MỤC TIÊU, CÁCH TIẾP CẬN, ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Mục tiêu
Thu nhận 5 cao ethanol thực vật có hoạt tính kháng MRSA
Khảo sát MIC của cao thực vật kháng MRSA cao nhất
Khảo sát MBC của cao thực vật kháng MRSA cao nhất Định danh thực vật có hoạt tính kháng MRSA cao nhất.
Cách tiếp cận
Từ nhu cầu thực tế, tham khảo các nghiên cứu trong và ngoài nước
Thu thập các phương pháp nghiên cứu liên quan
Tiến hành khảo sát thực nghiệm.
Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
Hoạt tính kháng Chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus kháng methicillin (MRSA) ATCC
33591 của cao chiết ethanol thực vật mọc tại Bình Dương.
Phạm vi nghiên cứu
Thu nhận cao chiết của 20 loài thực vật Đánh giá khả năng kháng MRSA của hoạt chất thực vật trong điều kiện In Vitro
Thu nhận 5 cao thực vật có hoạt tính kháng MRSA.
Phương pháp nghiên cứu
Nuôi cấy vi khuẩn: Chủng vi khuẩn Chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus nhạy methicillin (MSSA) ATCC 6538 được sử dụng như chủng đối chứng, chủng
Staphylococcus aureus kháng methicillin (MRSA) ATCC 33591 được cung cấp bởi công ty Microbiologics (USA) và MSSA được nuôi trên môi trường lỏng Trypton Soy
(Himedia, Ấn Độ), và môi trường Trypton Soy agar (Himedia, Ấn Độ) Chủng vi khuẩn được nuôi trong tủ ấm (DaiHan, Hàn Quốc), ở nhiệt độ 37 0 C, trong vòng 18 giờ
Phương pháp thu nhận cao ethanol thực vật bắt đầu bằng việc rửa sạch sinh khối tươi (lá, hoa, cành non) bằng nước cất và bảo quản trong tủ lạnh 24 giờ Sau đó, sinh khối được nghiền bằng máy xay FY 130 với tốc độ 34,000 vòng/phút và kích thước mắt lưới từ 0.074-0.25mm Tiếp theo, bột thực vật được chiết xuất bằng ethanol ở 50 độ C, lắc 100 vòng/phút trong máy lắc Ika KS 4000i trong 24 giờ, sau đó thực hiện chiết kiệt trong vòng 1 tuần với tỷ lệ ethanol: sinh khối khô là 2 lít: 50g, lặp lại 3 lần Dung dịch thu được được lọc qua giấy lọc Whatman đường kính 110mm với kích thước lỗ lọc 20-25μm, sau đó được cô đặc bằng máy quay ở 50 độ C trong 2-3 giờ, và cuối cùng, cao sệt được sấy ở 50 độ C đến khi đạt khối lượng không đổi.
Phương pháp thu nhận dung dịch cao thực vật để khảo sát hoạt tính kháng MRSA bao gồm các bước sau: Cao thực vật được cân bằng cân phân tích Sartorius (Đức) và hòa tan trong dung dịch DMSO 10% Dịch hòa tan sau đó được ly tâm ở tốc độ 14.000 vòng/phút trong 4 phút bằng máy Hermle (Đức), loại bỏ cặn và thu dịch Dung dịch này được lọc qua phin lọc kích thước 0.22µm và nồng độ được xác định qua hai phương pháp: gián tiếp và trực tiếp Phương pháp gián tiếp đo khối lượng cặn phơi trong tủ sấy ở 50°C đến khối lượng không đổi, trong khi phương pháp trực tiếp sử dụng pipetman để lấy 1ml dịch và cô đặc trong tủ sấy DaiHan (Hàn Quốc) ở 50°C, từ đó xác định khối lượng chất tan trong 1ml dung dịch khảo sát.
Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch sử dụng môi trường Muller-Hinton Agar (MHA) với vi khuẩn ở nồng độ 10^6 CFU/ml, áp dụng phương pháp Kirby-Bauer Các giếng khoan 4mm trên đĩa thạch được làm đầy bằng 50µl dịch chiết và nồng độ MIC tối thiểu của kháng sinh đối chứng, sau đó ủ ở 37°C trong 24 giờ Kết quả được lặp lại 3 lần và kích thước vòng kháng khuẩn được đo sau 24 giờ Hoạt tính kháng MRSA của cao thực vật được đánh giá so với kích thước vòng kháng khuẩn của kháng sinh chuẩn, sử dụng tiêu chuẩn vòng kháng khuẩn của CLSI để giải thích hoạt tính kháng khuẩn.
Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết được xác định bằng phương pháp pha loãng (Broth microdilution method), là nồng độ thấp nhất ngăn chặn sự phát triển của vi khuẩn sau 24 giờ nuôi cấy Phương pháp này sử dụng đĩa nuôi cấy 96 giếng, trong đó mỗi giếng chứa 10µl dịch vi khuẩn với nồng độ 10^6 CFU/ml và cao chiết thực vật được pha loãng Mỗi giếng bao gồm 100µl dịch cao chiết và 100µl môi trường lỏng Muller Hinton, tổng thể tích là 210µl Hai giếng đối chứng được sử dụng: một giếng chỉ chứa môi trường MHB (đối chứng âm) và một giếng chứa môi trường MHB cùng với chủng vi khuẩn (đối chứng dương) Các giếng được ủ hiếu khí ở 37°C trong 24 giờ, và nồng độ thấp nhất trong dãy nồng độ mà ức chế sự phát triển của vi khuẩn sẽ được xác định là nồng độ ức chế tối thiểu (MIC).
Xác định nồng độ diệt khuẩn của cao chiết bằng phương pháp trải đĩa nhằm tìm ra nồng độ diệt khuẩn tối thiểu, tức là nồng độ thấp nhất làm giảm 99,9% lượng vi khuẩn Các ống có nồng độ ức chế tối thiểu được chọn từ kết quả thí nghiệm và 100µl dịch trong mỗi ống được trải lên 2 đĩa thạch theo phương pháp Shanholtzer Dung dịch đối chứng cũng được xử lý tương tự Các đĩa trải được ủ ở 35°C trong 24 giờ, và nồng độ thấp nhất của chất chiết không có sự hiện diện của khuẩn lạc trên đĩa sẽ được xác định là giá trị MBC Những quan sát này được liên kết với các ống MIC sau 48 giờ ủ.
Khảo sát khả năng kết hợp bằng phương pháp khuếch tán đĩa
Phương pháp Kirby-Bauer được áp dụng với một số điều chỉnh cụ thể: Mỗi đĩa môi trường MHA có 3 giếng, trong đó giếng thứ nhất chứa cao thực vật A, giếng thứ hai chứa cao thực vật B, và giếng thứ ba là sự kết hợp giữa cao thực vật A và B Mỗi giếng được bổ sung 100μl dịch, với giếng thứ ba có 100μl dịch cao thực vật A và 100μl dịch cao thực vật B Sau khi ủ ở 37°C trong 18 giờ, các thí nghiệm được lặp lại 3 lần Kích thước vòng kháng khuẩn được đo bằng milimet (mm) sau 18 giờ và được phân tích theo tiêu chuẩn vòng kháng khuẩn của CLSI Đường kính vòng kháng khuẩn kết hợp được tính toán theo công thức.
D=rA+rB (mm); rA là bán kính vòng kháng khuẩn của thực vật A (mm) rB là bán kính vòng kháng khuẩn của thực vật B (mm)
C là đường kính vòng kháng khuẩn mở rộng (mm)
Các thí nghiệm được lặp lại 3 lần và được xử lý bằng phần mềm STATGRAPHICS Centurion XV.
Nội dung nghiên cứu
Nội dung 1: Thu cao chiết ethanol của 20 loài thực vật
Phương pháp chính: Phương pháp ngâm dầm
Để thực hiện, thu nhận các bộ phận của thực vật như thân, lá, rễ, sau đó phơi khô và xay thành bột mịn, gọi là bột dược liệu Tiếp theo, ngâm bột dược liệu trong ethanol với tỷ lệ 1:1 về khối lượng trong khoảng 24 giờ Sau khi lọc và gộp dịch chiết, cô giảm áp cho đến khi thể tích còn khoảng 1/4, rồi cho cao sệt vào tủ sấy ở 50 độ C đến khi đạt khối lượng không đổi, từ đó thu được cao ethanol.
Kết quả dự kiến: Thu được 20 cao ethanol thực vật
Nội dung 2: Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn MRSA của cao chiết
Phương pháp chính để thử nghiệm khả năng kháng khuẩn bao gồm khuếch tán trên đĩa thạch Muller-Hinton Agar Để xác định nồng độ ức chế tối thiểu của cao chiết, áp dụng phương pháp pha loãng (Broth microdilution method) Ngoài ra, nồng độ diệt khuẩn của cao chiết được xác định thông qua phương pháp trải đĩa.
Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch sử dụng môi trường Muller-Hinton Agar (MHA) với vi khuẩn ở nồng độ 10^6 CFU/ml, áp dụng phương pháp Kirby-Bauer Các giếng khoan có kích thước 4mm được làm đầy bằng 50µl dịch chiết thực vật và dịch chiết kháng sinh đối chứng ở nồng độ MIC tối thiểu Sau khi ủ ở 37°C trong 24 giờ, các thí nghiệm được lặp lại ba lần để đo kích thước vòng kháng khuẩn Hoạt tính kháng MRSA của cao thực vật được so sánh với kích thước vòng kháng khuẩn của kháng sinh chuẩn, dựa trên tiêu chuẩn của CLSI.
Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) được xác định bằng phương pháp pha loãng, là nồng độ thấp nhất có khả năng ngăn chặn sự phát triển của vi khuẩn sau 24 giờ nuôi cấy Phương pháp này sử dụng đĩa nuôi cấy 96 giếng, trong đó mỗi giếng chứa 10µl dịch vi khuẩn với nồng độ 10^6 CFU/ml và cao chiết thực vật được pha loãng Mỗi giếng bao gồm 100µl dịch cao chiết và 100µl môi trường lỏng Muller Hinton, tổng thể tích là 210µl Hai giếng đối chứng được sử dụng: một giếng chứa chỉ môi trường MHB (đối chứng âm) và một giếng chứa môi trường MHB cùng với chủng vi khuẩn (đối chứng dương) Các giếng được ủ hiếu khí ở 37°C trong 24 giờ, và nồng độ thấp nhất trong dãy nồng độ mà ức chế sự phát triển của vi khuẩn được xác định là nồng độ ức chế tối thiểu (MIC).
Xác định nồng độ diệt khuẩn của cao chiết bằng phương pháp trải đĩa cho thấy nồng độ diệt khuẩn tối thiểu là nồng độ thấp nhất làm giảm 99,9% lượng vi khuẩn Từ kết quả thí nghiệm, các ống có nồng độ thấp nhất có khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn sẽ được chọn Sử dụng pipette, 100μl dịch từ mỗi ống được trải trên 2 đĩa thạch theo phương pháp Shanholtzer Dung dịch đối chứng cũng được xử lý tương tự Các đĩa trải được ủ ở 35°C trong 24 giờ Sau thời gian ủ, nếu nồng độ thấp nhất của chất chiết không có sự hiện diện của khuẩn lạc trên đĩa, giá trị nồng độ đó được xác định là MBC, và các quan sát này được liên kết với các ống MIC sau 48 giờ ủ.
Cách thực hiện: Sau khi thu cao chiết, pha loãng cao chiết trong nước cất tiệt trùng xác định nồng độ MIC, MBC
Kết quả dự kiến: Khả năng kháng khuẩn MRSA của cao chiết thực vật
Nội dung 3: Định danh thực vật có hoạt tính kháng MRSA cao nhất
Mẫu thực vật cho hoạt tính kháng khuẩn MRSA cao nhất được định danh dựa trên hình thái thực vật theo mô tả của GS Phạm Hoàng Hộ
1 Danh mục thực vật sàng lọc cao ethanol thực vật kháng MSSA và MRSA stt Tên mẫu
1 Kinh giới Lamiaceae Elsholtzia cristata
2 Rẻ quạt Iridaceae Belamcanda chinensis
4 Tiêu lớp Piperaceae Piper longum Toàn cây - - -
6 Hoa sữa Apocynaceae Alstonia scholaris L
7 Chè xanh Theaceae Camellia sinensis
12 Cơm rượu Rutaceae Glycosmis pentaphylla
13 Đinh lăng Araliaceae Polyscias fruticosa
14 Cỏ sữa lá nhỏ Euphorbiaceae Euphorbia thymifolia L
Cây Ké Đầu Ngựa Asteraceae
17 Trâm Tròn Myrtaceae Syzygium glomerulatum
18 Trâm Dài Myrtaceae Syzygium cumini L
19 Cò ke Malvaceae Grewia asiatica L
20 Xăng mã Rhizophoraceae Carallia brachiata
VK±SD (Standard deviation) = (-): không có hoạt tính kháng khuẩn, NT: Không khảo sát
2 Hoạt tính kháng MRSA từ cao thực vật
Bảng 2 Danh mục thực vật thu cao chiết ethanol cho hoạt tính kháng MRSA
Nồng độ Cao thực vật (àg/ml)
Tên thông thường Tên khoa học
1 Kim vàng Barleria lupulina Lindl Toàn cây 90.12 +
2 Trâm Tròn Syzygium glomerulatum Lá và cành non
3 Trâm Dài Syzygium cumini L Lá và cành non
4 Cò ke Grewia asiatica L Lá và cành non
5 Xăng mã Carallia brachiata Lá và cành non
Thành phố Thủ Dầu Một, tỉnh Bình Dương 11 0 00’33.02’’ Phía Bắc, 106 0 39’00.37’’ phía Đông, Độ cao 11m±3m
Từ 20 loài thực vật được thu nhận tại Bình Dương, bằng phương pháp chiết ngâm dầm ethanol 99% kết hợp với lắc ở tốc độ 100 vòng/phút trong thời gian 24h, chiết 1 lần và lặp lại trong vòng 1 tuần cho đến khi chiết kiệt Cô giảm áp còn khoảng 1/4 thể tích, sau đó cao sệt được để vào tủ sấy 50 0 C đến khối lượng không đổi ta được cao ethanol Cao ethanol thực vật được hòa trong DMSO 10% để khảo sát hoạt tính kháng khuẩn Staphylococus aureus nhạy methicillin (MSSA)ATCC 6538 và Staphylococcus aureus kháng methicillin
Nghiên cứu về hoạt tính kháng khuẩn của cao ethanol thực vật đối với MRSA (ATCC 33591) đã chỉ ra năm loại thực vật có hiệu quả, bao gồm Kim vàng, Xăng Mã, Trâm Trũn, Trõm Dài và Cũ ke, với nồng độ hoạt tính lần lượt là 90.12 àg/ml, 31.34 àg/ml, 9.83 àg/ml, 50.83 àg/ml và 29.4 àg/ml Đây là lần đầu tiên hoạt tính kháng MRSA của năm loại thực vật này được báo cáo tại Việt Nam, mặc dù một số nghiên cứu trước đó cũng đã đề cập đến chúng trên thế giới Đặc biệt, nghiên cứu của Keerati Joyjamras tại Đại Học Rangsit, Thái Lan cho thấy Kim vàng không có hoạt tính kháng MSSA và MRSA, điều này cũng được xác nhận bởi nhóm tác giả Voravuthikunchai và cộng sự vào năm 2005 Tuy nhiên, nghiên cứu hiện tại đã phát hiện hoạt tính kháng MRSA ở nồng độ 90.12 àg/ml, cho thấy rằng yếu tố thổ nhưỡng có thể ảnh hưởng đến khả năng kháng khuẩn của cao chiết thực vật.
Hình 1 Hoạt tính kháng khuẩn của Năm cao ethanol thực vật kháng MRSA
Trong số bốn loài cây còn lại, Trâm Dài đã được nghiên cứu nhiều về hoạt tính kháng khuẩn, với nồng độ methanol cao kháng MRSA được báo cáo là 100mg/ml, cho kích thước vòng kháng MRSA đạt 13.15±0.21(mm) Trong khi đó, nghiên cứu này ghi nhận hoạt tính kháng MRSA của loài cây được khảo sát là 50.83 µg/ml, với kích thước vũng kháng là 12mm Đối với loài Cao tròn, hiện chưa có công trình nghiên cứu nào được công bố Hai loài thực vật còn lại là Xăng.
Chưa có nghiên cứu nào tại Việt Nam về hoạt tính MRSA của cao chiết từ Cò Ke Ruchi Tiwari và các cộng sự đã báo cáo về khả năng làm lành vết thương của Xăng Mã, đồng thời xác định các nhóm hợp chất có trong cao Xăng.
Cao chiết ethanol từ các loài thực vật bản địa Bình Dương chứa các hợp chất như tannins, flavonoids và glyceroglycolipids, cho thấy tiềm năng kháng khuẩn đáng kể, đặc biệt là đối với vi khuẩn kháng methicillin Staphylococcus aureus (MRSA).
3 Khảo sát khả năng kết hợp của các cao ethanol năm loài thực vật trên hoạt tính kháng MRSA
Hình 2 Hoạt tính kháng khuẩn và khả năng kết hợp của dịch chiết cao Xăng Mã, Cò Ke,
Trâm Dài với Cao Trâm Tròn, Kim Vàng kháng MRSA
Bảng 2 Khảo sát khả năng kết hợp của Cao Xăng Mã, Cò Ke, Trâm Dài với Trâm Tròn,
Kim Vàng trên chủng MSSA và MRSA bằng phương pháp khuếch tán đĩa
Bán kính vòng kháng khuẩn (rA) (mm)
Bán kính vòng kháng khuẩn (rB) (mm)
Kích thước vòng kháng khuẩn theo công thức (D) (mm)
Kích thước vòng kháng khuẩn mở rộng (C) (mm)
Kết hợp vi khuẩn Trâm
Theo công thức của Farrukh Aqil và cộng sự, kích thước vòng kháng khuẩn được tính toán và kết quả được trình bày trong Bảng 2 và Hình 2 Cụ thể, rA của Cao Xăng Mã trên chủng MSSA lần lượt là 4mm và 6mm, trong khi rB của Trâm Tròn và Kim Vàng là 9mm và 4mm Kích thước vòng kháng khuẩn D được xác định là 13mm và 10mm, nhỏ hơn kích thước vòng kháng khuẩn mở rộng của Cao Xăng Mã với Trâm Tròn là 17mm và với Kim Vàng là 12mm Điều này cho thấy sự kết hợp hoạt động của Cao Xăng Mã với các chủng vi khuẩn khác.
Trâm Tròn và Kim Vàng thể hiện hoạt tính kháng MSSA, trong khi Cao Cò ke kết hợp với Cao Trâm Tròn và Cao Kim Vàng Ngoài ra, Cao Trâm Dài cũng kết hợp với Cao Trâm Tròn nhưng không kết hợp với Cao Kim Vàng khi xét đến hoạt tính kháng MRSA.
Hình 3 Hoạt tính kháng khuẩn và khả năng kết hợp của dịch chiết cao Xăng Mã với Cao
Trâm Tròn, Kim Vàng kháng S.aureus
Xăng Mã, Cò Ke, và Trâm Dài đều có khả năng kết hợp với Trâm Tròn trong hoạt tính kháng MRSA, trong khi Kim Vàng chỉ có Xăng Mã và Cò Ke thể hiện khả năng này, còn Trâm Dài thì không Trâm Dài và Trâm Tròn thuộc họ Syzygium, cho thấy khả năng kết hợp cao do có thể chia sẻ một số nhóm hợp chất tương tự.
4 Khả năng kết hợp của Cao thực vật với kháng sinh vancomycin cho hoạt tính kháng MRSA
Để đánh giá khả năng kết hợp giữa các cao thực vật và kháng sinh vancomycin, chúng tôi đã áp dụng phương pháp khuếch tán đĩa theo công thức của Farrukh Aqil và cộng sự Nghiên cứu này tập trung vào việc xác định khả năng tương tác của Cao Xăng Mã, Cao Cò Ke và Cao Trõm Dài với vancomycin ở nồng độ 750 µg/ml, cao hơn 14 lần so với MIC của kháng sinh Kết quả được trình bày trong Bảng 3 và Hình 3, trong đó kích thước giếng là 4mm.
1 là dung dịch cao thực vật, giếng 2 là kháng sinh vancomycin, và giếng 3 là kết hợp giữa
2 3 cao thực vật và vancomycin Các dung dịch cao Xăng Mã, Cao Cò Ke, Cao Trâm Dài có nồng độ tương ứng là 31.34àg/ml, 29.4 àg/ml, 50.83àg/ml
Bảng 3 Khảo sát khả năng kết hợp của Cao Xăng Mã, Cò Ke, Trâm Dài với vancomycin trên chủng MSSA và MRSA bằng phương pháp khuếch tán đĩa
Bán kính vòng kháng khuẩn (rA) (mm)
Bán kính vòng kháng khuẩn vancomycin (rB) (mm)
Kích thước vòng kháng khuẩn theo công thức (D) (mm)
Kích thước vòng kháng khuẩn mở rộng (C) (mm)
Bán kính vòng kháng khuẩn của cao thực vật Xăng Mã trên chủng S.aureus và MRSA lần lượt là 6.5mm và 6mm, trong khi dung dịch vancomycin ở nồng độ 750 àg/ml cho bán kính vòng kháng khuẩn là 7.5mm và 7mm Theo công thức của Farrukh Aqil và cộng sự, kích thước vòng kháng khuẩn của Xăng Mã là 14mm đối với MSSA và 13mm đối với MRSA, tương đương với kích thước vòng kháng khuẩn kết hợp giữa Xăng Mã và Vancomycin Kết quả cho thấy dung dịch cao Xăng Mã không có khả năng kết hợp với vancomycin.
Hình 4 Khảo sát khả năng kết hợp của cao Xăng Mã, Cò Ke, Trâm Dài với vancomycin trên chủng S.aureus bằng phương pháp khuếch tán đĩa