Nghiên cứu đa dạng vi sinh vật trong mẫu đất nhiễm chất diệt cỏ dioxin ở biên hòa, đồng nai và đánh giá khả năng phân hủy của một số chủng phân lập

Trong 20 năm trở lại đây, số lượng nghiên cứu liên quan tới khả năng phân hủy chất diệt cỏ/dioxin bởi các VSV phân lập được, số lượng enzyme tham gia vào con đường chuyển hóa cũng như đa

PH ẠM QUANG HUY

VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY CỦA MỘT SỐ

LU ẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Hà N ội, 2021

PH ẠM QUANG HUY

VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY CỦA MỘT SỐ

i

Nguy ễn Kim Thoa, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công

nghệ Việt Nam đã tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện tốt nhất về cơ sở vật chất cũng như động viên tôi trong những lúc khó khăn nhất để tôi có thể thực hiện và hoàn thành luận án này

Tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn tới Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học

đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi được học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận

án Tôi xin cảm ơn tập thể cán bộ Phòng Công nghệ sinh học tái tạo môi trường đã

tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận án

Tôi xin chân thành cảm ơn sự hỗ trợ kinh phí từ đề tài độc lập cấp nhà nước:

“Nghiên cứu metagenome của vi sinh vật vùng đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin

nh ằm tìm kiếm các gen, enzyme mới có khả năng phân hủy dioxin” do PGS

TS Đặng Thị Cẩm Hà chủ nhiệm

Tôi xin chân thành cảm ơn ThS Bùi Thị Hải Hà, chuyên viên phụ trách đào

tạo, Viện Công nghệ sinh học đã tận tình hướng dẫn tôi hoàn thành mọi thủ tục trong suốt quá trình học tập làm nghiên cứu sinh tại Viện

Cuối cùng, tôi xin gửi tới người thân trong gia đình cùng bạn bè sự biết ơn, đặc biệt là bố mẹ đã dành cho tôi tình yêu thương sâu sắc và tạo điều kiện tốt nhất

để tôi học tập và hoàn thành tốt nội dung luận án

Tôi xin trân trọng cảm ơn!

NCS Phạm Quang Huy

ii

cộng sự khác

Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực, một phần đã được công

bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả

Các thông tin trích dẫn trong luận án đã được ghi rõ nguồn gốc

Tác giả

NCS Phạm Quang Huy

iii

M ỤC LỤC iii

DANH M ỤC CÁC BẢNG vi

DANH MỤC CÁC HÌNH vii

DANH M ỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ix

M Ở ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Phân h ủy sinh học chất diệt cỏ/dioxin 4

1.1.1 Đặc điểm và ảnh hưởng của chất diệt cỏ/dioxin tới môi trường và con người 4

1.1.2 Ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin ở sân bay Biên Hòa và Đà Nẵng 5

1.1.3 Phân hủy sinh học chất diệt cỏ/dioxin trong đất ô nhiễm 7

1.2 Đa dạng VSV và gene chức năng trong đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin 12

1.2.1 Đa dạng VSV hiếu khí nuôi cấy được trong đất ô nhiễm 12

1.2.2 Đa dạng vi khuẩn kị khí nuôi cấy được trong đất ô nhiễm dioxin 13

1.2.3 Đa dạng gene chức năng mã hóa cho enzyme tham gia phân hủy ch ất diệt cỏ/dioxin 18

1.3 Sử dụng công cụ metagenomic nghiên cứu đa dạng VSV ô nhiễm POPs 19

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27

2.1 V ật liệu 27

iv

2.1.3 Môi trường nuôi cấy 30

2.1.4 Sơ đồ thí nghiệm 30

2.2 Phương pháp nghiên cứu 32

2.2.1 Thu thập và bảo quản mẫu đất để nghiên cứu metagenome 32

2.2.2 Phân tích thành phần cơ giới và nồng độ dioxin trong mẫu nghiên cứu 32

2.2.3 Phân l ập, phân loại VSV từ nguồn đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin 32

2.2.4 Phương pháp xác định hoạt tính laccase và laccase-like 33

2.2.5 Đánh giá phân hủy 2,3,7,8-TCDD trong đất ô nhiễm bởi hỗn hợp VSV 34

2.2.6 Phương pháp tách chiết DNA metagenome 35

2.2.7 Phương pháp xác định hàm lượng và độ tinh sạch của DNA metagenome 35

2.2.8 Phân tích trình t ự DNA metagenome của C và BHR 36

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 39

3.1 Phân hủy sinh học chất diệt cỏ/dioxin bởi tổ hợp vi khuẩn, xạ khuẩn quy mô phòng thí nghi ệm 40

3.1.1 Vi khuẩn từ đất nhiễm dioxin phân lập được, định danh và khả năng phân h ủy dioxin bởi tổ hợp 5 chủng vi khuẩn có tiềm năng 40

3.1.2 Xạ khuẩn từ đất nhiễm dioxin đã được phân lập, định danh và khả năng phân hủy dioxin bởi tổ hợp 5 chủng xạ khuẩn tiềm năng 42

3.2 Đa dạng VSV và gene chức năng từ trình tự DNA metagenome C và BHR 46

3.2.1 Thu nhận DNA metagenome từ mẫu C và BHR 46

v

3.2.4 M ối liên hệ giữa một số chi vi khuẩn với tổng độ độc và các đặc

tính lý hóa c ủa đất 69 3.2.5 Đa dạng gene chức năng tham gia phân hủy xenobiotic của

metagenome C và BHR 70 3.2.6 Nhóm gene mã hóa enzyme tham gia phân hủy, chuyển hóa chất

di ệt cỏ/dioxin 72 3.2.7 Gene tham gia vào phân hủy chuyển hóa xenobiotic từ metagenome

đã được phát hiện 76

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 79

4.1 Đa dạng VSV và gene chức năng từ trình tự DNA metagenome C

và BHR thu được 79 4.2 Đa dạng gene chức năng tham gia phân hủy xenobiotic của

metagenome C và BHR (một trong 4 con đường phân hủy và

khoáng hóa dioxin) 92

K ẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 95

NH ỮNG CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN

QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI 97 TÓM T ẮT LUẬN ÁN BẰNG TIẾNG ANH 98 TÀI LI ỆU THAM KHẢO 105

PH Ụ LỤC

vi

cỏ/dioxin bởi tổ hợp 5 chủng vi khuẩn 42

B ảng 3.2 Hiệu suất phân hủy dioxin trong đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin bởi chủng XKBHA22 45

B ảng 3.3 Hiệu suất phân hủy dioxin trong đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin bởi tổ hợp 5 chủng xạ khuẩn 45

B ảng 3.4 Trình tự read chất lượng cao 47

B ảng 3.5 Lắp ráp de novo trình tự DNA metagenome C, BHR 48

B ảng 3.6 Phân bố gene từ trình tự DNA metagenome C, BHR 48

B ảng 3.7 Đa dạng ở các mức độ phân loại của metagenome C và BHR 52

B ảng 3.8 Một số chi có các đại diện đã được chứng minh có khả năng phân huỷ chất diệt cỏ/ dioxin 57

B ảng 3.9 Đa dạng nấm sợi và nấm đảm trong metegenome của C và BHR 66

Bảng 3.10 Số lượng trình tự tương đồng cao với các gene chức năng trong tập dữ liệu chuẩn hóa 71

B ảng 3.11 Số lượng trình tự liên quan đặc thù tới con đường phân 2,4-D và polychlorinated biphenyl (PCB) dựa trên cơ sở dữ liệu KEEG 72

vii

Hình 1.2 Cơ chế tạo ra 2,3,7,8-TCDD trong quá trình tổng hợp 2,4,5-T 5

Hình 1.3: C ác con đường chuyển hóa, phân hủy, khoáng hóa hỗn hợp chất diệt cỏ/dioxin và các chất trao đổi chất bằng phương pháp sinh h ọc 8

Hình 1.4 Nghiên c ứu theo hướng -Omics trong sinh học 20

Hình 1.5 Các bước thực hiện phân tích metagenomic 22

Hình 2.1 M ẫu đất nhiễm nặng chất diệt cỏ/dioxin (ký hiệu C) 27

Hình 2.2 M ặt cắt dọc của lô xử lý 28

Hình 2.3 M ẫu đất trong lô xử lý bằng công nghệ phân hủy sinh học (ký hi ệu BHR) 28

Hình 2.4 Sơ đồ thực hiện nghiên cứu 31

Hình 2.5 Quy trình phân tích d ữ liệu DNA metagenome trên hệ thống MG RAST 37

Hình 3.1 Hình thái khu ẩn lạc 5 chủng vi khuẩn BHBi1, BHBi4, BHBi5, BHBi7 và BHO9 từ mẫu làm giàu trên môi trường MSM chứa dịch chiết đất 40

Hình 3.2 Hình thái t ế bào 5 chủng vi khuẩn dưới kính hiển vi điện tử quét 41

Hình 3.3 Cây phát sinh ch ủng loại của 5 chủng vi khuẩn 41

Hình 3.4 Kh ả năng phân hủy chất diệt cỏ/dioxin trong đất bằng tổ hợp vi khuẩn A: Đối chứng (không có VSV); B: Tổ hợp 5 chủng vi khuẩn 42

Hình 3.5 Hình thái khu ẩn lạc 5 chủng xạ khuẩn và sinh trưởng của chúng trên môi trường Gause M chứa DCĐ 43

viii

Hình 3.9 Điện di đồ DNA mẫu nghiên cứu trên gel agarose 47

Hình 3.10 Đa dạng ở các mức độ khác nhau của metagenome C (vòng ngoài) và BHR (vòng trong) trên cơ sở dữ liệu RefSeq 51

Hình 3.11 Đa dạng vi khuẩn ở mức độ ngành trong metagenome C và BHR 52

Hình 3.12 Đa dạng vi khuẩn ở mức độ lớp trong metagenome C và BHR 53

Hình 3.13 Đa dạng vi khuẩn ở mức độ bộ trong metagenome C và BHR 54

Hình 3.14 Đa dạng vi khuẩn ở mức độ họ trong metagenome C và BHR 55

Hình 3.15 Đa dạng vi khuẩn ở mức độ chi trong metagenome C và BHR 56

Hình 3.16 Đa dạng vi khuẩn cổ mức độ ngành trong metagenome C và BHR 63

Hình 3.17 Đa dạng vi khuẩn cổ ở mức độ lớp trong metagenome C và BHR 63

Hình 3.18 Đa dạng vi khuẩn cổ ở mức độ chi trong metagenome C và BHR 63

Hình 3.19 Đa dạng vi khuẩn cổ sinh metan trong metagenome C và BHR 65

Hình 3.20 Đa dạng vi khuẩn cổ ưa mặn trong metagenome C và BHR 65

Hình 3.21 Các chi vi khu ẩn có tỷ lệ chiếm ưu thế ít chênh lệch trong metagenome của mẫu C và BHR 70

Hình 3.22 Tương quan gene liên quan đến chuyển hóa xenobiotic giữa metagenome C và BHR 71

CDS Coding sequence (Trình tự mã hóa)

COG Clusters of Orthologous Groups (Cơ sở dữ liệu về gen và

x

EBI European Bioinformatics Institute (Ngân hang cơ sở dữ liệu

Châu Âu)

eggNOG evolutionary genealogy of genes: Non-supervised Orthologous

Groups (Cơ sở dữ liệu về chú thích chức năng gen) EPA United States Environmental Protection Agency (Cục bảo vệ

Môi trường Hoa Kỳ)

HR-GC/MS High Resolution Gas Chromatography Mass Spectrometry

(Sắc ký khí khối phổ độ phân giải cao) IMG Integrated Microbial Genome (Hệ thống bộ gen vi sinh vật tích

hợp)

KEGG Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (Cơ sở dữ liệu về

gen và con đường chuyển hóa giả định)

MG-RAST

Metagenomic Rapid Annotations using Subsystems Technology (Hệ thống phân tích tự động metagenome trực tuyến mã nguồn mở)

MS Multiple Sampling (Lấy mẫu đa điểm)

ORF Open reading frame (Khung đọc mở)

ORF Open reading frame (Khung đọc mở)

PAH Polycyclic Aromatic Hydrocarbon (Hydrocarbon thơm đa

nhân) PCB Polychlorinated biphenyl

PCDD Polychlorinated dibenzo-p-dioxin

xi

PFAM Protein families database (Cơ sở dữ liệu protein)

POPs Persistent Organic Pollutants (Hợp chất hữu cơ khó phân hủy) Ppt Part per trillion (10-12)

QCVN Tiêu chuẩn quốc gia Việt Nam

RefSeq Reference Sequence (Cơ sở dữ liệu trình tự tham chiếu)

RT-PCR Real time PCR (Phản ứng chuỗi trùng hợp theo thời gian thực) SSCP Single Strand Conformation Polymorphism (Đa hình cấu hình

sợi đơn)

TEF Toxic Equivalent Factor (Độ độc tương đương)

TGGE Temperature Gradient Gel Electrophoresis (Điện di trên gel

građient nhiệt)

T-RFLP Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism (Đa

hình chiều dài đoạn cắt cuối) USAID United States Agency for International Development (Cơ quan

phát triển quốc tế của Hoa Kỳ)

M Ở ĐẦU

Gần 50 năm sau chiến tranh, hơn 100 triệu lít thuốc diệt cỏ chứa tetrachlorodibenzo-p-dioxin (2,3,7,8-TCDD là đồng phân dioxin độc nhất với độ độc tương đương là 1 đã phun rải và hiện vẫn còn tồn lưu ở miền nam Việt Nam (Cecil, 1986) Hỗn hợp chất độc tại các khu vực ô nhiễm khiến môi trường tự nhiên

2,3,7,8-bị phá hủy, sức khỏe di truyền của bệnh nhân phơi nhiễm bị ảnh hưởng qua nhiều

thế hệ, quần xã vi sinh vật (VSV) bị thay đổi mà vẫn chưa thể đánh giá chính xác được Do đó, ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin nói riêng và ô nhiễm các hợp chất hữu cơ khó phân hủy (POPs) nói chung cần phải được loại bỏ theo công ước Stockholm

Do đó, nghiên cứu đánh giá vai trò thực chất của các quần xã vi sinh vật trong tự nhiên cũng như trong các vùng đã và đang được xử lý khử độc là rất cấp thiết

Trong 20 năm trở lại đây, số lượng nghiên cứu liên quan tới khả năng phân hủy chất diệt cỏ/dioxin bởi các VSV phân lập được, số lượng enzyme tham gia vào con đường chuyển hóa cũng như đa dạng VSV không thông qua nuôi cấy (sử dụng phương pháp đa hình cấu hình sợi đơn (Single-Strand Conformation Polymorphism

- SSCP, điện di trên gel građient biến tính biến tính (denaturing gradient gel electrophoresis - DGGE, nhân gene theo thời gian thực (real time Polymerase Chain Reaction – RT PCR) tăng dần nhằm xây dựng công nghệ xử lý ô nhiễm với hiệu

suất cao và triệt để hơn bởi vi sinh vật

Ở Việt Nam, quy mô thử nghiệm và triển khai công nghệ xử lý khử độc bằng phân hủy sinh học (Bioremediation) tăng dần từ pilot 0,5 m3 – 100 m3ở sân bay Đà Nẵng tới quy mô hiện trường 3.384 m3 ở sân bay Biên Hòa Qua các công bố mới được cập nhật, các VSV có khả năng nuôi cấy chiếm tỷ lệ rất thấp chỉ từ 0,001 đến 0,1% cho thấy hạn chế của các phương pháp nghiên cứu truyền thống đã thực hiện trong nhiều thập niên qua Do đó, việc áp dụng các công cụ nghiên cứu hiện đại trở nên rất cần thiết để có thể từng bước hiểu rõ sự đa dạng và bản chất cấu trúc quần

xã VSV để từ đó cải tiến quy trình công nghệ hiện có nhằm rút ngắn thời gian và

nâng cao hiệu suất xử lý khử độc ô nhiễm hỗn hợp chất diệt cỏ/dioxin vẫn còn tồn đọng ở Việt Nam và các loại chất hữu cơ khó phân hủy (POPs) khác trên thế giới

Giải trình tự và phân tích nguyên liệu di truyền bằng cách tách DNA trực tiếp từ

mẫu đất ô nhiễm không thông qua nuôi cấy bằng hệ thống máy công năng cao thế hệ mới Hiseq Illumina và các phần mềm tin sinh chuyên dụng sẽ khắc phục được hạn chế của các phương pháp nghiên cứu truyền thống Bởi vì kết quả thu được cung cấp thông tin chi tiết về sự đa dạng VSV từ ngành, lớp, bộ, họ, chi cho đến loài cùng hệ gene

chức năng tồn tại cũng như đa dạng protein giả định và các con đường chuyển hóa trong metagenome của mẫu nghiên cứu Vì vậy, tại thời điểm này sử dụng công cụ metagenomic với mẫu đất liên quan tới ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin sẽ cung cấp bức tranh đầy đủ nhất có thể về chủng loài và các mối quan hệ quần xã của vi sinh vật

nhằm nâng cao hiệu suất xử lý khử độc bằng công nghệ phân hủy sinh học không chỉ

áp dụng đối với ô nhiễm dioxin mà còn với các POPs khác

Với các lý do trên, luận án nghiên cứu sinh đã được thực hiện và đây là nghiên cứu đầu tiên ở Việt Nam sử dụng công cụ nghiên cứu hiện đại với đất ô nhiễm nặng chất diệt cỏ/dioxin ở sân bay Biên Hòa thuộc đối tượng đất đặc thù bởi thành phần hóa học phức tạp để tách và làm sạch được DNA đủ chất lượng đáp ứng yêu cầu của nghiên cứu Mẫu ở 2 khu vực đã được chọn để nghiên cứu metagenome

gồm: đất từ khu Tây Nam Biên Hòa bị ô nhiễm nặng chất diệt cỏ/dioxin có độ độc trung bình 21.605 ng TEQ/kg và đất đã được xử lý làm sạch sau 60 tháng ở khu chôn lấp Z1 có độ độc trung bình 13,2 ng TEQ/kg Tên luận án của nghiên cứu sinh là: ”Nghiên cứu đa dạng vi sinh vật trong mẫu đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin ở

Biên Hòa, Đồng Nai và đánh giá khả năng phân hủy của một số chủng phân

l ập” Kết quả về sự đa dạng và các đặc điểm, cấu trúc quần xã và khả năng phân

hủy dioxin của một số đại diện được trình bày trong luận án này là một phần số liệu

thu được từ đề tài độc lập cấp nhà nước “Nghiên cứu metagenome của vi sinh vật

vùng đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin nhằm tìm kiếm các gene, enzyme mới có khả năng phân hủy dioxin” mã số ĐTĐLCN.13/14 do PGS TS Đặng Thị Cẩm Hà chủ

nhiệm và đã được nghiệm thu năm 2019

Đánh giá khả năng phân hủy hiếu khí dioxin trong đất ô nhiễm nặng hỗn hợp

chất diệt cỏ/dioxin bằng tổ hợp vi khuẩn (VK) và tổ hợp xạ khuẩn (XK) được phân

lập và lựa chọn từ các mẫu đất nghiên cứu

2) N ỘI DUNG NGHIÊN CỨU

- Thu th ập, bảo quản, phân tích thành phần cơ giới của mẫu đất ô nhiễm

ch ất diệt cỏ/dioxin ở sân bay Biên Hòa;

- Tách chi ết, tinh sạch DNA từ các mẫu nghiên cứu và xác định trình tự DNA b ằng máy giải trình tự công năng cao thế hệ mới Illumina Hiseq 2500;

- Phân tích, đánh giá đa dạng VSV, đa dạng gene chức năng giả định từ

d ữ liệu metagenome của các mẫu nghiên cứu;

- Đánh giá khả năng phân hủy hiếu khí dioxin trong đất ô nhiễm nặng

b ằng tổ hợp vi khuẩn và xạ khuẩn được phân lập từ đất ô nhiễm chất diệt

c ỏ/dioxin

3) NH ỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN

- Đây là công trình đầu tiên ở Việt Nam sử dụng công cụ metagenomic trong nghiên cứu đa dạng VSV trong đất ô nhiễm nặng chất diệt cỏ/dioxin, đất đã được xử

lý khử độc sạch ở sân bay quân sự Biên Hòa và phát hiện được sự rất đa dạng trong các quần xã vi khuẩn, vi khuẩn cổ ưa mặn, loại halogen với số lượng các gene chức năng mới như laccase và laccase-like tham gia vào phân hủy hợp chất xenobiotic cùng sự đa dạng của nấm sợi, nấm men và nấm đảm;

- Bổ sung cơ sở khoa học giải thích sự thành công của công nghệ phân hủy sinh học đã thực hiện ở sân bay Biên Hòa và khả năng cải tiến qui trình công nghệ, nâng cao hiệu suất xử lý khử độc hỗn hợp chất diệt cỏ/dioxin có tổng độ độc rất cao cũng như một số loại hình ô nhiễm POPs khác

CHƯƠNG 1

T ỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Phân h ủy sinh học chất diệt cỏ/dioxin

1.1.1 Đặc điểm và ảnh hưởng của chất diệt cỏ/dioxin tới môi trường và con người

Dioxin là gọi tắt của nhóm các chất hữu cơ khó phân huỷ với hai vòng thơm

gắn từ 1 đến 8 nguyên tử clo có quan hệ gần gũi với nhau về cấu trúc và tính chất hóa học Khi đề cập tới ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin là chủ yếu nhắc tới các nhóm Policlodibenzo-p-dioxin (PCDD) có 75 chất và Polyclodibenzofuran (PCDF) có 135

chất, polyclobiphenyl (PCB) bởi chúng thường tồn tại dạng hỗn hợp của các chất hóa học bền vững trong môi trường (Schecter, 2013; Van den Berg và cs., 1998) Hai đồng phân của dioxin có độ độc cao nhất là 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (2,3,7,8-TCDD) và 1,2,3,7,8-pentachlorodibenzo-p-dioxin (1,2,3,7,8-PeCDD) với

tổng độ độc tương đương TEF (Toxic Equivalency Factor) là 1 (tổ chức Y tế thế giới - WHO)

Hình 1.1 Cấu trúc hóa học của PCDD, PCDF và PCB

(Nguồn: Kulkami và cs., 2008)

Các PCDD, PCDF và PCB có tính không phân cực cao, độ hòa tan trong nước rất thấp, có xu hướng tích lũy vào đất mùn, trầm tích, các vật chất kị nước như

mô mỡ động vật (Schreiner và cs., 1997) và rất bền vững trong tự nhiên Dioxin có

thể di chuyển trên bề mặt đất, theo dòng nước và theo không khí gây ra ô nhiễm môi trường trong phạm vi rộng và phức tạp Thời gian bán huỷ của dioxin là 10-100 năm tùy vị trí và điều kiện tự nhiên Thời gian bán huỷ của dioxin trong đất là 4.720 ngày (~13 năm), hexaclobenze là 1.530 ngày (4,2 năm), PCBs là 940 ngày (2,6 năm), PAHs là 570 ngày (1,6 năm), pentaclophenol 100 ngày Trong cặn đáy ao hồ hay còn gọi là trầm tích dioxin có thể tồn tại hàng trăm năm Dioxin có nhiệt độ

nóng chảy khá cao, ngay cả ở nhiệt độ 1.200oC quá trình phân huỷ dioxin vẫn là quá trình thuận nghịch, dioxin chỉ bị phân huỷ hoàn toàn ở nhiệt độ lớn hơn 1.200-1.400oC

Hình 1.2 Cơ chế tạo ra 2,3,7,8-TCDD trong quá trình tổng hợp 2,4,5-T

(Nguồn: Schmalenberger và Tebbe, 2003)

Hàng trăm triệu lít chất diệt cỏ chứa dioxin do Mỹ phun rải nhằm phát quang các cánh rừng tại miền Trung và Nam Việt Nam làm hơn 4 triệu ha rừng đã bị phá

hủy hoàn toàn, sự tồn lưu chất diệt cỏ/dioxin trong đất từ đó phân tán bởi lớp nước mặt, nước ngầm, tích tụ trong cơ thể sinh vật Mặt khác, các sân bay đã từng được

sử dụng làm điểm tập kết, súc rửa thùng đựng, máy bay sau khi phun rải nên lượng

lớn chất độc còn tồn lưu làm biến đổi hệ sinh thái, giết chết rất nhiều động, thực vật cũng như phá hủy hệ VSV đất EPA đã công nhận dioxin là một chất gây ung thư nhóm 1 cho con người ở tất cả các liều lượng khi đã phơi nhiễm (Van den Berg và cs., 2006) Theo Angelo và cộng sự, PCBs có thể ảnh hưởng đến gan, đường ruột, máu, hệ nội tiết, miễn dịch, hệ thần kinh và hệ sinh sản (D’Angelo và Nunez, 2010) nên có thể di truyền cho nhiều thế hệ sau Theo thời gian ô nhiễm, hệ VSV sẽ mất dần là nguyên nhân đất bị sói mòn vì thiếu dưỡng chất

1.1.2 Ô nhi ễm chất diệt cỏ/dioxin ở sân bay Biên Hòa và Đà Nẵng

Ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin ở Việt Nam phần lớn do tồn dư bởi chiến tranh hóa học do Mỹ gây ra từ 1961 và tập trung chủ yếu ở các sân bay quân sự cũ như Biên Hòa, Đà Nẵng với các mức độ khác nhau

Gần đây, cơ quan phát triển quốc tế hoa kỳ (United States Agency for International Development – USAID) cùng Viện Khoa học và Công nghệ Quân sự thuộc Bộ Quốc phòng (BQP) lấy từ 76 vị trí theo phương pháp lấy mẫu đa điểm (MS) để điều tra mức độ ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin ở sân bay Biên Hòa Tổng

cộng thu thập hơn 1.400 mẫu và phân tích nồng độ dioxin đối chiếu với Tiêu chuẩn

quốc gia Việt Nam (QCVN 45:2012/BTNMT) và ngưỡng dioxin của BQP đối với

từng điểm lấy mẫu cho thấy ô nhiễm nặng nhất tập trung ở khu Tây Nam sân bay (độ độc lên tới 110.000 ppt ở độ sâu 30 – 60cm)

Thống kê cho thấy khoảng 315.700 – 377.700 m3 và 92.800 – 117.600 m3

trầm tích ô nhiễm dioxin (42% ở khu Pacer Ivy, 24% ở khu Z1 (bao gồm cả Bãi chôn lấp Z1 là khu vực có lô xử lý 3.384 m3 đất ô nhiễm bằng phương pháp phân

hủy sinh học được thực hiện bởi PGS TS Đặng Thị Cẩm Hà và cộng sự, Viện Công nghệ Sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam), 15% ở khu Tây nam, 19% ở các khu ZT, Tây bắc và Đông bắc và khoảng 5% tổng khối lượng nhiễm dioxin nằm ở ngoài khu vực sân bay) Diện tích ô nhiễm ước tính là khoảng 522.400 m2, trong đó có khoảng 369.600 m2 diện tích đất và 152.800 m2diện tích trầm tích

Tình trạng ô nhiễm dioxin ở sân bay Đà Nẵng được thể hiện trong Báo cáo

tổng kết của Văn phòng 33 và công ty Hatfield cho thấy khu vực đầu bắc sân bay (khu pha trộn và đóng nạp) và khu Pacer Ivy (khu vực lưu trữ ở phía nam sân bay)

nồng độ TCDD cao nhất đạt tương ứng 361.000 ppt và 20.600 ppt ở độ sâu từ 0 – 10

cm với đồng phân 2,3,7,8-TCDD chiếm 99% và 65% Viện Công nghệ Sinh học đã

tiến hành xử lý thử nghiệm ở quy mô 10 m3 và 100 m3 bằng biện pháp chôn lấp tích

cực với hiệu quả phân hủy dioxin từ 50-70% ở khu đầu bắc sân bay (Hà và cs., 2005)

Đã tiến hành xử lý khử độc đất ô nhiễm có độ độc cao hơn 43.000 ng TEQ/kg ở 11 công thức khác nhau ở qui mô pilot (2 m3) ngay tại sân bay Đà Nẵng, sau 6 tháng xử

lý 30% tổng độ độc đã bị loại bỏ tính chung cả các công thức hiếu khí và kị khí Đây

là công trình hợp tác giữa viện công nghệ sinh học với Cục bảo vệ Môi trường Hoa

Kỳ (United States Environmental Protection Agency – EPA) năm 2009 với kinh phí

từ quỹ Ford (Hà và cộng sự , 2010) Lần đầu tiên ở Việt Nam và cũng là lần đầu tiên trên thế giới công nghệ phân hủy sinh học khử dioxin (độ độc chủ yếu từ đồng phân 2,3,7,8 TCDD) sản xuất từ công nghệ cũ của những năm 50 của thế kỷ trước được

tiến hành ở qui mô lớn 3384 m3 Bằng sự kết hợp của thi công cơ giới, bán cơ giới (ở

một số công đoạn nhỏ) do các cán bộ khoa học của 2 cơ quan Viện KH&CN Việt Nam và Bộ Quốc phòng đã cùng thực hiện công nghệ được gọi là: “Chôn lấp tích

cực” Tháng 3 và 4/2009, Viện Công nghệ Sinh học đã phối hợp với các đơn vị của

Bộ Tư lệnh Hóa học xử lý 3.384 m3 đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin tại khu Z1 của sân bay Biên Hòa Trong các hố chôn lấp tích cực sự phân hủy sinh học xảy ra ở 3 điều

kiện hiếu khí (có oxy), kỵ khí (không có oxy) và kỵ khí không bắt buộc (có ít oxy) Quá trình xử lý bao gồm thúc đẩy sự chuyển hóa, phân hủy và giai đoạn cuối cùng tốt

nhất là khoáng hóa hoàn toàn các hỗn hợp chất độc bao gồm dioxin (độc nhất) là 2,3,7,8-TCDD (chiếm từ 90 - 99,63% tổng độ độc), 2,4,5-T, 2,4-D, TCP, DCP và các PAH có nhiều vòng thơm v.v

Năm 2009 Bộ quốc phòng Việt Nam và cụ thể là Bộ Tư lệnh Hóa học đã chôn lấp hơn 90.000 m3 trong khuôn khổ dự án ở khu vực Z1 và 3.384 m3 đất thuộc

dự án này đã được làm sạch bằng công nghệ phân hủy sinh học như đã đề cập ở trên Năm 2011, USAID và BQP Việt Nam cùng phối hợp thực hiện Dự án Xử lý Môi trường tại Sân bay Đà Nẵng sử dụng phương pháp khử hấp thu nhiệt và lưu chứa Đất, bùn nhiễm dioxin được đưa vào mố kín trên mặt đất và nung nóng tới nhiệt độ

tối thiểu 335ºC để tiêu hủy dioxin Dự án đã xử lý hơn 90.000 m3 đất, trầm tích ô nhiễm trầm tích nhiễm dioxin nồng độ thấp và đã bàn giao vào cuối năm 2018 Tuy nhiên, sản phẩm sau khi sử dụng phương pháp giải hấp phụ nhiệt vẫn gây nhiều tranh cãi về hiệu quả môi trường và sản phẩm cuối cùng vẫn còn phải xử lý tiếp

1.1.3 Phân h ủy sinh học chất diệt cỏ/dioxin trong đất ô nhiễm

Do đất bị ô nhiễm ở mức rất nặng, phức tạp và kéo dài nên việc xử lý triệt để tuân thủ công ước Stockholm là rất cần thiết Hiện có rất nhiều phương pháp hóa

học, lý học, sinh học được đề xuất để xử lý nhưng cần có những nghiên cứu kỹ trước khi áp dụng Quá trình phân hủy sinh học có thể xảy ra theo 4 con đường chủ

yếu (Báo cáo kết quả nhiệm vụ chôn lấp tích cực thuộc dự án “Xử lý khu đất nhiễm chất độc hóa học chứa Dioxin tại sân bay Biên Hòa, tỉnh Đồng Nai” do Bộ Tư lệnh Hóa học - Bộ Quốc phòng làm chủ đầu tư và thực hiện năm 2009) Ba con đường oxy hóa cắt vòng, loại clo các hợp chất hữu cơ thơm đã được mở vòng và xúc tác

bởi các enzyme ngoại bào hay các chất xúc tác không có cấu trúc enzyme nhưng

hoạt động như enzyme đều cần oxy và con đường thứ tư là loại khử clo đối với các chất hữu cơ đa vòng thơm (Hình 1.3) Tất cả các quá trình nêu trên được thực hiện

bởi tập đoàn vi sinh vật bản địa trong các tầng đất của lô “Chôn lấp tích cực”

Hình 1.3: Các con đường chuyển hóa, phân hủy, khoáng hóa hỗn hợp chất diệt

cỏ/dioxin và các chất trao đổi chất bằng phương pháp sinh học

Sản phẩm trung gian của con đường khử loại clo là các hợp chất bớt độc hơn

do loại khử bớt clo Các sản phẩn tạo ra theo các con đường khác rất phong phú ở

mỗi giai đoạn và điều kiện môi trường luôn biến động tạo cơ hội cho các quần xã vi sinh vật hoạt động phân hủy, chuyển hóa và sản phẩm cuối cùng của 4 con đường trao đổi chất nói trên là các chất đi vào chu trình Krebs trước khi được khoáng hóa tới các axit hữu cơ, nước, CO2 và sinh khối vi sinh vật

1.1.3.1 Phân h ủy sinh học hiếu khí xenobiotic và chất diệt cỏ/dioxin

Chất diệt cỏ/dioxin gồm 2 nhóm là chứa và không chứa clo với cơ chế phân

hủy khác nhau bởi VSV trong các điều kiện khác nhau

Phân h ủy sinh học hợp chất dioxin không chứa clo

Cấu trúc dạng vòng dễ bị quá trình oxy hóa (bởi hệ enzyme được sinh bởi các

vi sinh vật) phá vỡ làm giảm độc tính của dioxin Quá trình hydroxyl hóa vòng thơm

xuất hiện ở vị trí bên các nguyên tử carbon 1,2; 2,3 hoặc 3,4 như Novosphingobium

aromaticivorans IFO15084, N stygium IFO 16085, N sunterraneum IFO 16086,

Porphyribacter sanguineus IAM 12620T, Sphingobacterium yanoikuyae B1,

Burkholderia cepacia F297, B cepacia ET4, Ralstonia sp SBUG290, Pseudomonas

sp HL7b v.v (Hong và cs., 2007) ho ặc các vị trí góc 4,4a như Cycloclasticus pugetti,

Comamonas sp KD7, Rhodococcus sp NCIMB 12038, Rhodococcus opacus SAO

101 và Rhodococcus sp HA01 (Chang, 2008) Quá trình này sinh ra các chất trao đổi trung gian có màu vàng nhạt đến vàng lẫn nâu nhạt (hấp thụ ở bước sóng 460nm) (Johnson, 2008)

Phân hủy dioxin và các chất tương tự bởi oxy hóa kép vị trí góc như

Sphingomonas sp HH19k; Sphingomonas sp HH69; Burkholderia sp JB1;

Burkholderia sp LB400; Ralstonia sp SBUG 290; Pseudomonas sp F274, v.v cũng đã được Fortnagel và cộng sự chứng minh (Fortnagel và cs., 1989) Wittchi và

cộng sự đã công bố về oxy hóa vị trí góc bởi enzyme dioxin dioxygenease từ

Sphingomonas wittchi RW1

Phân h ủy sinh học hợp chất dioxin chứa clo

Quá trình xảy ra theo cơ chế đồng trao đổi chất Theo nghiên cứu của Field và Sierra-Alvarez, 84% công bố vi khuẩn (VK) thuộc các chi Rhodococcus, Beijerinckia,

Pseudomonas , Bacillus, Sphingomonas, Terrabacter, Burkholderia, Klebsiell,

Alcaligenees có khả năng phân hủy các PCDDs và PCDFs chứa 1 hoặc 2 clo (Field và Sierra-Alvarez, 2008) Các hợp chất PCDD/F chứa 5 nguyên tử clo hoặc nhiều hơn thì

mức độ bị phân hủy sinh học hiếu khí cũng khó hơn Chủng Sphingomonas wittchii

RW1 có khả năng chuyển hóa chậm 1,2,3,4,7,8-HCDD; 2,7-DCDD; 1,2,3-TriCDD; 1,2,3,4-TCDD và 1,2,3,4,7,8-HxCDD thành các chlorocatechol tương ứng nhưng lại không thể chuyển hóa 2,3,7-TriCDD và 1,2,3,7,8-PeCDD Schreiner và cộng sự khảo sát quá trình phân hủy sinh học bởi chủng Sphingomonas sp HH69 cho thấy 31%

2,3,7,8-TCDF và 15% 2,3,7,8-TCDD đã bị loại bỏ trong 84 ngày (Schreiner và cs.,

1997) Chủng vi khuẩn Pseudomonas sp PSX cũng phân hủy 64% lượng

2,3,7,8-TCDF và 82% lượng 2,3,7,8-TCDD trong cùng thời gian

Phân h ủy sinh học hiếu khí chất diệt cỏ/dioxin ở Việt Nam

Vi sinh vật trong các công thức xử lý tại sân bay Đà Nẵng năm 2009 (dự án

hợp tác với EPA Hòa Kỳ được Quỹ For tài trợ) cho thấy số lượng dao động trong khoảng 102-105 CFU/g và thay đổi theo thời gian bổ sung chế phẩm và đảo trộn đất Vi khuẩn có số lượng cao nhất rồi đến nấm sợi và xạ khuẩn Chúng sinh trưởng trên môi trường chứa chất diệt cỏ/dioxin như nguồn cacbon và năng lượng duy nhất hay sử dụng chất độc theo cơ chế đồng trao đổi chất

Hỗn hợp vi khuẩn của SETDN 20 được làm giàu từ lô đất xử lý tẩy độc bằng phân hủy sinh học ở Đà Nẵng, loại bỏ 17,9% tổng độ độc trong đó đồng phân 2,3,7,8-TCDD giảm từ 4.299 ppt xuống còn 3.528 ppt sau 60 ngày nuôi cấy trên môi trường xử lý chứa dịch chiết đất Một số chủng có khả năng phân hủy dioxin; 2,4,5-T; 2,4-D và các PAHs đa vòng (pyren và fluoranthen) đã được chứng minh

như Streptomyces sp XKDN11, Streptomyces sp XKDN19, Streptomyces sp XKDNR1, Brevibacillus sp.XKDN3, Brebacillus sp BDNR10, Bacillus sp BDN6,

Bacillus sp BU3, Pseudomonas sp BDN15, Pseudomonas sp BDNR1,

Pseudomonas sp Setdn1, Aspergillus sp FDN9, Aspergillus sp FDN20 Chủng

Rhodococcus sp HDN3 và Terrabacter sp DMA phân hủy hoàn toàn DBF với

nồng độ 4 mM sau 24 và 48 giờ nuôi cấy tương ứng

Ngoài ra, các nhà khoa học Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa

học và Công nghệ Việt Nam phối hợp Bộ Tư lệnh Hóa học - Bộ Quốc phòng tiến hành khử độc thành công 3.384 m3 đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin ở sân bay Biên Hòa

Số lượng VSV hiếu khí tùy tiện sử dụng dioxin như nguồn cacbon và năng lượng duy

nhất dao động từ 3,3x104 đến 8,7x107 Sau 27 tháng xử lý, tổng độ độc của dioxin trong các mẫu đất giảm từ 10.000 ng TEQ/kg đất khô xuống còn 52 ng TEQ/kg đất khô, hiệu quả xử lý đạt 99,48% Ở Đà Nẵng với các công thức gồm 0,5 m3, 1,5 m3, 10

và 100 m3 cũng được thực hiện với độ độc giảm từ 32,84% đến 71,04% sau 1 tháng

và giảm 50-70% sau gần 2 năm xử lý (Hà và cs., 2008)

1.1.3.2 Phân h ủy sinh học kị khí chất diệt cỏ/dioxin

Phân h ủy sinh học kị khí chất diệt cỏ/dioxin chứa clo

Các vi khuẩn kị khí tham gia vào quá trình loại khử clo cũng khá đa dạng, bao gồm nhóm vi khuẩn khử sulfate như Desulfovibrio, Desulfitobacterium,

Desulfomonile, nhóm Dehalobacter, Dehalococcoides, Dehalogenimonas v.v được

xếp vào ba ngành chính là Chloroflexi, Firmicute và Proteobacteria (Hiraishi, 2008;

Maphosa và cs., 2010)

Chủng Dehalococcoides ethenogenes 195 có khả năng loại khử clo của

1,2,3,4-TCDD thành 1,2,4-TrCDD; 1,3-DiCDD; loại clo của hexachlorobenzene thành tetrachlorobenzene; loại clo của 2,3,4,5,6-petachlorobiphenyl thành 2,3,4,6-tetrachlorobenzene; 1,3,5-trichlorobenzene; loại clo của 1,2,3,4-tetrachloronaphthalene

1,2,3,5-tạo ra các đồng phân dichloronaphthalene chưa xác định (Fennell và cs., 2004) Việc bổ

sung 1,2,3,4-TCB và 2,3,4,5-tetrachloroanisole đã tăng cường quá trình loại clo của 1,2,3,4-TCDD và TCDF của VSV trong các trầm tích (Hiraishi, 2008) Các vi khuẩn thuộc chi Dehalococcoides có thể loại khử clo của hợp chất hữu cơ chứa nhiều clo

thành các hợp chất có độ độc giảm và chứa ít clo để các VSV hiếu khí phân hủy tiếp bằng cách oxy hóa mở vòng (Bunge và Lechner, 2009)

Phân h ủy sinh học hiếu khí-kị khí chất diệt cỏ/dioxin ở Việt Nam

Nguyễn Bá Hữu trong nghiên cứu luận án tiến sỹ của mình đã sử dụng các phương pháp nghiên cứu như Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (Điện di trên gel građient biến tính – DGGE), Single Strand Conformation Polymorphism (Đa hình cấu hình sợi đơn – SSCP) để nghiên cứu cấu trúc tập đoàn VSV, tập đoàn vi khuẩn hiếu khí, vi khuẩn kị khí tùy tiện và nhóm Dehalococcoides trong các mẫu

bùn hồ, mẫu đất và trầm tích ở một số lô xử lý tại sân bay Đà Nẵng (Hữu và cs., 2006; 2007) Một số dòng vi khuẩn ở bùn hồ thuộc các lớp α-proteobacteria,

Chlorobi, Chloroflexi, Sulfuricurvum, Fusobacteria, Nitrospiraceae, vi khuẩn chưa

xác định và vi khuẩn Dehalococcoides bước đầu đã được phát hiện sự có mặt trong

lô xử lý 10 m3 ở Đà Nẵng Số lượng VSV ban đầu trong các công thức xử lý kị khí

rất thấp (từ 1 tế bào đến 5,1x102 MPN/g ) và đạt từ 2,95x102 đến 3,02x107 sau 6 tháng xử lý mặc dù tổng độ độc ban đầu rất cao 43.000 ng TEQ/kg Bên cạnh đó, biến động về tập đoàn vi khuẩn, nấm, xạ khuẩn sử dụng chất diệt cỏ/dioxin làm nguồn cacbon và năng lượng duy nhất và cơ chế đồng trao đổi chất cũng được thực hiện trong báo cáo (Hà và cs., 2010) Nếu tính tốc độ khử độc trung bình trên ngày

thì ở các công thức xử lý hiếu khí lên tới 100 ng TEQ/kg/ngày và 50 ng TEQ/kg/ngày ở các công thức xử lý kị khí

Nguyễn Thị Tâm Thư cũng đã thực hiện đề tài nghiên cứu sinh của mình và đã phát hiện được cả 3 nhóm vi khuẩn hô hấp loại khử clo bao gồm loại khử clo bắt buộc

(Dehalococcoides, Dehalogenimonas), loại khử clo không bắt buộc (Desulfovibrio,

Desulfitobacterium, Desulfuromonas) và loại khử clo đồng trao đổi chất (Pseudomonas,

Shewanella, Clostridium) và đa dạng vi khuẩn khử sulfate (VK KSF) trong các lô xử lý

bằng phương pháp DGGE với mẫu từ các lô xử lý ở Đà Nẵng và Biên Hòa (Thư, 2013)

1.2 Đa dạng VSV và gene chức năng trong đất ô nhiễm chất diệt

c ỏ/dioxin

1.2 1 Đa dạng VSV hiếu khí nuôi cấy được trong đất ô nhiễm

Tập đoàn VSV hiếu khí có khả năng phân hủy chất độc khá phong phú trong các loại hình đất ô nhiễm POPs và các chất tương tự gồm nấm sợi, vi khuẩn và xạ khuẩn đã được ghi nhận ở Việt Nam (Hà và cs, 2005)

Hong và cộng sự đã chứng minh chủng vi khuẩn Pseudomonas veronii

PH-03 có thể phân hủy được một số đồng loại dioxin và furan: dibenzo-p-dioxin (DD);

dibenzofuran (DBF); 1-MCDD và 2-CDD (Hong và cs., 2004) Chủng

Hydrocarboniphaga effusa strain AP103 phân lập từ đất nhiễm dầu máy ở New Jersey Một số vi khuẩn thuộc chi Microbacterium đã được công bố về sự có mặt

trong mẫu đất ô nhiễm dioxin tại Nhật Bản (Hiraishi, 2003) và đất nhiễm chất diệt

cỏ dioxin tại sân bay quân sự Đà Nẵng (Hữu, 2007)

Hiện nay, công bố về khả năng phân hủy 2,3,7,8-TCDD bởi các chủng VSV thuần khiết trên thế giới có rất ít Các nghiên cứu tập trung chủ yếu vào khả năng phân hủy các đồng phân ít độc của dioxin bởi các chủng nấm có khả năng sinh enzyme ngoại bào như Acremonium sp 622, Cordyceps sinensis A, Phanerochaete

chrysosporium IFO31249, Phanerochaete sordida YK-624 v.v (Nakamiya và cs., 2002; Ishii và cs., 2004) và m ột số chủng vi khuẩn thuộc các chi Rhodococcus,

Beijerinckia, Pseudomonas, Bacillus, Sphingomonas, Terrabacter, Burkholderia, Klebsiella, Alcaligenes, Erwinia, Nocardioides, Ralstonia, Novosphingobium,

Sphingobacterium v.v (Field và Sierra-Alvarez, 2008) Các chi này thuộc 2 ngành Proteobacteria và Actinobacteria Khả năng phân hủy đồng loại 2,3,7,8-TCDD bởi đơn chủng nấm đảm FBV40 và hỗn hợp 3 chủng nấm FBV40, FBD154 và FNBLa1 cũng được thông báo

Bên cạnh phát hiện vi khuẩn, nấm sợi và xạ khuẩn với khả năng sinh laccase và laccase-like là các enzyme đã được chứng minh có khả năng phân hủy chất diệt

cỏ/dioxin Các chủng xạ khuẩn như Streptomyces sp M7 được phân lập từ nước thải

trầm tích có khả năng sử dụng γ-HCH (Alvarez và cs., 2012), Streptomyces werraensis

và Streptomyces rochei phân lập từ đất thể hiện khả năng phân hủy plastic,

Streptomyces badius , S setnii và S viridosporous phân lập từ Ấn Độ đã được thông

báo có khả năng phân hủy LDPE (Arutchelvi và cs., 2007), Streptomyces sp

ERI-CPDA-1 có thể phân hủy PAHs trong đất nhiễm ở Chennai, Ấn Độ (Balachandrana và

cs., 2012), Streptomyces rochei 303 phân hủy pentachlorophenol (PCP) (Zaborina và cs., 1997)

Bộ sưu tập giống VSV có khả năng phân hủy 2,3,7,8-TCDD hoặc 2,4,5-T;

2,4-D, DBF, PAH v.v của cộng sự thuộc phòng Công nghệ sinh học tái tạo môi trường đã

được định danh gồm Streptomyces sp XKDN11, Streptomyces sp XKDN19,

Streptomyces sp XKDNR1, Brevibacillus sp.XKDN3, Brebacillus sp BDNR10,

Bacillus sp BDN6, Bacillus sp BU3, Pseudomonas sp BDN15, Pseudomonas sp BDNR1, Pseudomonas sp Setdn1, Aspergillus sp FDN9, Aspergillus sp FDN20 v.v

1.2 2 Đa dạng vi khuẩn kị khí nuôi cấy được trong đất ô nhiễm dioxin

1.2.2.1 Vi khu ẩn hô hấp loại khử clo

Các nghiên cứu đã chỉ ra 12 chi vi khuẩn tham gia hô hấp loại khử clo đã được công bố gồm: Desulfitobacterium, Dehalobacter, Desulfuromonas, Desulfomonile,

Desulfovibrio, Dehalospirillum, Sulfurospirillum, Anaeromyxobacter, Geobacter, Dehalococcoides, Dehalobium, Dehalogenimonas và một số vi khuẩn không nuôi cấy thuộc 3 ngành chính là Chloroflexi, Firmicutes, Proteobacteria (Smidt và cs., 2000;

Hiraishi, 2008; Richardson, 2013)

Dựa vào đặc tính và sinh lý, vi khuẩn hô hấp loại khử clo được chia thành 2 nhóm là vi khuẩn hô hấp loại khử clo bắt buộc và không bắt buộc

Vi khu ẩn hô hấp loại khử clo không bắt buộc (vi khuẩn khử sulfate- đóng vai trò chủ đạo)

Vi khuẩn khử sulfate (VK KSF) được chia thành 6 phân nhóm với các đại

diện có khả năng loại clo của hợp chất hữu cơ chứa clo gồm: nhóm 1

(Desulfuromaculum), nhóm 2 (Desulfobulbus), nhóm 3 (Desulfobacterium), nhóm 4 (Desulfobacter), nhóm 5 (Desulfococcus, Desulfovibrio, Desulfosarcina,

Desulfonema ), nhóm 6 (Desulfovibrio, Desulfomicrobium) (Boyle và cs., 1999;

Reineke, 2001; Muyzer và Stams, 2008; D’Angelo và Nunez, 2010) Ngoài ra, nhiều vi khuẩn khử sunlfate cũng tham gia loại clo của các hợp chất hữu cơ chứa

clo như các đại diện thuộc chi Desulfitobacterium, Desulfomonas, Desulfomonile

(Kranzioch và cs., 2013)

Các vi khuẩn khử sulfate thuộc các chi Desulfitobacterium, Desulfovibrio,

Desulfomonile, Desulfuromonas, Desulfobacterium có khả năng loại khử clo của cả các hợp chất hữu cơ vòng thơm chứa clo (chlorobenzene, chlorophenol) và mạch

thẳng (PCE, TCE) Trong số đó, Desulfovibrio là chi kị khí không bắt buộc và có

khá nhiều nghiên cứu trên thế giới về khả năng hô hấp loại halogen (clo, brom) của

một số hợp chất halogen hữu cơ, chi này đã được xác định là có mặt trong lô xử lý ở sân bay Đà Nẵng (Sun và cs., 2000; Boyle và cs., 1999; Häggblom và cs., 2006; Sánh và cs., 2005)

Có thể kể đến một số chủng thuộc chi Desulfovibrio được nghiên cứu trên

thế giới như: Chủng Desulfovibrio dechloracetivorans SF3 phân lập từ biển có khả

năng loại clo ở vị trí ortho của 2-chlorophenol và 2,6-dichlorophenol tạo ra phenol

(Sun và cs., 2000); Ch ủng Desulfovibrio phân lập từ vùng bùn cửa sông có thể sinh

trưởng trên lactate kết hợp với loại khử halogen của 2,4,6-tribromphenol (Boyle và cs., 1999); Chủng Desulfovibrio sp 2BP-48 đơn lẻ có khả năng khoáng hóa 2-

bromophenol kết hợp với quá trình khử sulfate và kết hợp chủng Desulfovibrio khác

có thể loại khử halogen của các chất bromophenol, 2,6-dibromophenol, iodophenol tạo ra phenol (Häggblom và cs., 2006)

2-Theo Drzyzga, chủng Desulfovibrio sp TBP1 có khả năng loại khử brom của các hợp chất chứa brom trong trầm tích biển như 2-bromo-; 4-bromo-; 2,4-dibromo-

; 2,6-dibromo-; 2,4,6-tribromophenol (Drzyzga và cs., 2001) Chi Desulfovibrio và

Desulfitobacterium cùng tồn tại trong mẫu làm giàu từ đất ô nhiễm PCE và loại clo

của hợp chất này đến 1,2-DCE Chi Desulfovibrio chiếm ưu thế trong môi trường có

tỷ lệ SO42-/PCE cao Theo Boyle và cộng sự, các loài Desulfovibrio gigas, D

africanus, Desulfococcus multivorans có khả năng loại clo của lindane tới benzene

và chlorobenzene trong vòng 48 giờ (Boyle và cs., 1999) Vi khuẩn thuộc chi

Desulfitobacterium có khả năng loại khử clo của hợp chất chứa clo mạch thẳng và vòng thơm nhưng lại khó phân lập, nuôi cấy (Ritalahti và Löffler, 2004)

Ngoài ra, một số VK KSF thuộc các chi khác cũng có khả năng hô hấp loại

clo như chủng Desulfomonile tiedjei DCB-1 và loài D liminaris loại khử clo của

3-chlorobenzoate tạo thành benzoate (Muyzer và Stams, 2008) Desulfococcus

multivorans có khả năng loại clo của lindane tới benzene và chlorobenzene trong vòng 48 giờ (Boyle và cs., 1999) Các vi khuẩn có khả năng loại khử PCB được phát hiện ở sông Ohio bị nhiễm PCB với mức độ 0,01-8,5 mg/kg bùn bao gồm

Geobacter, Desulfitobacterium, Desulforomonas, Desulfomonile (D’Angelo và Nunez, 2010) Trong mẫu nuôi cấy các vi khuẩn phân hủy PCE đến ethene cũng có

mặt các VK KSF như Desulfomonile, Desulfitobacterium (Kranzioch và cs., 2013)

Vi khuẩn kị khí loại khử clo bắt buộc (Dehalococcoides)

Các vi khuẩn nhóm này khó phân lập và nuôi cấy bởi chúng không có khả

năng sử dụng chất không chứa clo để sinh trưởng gồm các chi Dehalobacter,

Dehalococcoides, Dehalogenimonas, Dehalobium và một số đại diện thuộc ngành Chloroflexi không nuôi cấy (Hiraishi, 2008) Do đó, nhóm vi khuẩn này đóng vai trò rất quan trọng trong quá trình xử lý các chất ô nhiễm hữu cơ chứa clo (Lee và cs., 2006; Krajmalnik-Brown, 2005; Richardson, 2013) Vi khuẩn được nghiên cứu

nhiều nhất là Dehalococcoides sử dụng H2 làm chất cho điện tử và các chất hữu cơ

chứa clo như pyruvate, lactate, furmarate, formate v.v làm chất nhận điện tử để

sinh trưởng và chúng thường tồn tại dưới dạng tập đoàn (Hug và cs., 2012)

Futagami và cộng sự đã chứng minh chỉ có nhóm vi khuẩn Dehalococcoides có khả năng loại khử clo của PCE, TCE tới hợp chất ethene hoàn toàn không độc thay vì hợp chất 1,2-cis-DCE là sản phẩm cuối cùng (Futagami và cs., 2008); (Kranzioch

và cs., 2013) Các nhà khoa học xem Dehalococcoides là thợ loại khử clo

Hiện nay, nghiên cứu khả năng loại khử clo bởi các quần xã và chủng

Dehalococcoides thuần khiết khác nhau đã được thực hiện Löffler đã xác định

được loài Dehalococcoides mccartyi gen nov với 6 chủng (gồm các chủng 195 –

chiếm đa số, CBDB1, BAV1, VS, FL2 và GT) (Löffler và cs., 2013) Henrickson lại

chia các vi khuẩn Dehalococcoides thành 3 nhóm là Cornell, Victoria và Pinellas

Trong rất nhiều nghiên cứu đất, trầm tích ô nhiễm các chất xenobiotic đã phát hiện thấy chi Pseudomonas luôn chiếm ưu thế và có mặt ở rất nhiều loại môi trường với nồng độ chất ô nhiễm khác nhau Chính vì vậy sự đa dạng của chi vi sinh vật này đã được nghiên cứu sinh tổng hợp từ các công bố được trình bày dưới đây

1.2.2.2 Đa dạng vi khuẩn Pseudomonas

Rất nhiều công bố đã phân lập và nghiên cứu khả năng chuyển hóa, phân hủy các hợp chất đa vòng thơm và các hợp chất halogen, có thể kể đến: Pseudomonas

sp PS14 phân hủy 1,2,3,5-TCB bằng enzyme benzene dioxygenase, chloromuconate cycloisomerase, maleylacetate reductase (Reineke, 2001);

Pseudomonas sp B13 phân hủy 3-chlorobenzoate, 4-chlorophenol như nguồn carbon duy nhất và 2-3-chloro-phenol như nguồn carbon đồng trao đổi chất;

Pseudomonas putida GJ31 phân hủy chlorobenzene tới 3-chlorocatechol;

Pseudomonas pickettii loại clo của 2,4,6-TCP thành 2,6-dichlorohydro-quinone

(Reineke, 2001); Pseudomonas sp WR912 có khả năng sinh trưởng trên 3-chloro-; 4-chloro-; 3,5-dichlorobenzoate Chủng P aeruginosa JB2 sinh trưởng kị khí trên

2,5-dichlorobenzoate Chủng P veronii PH-03 có khả năng sinh trưởng trên môi

trường chứa dioxin là nguồn carbon và năng lượng duy nhất Chủng này phân hủy được 90,7% DD; 79,7% DBF; 88,3% 1-MCDD; 78,6% 2-CDD 1 mM sau 60 giờ

(Hong và cs., 2004) Ch ủng vi khuẩn P aeruginosa phân lập từ bùn hoạt tính hay từ

đất tham gia loại khử clo của 1,1,1-trichloro-2,2-di(4-chlorophenyl)ethane (DDT) thành 1-chloro-4-[2,2-dichloro-1-(4-chlorophenyl)ethyl]benzene (DDD) ở điều kiện

kị khí, sau đó chúng chuyển hóa tiếp bằng cách cắt vòng thơm ở điều kiện hiếu khí

Dịch chiết tế bào của Pseudomonas có thể phân hủy các sản phẩm DDT, DDD,

1,1'-(2-chloroethane-1,1-diyl)bis(4-chlorobenzene) (DDMS), phenyl) ethenyl]benzene (DDNU) theo con đường chuyển hóa kị khí (Gohil, 2011)

1-chloro-4-[1-(4-chloro-Nghiên cứu đa dạng VSV các lô xử lý tại sân bay Đà Nẵng bằng phương pháp DGGE hay SSCP cho thấy VK thuộc chi Pseudomonas có mặt và chiếm đa số

trong các lô xử lý với số lượng các dòng khác nhau (Hữu và cs., 2007; Hữu, 2009) Ngoài ra, chủng Pseudomonas sp SETDN1 phân lập từ lô xử lý 10 DNT sinh

trưởng trên môi trường chứa dịch chiết đất bao gồm 2,4-D; 2,4,5-T; TCDD; PCDD; PCDF (Sánh và cs., 2005) Chủng Pseudomonas sp BDN15 sinh trưởng trên môi

trường muối khoáng chứa 2,4,5-T ở nồng độ 1.000 ppm như nguồn carbon và năng lượng duy nhất (Phương và cs., 2005) Hỗn hợp chủng SETDN20 nuôi kị khí không

bắt buộc trong phòng thí nghiệm có khả năng phân hủy 17,9% tổng độ độc sau 60 ngày với nồng độ 4.299 pg TEQ/ml Bằng phương pháp DGGE đã xác định hỗn

hợp này có ít nhất 3 chủng vi khuẩn (Sánh và cs., 2007) Chủng Pseudomonas sp

HR5.1 phân lập từ bioreactor xử lý chất độc hóa học có mặt 2,4,5-T ở nồng độ 200 ppm (Long và cs., 2009) Chủng Pseudomonas sp BQNR có khả năng phân hủy

trinitrotoluen (TNT) tới nồng độ 600 ppm (Hà và cs., 2009) Ngoài ra, một số gene

mã hóa cho enzyme tham gia phân hủy 2,4-D; 2,4,5-T của Pseudomonas cũng đã

được công bố trong kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thị Tâm Thư và cộng sự bằng công cụ metagenomic

1.2.3 Đa dạng gene chức năng mã hóa cho enzyme tham gia phân hủy chất diệt

c ỏ/dioxin

Việt Nam đã có một số công bố về phân hủy sinh học 2,4-D và 2,4,5-T, Nguyễn Lan Hương và cộng sự phân lập được một số VK thuộc nhóm

Burkholderia, Sphingomonas, Ralstonia chứa gen tfdA, tfdA và tftA (cadA)

Nguyễn Bá Hữu và cộng sự đã xác định được số lượng bản sao gen tfdA trong 1 g đất ô nhiễm từ 1,06x105 đến 5,99x106 và xác định sự có mặt của gen mã hóa

dioxygenase, tfdA, tftA trong 3 ch ủng vi khuẩn phân lập Paenibacillus sp Ao3,

Terrabacter sp DMA và Rhodococcus sp HDN3 (Hữu và cs., 2009) Phùng Khắc

Huy Chú và cộng sự cũng phát hiện thấy hai chủng Pseudomonas sp BHNA1 và

Acinetobacter sp BHNB1 có mang gene chức năng tfdA (Chú và cs., 2012) Như đã

đề cập, trong dự án hợp tác khử độc dioxin ở sân bay Đà Nẵng năm 2009 với Cục

bảo vệ môi trường Hoa Kỳ các tác giả Việt Nam đã xác định số lượng bản sao của gene chức năng C230 (Catechol 2,3 dioxygenase) Kết quả định lượng cho thấy số

bản sao của gen C230 được phát hiện ở tất cả các mẫu phân tích với số lượng dao

động từ 2,1 x105ở mẫu M9.0 đến 6,7x106ở M8.3 (Hà và cs., 2010)

Với dioxin và các hợp chất tương tự, quá trình phân hủy thường diễn ra trong 2 điều kiện là hiếu khí và kị khí bởi VSV cũng như hệ enzyme khác nhau Một số VK mang gen mã hóa enzyme dioxin dioxygenase có khả năng oxy hóa vị trí bên như

Novosphingobium aromaticivorans IFO15084, N stygium IFO 16085, N

sunterraneum IFO 16086, Porphyribacter sanguineus IAM 12620T, Sphingobacterium

yanoikuyae B1, B cepacia F297, B cepacia ET4, Ralstonia sp SBUG290,

Pseudomonas sp HL7b v.v Kubota và cộng sự (2005), Sphingomonas wittichii RW1

(Hartmann, 2014) hoặc cả vị trí góc như Cycloclasticus pugetti, Comamonas sp KD7,

Rhodococcus sp NCIMB 12038, Rhodococcus opacus SAO 101 (Chang, 2008) và

Rhodococcus sp HA01 (Hamdy và Aly, 2008) Bên cạnh đó còn 1 số enzyme có thể kể đến như toluene monooxygenase, toluene dioxygenase, phenol monooxygenase và methane monooxygenase Một số chủng nấm chứa hệ enzyme oxy hóa ngoại bào (ligninolytic enzyme) và enzyme nội bào (cytochrome P450 monooxygenase,

arylalcohol dehydrogenase, arylaldehyde dehydrogenase) (Stella và cs., 2013) phân

hủy dioxin cũng được chứng minh như Cerrena sp F0607, Pleurotus ostreatus

(Hidayat và Tachibana, 2013)

Tuy các enzyme tham gia phân hủy kị khí hợp chất chứa clo rất đa dạng nhưng các nghiên cứu mới chỉ chủ yếu tập trung enzyme RdhA (reductive dehalogenase) bởi enzyme này có thể xúc tác cho quá trình loại clo của nhiều hợp

chất hữu cơ chứa clo khác nhau (Krajmalnik, 2005) Các vi khuẩn khác nhau có thể

cùng mang gene rdhA (gene pceA, cprA) mã hóa enzyme tương đồng nhau như enzyme PceA của các chủng Dehalobacter restrictus, Desulfitobacterium hafniense

Y51 và D hafniense TCE1

Ngoài ra, có thể kể đến nhiều gene và enzyme tham gia vào quá trình hô hấp

loại clo như benzoyl-CoA, chlorocatechol dioxygenase, 4-hydroxybenzoyl-CoA thioesterase (Gohil, 2011), enzyme benzene dioxygenase, chloromuconate cycloisomerase, maleylacetate reductase tham gia quá trình phân hủy 1,2,3,5-TCB ở

chủng Pseudomonas sp PS14 (Reineke, 2001); 3-oxoadipate enol-lactone hydrolase;

3-oxoadipate:succinyl-CoA transferase; 3-oxoadipyl-CoA thiolase tham gia vào quá trình phân hủy và chuyển hóa benzoate, chlorobenzoate ở chủng Pseudomonas sp B13 (Stefan và cs., 2002); pentylacetyl-CoA ligase, enoyl-CoA hydratase, acyl-CoA dehydrogenase, ketothiolase mã hóa enzyme tham gia vào quá trình phân hủy phenylacetate acid ở chủng P putida KT2440 (Kim và cs., 2009) Nguyễn Thị Tâm

Thư và cộng sự đã xác định được 30/1883 gene chức năng mã hóa enzyme phân hủy các hợp chất vòng thơm nhưng không phát hiện được RdhA, đây là câu hỏi cần được

trả lời bằng những nghiên cứu tiếp theo (Thư và cs., 2013)

1.3 S ử dụng công cụ metagenomic nghiên cứu đa dạng VSV ô nhiễm POPs

Công nghệ giải trình tự bằng máy giải trình tự công năng cao thế hệ mới kết

hợp phần mềm tin sinh (Công cụ metagenomic) dựa trên các thuật toán lắp ráp, phân tích dữ liệu lớn nhằm hiểu sâu hơn về đa dạng vi sinh vật trong mẫu môi trường đặc biệt là địa điểm có cấu trúc phức tạp, xác định VSV hoặc cụm gene mã hóa cho các enzyme phân hủy chất ô nhiễm, chẩn đoán bệnh v.v (Breitwieser và cs., 2017; Quince và cs., 2017)

Hình 1.4 Nghiên cứu theo hướng -Omics trong sinh học

(Nguồn: Mukesh Kumar Awasthi và cs., 2020)

Số lượng mẫu phân tích metagenomic từ môi trường gia tăng gấp 10 lần từ

2015 tới 2017, tính đến tháng 1 năm 2019 dữ liệu trên ngân hang cơ sở dữ liệu Châu

Âu (European Bioinformatics Institute – EBI) đạt 140.000 mẫu và 1,9 triệu phân tích

(Mitchell và cs., 2017) Với sự phát triển nhanh chóng như vậy đã tạo ra dữ liệu lớn các nghiên cứu metagenome và cần có các công cụ để theo dõi, thống kê và liên kết các kết quả đó với nhau Do đó, Sử dụng metagenomic trong nghiên cứu đa dạng VSV phân hủy chất diệt cỏ/dioxin là cần thiết và có tính khả thi cao Trong tương lai,

những cải tiến cũng như đổi mới công nghệ sẽ giúp giảm chi phí và sự thay đổi của các nền tảng công nghệ sẽ giúp khai thác sâu hơn các metagenome từ đó ứng dụng vào y tế, nông nghiệp và tạo môi trường bền vững Hiện tại, dữ liệu về VSV liên quan đến chất diệt cỏ/dioxin trong đất còn rất hạn chế nên luận án chỉ đề cập thông tin có thể tiếp cận được ở mức độ chung tới các gene chức năng liên quan đến chuyển hóa, phân hủy xenobiotics Sự đa dạng của các nhóm VSV có mặt trong đất ô nhiễm nặng

và đã xử lý làm sạch sẽ được thông báo trong luận án của nghiên cứu sinh

Nghiên cứu metagenomic hiện nay có thể được thực hiện theo các hướng tiếp

cận khác nhau nhưng đều có các bước cơ bản gồm: Thu nhận và tách chiết DNA mẫu môi trường, giải trình tự toàn bộ DNA và phân tích các trình tự thu được bằng các phần mềm tin sinh chuyên dụng với các cơ sở dữ liệu đã có (về đa dạng VSV, gen chức năng, protein và con đường chuyển hóa giả định) Các bước thực hiện chính được thể hiện ở hình 1.5

Việc sử dụng các Kit thương mại như PowerSoil® DNA Isolation Kit (MO BIO Laboratories, Inc.), Soil DNA Isolation Kit (Norgen Biotek Corp.), E.Z.N.A.®Soil DNA Kit (Omega Bio-tek) giúp thu được lượng lớn DNA với độ tinh sạch cao theo yêu cầu Công nghệ giải trình tự có thể kể đến gồm: Sanger, pyrosequencing 454/Roche, whole genome shotgun sequencing Illumina/Solexa với kích thước các đoạn read tương ứng >700 bp, 400-600 bp và 100-300 bp (Thomas và cs., 2012; Lim

và cs., 2012) Tiếp đó, các trình tự được lắp ráp để tạo nên các trình tự có nghĩa dựa trên trình tự tham chiếu (reference-based assembly) và lắp ráp de novo (Ayling và cs., 2019) bằng một số phần mềm như: Newbler (Roche), AMOS hay MIRA, Meta Velvet, Meta – IDBA, SOAP v.v (Chevreux và cs., 1999; Miller và cs., 2010; Pevzner và cs., 2001) Bước cuối cùng trong phân tích metagenome là chú giải các trình tự trên các cơ sở dữ liệu (CSDL) online như rapid annotation using subsystem technology (MG-RAST) (Meyer và cs., 2008), integrated microbial genome (IMG), Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) (Kanehisa và Goto, 2000), evolutionary genealogy of genes: Non-supervised Orthologous Groups (eggNOG) (Muller và cs., 2009), Clusters of Orthologous Groups (COG/KOG) (Tatusov và cs., 2000), PFAM (Bateman và cs., 2004) v.v với các phần mềm dự đoán các trình tự

có nghĩa từ metagenome (CDS) như FragGene Scan, MetaGene Mark, MetaGene Annotator v.v (Thomas và cs., 2012; Rho và cs., 2010)

Công cụ metagenomic đã được sử dụng để nghiên cứu quần xã sinh vật trong nhiều loại môi trường khác nhau như ruột mối, đường ruột ở người, hệ thống xử lý nước thải, bể phân hủy kị khí và hệ thống thoát nước mỏ acid, đất ô nhiễm cadimi v.v (Beloqui và cs., 2006; Fang và cs., 2011; Zhang và cs., 2019) Nhiều nghiên

cứu liên quan đến sự đa dạng của VK hô hấp loại khử clo và quá trình trao đổi chất của chúng đã được thực hiện Các quần xã VK thường có sự tương tác đa loài trong

mạng lưới, chúng thường sống trong quần xã nhưng rất khó phân lập ở dạng thuần khiết nên cần thiết phải xác định các đặc điểm của quần xã dựa vào công cụ metagenomic

Hình 1.5 Các bước thực hiện phân tích metagenomic

(Nguồn: Spichler và cs., 2015)

Metagenomic được sử dụng trong xác định các chủng Dehalobacter sp E1 và

Sedimentibacter sp B4 có khả năng loại khử clo của beta-hexa-chlorocyclohexane (Maphosa và cs., 2010) Dehalobacter sp không thể được nuôi cấy ở dạng chủng sạch và

cần có cả VK Sedimentibacter để duy trì khả năng loại khử clo (Van Doesburg và cs., 2005) Metagenome của hỗn hợp KB-1 có khả năng loại khử clo của TCE chứa các chi Dehalococcoides, Geobacter, Methanosarcina, Spirochaeeta và Sporomusa (Hug và cs., 2012) Kết hợp metagenomic với metatranscriptomic và metaproteomic (nghiên cứu -Omics) cho phép chúng ta biết được hoạt động sống thực của quần xã VSV ở tự nhiên

Qua các kết quả nghiên cứu metagenome đa dạng VSV phân hủy hợp chất

hữu cơ chứa clo cho thấy các vi khuẩn kị khí (VK KK) hô hấp loại khử clo chỉ chiếm một phần rất nhỏ trong tổng số quần xã VSV nhưng vẫn có thể hiểu được quan hệ tương tác giữa chúng Đó cũng là điểm khác biệt rõ ràng nhất khi nghiên cứu sử dụng các kỹ thuật như DGGE, đa hình chiều dài đoạn cắt cuối (Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism – TRFLP) chỉ dựa vào các đoạn gene 16S rRNA so với công cụ metagenomic Khi sử dụng Metagenomic và các phương

pháp truyền thống nghiên cứu cấu trúc của quần xã VK KK được làm giàu từ bùn ô nhiễm ở Alameda Naval Air Station (ANAS), California cho thấy các vi khuẩn đã

loại clo của TCE đến ethene (Freeborn và cs., 2005; Holmes và cs., 2006) Trong metagenome đã tìm thấy sự thay đổi loài chiếm ưu thế và sự có mặt cả nhóm VK sinh metan Dựa trên cơ sở dữ liệu chung các nhà nghiên cứu có thể phân tích so sánh các nhóm VK KK hô hấp loại khử clo như Dehalococcoides, Dehalobacter,

Desulfitobacterium trong các quần xã khác nhau

Meier và cộng sự (2014) đã sử dụng công cụ metagenomic để nghiên cứu sự

đa dạng của quần xã VSV từ đất bị ô nhiễm hydrocarbon đa vòng thơm và tìm kiếm các gen chức năng tham gia vào quá trình phân hủy PAHs Từ phân tích của họ cho

thấy ngành Proteobacteria chiếm 90%, trong đó chi Pseudomonas chiếm 30% số

lượng VSV trong quần xã Nhóm tác giả cũng đã xác định sự có mặt của các gen

bph và bphA1 mã hóa cho enzyme carbazole dioxygenases (Meier, 2014)

Yan và cộng sự (2016) nghiên cứu mức độ đa dạng của quần xã VSV từ đất nhiễm chất phóng xạ Uranium, 2 ngành Actinobacteria và Proteobacteria chiếm ưu

thế trong mẫu nghiên cứu Trong đó, 3 chi vi khuẩn Robiginitalea, Microlunatus và

Alicyclobacillus chiếm ưu thế trong đất nhiễm chất phóng xạ (Yan và cs., 2016)

Daniel và cộng sự (2018) nghiên cứu metagenome của tổ hợp vi khuẩn được làm giàu trên PCBs như nguồn cacbon và năng lượng duy nhất Phân tích metagenome đã chỉ ra con đường chuyển hóa biphenyl thành benzoate bởi chủng Rhodococcus Các chủng thuộc Pseudomonas và Bordetella tham gia quá trình chuyển hóa benzoate thành TCA trong khi các bước chuyển hóa trung gian có sự tham gia của Achromobacter và Variovorax Garrido-Sanz và cộng sự cũng đã phân lập được chủng Rhodococcus WAY2 từ tổ hợp vi khuẩn trong mẫu nghiên cứu (Garrido-Sanz và cs., 2018)

Các nhà khoa học Australia sử dụng công cụ metagenomic nghiên cứu gene chức năng nhóm xenobiotic trong đất nông nghiệp nhiễm chất diệt cỏ cũng như sự

đa dạng VSV (Jeffries và cs., 2018) Có 2 nhóm khác nhau được đánh giá cùng với

sản phẩm của chúng bởi sự gia tăng của chu trình vận chuyển, chất dinh dưỡng và enzyme tham gia các quá trình phân hủy Nghiên cứu đã đề cập tới khả năng tăng cường xử lý môi trường ô nhiễm thông qua những hiểu biết mới về các đặc tính ô

nhiễm môi trường mà công cụ metagenomic đem lại Jakub và cộng sự (2017) cũng nghiên cứu mối quan hệ giữa các VSV cũng như đa dạng gene tham gia quá trình phân hủy sinh học PAHs trong đất Bằng cách so sánh mẫu đất ô nhiễm với mẫu đất nông nghiệp, đất rừng tác giả đã chỉ ra khả năng đồng hóa hợp chất hydrocacbon bởi vi khuẩn ở khắp nơi Nhóm Gammaproteobacteria chiếm ưu thế trong tất cả các mẫu sau đó là Alphaproteobacteria Đặc biệt, nhóm gene mã hóa cho enzyme dioxygenase tham gia vào quá trình phân hủy hợp chất vòng thơm cũng được xác định (Jakub Czarny và cs., 2017)

Nghiên cứu đã chỉ ra ngành Proteobacteria chiếm ưu thế, trong đó lớp Proteobacteria chiếm đa số Một số ngành chiếm tỷ lệ thấp Bacteroidetes, Firmicutes chưa được nghiên cứu nhiều và đều có các đại diện thuộc nhóm loại khử clo không bắt buộc và bắt buộc Ngành Chloroflexi lại có các đại diện thuộc nhóm

γ-loại khử clo bắt buộc, ngành Actinobacteria có các đại diện có khả năng loại halogen Ngoài ra sự đa dạng các gene chức năng tham gia trong quá trình loại khử

hợp chất hữu cơ chứa clo cũng được đề cập

Trong nghiên cứu của Zhang và cộng sự (2017) về sự thay đổi đa dạng VSV trong mẫu đất bùn nhiễm cadimin (Cd) trên sông Long Giang theo phương pháp khuếch đại gene 16S rRNA và giải trình tự bởi hệ thống Miseq cho thấy vi khuẩn chiếm đa số (90.65%) tiếp theo là vi khuẩn cổ (7.97%) và các trình tự chưa phân loại (1.38%) Ở mức độ ngành chiếm ưu thế lần lượt là Proteobacteria (30.88% ± 25.27%), Bacteroidetes (11.58% ± 9.7%), Chloroflexi (10.14% ± 8.77%), Acidobacteria (8.88% ± 6.70%) và Verrucomicrobia (7.16% ± 9.13%) (Zhang và cs., 2017)

Nghiên cứu thông qua giải trình tự metagenome đất ô nhiễm gần mỏ dầu Tianjin Dagang của miền Nam Trung Quốc đã được tiến hành Quần xã trong metagenome chiếm ưu thế là γ-Proteobacteria và α-Proteobacteria chúng là các VSV chìa khóa cho phân hủy hydrocarbon dầu mỏ Nghiên cứu đa dạng chức năng cho thấy xuất hiện các nhóm enzyme đại diện và các con đường tham gia phân hủy hàng

loạt các hợp chất vòng thơm xenobiotic bao gồm toluene, xylene, chlorobenzoate, aminobenzoate, DDT, methylnaphthalene và bisphenol (Bao và cs., 2017)

Ute và đồng tác giả (2018) cũng đã nghiên cứu khả năng phân hủy 2,4,5-T trong điều kiện kị khí bắt buộc bằng cách làm giàu mẫu đất trong lô xử lý bằng

phân hủy sinh học ở Biên Hòa (Giống địa điểm lấy mẫu BHR trong nghiên cứu này nhưng thời gian lấy mẫu là sau 40 tháng xử lý) với chất nhận điện tử là pyruvate và nguồn cacbon là 2,4,5-T Pyruvate chuyển hóa thành hydrogen, acetate và propionate Hydrogen sau đó cung cấp điện tử trực tiếp cho quá trình phân tách 2,4,5-T và khử clo của 2,4,5-TCP tạo thành Phân tích 16S rRNA cho thấy sự hiện

diện của vi khuẩn và cổ khuẩn chủ yếu thuộc Firmicutes, Bacteroidetes,

Spirochaetes, Chloroflexi và Euryarchaeota Chủng vi khuẩn Desulfitobacterium

hafniense đã được phân lập và xác định thuộc nhóm vi khuẩn loại khử clo Phân tích Metaproteonome cũng được thực hiện trong nghiên cứu này đối tượng là mẫu làm giàu khi có mặt 2,4,5-T đã phát hiện hơn 60 nhóm protein Enzyme thuộc nhóm loại khử clo nhiều nhất là RdhA3 của D hafniense và không phát hiện được enzyme tham gia cắt, ức chế 2,4,5-TCP tạo thành (Lechner và cs., 2018)

Từ các kết quả nghiên cứu quốc tế và trong nước đã công bố được tổng quan

ở trên chúng tôi rút ra một số nhận xét ngắn gọn và đây cũng là cơ sở để nghiên cứu sinh thực hiện luận án này:

- Dioxin và các hợp chất tương tự thuộc nhóm các chất hữu cơ khó phân hủy (POPs) Việt Nam đã ký công ước Stockholm phải được loại bỏ hoàn toàn bởi độc tính và khả năng tồn tại bền vững của chúng trong môi trường;

- Lượng chất diệt cỏ/dioxin tồn lưu trong đất bởi chiến tranh hóa học do Mỹ gây ra rất lớn Điểm nóng Đà Nẵng (Khu bắc sân bay – 361.000 ppt, khu Pacer Ivy – 20.600 ppt,) và Biên Hòa (Khu Z1 - 1.578 ppt, khu Tây nam – 110.000 ppt, khu Pacer Ivy – 11.400 ppt, khu Đông bắc – 1.300 ppt, khu Tây bắc – 477 ppt);

- Biên Hòa đã thực hiện chôn lấp 90.000 m3 đất ô nhiễm ở khu vực Z1 và trong đó đã xử lý thành công 3.384 m3 đất ô nhiễm trên 10.000 ngTEQ/kg bằng công nghệ phân hủy sinh học, tổng độ độc chỉ còn 13,2 ngTEQ/kg đất khô; Ở sân bay quân sự Đà Nẵng đã sử dụng phương pháp khử hấp thu nhiệt và lưu chứa để xử

lý dioxin trong 90.000 m3bùn đất ô nhiễm

- Sự đa dạng của quần xã VSV ở Đà Nẵng và Biên Hòa thực hiện bằng công nghệ sinh học phân tử hiện đại của thế hệ đầu như DGGE và SSCP không thông

qua nuôi cấy cho thấy số lượng VSV có thể phân hủy hiếu khí, kị khí chất diệt

cỏ/dioxin dao động rất lớn cũng như đa dạng về chủng loài cao hơn hẳn so với các phương pháp nghiên cứu truyền thống;

- Công cụ nghiên cứu đa dạng quần xã VSV đất hiện nay (metagenomic) giúp khắc phục được các nhược điểm trong kỹ thuật nuôi cấy và đánh giá cấu trúc

quần xã VSV trong môi trường ô nhiễm phức tạp tạo cơ sở hướng đích tới công nghệ khử độc, làm sạch hỗn hợp ô nhiễm các chất đa vòng thơm chứa halogen và không chứa halogen trong đó có chất diệt cỏ/dioxin và các loại POPs khác;

- Sự phát triển của các phần mềm tin sinh chuyên dụng ứng dụng trong metagenomic nói riêng và các công cụ -Omics nói chung (metagenomics, metatranscriptomics, proteomics và metabolomics) giúp phát hiện và khai thác VSV không thông qua nuôi cấy bằng các hình thức khác nhau từ các vùng ô nhiễm nhằm

tạo công nghệ phù hợp và hiệu suất cao hơn để tái tạo lại môi trường đã bị ô nhiễm;

- Bước đầu đã nghiên cứu đa dạng trong metagenome của quần xã vi khuẩn

kỵ khí nuôi cấy được trong mẫu làm giàu đất bùn ô nhiễm rất nặng chất diệt cỏ/dioxin ở sân bay Biên Hòa đã được thực hiện bằng thiết bị giải trình tự Miseq

Do sự đa dạng của hệ VSV hiếu khí lớn hơn gấp nhiều lần so với VSV kị khí nên

kết quả thu được là một minh chứng nhỏ đầu tiên về đa dạng quần xã cũng như cấu trúc của chúng trong vùng đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin và hệ enzyme tham gia cũng như con đường chuyển hóa giả định khác nhau

Từ những dữ liệu và minh chứng được tổng quan trình bày ở trên nên chúng tôi đã sử dụng công cụ metagenomic để nghiên cứu sự đa dạng về chủng loài (taxa),

đa dạng về gene chức năng, protein giả định tham gia vào 4 con đường chuyển hóa đất nhiễm nặng hỗn hợp chất diệt cỏ/dioxin có gì giống và khác so với các công bố trong và ngoài nước đã tổng quan ở trên Ngoài ra, hai tổ hợp là vi khuẩn và xạ khuẩn đã được làm sạch có mặt ở hai metagenome khác nhau cùng với khả năng phân hủy đồng phân độc nhất 2,3,7,8-TCDD (dioxin) của chúng sẽ được làm rõ trong luận án này

CHƯƠNG 2

V ẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 V ật liệu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

- Mẫu đất được thu thập ở các khu vực, vị trí khác nhau và tính thống kê cùng

tọa độ GPS khu vực thu mẫu Sau khi đồng nhất, đất được sử dụng trong tách chiết DNA metagenome và phân lập VSV sử dụng trong thí nghiệm phân hủy dioxin trong đất

bởi tổ hợp vi khuẩn và xạ khuẩn:

+ Đất ô nhiễm nặng chất diệt cỏ/dioxin (ký hiệu là mẫu C) nằm ở phía Tây Nam của sân bay Biên Hòa, tỉnh Đồng Nai (10°58'14.3"N 106°48'19.3"E) được lấy

từ 5 vị trí và độ sâu từ 0-100 cm Mẫu được tiến hành thu nhận vào tháng 4/2014;

Độ độc sau khi đồng nhất của mẫu đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin (C) lên tới 21.605 ng TEQ/kg, đây là mức ô nhiễm nặng cần phải khử độc (xử lý triệt để) theo hiệp định mà Việt Nam đã ký kết Hình ảnh hiện trường lấy mẫu và đất đã đồng

nhất được thể hiện ở hình 2.1

Hình 2.1 Mẫu đất nhiễm nặng chất diệt cỏ/dioxin (ký hiệu C) A: Hiện trường lấy mẫu khu Tây Nam; B: Đất đã đồng nhất để nghiên cứu

+ Đất đã được xử lý sạch chất diệt cỏ/dioxin bằng công nghệ phân hủy sinh

học trong các lô Chôn lấp tích cực (Bioremediation – ký hiệu là mẫu BHR) ở khu Z1 (10°57'46.4"N 106°49'22.6"E) của sân bay Biên Hòa Đây là khu thực hiện dự

án “Xử lý ô nhiễm dioxin tại các vùng nóng ở Việt Nam” do Bộ Quốc phòng thực

hiện tại Đồng Nai Lô xử lý có khối lượng 3.384 m3 đất ô nhiễm có tổng độ độc ban đầu khoảng 10.000 ng TEQ/kg đất Đất được bổ sung chế phẩm Slow-D, DHS1, DHS2 (là các chất có bản chất sinh học và hóa học khác nhau để cung cấp cho VSV sinh trưởng) và các phụ phế liệu nông nghiệp với các kích thước khác nhau trước khi chôn lấp Công nghệ được gọi là “chôn lấp tích cực”