như Daflon, Diosmil, flavonoid từ hoa hòe (rutin) với nhiều biệt dược khác nhau

đã chứng minh tác dụng làm bền thành mạch, làm giảm tính dòn và tính thấm của mao mạch Tác dụng này được hợp lực với acid ascorbic Các dẫn chất anthocyanosid có tác dụng tái tạo tế bào võng mạc và đã được chứng minh có tác dụng làm tăng thị lực vào ban đêm [17, 29]

Tác dụng đối với các bệnh tim mạch, tiểu đường

Tác động bảo vệ của các flavonoid đối với tim mạch có thể do khả năng của chúng trong việc ngăn ngừa sự oxi hóa các lipoprotein tỷ trọng thấp, phòng ngừa xơ vữa động mạch, chặn sự kết tụ huyết khối, điều hòa nhịp tim, ngăn ngừa bệnh mạch vành và nhồi máu cơ tim, điều hòa huyết áp Các kết quả nghiên cứu đã chỉ ra rằng các flavonoid tự có vai trò như chất kích thích insulin hay bắt chước chức năng của insulin; ngoài ra chúng còn có sự ảnh hưởng đến hoạt động của các enzyme trong quá trình chuyển hóa đường… [21]

Tác dụng đối với ung thư

Với nỗ lực nhằm nghiên cứu khả năng chống ung thư của các hợp chất flavonoid Gần đây nhiều tác giả trên thế giới đã tiếp tục thử nghiệm tác dụng in vitro của flavonoid lên các dòng tế bào ung thư khác nhau Quercetin có tác dụng ức chế sự phát triển của các tế bào ung thư tuyến tụy, chế độ ăn bổ sung quercetin cũng có tác dụng làm giảm khả năng phát triển của các khối u Naringenin và kaempferol- 3-O- (2, 6-di-O-p-trans-coumaroyl) glucoside thu

nhận từ hoa của cây Melastoma malabathricum L Cũng đã được tìm thấy là có

khả năng ức chế sự tăng sinh của dòng tế bào ung thư vú MCF7 với giá trị IC50 lần lượt là 0,28 µM và 1,3 µM [35]

1.3 Tình hình nghiên cứu, ứng dụng và sản xuất ở trong nước

Việt Nam trong thời gian gần đây đã có rất nhiều các nghiên cứu chiết tách và xác định thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của flavonoid có

trong một số loài thực vật như flavonoid trong hoa actiso Cynara scolymus L.,

hoa hòe, cây Đơn Kim, chè dây Cao Bằng, cây cỏ lào, cây diếp cá, lá chùm ngây, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã sản xuất rutin từ hoa hòe Trần Lưu Vân Hiền và cộng sự đã sản xuất sản phẩm flavonoid Vitexin từ vỏ đậu xanh Phan Văn Cừ đã phân lập flavonoid từ cao butanol trong cây diếp cá

(Houttuynia Cordata Thunb) ở tỉnh Thừa Thiên Huế[2] Năm 2015, Nguyễn Thị

Ngọc Trâm cùng với các cộng sự trong và ngoài nước đã nghiên cứu thành công

đề tài nghiên cứu tác dụng sinh học và độ an toàn của các phân đoạn alcaloid và flavonoid từ cây Trinh nữ hoàng cung [2]

Công trình nghiên cứu về những tác dụng của hợp chất flavonoid có trong diếp cá còn rất hạn chế Việc tinh chế các chất hữu ích có trong diếp cá vẫn là vấn đề hết sức phức tạp, đòi hỏi công nghệ hiện đại và tốn nhiều tiền bạc, mà điều đó ở nước ta chưa thực sự đáp ứng được

Hay nghiên cứu của nhóm tác giả Phạm Thành Quân, Nguyễn Hải Hà, Bạch Long Giang (Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG – HCM) và Tống Văn Hằng (Đại học Quốc gia Hồ Chí Minh) về: Hàm lượng polyphenol tổng, catechin tổng và hoạt tính quét gốc tự do DPPH của một số loại trà xanh trên thị trường Việt Nam, hay nghiên cứu quy trình công nghệ chiết tách các flavonoid

từ phế thải chè, rau quả nhằm ứng dụng trong thực phẩm chức năng của Lý Ngọc Trâm, năm 2012 Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Hà Thị Thanh Bình và cộng sự với nghiên cứu khảo sát tác dụng kháng khuẩn và chống viêm trên thực nghiệm của flavonoid chiết từ lá chè [5, 13, 24, 31]

cao chiết, chưa tạo ra được sản phẩm có độ tinh khiết cao Phần lớn các sản phẩm các chất flavonoid nguyên liệu dùng trong dược phẩm hay thực phẩm chức năng đều được nhập khẩu từ nước ngoài Đặc biệt những nghiên cứu về hoa Súp lơ vẫn còn rất hạn chế [10, 12,16,17]

1.4 Tình hình nghiên cứu, ứng dụng và sản xuất trên thế giới

Trong những nghiên cứu, các nhà khoa học trên thế giới đã chứng minh rằng, flavonoid là một chất chống oxy hóa mạnh giúp cơ thể chống lại các tổn thưong do sự oxy hóa và các gốc tự do một cách hữu hiệu Nhờ vậy flavonoid còn có tác dụng bảo vệ hệ tim mạch giảm nguy cơ tử vong do các bệnh lý tim mạch như nhồi máu cơ tim, đau thắt ngực, xơ vữa động mạch Ngược lại, nếu lượng flavonoid cung cấp hằng ngày giảm đi, nguy cơ các bệnh lý này tăng lên

rõ rệt.Khả năng chống oxy hóa của flavonoid còn mạnh hơn các chất khác như vitamin C, vitamin E, selenium, kẽm [27, 35, 36]

Tiến sĩ Catherine Rice Evans thuộc Intermational Antioxidant ResearchCentre, Luân Đôn báo cáo rằng: genistein và daidzen thuộc nhóm isoflavones có khả năng chống oxy hóa hữu hiệu nhất Các nhà khoa học Nhật Bản cho biết rằng nếu mỗi ngày người Nhật đều dùng trà xanh thì tỷ lệ chết vì ung thư và tim mạch giảm đi một cách rõ rệt Uống trà xanh mỗi ngày là tăng lượng flavonoid có trong máu của chúng ta lên đến 25% Một nghiên cứu của

Mỹ được đăng trên tạp chí ―Journal of Agricultural and Food Chemistry khẳng định rằng các chất flavonoid có trong chanh có tác dụng ngăn ngừa về các bệnh thoái hóa não Báo The Times Of India dẫn lời các nhà khoa học cho biết, chính hợp chất flavonoid có trong củ hành với đặc tính chống oxy hóa đã giúp tiêu diệt các phân tử gốc tự do [56]

CHƯƠNG 2 : NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Mục tiêu nghiên cứu

Trích ly được flavonoid và xác định được hàm lượng vitamin C trong hoa Súp lơ xanh, làm cơ sở cho đề xuất phương án chiết xuất và thu nhận flavonoid

từ vật liệu của cây Súp lơ

2.2 Nội dung nghiên cứu

 Xác định độ ẩm của hoa Súp lơ và hàm lượng vitamin C

 Tách chiết hợp chất flavonoid trong bột khô hoa Súp lơ

 Xác định hoạt tính kháng một số chủng vi sinh vật kiểm định của flavonoid tách chiết từ hoa Súp lơ xanh

2.3 Vật liệu nghiên cứu

Hình 2.1 Hoa Súp lơ

2.3.1 Vật liệu thực vật

 Đối tượng nghiên cứu: Hoa Súp lơ xanh Brassica oleracea italica Plenck.

 Sử dụng phần hoa của cây Súp lơ xanh trưởng thành, không bị vàng úa,

2.3.3 Môi trường nghiên cứu vi sinh vật

Hòa tan và dẫn nước đến 1000ml với pH= 7,0

2.4 Thiết bị dụng cụ, hóa chất nghiên cứu

Thiết bị, dụng cụ:

Tủ sấy , bếp từ , cân phân tích, máy đo quang phổ, tủ hút, tủ lạnh, bình

trụ, bình tam giác, pipet, ống eppendorf, phễu chiết, đĩa petri, giấy sắc khí, ống

đong, bình định mức

Hóa chất

Các loại alcohol (ethanol, buthanol, methanol, isopropanol), ethyl acetate (C3H8O2), cloroform (CH3Cl), sodium, hydroxide (NaOH), sodium chloride (NaCl), indigocarmine (C16H8N2Na2O8S2), toluene, formic acid, pepton, cao nấm men, KOH (10%), agar , H2O, glucose, NaOH (10%), natri axetat (C2H3NaO2)

2.5 Phương pháp nghiên cứu

2.5.1 Xác định độ ẩm của hoa Súp Lơ

Mục tiêu của thí nghiệm là: xác định độ ẩm của hoa Súp lơ xanh, sấy khô mẫu hoa súp lơ xanh, từ đó có nguyên liệu cho quá trình trích ly flavonoid Làm cơ sở cho tính toán hiệu suất trích ly flavonoid tổng số tính theo lượng khô tuyệt đối

Độ ẩm là lượng nước tự do có trong mẫu, có thể được xác định bằng phương pháp sấy khô

Nguyên lý: Dùng nhiệt làm bay hết hơi nước trong mẫu Cân trọng lượng mẫu trước và sau khi sấy khô, từ đó tính được phần trăm nước trong mẫu

Tiến hành: Cân khối lượng hoa Súp lơ đã được ngắt bỏ cành vào các khay đĩa đã được sấy khô đến khối lượng không đổi và biết khối lượng chính xác