Nghiên cứ phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp dextran

Với nhiều ứng dụng như vậy nhưng ở Việt Nam, các công trình khoa học nghiên cứu nhằm khai thác, tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp dextran cao còn rất ít.. Vì vậy

LỜI CẢM ƠN

Khóa luận này được thực hiện tại phòng thí nghiệm của bộ môn Vi sinh- hóa sinh, Viện công nghệ sinh học Lâm Nghiệp Để hoàn thành được khóa luận này em đã nhận được rất nhiều sự động viên, giúp đỡ của nhiều cá nhân và tập thể

Trước hết, em xin chân thành cảm ơn toàn thể thầy cô giáo trong Viện công nghệ sinh học Lâm nghiệp- Trường đại học Lâm Nghiệp Việt Nam đã tạo điều kiện phòng thí nghiệm, trang thiết bi và hóa chất vật tư

Tiếp theo, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Như Ngọc đã luôn đồng hành, tận tâm hướng dẫn, chỉ bảo, truyền đạt những kiến thức, kinh nghiệm của cô trong khoảng thời gian em nghiên cứu khóa luận này

Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình và bạn bè đã luôn động viên giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Do vốn kiến thức của bản thân còn hạn hẹp nên khóa luận không tránh khỏi sai sót Vì thế em mong nhận được những ý kiến đóng góp của thầy cô và bạn bè để bài khóa luận được hoàn thiện hơn

Một lần nữa em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 15 tháng 05 năm 2018 Sinh Viên Thực Hiện Nguyễn Thị Hiền

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

DANH MỤC CẤC TỪ VIẾT TẮT iv

DANH MỤC CÁC BẢNG v

DANH MỤC CÁC HÌNH vi

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1 TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 2

1.1 Giới thiệu chung về dextran 2

1.1.1 Định nghĩa 2

1.1.2 Công thức cấu tạo dextran 2

1.1.3 Cơ chế hình thành dextran 3

1.1.4 Ứng dụng của dextran 6

1.2 Vi sinh vật sinh tổng hợp dextran 8

1.2.1 Giống Leuconostoc 8

1.2.2 Giống Streptococcus 9

1.3.1: Trên thế giới 10

Chương 2 MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12

2.1 Mục tiêu nghiên cứu 12

2.2 Nội dung nghiên cứu 12

2.3 Vật liệu và hóa chất 12

2.3.1 Vật liệu 12

2.3.2 Hóa chất 12

2.4 Dụng cụ, thiết bị 12

2.5 Các môi trường sử dụng trong nghiên cứu 12

2.6 Địa điểm và điều kiện bố trí thí nghiệm 14

2.7 Phương pháp nghiên cứu 14

2.7.1 Phương pháp phân lập 14 2.7.2 Phương pháp tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng sinh dextran cao 14

2.7.3 Phương pháp xác định một số dặc điểm sinh hóa của chủng vi khuẩn

tuyển chọn 17

3.1 Kết quả phân lập các chủng vi khuẩn 20

3.2 Kết quả tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp dextran cao 23

3.2.1 Kết quả đo độ nhớt 23

3.2.2 Kết quả xác định hoạt độ enzyme dextransucrase bằng phương pháp DNS 24

3.2.3 Kết quả thu nhận dextran thô 26

3.3 Kết quả kiểm tra đặc tính sinh hóa của chủng D3, D4, D5, D7 28

Chương 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 32

4.1 Kết luận 32

4.2 Kiến nghị 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CẤC TỪ VIẾT TẮT

L mesenteroides Leuconostoc mesenteroides

S mutan Streptococcus mutan

S sobrinus Streptococcus sobrinus

DNS acid dinitrosalicylic ACM acetyl metyl carbinol

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1: Thành phần môi trường MRS 13

Bảng 2.2: Thành phần môi trường lên men đường 13

Bảng 2.3: Thành phần môi trường thử phản ứng VP 13

Bảng 3.1: Các chủng vi khuẩn phân lập được 20

Bảng 3.2: Độ nhớt của các chủng vi khuẩn phân lập được 23

Bảng 3.3: Mật độ quang của dãy dung dịch chuẩn glucose theo phương pháp DNS 24

Bảng 3.4: Mật độ quang của các mẫu đối chứng (enzyme đã bị bất hoạt) theo phương pháp DNS 25

Bảng 3.5: Hoạt độ enzyme 26

Bảng 3.6: Khối lượng dextran thô thu được 28

Bảng 3.7: Đặc điểm dưới KHV của 4 chủng đã được tuyển chọn 29

Bảng 3.8: Tổng hợp một số đặc điểm hóa sinh của 4 chủng vi khuẩn 30

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1: Hình ảnh công thức cấu tạo dextran 2

Hình 1.2: Hình ảnh cơ chế hoạt động của enzyme dextransaccharase 4

Hình 1.3: Cơ chế ngưng phản ứng tổng hợp dextran của chất nhận 5

Hình 3.1: Đường chuẩn tương quan giữa nồng độ glucose và độ hấp thụ 25

Hình 3.2: Dung dịch sau khi kết tủa với ethanol để qua đêm ở -80C 27

Hình 3.3: Dextran thô thu được 27

Hình 3.4: Lên men đường glucose 30

Hình 3.5: Lên men đường lactose 30

Hình 3.6: Lên men đường sucrose 31

Hình 3.7: Phản ứng VP 31

ĐẶT VẤN ĐỀ

Vi sinh vật trong tự nhiên rất đa dạng và phong phú Ngoài những tác hại

do vi sinh vật gây ra thì nguồn lợi do chúng mang lại cho chúng ta là vô cùng to lớn nếu ta hiểu, biết và sử dụng chúng hợp lí Vì vậy, ngành công nghệ vi sinh ngày càng được trú trọng phát triển Các sản phẩm từ vi sinh vật ngày càng đa dạng, gần gũi và đã dần thay thế các sản phẩm nhân tạo

Có rất nhiều loại polysaccharide được sinh tổng hợp bởi vi sinh vật như alginate, curlane, dextran Đa số các polysaccharide được tổng hợp bên trong tế bào vi sinh vật hoặc là sản phẩm trung gian của sự chuyển hóa nội bào nên việc thu hồi và tinh sạch sẽ khó khăn Trong khi đó, dextran là một polysaccharide được tổng hợp bên ngoài tế bào vi khuẩn nên việc thu nhận nó sẽ tiết kiệm thời gian và kinh phí hơn Hơn nữa nó được ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực như: Chất làm đặc cho mứt và kem, ngăn chặn sự kết tinh đường, cải thiện duy trì độ

ẩm, hương vị, trong ngành công nghiệp thực phẩm; ứng dụng trong các thuốc thay thế huyết tương, sephadex, trong y tế Ngoài ra, dextran còn được ứng dụng trong mỹ phẩm, nhiếp ảnh,

Với nhiều ứng dụng như vậy nhưng ở Việt Nam, các công trình khoa học nghiên cứu nhằm khai thác, tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng sinh

tổng hợp dextran cao còn rất ít Vì vậy, em tiến hành nghiên cứu “phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp dextran” nhằm

khai thác để sử dụng trong các mục đích khác nhau phục vụ đời sống con người

Chương 1 TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

1.1 Giới thiệu chung về dextran

1.1.1 Định nghĩa

Dextran là polymer sinh học, phần lớn được tổng hợp từ các vi khuẩn lactic,

có các monomer là các gốc glucose liên kết với nhau nhờ liên kết 1,6-glucoside [11] Những vi sinh vật khác nhau thường tạo nên những dextran khác nhau về trọng lượng phân tử, về sự phân bố nhánh trong cấu trúc phân tử Cấu trúc này còn phụ thuộc điều kiện nuôi cấy những vi sinh vật sản sinh ra dextran

Dextran chỉ được tổng hợp từ sucrose, không thể tổng hợp từ glucose hay bất

kỳ một loại đường nào khác Các loại đường khác trong môi trường lên men chỉ đóng vai trò như nguồn cacbon cho vi khuẩn phát triển [21]

1.1.2 Công thức cấu tạo dextran

Dextran là một loại polysaccharide tương tự như amylopectin, nhưng mạch chính được hình thành bởi liên kết α-1,6 glucoside và các nhánh bên được gắn với nhau bởi liên kết α-1,3 hoặc α-1,4 glucoside [11]

Hình 1.1: Hình ảnh công thức cấu tạo dextran

1.1.3 Cơ chế hình thành dextran

Đa số các polysaccharide ngoại bào từ vi sinh vật đều là sản phẩm của sự chuyển hóa nội bào cơ chất thành các sản phẩm trung gian, và cuối cùng thành polymer Dextran khác các polysaccharide này, cơ chất không thâm nhập vào tế bào vi sinh vật mà nó được chuyển hóa bên ngoài tế bào thành α-D-glucan phân nhánh, tức là dextran Chỉ có sucrose được dùng làm cơ chất cho phản ứng này, các loại đường khác thúc đẩy tăng trưởng của vi khuẩn nhưng không sản xuất enzyme dextransucrase – là enzyme tham gia trực tiếp vào quá trình chuyển hóa sucrose thành dextran [21]

Polysaccharide có thể được sản xuất bởi các tế bào nguyên vẹn trong môi trường nuôi hoặc có thể được tạo ra từ các chế phẩm phi tế bào chứa phức hệ enzyme dextransaccharase Enzyme này giải phóng Fructose và chuyển gốc glucose lên một gốc nhận cũng đã được liên kết với enzyme:

(1,6- α- D- glucosyl)n + sucrose  ( 1,6- α- D- glucosyl )n+1 + fructose

Hình 1.2: Hình ảnh cơ chế hoạt động của enzyme dextransaccharase

Enzyme giải phóng fructose ra khỏi saccharose và kết hợp tạo phức với gốc glucose Sau đó nhóm C6 - OH của một gốc phức khác kết hợp với C1 và giải phóng X, kết quả là hai gốc glucose liên kết lại với nhau bởi liên kết α-1,6-glucoside Trong quá trình polymer hóa chuỗi dextran đang dài ra vẫn liên kết chặt chẽ với enzyme, mức độ polymer hóa tăng cho đến khi phân tử chất nhận giải phóng chuỗi polymer khỏi enzyme

Năng lượng tự do của liên kết glucoside trong phân tử disaccharide nằm vào khoảng 23kJ trong khi năng lượng tự do của liên kết glucoside bên trong dextran thấp hơn một chút (12-17 kJ) Do vậy phản ứng diễn ra theo chiều từ trái sang phải đi kèm với một sự giảm năng lượng tự do Fructose có thể chuyển thành acid lactic, acid acetic, ethanol [7, 21]

Đáng lưu ý là trong chuỗi phản ứng còn có sự xuất hiện của một chất cho H+ trong phản ứng giải phóng fructose và nhận H+ trong phản ứng liên kết hai gốc glucoside lại với nhau Đó là hai nhóm imidazolium (C3H4N2) của histidine rất cần thiết cho quá trình tổng hợp dextran

Các loại đường khác ngoài sucrose tham gia phản ứng tạo thành các oligosaccharide thay vì các dextran cao phân tử Các gốc glucosyl còn sót lại trong quá trình tổng hợp dextran được chuyển thành các gốc tự do đóng vai trò

như là chất nhận có ảnh hưởng lớn đến phản ứng Trong tất cả các chất nhận thì maltose và isomaltose được xem là ảnh hưởng lớn nhất đến phản ứng Các chất nhận này tương tác cùng hóa trị với phức enzyme-glucosyl hoặc enzyme-dextranosyl để giải phóng glucose hay mạch dextran ra khỏi enzyme hoạt động, đồng thời tạo liên kết với glucose hay dextran ngay tại vị trí của enzyme

Hình 1.3: Cơ chế ngưng phản ứng tổng hợp dextran của chất nhận

Dựa vào cơ chế này người ta có thể khống chế được độ dài mạch dextran trong quá trình sản xuất bằng cách điều khiển sự thủy phân dextran để tạo các chất nhận

Khi chất nhận là dextran cao phân tử, C3 của dextran làm chất nhận kết hợp với C1 của phức glucosyl – enzyme hoặc dextranosyl – enzyme để giải phóng glucose hay dextran và hình thành một liên kết nhánh giữa dextran chất nhận và glucose hay dextran giải phóng tại vị trí của enzyme

Phản ứng này đã tạo thành liên kết nhánh cho mạch dextran, dạng α(1,3)- glucosyl Ngoài ra vẫn có liên kết nhánh dạng α(1,2)- glucosyl nhưng rất ít gặp trong cấu trúc dextran

- Sử dụng trong các chất lỏng truyền tĩnh mạch: Dextran được sử dụng trong một số thuốc nhỏ mắt như một chất bôi trơn và trong một số dịch truyền tĩnh mạch để hòa tan các yếu tố khác Nó đôi khi được sử dụng để thay thế máu

bị mất trong các tình huống khẩn cấp, nơi máu thay thế không có sẵn, nhưng phải được sử dụng thận trọng vì nó không cung cấp chất điện phân và có thể gây

ra giảm natri hoặc các rối loạn điện giải khác

- Hoạt tính chống đông máu: Dung dịch chứa dextran có tác dụng làm tăng nhanh thể tích tuần hoàn Do áp suất thẩm thấu cao hơn huyết tương, nên dịch từ khoang gian bào sẽ đi vào trong nội mạch Tác dụng duy trì thể tích kéo dài trong 3 - 4 giờ [6, 21]

Ngoài ra, nhờ khả năng gắn với nước mạnh mà dextran phân tử lượng thấp có thể cải thiện các tính chất lưu biến của máu vì thế có tác dụng đặc hiệu lên vi tuần hoàn: Tăng cấp dịch vào mô, tăng cung cấp oxygen cho mô, dẫn đến làm loãng máu, tăng cung cấp máu đến tim và giảm sức cản ngoại biên

- Sắt Dextran: Dextran là một vật liệu khởi đầu quan trọng cho tổng hợp sắt dextran Dung dịch sắt dextran để tiêm được áp dụng để điều trị thiếu hụt thiếu máu ở người và thú y

1.1.4.2 Trong công nghiệp thực phẩm

- Trong sản xuất bánh kẹo: Dextrans được sử dụng làm chất phụ gia trong các sản phẩm như bánh kẹo và kem vì nó có tác dụng ổn định, ngăn ngừa sự kết tinh đường, cải thiện độ giữ ẩm và duy trì hương vị cho sản phẩm [21]

- Trong sản xuất kem: Bởi vì dextran có nhiều ưu điểm vượt trội hơn so với các chất ổn định khác như không mùi, không vị và không độc nên nó thường được sử dụng làm chất ổn định trong sản xuất kem Người ta đã thực hiện các nghiên cứu và thấy rằng khi bổ sung 2-4% dextran thì độ ổn định của kem được cải thiện [6]

1.1.4.3 Trong công nghiệp nhiếp ảnh

Phần Dextran có độ tinh khiết cao được sử dụng rộng rãi trong ngành công nghiệp nhiếp ảnh bởi vì người ta đã chứng minh được rằng nó có tác dụng cải thiện chất lượng nhũ tương của các bức ảnh [6]

1.1.4.4 Trong lĩnh vực mỹ phẩm

Dextran và dẫn xuất của nó có khả năng liên kết tạo muối với các chất hoạt động bề mặt nên nó có nhiều tác dụng có lợi như chống lão hóa, chống nhăn, duy trì độ ẩm tốt, làm mềm các vùng da thô ráp, nứt nẻ Vì vậy, người ta

đã sử dụng dextran và các dẫn xuất của nó để sản xuất các sản phẩm dưỡng ẩm, giảm nhăn và chống lão hóa [6]

Ngoài ra, Giri et al đã chứng minh rằng dextran sulfat có tác dụng chống viêm [21]

1.1.4.5 Trong phòng thí nghiệm

- Dextran được sử dụng trong một số kỹ thuật sắc ký loại trừ kích thước,

ví dụ: sephadex được sử dụng để chế tạo các chất mang vi sinh vật trong nuôi cấy tế bào

- Dextran ưu tiên gắn kết với các endosome có gắn huỳnh quang nên nó được ứng dụng trong quan sát các endosome dưới kính hiển vi huỳnh quang

- Dextran đã được sử dụng trong cố định cảm biến sinh học Nó cũng có thể được sử dụng như một lớp phủ ổn định để bảo vệ các hạt nano kim loại mạnh từ quá trình oxy hóa [6]

1.1.4.6 Trong xử lý nước thải

Dextran đã được chứng minh có tác dụng trong xử lý nước thải vì nó có tính ổn định ở môi trường kiềm và axit ở nhiệt độ phòng Do dextran có khả năng liên kết các ion kim loại ở pH kiềm và có thể phân hủy sinh học nên nó được sử dụng rộng rãi trong quá trình keo tụ [6]

1.2 Vi sinh vật sinh tổng hợp dextran

Vi sinh vật dùng để lên men dextran chủ yếu là vi khuẩn axit lactic bao

gồm các chủng thuộc Leuconostoc mesenteroides, Leuconostoc dextranicum, Leuconostoc citrovorus, Saccharomyces cerevisiae, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus sanfrancisco, Streptobacterium dextranicum, Streptococcus mutans, Tuy nhiên hiện nay những chủng có khả năng sinh tổng hợp dextran

cao được đưa vào trong sản xuất quy mô công nghiệp thường là các chủng thuộc

giống Leuconostoc Ngoài ra, người ta còn tiến hành tìm hiểu thêm về các chủng thuộc giống Streptococcus để sản xuất vaccin chống sâu răng

1.2.1 Giống Leuconostoc

- Leuconostoc là vi khuẩn kị khí không bắt buộc, phân bố rộng rãi trong

môi trường tự nhiên và đóng vai trò quan trọng trong quá trình lên men thực phẩm và lên men công nghiệp Sinh trưởng ở nhiệt độ từ 50C đến 300

C, nhiệt độ tối ưu là 250C đến 300

C Hầu hết các giống nằm trong canh trường lỏng có dạng hình cầu, đơn lẻ hoặc tạo thành một cặp hay một chuỗi ngắn Tuy nhiên, hình thái của chúng cũng có thể thay đổi theo điều kiện sinh trưởng mà chúng có hình dạng hơi dài hoặc hình ovan Là vi khuẩn Gram (+), không sinh bào tử và không

di chuyển, có khả năng sinh acid lactic nên chịu được pH thấp

- Một số vi khuẩn Leuconostoc có khả năng tiết ra enzyme ngoại bào là

dextransucrase xúc tác cho phản ứng chuyển nhóm glucosyl còn lại từ phân tử sucrose ngoại bào tạo thành dextran, giải phóng fructose

- Trên thế giới đã có một số nghiên cứu về chủng Leuconostoc sinh tổng hợp dextran Trong đó, Leuconostoc mesenteroides là chủng nổi bật dùng trong

nghiên cứu sinh tổng hợp dextran Trong môi trường chứa scrose, to từ 25-30oC,

pH lên men ban đầu là 7 thì L Mesenteroides sẽ sản xuất enzyme tối đa [28]

+ L mesenteroides CMG 713: Được nuôi cấy trên môi trường chứa 20g/l

sucrose, nuôi ở nhiệt độ 30oC, pH giảm từ 7,5 xuống 4,5 Hoạt động enzyme tối

đa đã quan sát được lúc 20 giờ ủ là 40DSU/ml/giờ, độ nhớt đo được là 14,58 cp Dextran tạo ra không màu, khối lượng dextran tinh khiết trong khoảng 0,11-0,65 (g%) [11]

+ L mesenteroides NRRL B1299: Dextran được tạo ra có đặc điểm chứa

63% liên kết α- 1,6 glucoside, 27% liên kết α- 1,2 glucoside, 8% liên kết α- 1,3 glucoside [11]

+ L mesenteroides B512F: Dextran được tạo ra có đặc điểm chứa 95%

liên kết α- 1,6 glucoside, 5% liên kết α- 1,3 glucoside [11]

+ L mesenteroides AA1: Được nuôi cấy trên môi trường tối ưu chứa

2,5% sucrose, ở nhiệt độ 25oC Hoạt độ của enzyme dextransucrase là 53 DSU/ml/giờ [3]

+ L mesenteroides T1: Được phân lập từ nước lên men trá cây, nuôi cấy

trong môi trường chứa 5% sucrose thì lượng dextran được tạo ra khoảng 18,46 g/l [19]

11,56-1.2.2 Giống Streptococcus

- Streptococcus là vi khuẩn G (+), hình cầu hoặc hình trứng đường kính

nhỏ hơn 1μm, chúng thường đứng riêng lẻ, xếp thành đôi hoặc thành từng chuỗi ngắn như chuỗi hạt, có độ dài ngắn không đều nhau Chiều dài của chuỗi tuỳ thuộc vào điều kiện môi trường

- Streptococcus có khả năng sinh tổng hợp dextran thường là các chủng gây bệnh sâu răng như S mutan, S sobrinus Dextran được tạo ra sẽ giúp vi

khuẩn gây bệnh bám vào răng tạo thành các mảng bám gây sâu răng Dựa vào

cơ chế này người ta đã tiến hành nghiên cứu vaccin chống sâu răng [22]

1.3 Tình hình nghiên cứu dextran

1.3.1: Trên thế giới

- Dextran là 1 polysaccharide ngoại bào từ vi khuẩn được phát hiện vào năm 1861 trong 1 lần Pasteur phát hiện nước ép từ mía bị đặc quánh lại một cách khó hiểu

- Dextran được sản xuất bởi nhiều loài:

+ Năm 1930: Hucker và Pederson là người đầu tiên thông báo việc sản

xuất dextran từ sucrose bởi chủng Leuconostoc [20]

+ Năm 1941: Dextran được sản xuất từ chủng Streptococcus trong môi

trường chứa sucrose cũng đã được báo cáo [20]

- Scheibler là người đầu tiên chứng minh dextran có trọng lượng phân tử

> 1000 Da, có CTCT gồm mạch chính được hình thành bởi liên kết α-1,6 glucoside và các nhánh bên được gắn với nhau bởi liên kết α-1,3 hoặc α-1,4 glucoside

- 1980: Seymour và knapp đã nghiên cứu được cấu trúc chính xác của từng loại dextran [21]

- Càng ngày dextran càng được biết đến nhiều hơn vì nó có các ứng dụng tuyệt vời trong nhiều lĩnh vực Ngoài những ứng dụng hữu ích trong y dược đã được Ingelman và Gronwall tìm thấy, năm 2003 Neubauer et al đã nghiên cứu ứng dụng dextran trong ngành công nghiệp thực phẩm như trong đồ uống có sữa, sữa chua và kem [10]

- Mặc dù dextran có nhiều công dụng nhưng sản lượng dextran được tạo

ra từ các chủng bản địa lại không cao, không đủ đáp ứng nhu cầu sử dụng Vì vậy cần phải nghiên cứu các điều kiện tối ưu, đột biến chủng để thu được lượng dextran tối đa

+ Năm 2003: Behravan et al đã nghiên cứu và thấy rằng đường mật, đường củ cải và cám gạo có thể được sử dụng như nguồn cacbon chính để sản xuất enzyme [10]

+ Năm 2005: UL Qader et al đã nghiên cứu tối ưu hóa các điều kiện sản

xuất dextran từ 2 chủng Leuconostoc mesenteroides PCSIR-4 và PCSIR-9 [20]

+ Năm 2008: Sarwat et al đã nghiên cứu tối ưu hóa các điều kiện để thu

được năng suất tối đa từ chủng Leuconostoc mesenteroides CMG 713 [21]

Cùng trong năm 2008 Kim et al đã nghiên cứu một quy trình mới để sản xuất dextran lâm sàng đơn giản và tiết kiệm hơn các phương pháp truyền thống và được chứng minh là một phương pháp công nghiệp cho sản xuất dextran lâm sàng [21]

- Năm 2012: Ahmed và Sarwat đã nghiên cứu tối ưu hóa các thông số như

pH, to, NaCl và sucrose để vi sinh vật tập trung vào tăng trưởng và sinh dextran [21]

Chương 2 MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Mục tiêu nghiên cứu

Phân lập và tuyển chọn được một số chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp dextran

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Phân lập các chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp dextran từ các sản phẩm lên men

- Tuyển chọn chủng vi khuẩn sinh tổng hợp dextran cao

- Nghiên cứu một số đặc tính sinh hóa của chủng vi khuẩn tuyển chọn

- Các hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu là các hóa chất thông dụng

có ở phòng Bộ môn Công nghệ vi sinh – Hóa sinh thuộc Viện Công Nghệ Sinh Học Lâm Nghiệp (do Việt Nam, Trung Quốc, Đức, Mỹ sản xuất như: Cao nấm men, peptone, glucose, sucrose, triammonium citrate, natri axetat, MnSO4 H2O, MgSO4.7H2O, K2HPO4, Tween 80, bộ nhuộm gram, )

2.4 Dụng cụ, thiết bị

- Buồng cấy, tủ ấm, máy lắc ổn nhiệt, máy li tâm, cân điện tử, kính hiển vi quang học, nồi hấp, tủ lạnh, tủ mát, đĩa petri, bình tam giác, ống nghiệm và các thiết bị khác thuộc phòng thí nghiệm Vi sinh – Hóa sinh Trường Đại Học Lâm Nghiệp Việt Nam

2.5 Các môi trường sử dụng trong nghiên cứu

- Môi trường MRS:

- Môi trường thử hoạt tính sinh hóa:

Bảng 2.2: Thành phần môi trường lên men đường

2.6 Địa điểm và điều kiện bố trí thí nghiệm

Phòng Vi sinh - Hóa sinh, Viện công nghệ sinh học Lâm nghiệp, Trường Đại Học Lâm Nghiệp Việt Nam

2.7 Phương pháp nghiên cứu

- Pha loãng mẫu đến các nồng độ: 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5

- Hút 0,1ml (100µl) dịch ở nồng độ từ 10-2 đến 10-5 nhỏ vào các đĩa petri chứa môi trường MRS Sau đó, dùng que gạt thủy tinh trải đều dịch mẫu khắp mặt thạch Nuôi trong tủ ấm ở nhiệt độ 300C trong 1-2 ngày

- Các khuẩn lạc có hình dạng, màu sắc khác nhau được tách riêng làm thuần trên môi trường mMRS và giữ giống trong các ống nghiệm để sử dụng cho các thí nghiệm sau

2.7.1.3 Phương pháp cấy truyền bảo quản giống trên môi trường thạch nghiêng

- Dán nhãn ghi gồm tên giống vi sinh vật và ngày cấy

- Dùng que cấy lấy khuẩn lạc đã được tách rời cấy sang ống thạch