Nghiên cứu phân lập tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng phân giải hợp chất hữu cơ trong nước thải nhà máy bia

Các vi sinh vật ứng dụng khả năng phân giải các hợp chất hữu cơ trong nước thải .... Chính vì thế mà việc tìm ra các chủng vi sinh vật trong nước thải của của nhà máy sản xuất bia có khả

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài này tôi đã nhận được sự

giúp đỡ tận tình của thầy cô giáo, bạn bè và gia đình rất nhiều Để có được kết

quả như hôm nay, tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Nguyễn

Như Ngọc và TS Trần Thị Thu Lan đã dành nhiều thời gian hướng dẫn tận tình,

cung cấp nhiều kiến thức và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình

thực hiện đề tài khóa luận tốt nghiệp

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới thầy cô giáo, anh chị tại Viện Công nghệ sinh

học Lâm Nghiệp –Trường Đại Học Lâm Nghiệp đã tạo điều kiện giúp đỡ, chỉ

bảo tận tình tôi trong suốt quá trình nghiên cứu

Tôi cũng xin cảm ơn gia đình, bạn bè đã động viên, giúp đỡ tôi để hoàn

thành đề tài này

Một lần nữa, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến tất cả mọi người!

Hà nội, ngày 14 tháng 5 năm 2018

Sinh viên thực hiện

Ngô Thúy Quỳnh

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

MỤC LỤC

DANH MỤC KÝ HIỆU, TỪ VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

DANH MỤC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 2

TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 2

1.1 Tình hình sản xuất và tiêu thụ bia trên thế giới và việt nam 2

1.1.1 Tình hình sản xuất và tiêu thụ bia trên thế giới 2

1.1.2 Tình hình sản xuất và tiêu thụ bia ở Việt Nam 3

1.2 Quy Trình Sản xuất bia 5

1.3 Đặc tính của nước thải nhà máy bia 7

1.3.1 Các chỉ tiêu đánh giá độ nhiễm bẩn của nước thải 7

1.3.2 Các phương pháp xử lý nước thải 8

1.4 Các vi sinh vật ứng dụng khả năng phân giải các hợp chất hữu cơ trong nước thải 12

1.5 Các chất hữu cơ và các enzyme vi sinh vật phân giải 13

1.5.1 Tinh bột và enzyme amylase 14

1.5.2 Cellulose và enzyme cellulose 15

1.5.3 Các chất protein và enzyme protease 16

CHƯƠNG 2: MỤC TIÊU, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1 Mục tiêu nghiên cứu 19

2.2 Nội dung nghiên cứu 19

2.3 Phương pháp nghiên cứu 19

2.3.1 Vật liệu nghiên cứu 19

2.3.2 Hóa Chất 19

2.3.3 Các trang thiết bị - dụng cụ 19

2.3.4 Phương pháp tiến hành 22

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30

3.1 Kết quả phân lập các chủng vi sinh vật từ nước thải nhà máy sản xuất bia 30

3.2 Kết quả xác định khả năng sinh enzyme ngoại bào phân giải các hợp chất hữu cơ 33

3.3 Kết quả xác định đặc tính sinh hóa của các chủng vi sinh vật 36

3.3.1 Kết quả nhuộm gram quan sát đặc điểm hình thái tế bào 36

3.3.2 Kết quả kiểm tra đặc tính sinh hóa của chủng vi khuẩn 39

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 44

4.1 Kết luận 44

4.2 Kiến nghị 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC KÝ HIỆU, TỪ VIẾT TẮT

VSV: Vi sinh vật

COD: Chemical Oxygen Demand

BOD: Biochemical Oxygen Demand

TSS: Total Suspended Solid

LB: Môi trường LB broth

DS: Dissolved Solid

DO: Dissolved Oxygen

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Các thông số của nước thải sản xuất bia 8

Bảng 2.1: Các thiết bị sử dụng trong thí nghiệm 20

Bảng 2.2: Môi trường nuôi cấy vi sinh vật 20

Bảng 3.1: Đặc điểm hình thái các chủng vi sinh vật 30

Bảng 3.2: Đường kính vòng phân giải cơ chất của các chủng vi sinh vật 33

Bảng 3.3: Các đặc điểm sinh hóa của 4 chủng vi sinh vật 43

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 1: Tỉ trọng tiêu thụ bia theo khu vực năm 2011 3

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Sản lượng tiêu thụ bia từ năm 2010 - 2016 4

Hình 1.2: Quy trình sản xuất bia 5

Hình 1.3 Sự chuyển amine 17

Hình 1.4 Sơ đồ phân huỷ protein ở bên ngoài và bên trong tế bào vi khuẩn và những cách biến đổi axit amin tiếp theo 17

Hình 3.1: Vòng phân giải của tinh bột của chủng vi sinh vật 34

Hình 3.2: Vòng phân giải protein của chủng vi sinh vật 35

Hình 3.3: Vòng phân giải cellulose của chủng vi sinh vật 35

Hình 3.4: Hình thái khuẩn lạc (A) và hình dạng tế bào (B) của chủng 22.B2 37

Hình 3.5: Hình thái khuẩn lạc (A) và hình dạng tế bào (B) của chủng M 37

Hình 3.6: Hình thái khuẩn lạc (A) và hình dạng tế bào (B) của chủng B1 38

Hình 3.7: Hình thái khuẩn lạc (A) và hình dạng tế bào (B) của chủng CL2 38

Hình 3.8: Khả năng lên men đường Saccharose của 4 chủng vi sinh vật 39

Hình 3.9: Khả năng lên men đường Glucose của 4 chủng vi sinh vật 39

Hình 3.10: Khả năng lên men đường lactose của 4 chủng vi sinh vật 39

Hình 3.11: Phản ứng MR của 4 chủng vi sinh vật 40

Hình 3.12: Phản ứng VP của 4 chủng vi sinh vật 41

Hình 3.13: Phản ứng khả năng phân giải Urease 41

Hình 3.14: Khả năng khử của Nitrate 42

ĐẶT VẤN ĐỀ

Sự phát triển của kinh tế dẫn đến thu nhập người dân ngày càng cao, nhu cầu sử dụng các loại thức uống giải khát cũng như bia ngày càng tăng Trong những năm qua các nhà máy sản xuất bia được đầu tư xây dựng ngày càng nhiều nhằm đáp ứng nhu cầu tiêu dùng Thị trường càng mở rộng thì nhu cầu tiêu thụ bia càng lớn Sự xuất hiện của các nhà máy sản xuất bia dẫn tới các loại chất thải được thải ra trong quy trình sản xuất cũng không ngừng tăng lên gây ô nhiễm môi trường và cũng là vấn đề cấp bách của xã hội Vì vậy việc nghiên cứu, thiết

kế hệ thông xử lý trong nước thải bia là một nhu cầu cần thiết để bảo vệ môi trường Dựa trên tính chất nước thải nhà máy sản xuất chứa hàm lượng các hợp chất hữu cơ cao chủ yếu như tinh bột, cellulose, hemicellulose … là các chất dễ phân hủy, chuyển hóa sinh học Có rất nhiều các biện pháp xử lý, dựa vào tinh chất của nước thải là yếu tố cơ sở để việc để đưa biện pháp sinh học vào xử lý hiệu quả mà không tốn chi phí cao Chính vì thế mà việc tìm ra các chủng vi sinh vật trong nước thải của của nhà máy sản xuất bia có khả năng phân giải các hợp chất hữu cơ được con người ngày càng được quan tâm Cũng là tiền đề để đưa vi sinh vật vào xử lý bằng phương pháp sinh học và ứng dụng sản xuất các chế phẩm vi sinh góp phần đưa các vi sinh vật vào xử lý nguồn nước thải bị ô nhiễm, giúp cho nguồn nước chở về tính chất ban đầu của chúng, không gây ô nhiễm môi trường

Trên cơ sở đó, mà tôi đã thực hiện đề tài: “Nghiên cứu phân lập, tuyển

chọn các chủng vi sinh vật có khả năng phân giải các hợp chất hữu cơ trong nước thải nhà máy bia ”

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Tình hình sản xuất và tiêu thụ bia trên thế giới và việt nam

1.1.1 Tình hình sản xuất và tiêu thụ bia trên thế giới

Bia là loại nước giải khát đã sản xuất từ rất lâu đời trên thế giới Từ thời

cổ đại, bia đã được chế biến từ lúc mạch nhưng phải đến thế kỷ 19, khi Louis Pasteur thành công trong những nghiên cứu về vi sinh vật và Christian Hansen (người Đan Mạch) phân lập được nấm men và áp dụng vào sản xuất bia thì bia mới thực sự trở thành một thứ đồ uống hảo hạng, được nhiều người khắp nơi trên thế giới ưa chuộng Ước tính sản lượng bia năm 2005 đạt 153 tỷ lít/năm Sản lượng bia thế giới trong một thập kỷ tăng 35,6% Có sản lượng lớn và luôn phát triển là Trung Quốc, kế đến là Nga và Brazil Trong khi đó năm 2001, Mỹ

là nước dẫn đầu sản lượng bia thế giới với 23.300 triệu lít, đến năm 2011 giảm sản lượng còn 22.546 triệu lít đứng vị trí thứ hai Việt Nam, Ukraina và Trung Quốc có mức tăng trưởng cao trong mười năm qua, lần lượt là 240,4%, 132,9%

và 118% [15, 21]

Trong năm 2011, mức tiêu thụ bia toàn cầu đạt 188,78 tỉ lít, tăng 3,8% so với năm 2010 Trong đó, lượng tiêu thụ của Châu Á đứng đầu thế giới ở mức 66,2 tỉ lít, tiếp đó là thị trường truyền thống Châu Âu 51,2 tỉ lít Khu vực Trung Đông là khu vực tiêu thụ ít nhất, chỉ đạt 1,4 tỉ lít dù dân số bằng ½ so với Châu Âu Các khu vực

Mĩ La Tinh, Bắc Mĩ, Châu Phi và Châu Đại Dương đạt 30,8; 26,1; 10,8 và 2,2 tỉ lít Tổng thu nhập của thị trường bia năm 2011 đạt 500,24 tỉ đô la Mĩ Mức tiêu thụ bia ở các châu lục khác nhau được thể hiện trên biểu đổ 1

Biểu đồ 1: Tỉ trọng tiêu thụ bia theo khu vực năm 2011

Lượng tiêu thụ bia ở Châu Á ghi nhận một mức tăng lớn 8.4% so với năm

2010 Châu Mĩ La Tinh và Châu Phi cũng tăng nhanh trong năm 2011 với mức tăng hàng năm 3.7% và 6.9% Sự tăng trưởng của Châu Mĩ La Tinh tăng 3.5%

so với 2010 Tại Châu Phi, sự tăng trưởng chủ yếu là Nam Phi, với mức tăng hàng năm đạt 2.5% Mức tiêu thụ hàng năm tại Châu Âu tăng 0.4%, lần đầu tiên trong 4 năm Bắc Mĩ, do khủng hoảng kinh tế, giảm đi 1,2% so với 2010

Vào cuối năm 2017, thị trường bia của khu vực Châu Á càng ngày càng phát triển như Trung Quốc, Nhật Bản Theo thông tin mới nhất Việt Nam đã chính thức lọt vào Top 10 thị trường lớn nhất thế giới xét về dung lượng bia tiêu thụ

Dự kiến với mức tăng trưởng kinh tế như hiện nay, mức sống của người dân trên thế giới ngày càng cao thì công nghiệp sản xuất bia sẽ phát triển mạnh, sản lượng tiêu thụ bia tiếp tục tăng cao trong những năm tới

1.1.2 Tình hình sản xuất và tiêu thụ bia ở Việt Nam

Bia được đưa vào Việt Nam từ năm như vậy Bia Việt Nam đã có lịch sử hơn 100 năm Hiện nay, do nhu cầu của thị trường, chỉ trong một thời gian ngắn, ngành sản xuất bia có những bước phát triển mạnh mẽ Do tác động của nhiều yếu tố như tốc độ tăng trưởng GDP, tốc độ tăng dân sô, tốc độ đô thị hóa, tốc

1890 cùng với sự xuất hiện của nhà máy Bia Sài Gòn và nhà máy Bia Hà Nội,

độ đầu tư Mà ngành công nghiệp bia phát triển với tốc độ tăng trưởng khá cao Chẳng hạn như năm 2003, sản lượng bia đạt 1290 triệu lít, tăng 20,7% [21]

Series1, Châu Á, 35.06%, 35%

Series1, Châu Âu, 27.15%, 27%

Series1, Mĩ La Tinh, 16.31%, 16%

Series1, Bắc Mĩ, 13.85%, 14%

Series1, Châu Phi,

5.70%, 6%

Series1, Trung Đông, 0.75%, 1%

Series1, Châu Đại Dương, 1.17%, 1%

Châu Á Châu Âu Mĩ La Tinh Bắc Mĩ Châu Phi Trung Đông Châu Đại Dương

Theo thống kê hiện nay, cả nước có khoảng trên 320 nhà máy bia và các

cơ sở sản xuất bia với tổng năng lực sản xuất đạt trên 800 triệu lít/năm Sự phát triển thị trường tiêu thụ bia ở việt nam ngày càng tăng với con số lên tới hơn 2,41 tỷ lít đối với năm 2010 và phát triển theo chiều tăng đến năm 2016 là 37,9

tỷ Dưới đây là bẳng số liệu sản lượng tiêu thụ bia bia tăng đều theo các năm (hình 1.1)

Hình 1.1: Sản lượng tiêu thụ bia từ năm 2010 - 2016

Do mức sống ngày càng cao thị trường tiêu thụ bia theo đầu người rất cao

do thói quen uông, chính vì thế mà thị trường tiêu thụ bia càng mở rộng và tăng theo các năm Hiện tại thì có 10 loại bia được tiêu thụ nhiều nhất ở việt nam điểm hình như bia Sài Gòn, Bia Hà Nội, Bia Tiger, Bia Habeco… Được phân

bố dẫn đầu các thị trường tiêu thụ từ khu vực miền Bắc cho đến khu vực miền Nam, các thành phố lớn [15, 21]

Theo báo cáo của Hiệp hội Bia - rượu - nước giải khát Việt Nam, năm

2017 lượng bia các loại tiêu thụ trên cả nước đạt hơn 4 tỉ lít, tăng 6% so với năm

2016 Con số này đã sát mục tiêu đạt 4,1 tỉ lít bia vào năm 2020 trong quy hoạch phát triển ngành bia, rượu, nước giải khát VN do Bộ Công thương phê duyệt Với dân số 93,7 triệu người hiện nay, ước tính mỗi người dân Việt Nam uống gần 43 lít bia/năm Dự báo mức tiêu thụ này sẽ còn tiếp tục gia tăng theo các năm tiếp theo

1.2 Quy Trình Sản xuất bia

Quy trình sản xuất bia gồm có các giai đoạn chính:

Hình 1.2: Quy trình sản xuất bia

Các bước chính trong một quá trình sản xuất bia đó là: đường hóa, lọc, đun sôi, lên men, ủ phụ, lọc và chiết [18,24]

 Đường hóa là một quá trình trộn lẫn ngũ cốc đã ngiền (thường là ngũ cốc đã trải qua quá trình malt hóa) và đun nóng hỗn hợp này và chờ ở các vọng nhiệt độ nhất định để các enzymes trong malt phá vỡ tinh bột trong ngũ cốc thành đường mà chủ yếu là maltose

 Lọc là một quá trình phân tách chất chiết thu được trong quá trình đường hóa ra khỏi bã ngũ cốc (bã bia) Quá trình lọc gồm 2 giai đoạn: Dịch lọc đầu thu được chất chiết mà chưa có sự pha loãng bã bia và dịch lọc sau chất chiết được tận thu bằng cách rửa bã bia với nước nóng

 Đun sôi: quá trình đun sôi chất chiết thu được gọi là dịch nha, nhằm giúp dịch nha trở nên vô trùng, tránh sự nhiễm khuẩn

 Làm lạnh nha: Quá trình lọc hoa, dịch nha được hạ lạnh xuống nhiệt độ lên men trước khi tiếp giống nấm men

 Lên men: quá trình lên men được thực hiện trong các tank lên men và được bắt đầu ngay khi nấm men được định lượng vào dịch nha lạnh Trong suốt quá trình này nấm men chuyển hóa các loại đường trong dịch nha thành cồn và CO2

 Ủ chín bia: Khi các loại đường được sử dụng gần hết trong quá trình lên men bia, quá trình lên men chậm dần và nấm men bắt đầu lắng xuống đáy tank

 Lọc bia: Quá trình loại bỏ nấm men, cặn, giúp ổn định hương, vị bia và mang đến cho bia sự trong sáng màu sắc bia

 Chiết chai là quá trình rót bia vào chai, keg, lon hoặc các đồ chứa khác

có dung tích lớn hơn

Ở các giai đoạn của quá trình sản xuất bia, nước sạch từ bên ngoài đi theo đường ống vào bên trong qua các quá trình nấu – đường hóa, lên men, các giai đoạn thành phẩm Các giai đoạn này, nước thừa được đưa ra ngoài đi theo đường ống đến bể xử lý Nước thải từ các quy trình sản xuất bia bao gồm nước lẫn theo bã man và bột sau khi lấy dịch còn sót lại, nước rửa các thiết bị lọc, nồi nấu, thùng lên men, nước nồi hơi, nước rửa chai, từ hệ thống làm lạnh đi theo đường ống ra môi trường bên ngoài Nước thải của các công đoạn sảm xuất bia

có chứa hàm lượng cao giàu các chất hydroccacbon, cellulose, hemixenlulose, pentose trong vỏ trấu, các mảnh hạt và bột,… cùng với xác hoa, một ít tanin, các chất đắng, chất màu Ngoài nước thải đó còn chứa các chất dinh dưỡng giàu protein của các xác men, các chất khoáng, vitamin cùng với cặn bia

1.3 Đặc tính của nước thải nhà máy bia

1.3.1 Các chỉ tiêu đánh giá độ nhiễm bẩn của nước thải

Do đặc thù về công nghệ nên trong sản xuất lượng bia tiêu hao cao và nước thải phát sinh nhiều Với công nghệ thông thường, để sản xuất 1 lít bia cần

sử dụng khoảng 4 -11 lít nước Trong đó, 2/3 lượng nước dùng quy trình công nghệ và 1/3 còn lại dùng cho hoạt động vệ sinh Từ những nguồn phát sinh trên, nước thải từ nhà máy sản xuất bia rất giàu chất hữu cơ rất cao, do đó là các chỉ

số BOD, COD, SS tương đối lớn Do đó nước thải nếu không được xử lý sẽ làm mùi hôi thối, lắng cặn, giảm nồng độ oxy hòa tan trong nguồn nước [7,16]

Các thông đánh giá mức chất lượng nước thải bao gồm:

pH: Chỉ số pH < 7 thì nước có môi trường axít; pH > 7 thì nước có môi trường kiềm, khi biết chỉ số Ph thì sẽ có phương pháp xử lý nước thải khác nhau

Độ đục: Đánh giá độ bẩn trong nước thải, ngoài ra nước đục còn ngăn cản quá trình chiếu sán của mặt trời xuống đáy làm giảm quá trình quang hợp và nồng độ oxy hòa tan trong nước

Mùi: Các chất thải bị phân hủy có chứ NH3, các hợp chất hữu cơ có chứa lưu huỳnh

SS (solid solved – chất rắn lơ lửng)

Chất rắn lơ lửng nói riêng và tổng chất rắn nói chung có ảnh hưởng đến chất lượng nước trên nhiều phương diện Hàm lượng chất rắn hoà tan trong nước thấp làm hạn chế sự sinh trưởng hoặc ngăn cản sự sống của thuỷ sinh Hàm lượng chất rắn hoà tan trong nước cao thường có vị

DO (dyssolved oxygen – ôxy hoà tan trong nước)

Ôxy có mặt trong nước một mặt được hòa tan từ ôxy trong không khí, một mặt được sinh ra từ các phản ứng tổng hợp quang hoá của tảo và các thực vật sống trong nước Các yếu tố ảnh hưởng đến sự hòa tan ôxy vào nước là nhiệt độ,

áp suất khí quyển, dòng chảy, địa điểm, địa hình COD là tiêu chuẩn quan trọng

để đánh giá mức độ ô nhiễm của nước (nước thải, nước mặt, nước sinh hoạt) vì

nó cho biết hàm lượng chất hữu cơ có trong nước là bao nhiêu Hàm lượng COD trong nước cao thì chứng tỏ nguồn nước có nhiều chất hữu cơ gây ô nhiễm

BOD (Biochemical oxygen Demand): Nhu cầu ôxy sinh hoá

BOD là lượng ôxy cần cho vi sinh vật tiêu thụ để ôxy hoá sinh học các chất hữu cơ trong bóng tối ở điều kiện tiêu chuẩn về nhiệt độ và thời gian Như vậy BOD phản ánh lượng các chất hữu cơ dễ bị phân huỷ sinh học có trong mẫu nước

Sau đây là các thông chỉ tiêu đánh giá độ ô nhiễm của nước thải bia (bảng 1.1)

Bảng 1.1: Các thông số của nước thải sản xuất bia

Trong bảng 1.1 đưa ra các chỉ tiêu thông số đánh giá thấy rằng nước thải sau khi sản xuất bia có các thông chỉ tiêu cao hơn các chỉ tiêu quy chuẩn việt nam ở cột B về nước thải ra môi trường bên ngoài, nước thải sau khi sản xuất gấp từ 6 cho đến 18 lần từng loại tiêu chuẩn quy định, có thể thấy các chỉ tiêu về nước thải đầu ra của quy sản xuất bia đang bị ô nhiễm hoàn toàn cần được xử lý trước khi đưa nước thải ra ngoài môi trường [14]

1.3.2 Các phương pháp xử lý nước thải

Hiện nay có rất nhiều phương pháp xử lý nước thải khác nhau nhưng có thể chia thành 4 phương pháp chính:

1.3.2.1 Phương pháp cơ học

Phương pháp này thường dùng để xử lý sơ bộ, ít khi là quá trình kết thúc của quá trình xử lý công nghiệp Phương pháp này dùng để loại bỏ tạp chất không tan hay tạp chất cơ học trong nước thải Các tạp chất này có thể là vô cơ hay hữu cơ

Các phương pháp thường dùng là: Lọc qua lưới, lắng, xyclon thủy lực, lọc cát, ly tâm

1.3.2.2 Phương pháp hóa học

Cơ sở của phản ứng hóa học là các phản ứng hóa học của các chất bẩn có trong nước thải và hóa chất cho thêm vào Những phản ứng diễn ra thường là phản ứng oxy hóa, trung hòa, keo tụ và nhiều hiện tượng vật lý khác Các phương pháp ozon hóa có khả năng đạt được hiệu suất cao do ozon là chất oxy hóa mạnh, dễ dàng nhường đi oxy nguyên tử

Thực chất của phương pháp hóa học là nhờ các phản ứng oxy hóa khử mà các chất bẩn chất độc hại trong nước được chuyển thành các chất không độc hại, một phần ở dạng cặn, một phần ở dạng khí Vì vậy để khử các chất độc hại trong nước thải thường dùng nhiều phương pháp nối tiếp: oxy hóa khử - lắng cặn- hấp phụ

- Hấp phụ: Là tách các chất bẩn và khí hòa tan khỏi nước thải bằng cách tập trung các chất đó trên bền mặt chất mang

- Trích ly: Là tách các chất bẩn hòa tan khỏi nước thải bằng dung môi, dung môi này không tan trong nước và độ hòa tan của chất bẩn trong dung môi phải cao hơn trong nước

- Chưng bay hơi: Chưng cất nước thải để các chất độc hòa tan trong đó phải bay hơi theo hơi nước

- Tuyển nổi: Dùng các tác nhân tuyển nổi để thu hút và kéo các chất bẩn lên mặt nước, sau đó loại tác nhân tuyển nổi và chất bẩn khỏi nước Khi tuyển nổi thường dùng các hạt khí nhỏ, phân tán và bão hòa trong nước thải Các hạt chất bẩn có bám bọt khí nhẹ dần sẽ nổi lên

- Thẩm tích dializ (màng bán thấm): Dùng màng xốp, bán thấm không cho các hạt keo đi qua để tách ta khỏi nước thải

1.3.2.4 Phương pháp xử lý sinh học:

Cở sở của phương pháp là dựa vào khả năng hoạt động sống của vi sinh vật Chúng sử dụng các hợp chất hữu cơ có trong nước thải làm nguồn dinh dưỡng như C, P, N… Trong quá trình trao đổi chất, vi sinh vật phân hủy và sử dụng các hợp chất hữu cơ để sinh năng lượng phục vụ cho hoạt động sống và xây dựng tế bào mới làm tăng sinh khối

Các vi sinh vật quan trọng trong xử lý nước thải sinh học bao gồm nhiều loại vi sinh vật khác nhau như vi khuẩn, nấm men, nấm mốc, nguyên sinh động vật protozoa, các thể kí sinh và cộng sinh tảo… Chúng có khả năng phân giải protein, đường, tinh bột, mỡ và còn có thể phân giải cả peptin, hemixenluloce, lignin và kitin

Có 3 nhóm phương pháp xử lý nước thải sinh học:

- Phương pháp kị khí (anerobic)

- Phương pháp hiếu khí (aerobic)

- Phương pháp thiếu oxy (anoxic)

Phương pháp xử lý hiếu khí

Phương pháp hiếu khí dùng để loại bỏ các hợp chất hữu cơ dễ bị vi sinh vật phân hủy ra khỏi nguồn nước Các chất này được các vi sinh vật hiếu khí oxy hóa bằng oxy hòa tan trong nước

Chất hữu cơ + O2 CO2 + H2O + Năng lượng

Chất hữu cơ + O2 +W Tế bào mới

VSV VSV

Tế bào mới + O2 → CO2 + H2O + NH3 =>Tổng cộng: Chất hữu cơ + O2

Theo phương pháp này các hợp chất trong nước thải được oxy hóa và phân hủy theo 3 giai đoạn:

- Oxy hóa các hợp chất hữu cơ:

CxHyOz + (x+y-z) O2 → xCO2 + y/2 H2O

- Pha phát triển của vi sinh vật:

nCxHyOz + nNH3 + (x + y/4-z/2-5) O2 → (C5H7NO2)n + n(-5) CO2 + n(y-4) /2 H2O

Ở đây CxHyOz là hợp chất hữu cơ và (C5H7NO2)n là tế bào chất Tất cả các phản ứng trên đều xảy ra dưới tác dụng của emzim nội bào hay enzim ngoại bào do vi sinh vật trong bùn hoạt tính tạo nên.Trong quá trình oxy hóa khử các hợp chất hữu cơ bị phân hủy theo thứ tự là: đường, protein, tinh bột, chất béo, các chất cao phân tử (xenluloza, lignin )

Phương pháp thiếu khí (anoxic)

Trong điều kiện thiếu oxy hòa tan việc khử nitrat hóa sẽ sảy ra Oxy được giải phóng từ nitrat sẽ oxy hóa chất hữu cơ và nitơ sẽ tạo thành

Nitrobacter

Nitrosomonas

VSV

lượng, tạo ra ít bùn, khả năng phân huỷ chất hữu cơ tới 75% và tạo ra khí thải Các nghiên cứu cho thấy trong quá trình xử lý kị khí có tới 90% chất hữu cơ trong nước thải biến thành khí sinh học với hàm lượng 60 ÷ 70% có thể sử dụng như một năng lượng tái sinh có giá trị

1.4 Các vi sinh vật ứng dụng khả năng phân giải các hợp chất hữu cơ trong nước thải

Quá trình phân giải các hợp chất hữu cơ trong nước thải là quá trình sinh học phức tạp nhờ hoạt động của vi sinh vật Một lượng lớn chất hữu cơ bị phân giải và làm giảm trọng lượng Trong quá trình này các chất hữu cơ được phân giải thành những phần nhỏ hơn, sinh khối của si sinh vật mới được tạo thành đồng thời tạo ra các sản phẩm của quá trình trao đổi chất và giải phóng năng lượng, các vi sinh vật được chia hay nhóm là tự dưỡng và dị dưỡng Các thành phần vi sinh vật đó là:

Vi khuẩn:

Chủng vi sinh vật cao nhất trong nước thải là vi khuẩn Thành phần hóa học của vi khuẩn gồm khoảng 80% nước, 20% chất khô (trong đó khoảng 90% hữu cơ và vô cơ) Công thức tương đối cho các hợp chất hữu cơ của vi khuẩn là C5H7O2N Theo công thức này thì 53% trọng lượng hợp phần hữu cơ là cacbon Khi xét cả photpho thì công thức chung của tế bào vi khuẩn là C5H87O23N12P Các hợp chất vô cơ gồm có P2O5 (50%), SO3 (15%), Na2O (11%), CaO (9%), MgO (8%), K2O (6%), Fe2O3 (1%) Tất cả các nguyên tố và hợp chất này vi khuẩn đều phải lấy từ môi trường nên vi khuẩn có vai trò quan trọng trong chuyển hóa các chất có trong nước thải Các nhà máy xử lý nước thải thông thường dựa trên sự thủy phân hủy sinh học của các chất hữu cơ không độc nhờ

vi khuẩn Sự phân hủy sinh học này trong điều kiện có oxi có thể được biểu diễn theo phương trình :

Các chất thải hữu cơ + O2 CO2 + H2O + H2SO4 + NH4+ + NO3-

(C, O, N, S)

Các vi sinh vật hóa dị dưỡng chiếm ưu thế vì vi sinh vật dị dưỡng sử dụng các hợp chất hữu cơ làm nguồn cacbon và nguồn năng lượng để thực hiện các phản ứng sinh tổng hợp [1,11]

Vi nấm: Vi nấm có tầm quan trọng trong kỹ thuật môi trường, đó là các

nấm dị dưỡng, hầu hết các vi nấm là vi hiếu khí bắt buộc.Chúng có khả năng sinh trưởng ở điều kiện nhiệt độ thấp và có thể chịu được điều kiện pH tương đối thấp, pH tối ưu cho các nấm là 5-6 mặc dù giới hạn pH là 2-9 Nấm có nhu cầu nitơ thấp, chỉ bằng nửa nhu cầu của vi khuẩn Khả năng sống ở pH thấp

và điều kiện hạn chế về nguồn nitơ và đi cùng với khả năng phân giải cellulose của chúng Đặc điểm này khiến chúng trở nên quan trọng trong phân giải chất thải công ghiệp, chẳng hạn từ các nhà máy sản xuất gỗ, giấy…

Động vật nguyên sinh:

Động vật nguyên sinh là các cá thể đơn bào có khả năng di động Đa số động vật nguyên sinh là dị dưỡng hiếu khí, một số là kỵ khí Protozoa thường lớn hơn vi khuẩn và có khả năng thực khuẩn, dùng chúng làm nguồn năng lượng Trong các quá trình xử lý chất thải bằng phương pháp sinh học, protoza thường lớn hơn vi khuẩn và có khả nằn thực khuẩn, dùng chúng làm nguồn năng lượng Trong các quá trình xử lý nước thải bằng phương pháp sinh học, Protozoa hoạt động như một yếu tố làm sạch dòng chảy do tiêu thụ vi khuẩn và các chất hữu cơ

Tảo, vi khuẩn lam:

Tảo và vi khuẩn lam là sinh vật đơn bào, tự dưỡng Chúng có vai trò quan trọng đối với xử lý sinh học bởi hai lý do:

- Trong ao hồ chúng quang hợp tạo ra oxi cần thiếtcho hệ sinh thái nước

- Ở các bể oxi hóa hiếu khí hay hiếu khí không bắt buộc thì tảo cũng cần cung cấp oxi cho các vi khuẩn hiếu khí dị dưỡng

1.5 Các chất hữu cơ và các enzyme vi sinh vật phân giải

Quá trình phân hủy các hợp chất hữu cơ trong tự nhiên là quá trình hóa sinh phức tạp Nhờ hoạt động sống của vi sinh vật, một lượng lớn hợp chất hữu

cơ bị phân giải Trong quá trình phân hủy các vi sinh vật tiết ra các enzym ngoại bào và các hợp chất hữu cơ như xenlulose, tinh bột, protein…được phân giải thành những phần nhỏ như các axit hữu cơ, peptit, các đường đơn, các axit amin…đồng thời sinh khối vi sinh vật được tạo thành và các sản phẩm cuối cùng của quá trình trao đổi chất là CO2, CH4, H2O Các hợp chất hữu cơ trong tự nhiên chủ yếu là xenlulose, hemi- xenlulose, tinh bột, protein…ưu tiên các sinh vật có hoạt tính amylase, cellulose, protease [1,19]

1.5.1 Tinh bột và enzyme amylase

Tinh bột là polysaccarit dự trữ của thực vật, chủ yếu có trong hạt, phổ

biến ở các loại lúa mỳ, khoai tây, sắn, gạo… Phân tử tinh bột có công thức cấu tạo là C6H10O5

- Amylose có chứa liên kết -1,4-glucozit Phân tử cấu tạo dạng chuỗi không phân nhánh, dài khoảng 300-1000 gốc glucose, xoắn theo kiểu lò xo, cấu trúc xoắn được giữ vững nhờ liên kết hydro được tạo thành giữa các nhóm -OH

tự do Amylase tạo thành màu xanh khi kết hợp với iốt

- Amylopectin có chứa cả liên kết -1,4-glucozit và -1,6-glucozit Cấu trúc phân tử của nó bao gồm một nhánh trung tâm (chứa liên kiết 1,4-glucozit),

từ nhánh này phát ra các nhánh phụ có chiều dài khoảng vài chục gốc glucose

Enzym amylase Trong tự nhiên có rất nhiều loại vi sinh vật có khả năng

tổng hợp amylase xúc tác cho quá trình thuỷ phân tinh bột, glycogen… thành các phân tử có khối lượng nhỏ hơn như: oligosaccarit, glucose, maltose… Amylase có ba loại:

- -amylase(amylo-1,4-dextrinase) có khả năng phân giải các liên kết 1,4-glucozit trong chuỗi polysaccarit thành các dextrin phân tử thấp, nhưng lại không phân giải được liên kết -1,6-glucozit và một số các liên kết -1,4-glucozit ở gần chỗ phân nhánh Dưới tác dụng của -amylase, tinh bột bị giảm khối lượng phân tử mạnh, đồng thời gây giảm tính nhớt, mất khả năng tạo màu với iốt

-amylase (amylo-1,4glucozidase) có khả năng phân giải liên kết glucozit nhưng không có khả năng phân giải liên kết -1,6-glucozit Sản phẩm cuối cùng là maltose và glucose

-1,4 -amylase (amylo-1,6-dextrinase) có khả năng phân giải các liên kết 1,6-glucozit, giúp thuỷ phân tinh bột thành các dextrin, glucose và maltose

Hầu hết các vi khuẩn đều có khả năng sinh amylase như: Aspergillus oryzae, Bacillus subtilis, Bacillus diastaticus, Aerobacillus macerans Trong đó Bacillus là một trong những nhóm được xét là có khả năng sinh amylaza mạnh

Hầu hết các chế phẩm xử lý ô nhiễm đều có thành các loài thuộc chi Bacillus.[1]

1.5.2 Cellulose và enzyme cellulose

Cellulose là thành phần chính có trong lớp vỏ của tế bào thực vật Công

thức cấu tạo chung của xenlulose là (C6H10O5)n Khác với tinh bột, hợp chất cao phân tử này được cấu tạo từ hàng trăm, hàng nghìn gốc -1,4-glucose liên kết với nhau bằng liên kết -1,4-glucozit tại vị trí C1 của phân tử glucose này với vị trí C4 của phân tử glucose kế tiếp [6]

CMC (Cacboxymethyl cellulose) được tạo thành khi cho alcalixenlulose

tác dụng với axit cloaxetic hoặc muối natri cloaxetat cho nên CMC có thể tồn tại

ở hai dạng H hoặc Na Dạng H - CMC không tan trong nước, rượu, axeton nhưng tan trong dung dịch kiềm cũng như trong các hệ dung môi dùng để hoà tan cellulose

Cellulose: Hàng loạt vi khuẩn và nấm có khả năng phân giải cellulose một

cách tự nhiên nhờ hoạt động phối hợp của một tập hợp các enzyme Cellulose Ở một số vi khuẩn hoạt tính cellulose thường gặp trong một số phức hệ nhiều enzyme

- Endoglucanase (CMC-ase) có khả năng cắt đứt các liên kết bên trong

phân tử cellulose làm giảm nhanh chiều dài chuỗi và làm tăng các nhóm khử Chúng thuỷ phân liên kết -1,4-glucozit một cách tuỳ tiện và giải phóng

xenlodextrin, cellobiose và glucose Giúp phân giải mạnh các cellulose hoà tan nhất là dạng xenluloza vô định hình và hoạt động chủ yếu ở vùng kết tinh

- Exoglucanase (exo-1,4--D glucan-exolobiohydrolase) có khả năng tấn công chuỗi cellulose từ đầu không khử và giải phóng chủ yếu ra cellobiose, đôi khi là glucose Enzym này không phân giải cellulose kết tinh cũng như cellulose hoà tan khác, chúng tác dụng yếu lên CMC nhưng hoạt động mạnh lên cellulose vô định hình hoặc cellulose đã phân giải một phần như cellodextrin

- -1,4-glucozidase(cellobiase) có khả năng thuỷ phân mạnh cellobiose

hay các cellodextrin hoà tan trong nước giải phóng glucoza Hoạt tính giảm của chúng giảm dần theo chiều dài của chính sự tích luỹ các chất cảm ứng của enzyme cellulose

Các loại vi khuẩn sinh Cellulose chủ yếu thuộc hiếu khí như:

Achromobacter, Pseudomonas, Cellulomonas, Vibrio, Cellvibrio, Bacillus, Cytophaga, Angiococcus, Polyangium, Sporocytophaga, Sorangium, Archangium, Promyxo bacterium Nấm sợi sinh xenlulaza nhiều hơn vi khuẩn Chúng tiết

vào môi trường hệ enzym đầy đủ hơn nên thủy phân hoàn toàn cơ chất cellulose

Ví dụ một số chủng đã được nghiên cứu như: Trichoderma reesei, T viride, Fusariumsolani, Penicillium pinophinum, Phanerochate chrysosporium, Sporotrichum pulverulentum và Sclerolium rolfsii

1.5.3 Các chất protein và enzyme protease

Protein là những phân tử sinh học hay đại phân tử, chứa một hoặc nhiều

mạch dài của các nhóm axit amin

Một số vi khuẩn và nấm, đặc biệt là các vi sinh vật gây bệnh, vi sinh vật làm hư hỏng thực phẩm và vi sinh vật đất, có thể sử dụng các protein làm nguồn carbon và năng lượng Nhiều vi sinh vật khác phân giải protein và acid amin chỉ khi vắng mặt các nguồn C như glucose và lipid Chúng tiết ra enzyme protease thuỷ phân các protein và polipeptit thành acid amin; các acid amin được vận

chuyển vào tế bào và được phân giải [7,9]

Hình 1.3 Sự chuyển amine

Trên đây là 1 ví dụ phổ biến của sự chuyển amin Nhóm α-amino của 17ung17ne đƣợc chuyển sang chất nhận α-ketoglutarat tạo thành pyruvate và glutamate Pyruvate có thể đƣợc chuyển hóa trong chu trình acid tricarboxylic

hoặc đƣợc 17ung trong sinh tổng hợp

Các vi sinh vật có khả năng phân giải protein như nấm men, nấm mốc, vi khuẩn

Vi khuẩn Gồm các loài thuộc hiếu khí, kị khí, sinh bào tử hoặc không sinh bào tử

Các cơ thể chứa protein là chủ yếu Đối với đa số vi sinh vật thì một cơ thể chết là cơ chất tốt nhất Các protein của sinh vật chết vị tấn công và phân huỷ rất nhanh bởi nhiều vi khuẩn và nấm Các enzym phân huỷ protein (các protease), do vi khuẩn và nấm tiết ra, thuỷ phân protein thành các oligopeptit và các axit amin Nhƣ vậy chúng cũng đƣợc dùng làm nguồn năng lƣợng

Hình 1.4 Sơ đồ phân huỷ protein ở bên ngoài và bên trong tế bào vi khuẩn

và những cách biến đổi axit amin tiếp theo

Các protease là những enzym phân huỷ liên kết peptit Trước hết cần phân biệt protease nội bào và protease ngoại bào Loại đầu tiên thực hiện những chức năng của trao đổi chất trong tế bào, còn loại sau phục vụ cho sự phân huỷ các

protease ngoại bào Các protease ngoại bào được tiết vào môi trường và phục vụ

cho việc phân huỷ protein Protease ngoại bào được nhiều vi khuẩn và nấm sinh

ra, nhưng không phải là mọi vi sinh vật đều có khả năng này [1,13]

Tham gia vào sự phân huỷ protein có vô số nấm và vi khuẩn, trong số đó

có Bacillus cereus var mycoides, các Pseudomonas, Proteus vulgaris vv

CHƯƠNG 2: MỤC TIÊU, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

2.1 Mục tiêu nghiên cứu

Phân lập, tuyển chọn được một số chủng vi sinh vật có khả năng phân giải hợp chất hữu cơ trong nước thải nhà máy bia

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu phân lập một số chủng vi sinh vật từ nước thải nhà máy sản xuất bia

- Xác định khả năng phân giải một số hợp chất hữu cơ của các chủng phân lập được

- Xác định một số đặc điểm sinh hóa của các chủng đã phân lập

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Vật liệu nghiên cứu

Các mẫu nước thải chưa qua xử lý dùng để nghiên cứu phân lập, tuyển chọn khả năng phân giải hợp chất hữu cơ được lấy từ nhà máy sản xuất bia Sài Gòn – Đồng Xuân, huyện Mê Linh, Hà Nội trong thời gian từ tháng 11 năm

2017 đến tháng 1 năm 2018

2.3.2 Hóa Chất

Các hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu là các hóa chất thông dụng

có ở Viện Công Nghệ sinh học Lâm Nghiệp ( Do Việt Nam, Trung Quốc sản xuất ); NaCl, H2PO4, MgSO4 , K2HPO4, …

Các hóa chất khác: Cao thịt men (Trung Quốc), peptone (Trung Quốc), agar, tinh bột, sodium carboxymethyl cellulose (CMC)

Các chất nhuộm màu: lugol, tím kết tinh, Fuchsin……

2.3.3 Các trang thiết bị - dụng cụ

Các thiết bị được sử dụng trong phòng thí nghiệm công nghệ vi sinh- hóa sinh của Viện công nghệ sinh học

Dụng cụ: đĩa petri, bình scod, bình tam giác, ống nghiệm;

- Pipet malt, đầu côn, pipet thủy tinh;