Tên luận án của nghiên cứu sinh là: ”Nghiên cứu đa dạng vi sinh vật trong mẫu đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin ở Biên Hòa, Đồng Nai và đánh giá khả năng phân hủy của một số chủng phân lập”.
Trang 2Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
Người hướng dẫn khoa học: 1 PGS TS Đặng Thị Cẩm Hà
Viện Công nghệ sinh học
2 TS Nguyễn Kim Thoa
Viện Công nghệ sinh học
Vào hồi giờ, ngày tháng năm 2021
Có thể tìm hiểu luận án tại:
- Thư viện Quốc gia Việt Nam
- Thư viện Viện Công nghệ sinh học
- Trang web của Bộ GD&ĐT
Trang 3MỞ ĐẦU
Gần 50 năm sau chiến tranh, hơn 100 triệu lít thuốc diệt cỏ chứa tetrachlorodibenzo-p-dioxin (2,3,7,8-TCDD là đồng phân dioxin độc nhất với độ độctương đương là 1 đã phun rải và hiện vẫn còn tồn lưu ở miền nam Việt Nam Hỗnhợp chất độc tại các khu vực ô nhiễm khiến môi trường tự nhiên bị phá hủy, sức khỏe
2,3,7,8-di truyền của bệnh nhân phơi nhiễm bị ảnh hưởng qua nhiều thế hệ, hệ vi sinh vật(VSV) bị thay đổi mà vẫn chưa thể lượng giá được Do đó, ô nhiễm chất diệtcỏ/dioxin nói riêng và ô nhiễm các hợp chất hữu cơ khó phân hủy (POPs) nói chungcần phải được loại bỏ theo công ước Stockholm
Trong 20 năm trở lại đây, số lượng nghiên cứu liên quan tới khả năng phân hủychất diệt cỏ/dioxin bởi các VSV phân lập được, số lượng enzyme tham gia vào conđường chuyển hóa cũng như đa dạng VSV không thông qua nuôi cấy (sử dụngphương pháp đa hình cấu hình sợi đơn (Single-Strand Conformation Polymorphism -SSCP, điện di trên gel građient biến tính biến tính (denaturing gradient gelelectrophoresis - DGGE, nhân gene theo thời gian thực (real time Polymerase ChainReaction – RT PCR) tăng dần
Quy mô thử nghiệm và triển khai công nghệ xử lý khử độc bằng phân hủy sinhhọc (Bioremediation) tăng dần từ pilot 0,5 m3 – 100 m3 ở sân bay Đà Nẵng tới quy
mô hiện trường 3.384 m3 ở sân bay Biên Hòa Qua các công bố mới được cập nhật,các VSV có khả năng nuôi cấy chiếm tỷ lệ rất thấp chỉ từ 0,001 đến 0,1% cho thấyhạn chế của các phương pháp nghiên cứu truyền thống đã thực hiện trong các thậpniên qua Do đó, việc áp dụng các công cụ nghiên cứu hiện đại trở nên rất cần thiết để
có thể từng bước hiểu rõ sự đa dạng và bản chất cấu trúc quần xã VSV để từ đó cảitiến quy trình công nghệ hiện có nhằm rút ngắn thời gian và nâng cao hiệu suất xử lý
ô nhiễm hỗn hợp chất diệt cỏ/dioxin vẫn còn tồn đọng ở Việt Nam và các loại chấthữu cơ khó phân hủy (POPs) khác trên thế giới
Giải trình tự và phân tích nguyên liệu di truyền bằng cách tách DNA trực tiếp từmẫu đất ô nhiễm không thông qua nuôi cấy bằng hệ thống máy công năng cao thế hệmới Hiseq Illumina và các phần mềm tin sinh chuyên dụng sẽ khắc phục được hạnchế của các phương pháp nghiên cứu truyền thống Bởi vì kết quả thu được cung cấpthông tin chi tiết về sự đa dạng VSV từ ngành, lớp, bộ, họ, chi cho đến loài cùng hệgene chức năng tồn tại cũng như đa dạng protein giả định và các con đường chuyểnhóa trong metagenome của mẫu nghiên cứu Vì vậy, tại thời điểm này sử dụng công
cụ metagenomic với mẫu đất liên quan tới ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin sẽ cung cấpbức tranh đầy đủ nhất về chủng loài và các mối quan hệ quần xã của vi sinh vật nhằm
Trang 4nâng cao hiệu suất xử lý khử độc bằng công nghệ phân hủy sinh học không chỉ ápdụng đối với ô nhiễm dioxin mà còn với các POPs khác
Với các lý do trên, luận án nghiên cứu sinh đã được thực hiện và đây là nghiêncứu đầu tiên ở Việt Nam sử dụng công cụ nghiên cứu hiện đại với đất ô nhiễm nặngchất diệt cỏ/dioxin ở sân bay Biên Hòa thuộc đối tượng đất đặc thù bởi thành phầnhóa học phức tạp để tách và làm sạch được DNA đủ chất lượng đáp ứng yêu cầu củanghiên cứu Mẫu ở 2 khu vực đã được chọn để nghiên cứu metagenome gồm: đất từkhu Tây Nam Biên Hòa bị ô nhiễm nặng chất diệt cỏ/dioxin có độ độc trung bình21.605 ng TEQ/kg và đất đã được xử lý làm sạch sau 60 tháng ở khu chôn lấp Z1 có
độ độc trung bình 13,2 ng TEQ/kg Tên luận án của nghiên cứu sinh là: ”Nghiên cứu
đa dạng vi sinh vật trong mẫu đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin ở Biên Hòa, Đồng Nai và đánh giá khả năng phân hủy của một số chủng phân lập” Kết quả về sự
đa dạng và các đặc điểm về cấu trúc quần xã và khả năng phân hủy dioxin của một sốđại diện được trình bày trong luận án này là một phần số liệu thu được từ đề tài cấp
nhà nước “Nghiên cứu metagenome của vi sinh vật vùng đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin nhằm tìm kiếm các gene, enzyme mới có khả năng phân hủy dioxin” do
PGS TS Đặng Thị Cẩm Hà chủ nhiệm và đã được nghiệm thu năm 2019
1 Mục tiêu
- Đánh giá đa dạng VSV trong (i) mẫu đất nhiễm nặng chất diệt cỏ/dioxin và (ii)mẫu đất đã được xử lý làm sạch bằng công nghệ phân hủy sinh học ở các lô “Chônlấp tích cực” sau 60 tháng ở sân bay Biên Hòa, Đồng Nai, Việt Nam bằng công cụmetagenomic;
- Đánh giá khả năng phân hủy hiếu khí dioxin trong đất ô nhiễm nặng hỗn hợpchất diệt cỏ/dioxin bằng tổ hợp vi khuẩn và tổ hợp xạ khuẩn (XK) được phân lập vàlựa chọn từ các mẫu đất nghiên cứu
2 Nội dung nghiên cứu
- Thu thập, bảo quản, phân tích thành phần cơ giới của mẫu đất ô nhiễm chất diệtcỏ/dioxin ở sân bay Biên Hòa;
- Tách chiết, tinh sạch DNA từ các mẫu nghiên cứu và xác định trình tự DNAbằng máy giải trình tự công năng cao thế hệ mới Illumina Hiseq 2500;
- Phân tích, đánh giá đa dạng VSV, đa dạng gene chức năng giả định từ dữ liệumetagenome của các mẫu nghiên cứu;
- Đánh giá khả năng phân hủy hiếu khí dioxin trong đất ô nhiễm nặng bằng tổ hợp
vi khuẩn và xạ khuẩn được phân lập từ đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin
Trang 53 Những đóng góp mới của luận án
- Đây là công trình đầu tiên ở Việt Nam sử dụng công cụ metagenomic trongnghiên cứu đa dạng VSV trong đất ô nhiễm nặng chất diệt cỏ/dioxin, đất đã được xử
lý khử độc sạch ở sân bay quân sự Biên Hòa và phát hiện được sự rất đa dạng trongcác quần xã vi khuẩn, vi khuẩn cổ ưa mặn, loại halogen với số lượng các gene chứcnăng mới như laccase và laccase-like tham gia vào phân hủy hợp chất xenobioticcùng sự đa dạng của nấm sợi, nấm men và nấm đảm;
- Bổ sung cơ sở khoa học giải thích sự thành công của công nghệ phân hủy sinhhọc đã thực hiện ở sân bay Biên Hòa và khả năng cải tiến qui trình công nghệ, nângcao hiệu suất xử lý khử độc hỗn hợp chất diệt cỏ/dioxin có tổng độ độc rất cao cũngnhư một số loại hình ô nhiễm POPs khác
4 Bố cục của luận án
Luận án gồm 152 trang: Mở đầu (3 trang); Chương 1: Tổng quan tài liệu (23trang, 5 hình); Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu (12 trang, 5 hình);Chương 3: Kết quả nghiên cứu (40 trang, 11 bảng, 22 hình); Chương 4: Bàn luận kếtquả nghiên cứu (16 trang); Kết luận và kiến nghị (2 trang); Danh sách các công trìnhcông bố (1 trang); Tóm tắt luận án bằng tiếng Anh (7 trang); Tài liệu tham khảo (12trang với 7 tài liệu tiếng Việt, 101 tài liệu tiếng Anh)
CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Dioxin và các hợp chất tương tự thuộc nhóm các chất hữu cơ khó phân hủy (POP)phải được loại bỏ hoàn toàn bởi độc tính và khả năng tồn tại bền vững của chúngtrong môi trường; Lượng chất diệt cỏ/dioxin tồn lưu trong đất bởi chiến tranh hóa học
do Mỹ gây ra rất lớn Điểm nóng Đà Nẵng (Khu bắc sân bay – 361.000 ppt, khuPacer Ivy – 20.600 ppt,) và Biên Hòa (Khu Z1 - 1.578 ppt, khu Tây nam – 110.000ppt, khu Pacer Ivy – 11.400 ppt, khu Đông bắc – 1.300 ppt, khu Tây bắc – 477 ppt)
Sự biến động VSV hiếu khí ở Đà Nẵng và Biên Hòa về số lượng cũng như đadạng chủng loài dao động lớn Quần xã VSV hay cá thể VSV thuần khiết được phânlập đã có thể phân hủy hỗn hợp chất diệt cỏ/dioxin và các chất đa vòng thơm chứa clohay không, chứa khác ở điều kiện hiếu khí kị khí không bắt buộc hoặc kị khí hoàntoàn với hiệu suất khác nhau; Ở sân bay quân sự Đà Nẵng đã sử dụng phương phápkhử hấp thu nhiệt và lưu chứa để loại bỏ dioxin trong 45.000 m3 bùn đất ô nhiễm.Biên Hòa đã thực hiện chôn lấp 90.000 m3 đất ô nhiễm ở khu vực Z1 và trong đó đã
xử lý thành công 3.384 m3 đất ô nhiễm trên 10.000 ngTEQ/kg bằng công nghệ phânhủy sinh học (bioremediation) tổng độ độc chỉ còn 13.2 ngTEQ/kg đất khô
Trang 6Quá trình phân hủy sinh học có thể xảy ra theo 4 con đường chủ yếu trong đó bacon đường oxy hóa cắt vòng, loại clo các hợp chất hữu cơ thơm đã được mở vòng vàxúc tác bởi các enzyme ngoại bào hay các chất xúc tác không có cấu trúc enzymenhưng hoạt động như enzyme đều cần oxy và con đường thứ tư là loại khử clo đối vớicác chất hữu cơ đa vòng thơm (Hình 1.1) Tất cả các quá trình nêu trên được thựchiện bởi tập đoàn vi sinh vật bản địa trong các tầng đất của lô “Chôn lấp tích cực”.Các sản phẩn tạo ra theo các con đường khác rất phong phú ở mỗi giai đoạn và điềukiện môi trường luôn biến động tạo cơ hội cho các quần xã vi sinh vật hoạt động phânhủy, chuyển hóa và sản phẩm cuối cùng của 4 con đường trao đổi chất nói trên là cácchất đi vào chu trình Krebs trước khi được khoáng hóa tới các axit hữu cơ, nước, CO2
và sinh khối vi sinh vật
Hình 1.1: Các con đường chuyển hóa, phân hủy, khoáng hóa hỗn hợp chất diệt cỏ/dioxin và
các chất trao đổi chất bằng phương pháp sinh học.
Nghiên cứu đa dạng VSV liên quan đến loại hình ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin vàkhả năng phân hủy chúng bởi VSV bản địa mới chỉ dừng ở các phương pháp truyềnthống và sinh học phân tử (SSCP và DGGE) Nghiên cứu đa dạng quần xã VSV hiệnnay đã được hỗ trợ bởi các thiết bị giải trình tự công năng cao và các phần mềmchuyên dụng được cải tiến liên tục giúp khắc phục được các nhược điểm trong kỹthuật nuôi cấy và đánh giá cấu trúc quần xã VSV trong môi trường ô nhiễm tạo cơ sởhướng đích tới công nghệ khử độc, làm sạch hỗn hợp ô nhiễm các chất đa vòng thơmtrong đó có chất diệt cỏ/dioxin; Sự phát triển của các phần mềm tin sinh chuyên dụngkết hợp với phát triển, ứng dụng công cụ metagenomic nói riêng và các công cụomics nói chung (metagenomic, metatranscriptomics, proteomics và metabolomics)giúp phát hiện và khai thác VSV trong các vùng ô nhiễm và trong quá trình xử lý;Nghiên cứu metagenome đa dạng hệ VSV kị khí trong mẫu làm giàu đất bùn ô nhiễmchất diệt cỏ/dioxin ở Biên Hòa bước đầu được thực hiện (bằng hệ thống Miseq) Do
sự đa dạng của hệ VSV hiếu khí lớn hơn rất nhiều so với kị khí nên kết quả thu được
sẽ tạo nên bức tranh tổng thể về VSV vùng đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin và hệenzyme tham gia cũng như con đường chuyển hóa giả định
Trang 7CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu
- Đối tượng nghiên cứu: Đất ô nhiễm nặng chất diệt cỏ/dioxin (ký hiệu là mẫu C)
ở khu Tây Nam sân bay Biên Hòa, tỉnh Đồng Nai (10°58'14.3"N 106°48'19.3"E) vàđất đã được xử lý sạch chất diệt cỏ/dioxin sau 60 tháng bằng công nghệ phân hủysinh học trong các lô Chôn lấp tích cực (Bioremediation – ký hiệu là mẫu BHR) ởkhu Z1 (Khu thực hiện dự án “Xử lý ô nhiễm dioxin tại các vùng nóng ở Việt Nam”
do Bộ Quốc phòng thực hiện ở Đồng Nai (10°57'46.4"N 106°49'22.6"E)) được thuthập, bảo quản đảm bảo chất lượng để nghiên cứu tách DNA metagenome và phân lập
vi sinh vật
- Hóa chất nghiên cứu: Đồng loại độc nhất trong các đồng phân của dioxin là
2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (2,3,7,8-TCDD) được cung cấp bởi Công ty Basic (Hà Lan) từ phòng cung cấp hóa chất isotop chuẩn, Vương Quốc Anh
BE-2.2 Phương pháp nghiên cứu
1 Thu thập và bảo quản mẫu đất để nghiên cứu metagenome theo phương pháp lấymẫu đa điểm (MIS)
2 Phân tích thành phần cơ giới và nồng độ dioxin trong mẫu nghiên cứu tại PhòngPhân tích Dioxin và Độc chất, Trung tâm Quan trắc môi trường, Tổng cục Môitrường theo EPA 8280A và Phòng Phân tích trung tâm (CAL) thuộc Viện Thổnhưỡng nông hóa (SFRI)
3 Phân lập, phân loại VSV từ nguồn đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin
4 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme laccase, laccase-like
5 Đánh giá phân hủy 2,3,7,8-TCDD trong đất ô nhiễm bởi hỗn hợp VSV
6 Phương pháp tách chiết DNA metagenome trực tiếp có cải tiến theo phương phápcủa Bourrain, Zhou, Islam và tách chiết DNA sử dụng Kit thương mại chuyêndụng như PowerSoil® DNA Isolation Kit (MO BIO Laboratories, Inc.) có cải tiến vàSoil DNA Isolation Kit (Norgen Biotek Corp.), E.Z.N.A.® Soil DNA Kit (OmegaBio-tek) ; ;
7 Xác định hàm lượng, độ tinh sạch của mẫu DNA metagenome bằng điện di gelagarose , đo độ hấp thụ của DNA tại bước sóng 260 nm và định lượng DNA
bằng nhuộm huỳnh quang (Bolger và cs, 1997).
8 Phân tích trình tự DNA metagenome của mẫu C và BHR sử dụng hệ thốngIllumina Hiseq 2500 tại công ty Baseclear, Hà Lan và hệ thống MG-RAST
Để thu được kết quả nghiên cứu phù hợp với mục tiêu đề ra, các bước thí nghiệmcủa luận án được thực hiện theo sơ đồ hình 2.1
Trang 8Hình 2.1 Sơ đồ thực hiện nghiên cứu CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Mức độ đa dạng VSV trong metagenome của 2 mẫu đại diện được mô tả ở mức
độ ngành, lớp, bộ, họ, chi và loài có liên quan trực tiếp đến phân hủy dioxin và cácchất tương tự Các chi được phát hiện rất mới trong ngành vi khuẩn, vi khuẩn cổ vàsinh vật nhân thật có mặt trong đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin Do số liệu thu đượcquá lớn nên nội dung luận án chỉ tập trung vào những kết quả quan trọng nhất Visinh vật từ hai mẫu đất nghiên cứu nuôi cấy đã được chọn để trình bày đầu tiên trongphần đầu của chương kết quả nghiên cứu này để chứng minh vai trò của những nhóm
vi khuẩn, xạ khuẩn hiếu khí trong quá trình xử lý khử độc đất ô nhiễm hỗn hợp chấtdiệt cỏ /dioxin và các chất trao đổi chất khác
3.1 Phân hủy sinh học chất diệt cỏ/dioxin bởi tổ hợp vi khuẩn, xạ khuẩn quy mô phòng thí nghiệm
3.1.1 Vi khuẩn từ đất nhiễm dioxin phân lập được, định danh và khả năng phân hủy dioxin bởi tổ hợp 5 chủng vi khuẩn có tiềm năng
Để đánh giá khả năng xử lý khử độc bởi VSV đối với chất diệt cỏ/dioxin, nộidung nghiên cứu khả năng phân hủy đã thực hiện độc lập trước khi sử dụng công cụmetagenomic và được đối chiếu lại với cơ sở metagenome của mẫu Từ đất ô nhiễmnặng chất diệt cỏ/dioxin (C) và đất ở khu vực xử lý bằng phân hủy sinh học (BHR), 5chủng vi khuẩn có khả năng sinh trưởng tốt trên môi trường MSM chứa dịch chiết đất
đã được phân lập (Hình 3.1)
Trang 9Hình 3.1 Hình thái khuẩn lạc 5 chủng vi khuẩn BHBi1, BHBi4, BHBi5, BHBi7 và BHO9 từ
mẫu làm giàu trên môi trường MSM chứa dịch chiết đất
Các chủng vi khuẩn phân lập được sử dụng trong nghiên cứu đều sinh trưởng tốttrên môi trường muối khoáng chứa chất độc Dưới kính hiển vi điện tử quét có độphóng đại từ 10.000 đến 50.000 lần, hình dáng và kích thước tế bào rất khác nhauđược xác định thể hiện ở Hình 3.2
Hình 3.2 Hình thái tế bào 5 chủng vi khuẩn dưới kính hiển vi điện tử quét
A: BHBi1; B: BHBi4; C: BHBi5; D: BHBi7; E: BHO9
Năm chủng vi khuẩn được định danh dựa vào trình tự gene 16S rRNA và đặt tên tương
ứng Methylobacterium sp BHBi1, Hydrocarboniphaga sp BHBi4, Agrobacterium sp BHBi5, Bosea sp BHBi7, Microbacterium sp BHO9 (Hình 3.3).
Ba trong số 5 chủng từ kết quả giải trình tự metagenome của 3 mẫu nghiên cứu đãđược phát hiện thấy ở mức độ chi trong metagenome của các mẫu nghiên cứu là
Agrobacterium sp BHBi5, Microbacterium sp BHO9, Methylobacterium sp BHBi1 Chi Agrobacterium có 3 đại diện xuất hiện ở trong cả 2 mẫu với tỷ lệ giảm dần là Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium vitis, Agrobacterium rhizogenes Chi Methylobacterium cũng có các đại diện từ 2 mẫu gồm M chloromethanicum, M extorquens, M nodulans, M populi, M radiotolerans, Methylobacterium sp 4-46 Hai chủng Hydrocarboniphaga sp BHBi4, Bosea sp BHBi7 hiện không tìm thấy đại
diện nào trong dữ liệu phân tích metagenome 2 mẫu
Trang 10Hình 3.3 Cây phát sinh chủng loại của 5 chủng vi khuẩn
Khả năng phân hủy dioxin trong đất bởi tổ hợp vi khuẩn đã được phân tích đánhgiá bằng GC/MS Hỗn hợp 5 chủng vi khuẩn đã phân hủy 59,1% tương đương1756,78 ngTEQ/kg sau 30 ngày nuôi lắc ở 30oC với độ độc ban đầu cao >4.000ngTEQ/kg Nếu tính theo ngày thì hiệu suất phân hủy đồng loại 2,3,7,8-TCDD lên tới84,58 ngTEQ/kg/ngày (Hình 3.4, Bảng 3.1)
Hình 3.4 Khả năng phân hủy chất diệt cỏ/dioxin trong đất bằng tổ hợp vi khuẩn
A: Đối chứng (không có VSV); B: Tổ hợp 5 chủng vi khuẩn
Bảng 3.1. Hiệu suất phân hủy dioxin trong đất ô nhiễm bởi tổ hợp 5 chủng vi khuẩn
Tổ hợp vi khuẩn Tổng độ độc (ngTEQ/kg đất khô) Phân hủy (%)
3.1.2 Xạ khuẩn từ đất nhiễm dioxin đã được phân lập, định danh và khả năng phân hủy dioxin bởi tổ hợp 5 chủng xạ khuẩn tiềm năng
Trang 11Từ mẫu ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin 5 chủng xạ khuẩn được phân lập và nuôi lắc150v/ph ở 30oC trong môi trường chứa chất diệt cỏ/dioxin để tăng khả năng sử dụngchất độc của chúng mục đích làm giống cho các nghiên cứu tiếp theo (Hình 3.5).
Hình 3.5 Hình thái khuẩn lạc 5 chủng xạ khuẩn trên môi trường Gause M chứa DCĐ
Hình 3.6 Cây phát sinh chủng loài của chủng xạ khuẩn XKBH921
Trong số 5 chủng nghiên cứu, chủng xạ khuẩn XKBH921 đã được phân loại và
định danh dựa vào trình tự gene 16S rRNA và đặt tên là Streptomyces sp XKBH921
(Hình 3.6)
Cả 5 chủng đều thuộc chi Streptomyces và đã có mặt ở metagenome của các mẫu
nghiên cứu Năm chủng xạ khuẩn đều có khả năng sinh tổng hợp laccase-like vớihoạt tính khác nhau Chủng XKBHA3 sinh laccase cao nhất 167 U/L trong 4 ngàyđầu và giảm dần sau 13 ngày còn 137 U/L Chủng XKBH28 sinh trưởng nhanh vàhoạt tính enzyme cũng đạt rất cao 360 U/L sau 3 ngày nuôi lắc và cũng giảm dần đến
288 U/L sau 13 ngày nuôi Chủng XKBHA22 sinh laccase-like nhưng lại tăng dầntheo thời gian, sau 3 ngày chỉ đo được 84 U/L và sau 13 ngày là 294 U/L và còn xuhướng tăng theo thời gian Tổ hợp 5 chủng xạ khuẩn trong đất nhiễm chất diệtcỏ/dioxin cũng xác định được laccase-like (Hình 3.7) Chủng XKBHA22 cũng đã
Trang 12được sử dụng để đánh giá khả năng phân hủy 2,3,7,8-TCDD, sau 30 ngày nuôi cấyhiệu suất phân hủy TCDD kém hơn hẳn so với hỗn hợp 5 chủng xạ khuẩn (Hình 3.7
đo được 294 U/L
Bảng 3.2 Hiệu suất phân hủy dioxin trong đất ô nhiễm bởi chủng XKBHA22
Chủng xạ khuẩn Tổng độ độc (ngTEQ/kg đất khô) Phân hủy (%)
Sự khác biệt so với các công bố khác là sử dụng hỗn hợp các chủng xạ khuẩn sinhtổng hợp laccase-like trong môi trường đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin trong đất cótổng độ độc là 4294,12 ngTEQ/kg Nếu tính theo ngày thì hiệu suất phân hủy đồngloại 2,3,7,8-TCDD lên tới 72.59 ngTEQ/kg đất/ngày (Hình 3.8)
Hình 3.8 Phân hủy chất diệt cỏ/dioxin trong đất bằng tổ hợp xạ khuẩn
A: Đối chứng (không có VSV); B: Tổ hợp 5 chủng xạ khuẩn
Hỗn hợp 5 chủng xạ khuẩn trong nghiên cứu này phân hủy 50,7% 2,3,7,8-TCDDtrong đất (2177,96 ngTEQ/kg) sau 30 ngày nuôi lắc ở 30oC được xác đình bằngHRGC/HRMS (Bảng 3.3)
Bảng 3.3. Hiệu suất phân hủy dioxin trong đất ô nhiễm bởi tổ hợp 5 chủng xạ khuẩn
Trang 13Tổ hợp xạ khuẩn Tổng độ độc (ngTEQ/kg đất khô) Phân hủy%
Mẫu C (23,2 ng/µl) Mẫu BHR (14,1 ng/µl)
Hình 3.9 Điện di đồ DNA mẫu nghiên cứu trên gel agarose
3.2.2 Trình tự, contig và gene chức năng từ metagenome mẫu C và BHR
Trình tự dữ liệu sau phân tích thu được là rất lớn (15 Gb) và độ chính xác cao(99,9%) Các thông số chi tiết về 2 mẫu như số lượng contig, tổng số bp, tỷ lệ phầntrăm GC, kích thước Contig lớn nhất, nhỏ nhất và trung bình cùng với các thông tinkhác cũng được thống kê rõ (Bảng 3.4 và Bảng 3.5)
Bảng 3.4. Trình tự read chất lượng cao
Mẫu Số lượng reads Độ lớn của mẫu (Mb) Điểm chất lượng trung bình (Phred)
Trang 14Các contig được sắp xếp và phân tích bằng hệ thống máy chủ MG-RAST với mã
số (MG-RAST ID) là 4730381.3 (C) và 4720115.3 (BHR) để nghiên cứu cấu trúcquần xã VSV và các nhóm gen chức năng tham gia vào các quá trình chuyển hóa của
tế bào (Bảng 3.6)
Bảng 3.6. Phân bố gene từ trình tự DNA metagenome C, BHR
Phân bố của gene trong DNA metagenome C BHR
Gene chứa peptide tín hiệu 5.051 10.954
Khối lượng gene (gene/Mbp) 963 1.012
Tổng kích thước gene 49.330.702 145.153.973
Kích thước gene lớn nhất 17.244 21.804
3.2.3 Đa dạng VSV của metagenome C và BHR
Trong tổng số 80.156 đoạn trình tự (OTU) của mẫu C và 268.768 OTU của mẫuBHR dự đoán được từ cơ sở dữ liệu RefSeq, các trình tự so sánh tương đồng với cáctrình tự có nguồn gốc từ vi khuẩn của 2 mẫu đều chiếm đa số (C đạt 79.508 (99,19%)
và BHR 263.858 (98,17%)) Tương tự như vậy, các trình tự từ vi khuẩn cổ (vi khuẩn