Nghiên cứu chiết tách, tinh chế berberine trong thân cây vàng đắng coscinium fenestratum tỉnh quảng nam sử dụng hệ hai pha nước (aqueous two phase systems)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM --- HUỲNH THỊ HÀ DUY NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH, TINH CHẾ BERBERINE TRONG THÂN CÂY VÀNG ĐẮNG COSCINIUM FENESTRATUM TỈNH QUẢNG NAM SỬ DỤNG HỆ HAI PHA NƯỚC AQUEOUS TW

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

-

HUỲNH THỊ HÀ DUY

NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH, TINH CHẾ BERBERINE TRONG THÂN CÂY VÀNG ĐẮNG COSCINIUM

FENESTRATUM TỈNH QUẢNG NAM SỬ DỤNG

HỆ HAI PHA NƯỚC (AQUEOUS TWO – PHASE SYSTEMS)

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

Đà Nẵng, Năm 2020

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

-

HUỲNH THỊ HÀ DUY

NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH, TINH CHẾ BERBERINE TRONG THÂN CÂY VÀNG ĐẮNG COSCINIUM

FENESTRATUM TỈNH QUẢNG NAM SỬ DỤNG

HỆ HAI PHA NƯỚC (AQUEOUS TWO – PHASE SYSTEMS)

Chuyên ngành: Hóa lý thuyết và hóa lý

Mã số: 844 01 19

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS Bùi Xuân Vững

Đà Nẵng, Năm 2020

MỞ ĐẦU 1

1 Lý do chọn đề tài 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 2

3.1 Đối tượng nghiên cứu 2

3.2 Phạm vi nghiên cứu 2

4 Phương pháp nghiên cứu 2

4.1 Nghiên cứu lý thuyết 2

4.2 Nghiên cứu thực nghiệm 2

5 Cấu trúc luận văn 3

CHƯƠNG 1 4

TỔNG QUAN 4

1.1 GIỚI THIỆU VỀ CÂY VÀNG ĐẮNG 4

1.1.1 Đặc điểm thực vật 4

1.1.2 Phân bố và sinh thái 6

1.1.3 Bộ phận dùng 6

1.1.4 Thành phần hóa học 7

1.1.5 Ứng dụng của cây vàng đắng 8

1.2 TỔNG QUAN VỀ BERBERINE 9

1.2.1 Công thức hóa học và tính chất 9

1.2.2 Tác dụng dược lý và ứng dụng 11

1.2.3 Nguồn nguyên liệu chiết xuất berberine 11

1.3 CHIẾT TÁCH VÀ TINH CHẾ BERBERINE 13

1.4 HỆ HAI PHA NƯỚC – ATPS (AQUEOUS TWO – PHASE SYSTEMS)14 1.4.1 Lịch sử hình thành hệ hai pha nước 15

1.4.2 Các loại hệ hai pha nước 16

1.4.3 Sự hình thành hai pha, nhiệt động và phân vùng 18

1.4.4 Ứng dụng trong tách, tinh chế hợp chất tự nhiên bằng hệ alcohol/muối 20

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.1 NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 22

2.1.1 Nguyên liệu 22

2.1.2 Hóa chất 22

2.1.3 Thiết bị và dụng cụ 23

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU THỰC NGHIỆM 23

2.2.1 Phương pháp xác định một số chỉ tiêu hóa lý 23

2.2.2 Phương pháp chiết berberine từ dược liệu vàng đắng 24

2.2.3 Phương pháp tinh chế berberine 24

2.3 TIẾN HÀNH THỰC NGHIỆM 26

2.3.1 Xác định một số chỉ tiêu hóa lý của thân cây vàng đắng 26

2.3.2 Khảo sát quá trình chiết berberine từ dược liệu vàng đắng 27

2.3.3 Tinh chế berberine bằng hệ ATPS 29

CHƯƠNG 3 32

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32

3.1 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ CHỈ TIÊU HÓA LÝ CỦA THÂN CÂY VÀNG ĐẮNG 32

3.1.1 Xác định độ ẩm 32

3.1.2 Xác định hàm lượng tro toàn phần 32

3.2 KẾT QUẢ KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH CHIẾT BERBERINE TỪ THÂN CÂY VÀNG ĐẮNG 33

3.2.1 Kết quả xây dựng đường chuẩn berberine clorid bằng phương pháp UV - Vis 33

3.2.2 Kết quả khảo sát dung môi chiết berberine 34

3.2.3 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ rắn/lỏng đến quá trình chiết berberine 35

3.2.4 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian đun đến quá trình chiết berberine 36

berberine 38

3.2.7 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH đến quá trình chiết berberine 39

3.2.8 Kết quả định tính berberine trong dịch chiết 40

3.3 KẾT QUẢ TINH CHẾ BERBERINE BẰNG HỆ HAI PHA NƯỚC 41

3.3.1 Kết quả xây dựng giản đồ pha hệ hai pha nước 41

3.3.2 Kết quả xác định hệ số phân bố 43

3.3.3 Kết quả xây dựng đường chuẩn berberine bằng phương pháp HPLC 45

3.3.4 Kết quả xác định hàm lượng berberine trong cao thô bằng phương pháp HPLC 46

3.3.5 Kết quả tinh chế berberine 47

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49

TÀI LIỆU THAM KHẢO 51 QUYẾT ĐỊNH GIAO ĐỀ TÀI LUẬN VĂN (bản sao)

ATPS : Hệ hai pha nước (Aqueous two – phase systems) HPLC : Sắc ký lỏng hiệu năng cao

IL/Ils : Chất lỏng ion (ionic liquid/ionic liquids)

PEG : Polyethylen glycol

TLTK : Tài liệu tham khảo

UV – Vis : Phổ tử ngoại khả kiến

Bảng 1.1 Các loại hệ ATPS điển hình 17

Bảng 2.1 Hóa chất sử dụng 22

Bảng 2.2 Thiết bị và dụng cụ 23

Bảng 3.1 Kết quả xác định độ ẩm của bột thân cây vàng đắng 32

Bảng 3.2 Kết quả xác định hàm lượng tro toàn phần của bột thân cây vàng đắng 32

Bảng 3.3 Số liệu xây dựng đường chuẩn berberine clorid bằng phương pháp UV – Vis 34

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của dung môi đến mật độ quang của các dịch chiết 34

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của tỉ lệ rắn/lỏng đến mật độ quang của các dịch chiết 35

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của thời gian đun đến mật độ quang của các dịch chiết 36

Bảng 3.7 Ảnh hưởng của nhiệt độ đun đến mật độ quang của các dịch chiết 37

Bảng 3.8 Ảnh hưởng của thời gian ngâm đến mật độ quang của các dịch chiết 38

Bảng 3.9 Ảnh hưởng của pH đến mật độ quang của các dịch chiết 39

Bảng 3.10 %w/w của các cấu tử trong hệ ATPS 42

Bảng 3.11 Hệ số phân bố berberine của 7 hệ ATPS 43

Bảng 3.12 Số liệu xây dựng đường chuẩn berberine bằng phương pháp HPLC 45

Bảng 3.13 Kết quả xác định hàm lượng berberine trong cao thô sau chiết 46

Bảng 3.14 Kết quả xác định hàm lượng berberine sau tinh chế 47

Hình 1.1 Thân, lá, hoa và quả của cây vàng đắng 5

Hình 1.2 Lát cắt của thân cây vàng đắng 7

Hình 1.3 Sơ đồ quy trình chiết xuất berberine bằng dung dịch H2SO4 0,4% [11] 13

Hình 1.4 Giản đồ pha hệ hai pha nước 19

Hình 2.1 Vàng đắng sau khi xử lý sơ bộ 22

Hình 2.2 Máy quang phổ hấp thụ phân tử UV – Vis 24

Hình 2.3 Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC 25

Hình 3.1 Mẫu bột thân vàng đắng sau khi nung đến khối lượng không đổi 33

Hình 3.2 Bước sóng hấp thụ cực đại của berberine clorid 33

Hình 3.3 Đường chuẩn berberine clorid bằng phương pháp UV – Vis 34

Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của dung môi chiết đến mật độ quang 35

Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của tỉ lệ rắn/lỏng đến mật độ quang 36

Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của thời gian đun đến mật độ quang 37

Hình 3.7 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ đến mật độ quang 38

Hình 3.8 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của thời gian ngâm đến mật độ quang 39

Hình 3.9 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của pH đến mật độ quang 40

Hình 3.10 Vàng đắng ban đầu và bã nguyên liệu sau khi chiết berberine40 Hình 3.11 Định tính berberine trong dịch chiết 41

Hình 3.12 Lọc dung dịch thu được kết tủa màu vàng nâu 41

Hình 3.13 Giản đồ pha của 7 hệ ATPS 42

Hình 3.14 Hệ số phân bố berberine của các hệ ATPS 44

Hình 3.16 Đường chuẩn berberine bằng phương pháp HPLC 45 Hình 3.17 Sắc ký đồ tiêu biểu của dung dịch chuẩn berberine 46 Hình 3.18 Sắc ký đồ HPLC của mẫu cao thô 46 Hình 3.19 Tinh chế berberine bằng hệ isopropanol 12%/K2HPO4 30% 47 Hình 3.20 Sắc ký đồ HPLC của mẫu cao chứa berberine sau tinh chế 47 Hình 3.21 Cao thô và cao sau tinh chế 48

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Những năm gần đây, việc sử dụng các thuốc có nguồn gốc tổng hợp hóa dược gặp nhiều bất cập và tác dụng phụ khôn lường, ảnh hưởng lâu dài đến sức khỏe người bệnh Vì vậy, xu hướng sử dụng thuốc có nguồn gốc từ thảo dược thiên nhiên ngày càng tăng, không chỉ ở các nước Á Đông mà còn ở các nước phương Tây

Một trong số những dược liệu có nguồn gốc thiên thiên là cây vàng đắng Vàng đắng là một cây thuốc quý, mọc hoang chủ yếu ở các nước vùng nhiệt đới Ở nước ta, cây mọc phổ biến ở miền Đông Nam Bộ, Nam Trung Bộ và Tây Nguyên Ngoài ra còn thấy mọc nhiều ở trung, hạ Lào và Campuchia Trong dân gian, vàng đắng thường được dùng để chữa lị, đau mắt, viêm ruột Những nghiên cứu gần đây

đã chỉ ra rằng berberine – thành phần chính của cây vàng đắng còn có tác dụng chống ung thư, làm giảm lượng cholesterol, kháng nấm, kháng virus Đặc biệt hơn

cả, berberine có tác dụng làm giảm đường huyết và giảm kháng insulin đối với bệnh tiểu đường tuýp II Trong thân cây vàng đắng, hàm lượng berberine rất cao (1,5% – 3%) Đây là nguồn nguyên liệu rất quý để chiết xuất berberine ở nước ta

Đã có nhiều tài liệu nghiên cứu về phương pháp chiết xuất và tinh chế berberine từ cây vàng đắng Nhưng các quy trình tinh chế truyền thống vẫn còn một

số nhược điểm như: kéo dài thời gian, tốn nhiều dung môi, hoá chất… Một giải pháp khác cho các vấn đề trên là tinh chế berberine bằng hệ hai pha nước (aqueous two – phase systems) Trong những năm gần đây, hệ hai pha nước (ATPS) đã trở thành một công cụ hữu ích được sử dụng trong công nghệ chiết tách và tinh chế Phương pháp này có thể cho hiệu suất và độ tinh khiết cao trong một bước duy nhất

Do đó, ATPS cung cấp một giải pháp thay thế hấp dẫn, đáp ứng nhu cầu trong các quy trình công nghiệp và nó cũng có lợi về mặt kinh tế, thân thiện với môi trường Việc sử dụng phương pháp chiết hệ hai pha nước để tinh chế berberine nói riêng và alkaloid nói chung còn khá mới mẻ ở nước ta

Với mong muốn đóng góp một phương pháp mới chiết xuất và tinh chế berberine trong thân cây vàng đắng có nhiều ưu việt hơn so với các phương pháp

truyền thống, tôi đã chọn đề tài: “Nghiên cứu chiết tách, tinh chế berberine trong

thân cây vàng đắng coscinium fenestratum tỉnh Quảng Nam sử dụng hệ hai pha nước (aqueous two – phase systems)”

2 Mục tiêu nghiên cứu

- Xác định một số chỉ tiêu hóa lý của dược liệu

- Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết berberine từ thân cây vàng đắng

- Xây dựng giản đồ pha hệ hai pha nước, xác định hệ số phân bố

- Tinh chế berberine sử dụng hệ hai pha nước

- Xác định hàm lượng berberine trước và sau tinh chế

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

3.1 Đối tượng nghiên cứu

Thân cây vàng đắng được lựa chọn ngẫu nhiên trên địa bàn tỉnh Quảng Nam

3.2 Phạm vi nghiên cứu

Trong giới hạn của đề tài luận văn, tôi tập trung nghiên cứu thực nghiệm những nội dung sau:

- Nghiên cứu một số chỉ tiêu hóa lý của thân cây vàng đắng

- Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết berberine trong thân cây vàng đắng

- Xây dựng giản đồ pha và xác định hệ số phân bố của hệ hai pha nước

- Tinh chế berberine sử dụng hệ hai pha nước

- Xác định hàm lượng berberine trước và sau tinh chế

4 Phương pháp nghiên cứu

4.1 Nghiên cứu lý thuyết

- Tham khảo các thông tin, tài liệu, các bài báo, giáo trình liên quan đến đề tài

- Trao đổi với giáo viên hướng dẫn

- Trao đổi kinh nghiệm với các chuyên gia, thầy cô giáo và đồng nghiệp

4.2 Nghiên cứu thực nghiệm

- Xác định một số chỉ tiêu hóa lý của thân cây vàng đắng

- Chiết tách, tinh chế berberine sử dụng hệ hai pha nước (aqueous two – phase systems)

- Sử dụng phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử UV - Vis để khảo sát điều kiện chiết và xác định hệ số phân bố của các hệ hai pha nước

- Xác định hàm lượng berberine trước và sau tinh chế bằng phương pháp HPLC

- Phương pháp thống kê xử lý số liệu

5 Cấu trúc luận văn

Ngoài phần mở đầu, kết luận và kiến nghị, nội dung luận văn gồm 3 chương như sau:

Chương 1: Tổng quan

Chương 2: Phương pháp nghiên cứu

Chương 3: Kết quả và thảo luận

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 GIỚI THIỆU VỀ CÂY VÀNG ĐẮNG

Vàng đắng thuộc chi Coscinium, là một chi nhỏ trong họ Tiết dê

(Menispermaceae) phân bố chủ yếu ở vùng núi miền Đông Nam Bộ, Nam Trung

Bộ, Tây Nguyên, ngoài ra còn mọc hoang nhiều ở Trung và Hạ Lào, Campuchia Theo Phạm Hoàng Hộ trong “Cây cỏ Việt Nam” đã mô tả 3 loài thuộc chi

Coscinium là: C fenestratum Colebr., C blumeamum Miers., C colaniae Gagn

phân bố ở vùng núi miền Đông Nam bộ, Tây Nguyên [6]

Vàng đắng có tên khoa học là: Coscinium fenestratum

Tên khác: cây mỏ vàng, vàng đằng, vàng giang, hoàng đằng lá trắng, cây kơ trơng và loong tơ rơn (tiếng Bana) [3]

1.1.1 Đặc điểm thực vật

Cây vàng đắng là một loại dây leo thân gỗ, có phân nhánh, leo lên những thân gỗ to, thân và cành hình trụ, có thể dài tới 10 m hoặc hơn, đường kính 1,5 – 10

cm Mặt ngoài màu vàng xám, có những nếp nhăn mờ hay nhẵn, thân già màu ngà,

xù xì, có đoạn có chỗ u phình to tròn và mắt (vết tích của lá rụng) Cành nhỏ mới đầu có lông lá hình đĩa Mặt cắt của thân và cành có màu vàng tươi; mặt cắt của rễ

có màu vàng sẫm, nhìn rõ những dây mạch gỗ tỏa tròn như hình nan hoa bánh xe, chất nước chảy ra từ mặt cắt cũng có màu vàng

Lá đơn nguyên, mọc so le, phiến lá mỏng dài, hình trứng rộng hoặc hình trứng dài 11 – 13 cm, rộng 8 – 23 cm, gốc phiến lá tròn, thẳng hay hình tim nông, ngọn lá thuôn nhọn, mặt trên lá không có lông, khi khô thường nhẵn, gân giữa và các gân chính lõm xuống; mặt dưới lá có lông hơi trắng, nhìn rõ 5 – 7 gân xòe ra như hình chân vịt và 1 – 2 đôi gân ở mép ngoài cùng, cũng như hệ gân hình mạng lưới nhỏ Cuống lá mảnh, dài 3 – 16 cm, mới đầu có lông hơi nâu, thường phồng ra

ở 2 đầu, đầu trên đỉnh cách mép phiến lá từ 0,2 – 0,8 cm, đầu dưới cong gập lại như gối

Cụm hoa màu trắng phớt tím, hoa đính trên các đầu hình cầu; đường kính 6 –

7 mm, có cuống nhỏ dài đến 10 – 30 mm, được sắp xếp trên một chùm dài 5 – 11

cm ở trên nách lá hay ở đoạn thân già không mang lá; các cụm hoa này đứng đơn độc hay tụ họp vài cái một, trục chính và nhánh của cụm hoa mảnh, có lông tơ màu nâu, các lá bắc dạng dùi, dài 4 – 5 mm Hoa đực gần như không cuống, bao hoa có 6 – 9 bộ phận phía trong dài 1,5 – 2 cm, các bộ phận ngoài cùng nhỏ hơn dài 1 – 1,5

mm đính thấp hơn Bộ nhị có 6 nhị xếp thành 2 vòng; vòng ngoài gồm 3 nhị rời, dài

1 mm, 3 nhị ở vòng trong dính liền nhau ở phía dưới Hoa cái có bao giống như hoa đực, 6 nhị lép hình chùy dài 1 mm, bộ nhụy gồm 3 lá noãn dài 2 mm, có lông dày, vòi hình sợi, uốn cong

Hình 1.1 Thân, lá, hoa và quả của cây vàng đắng

Quả mọc thành chùm dài 10 – 15 cm, gồm 20 – 30 quả hạch hình cầu, đường kính 2,5 – 3 cm, mặt ngoài có lông màu nâu đến vàng cam, thịt quả màu vàng, vị đắng; vỏ quả trong tạo thành hạch cứng, dày tới 3 mm (xem Hình 1.1); mùa ra hoa, quả từ tháng 1 đến tháng 5 [3]

Phạm Hoàng Hộ mô tả cây vàng đắng với những loài khác nhau [6]:

- Coscinium fenestratum Colebr (dây vàng đắng): dây leo to, thân rộng từ 5 – 7 cm,

gỗ vàng; nhánh, mặt dưới lá, hoa và trái có lông the quắn, trắng, phiến lá to đến

25 cm, có 5 gân xuất phát từ đáy, trắng mốc mặt dưới, cuống phù và cong ở đáy Chùm hoa tán trên thân già; hoa đực có 6 tiểu nhị, hoa cái có tiểu nhụy lép, 3 tâm

bì có lông cho ra trái tròn, to 2,5 cm

- C blumeanum Miers (vàng đắng Blume): dây leo, thân to; lá có phiến xoan, hai

xoan tròn dài, to 12 – 35 cm, rộng 6 – 20 cm, không lông Lúc nhỏ mặt bọt, mặt dưới mốc trắng, có lông dày, gân ở đáy, gân phụ 2 – 5 cặp, cuống dài 6 – 20 cm, gắn cách bìa lá 1,5 – 2 cm Hoa đầu to 10 – 13 cm; hoa đực có 3 – 6 lá đài, 6 tiểu nhị Hoa cái có 6 lá đài, 3 tâm bì Quả nhẵn cứng xoan, có lông, to 2,5 cm

1.1.2 Phân bố và sinh thái

Chi Coscinium là một chi nhỏ trong họ Tiết dê (Menispermaceae) gồm có 2

loại, phân bố chủ yếu ở các nước vùng nhiệt đới Ở Việt Nam cây mọc phổ biến ở vùng Đông Nam Bộ, Nam Trung Bộ, Tây Nguyên, Đồng Nai, Quảng Nam, Quảng Bình, Đà Nẵng, Bình Định, Gia Lai, Đắk Lắk, Khánh Hòa, Bình Thuận… Ngoài ra còn thấy ở Lào, Campuchia, Ấn Độ, Malaysia, Srilanca Vàng đắng thu hái hầu như quanh năm, thu hoạch về thái mỏng, phơi hay sấy khô hoặc không chế biến gì khác [3]

Hình 1.2 Lát cắt của thân cây vàng đắng

1.1.4 Thành phần hóa học

Trong thân và rễ cây vàng đắng ngoài berberine 1,5 – 3%, còn có ít palmatine, jatrorrhizin [3]

Palmatine Jatrorrhizin

Berberine Tetrahydroberberine

Bên cạnh đó còn có oxyberberine, tetrahydroberberine, sitosterol và stigmasterol [10]

Theo Đỗ Tất Lợi trong vàng đắng có nhiều alkaloid dẫn xuất của isoquinolein, chủ yếu là berberine chiếm từ 1,5 – 2%, có khi đến 3% [12]

Võ Văn Chi cho rằng thành phần hóa học chủ yếu trong cây vàng đắng là berberine, saponine; thân có chứa berberine có tỷ lệ tới 3,5% Ngoài ra còn có ceryl alcohol, hentriacontane, sitosterol, acid palmitic và acid oleic, glycosid sitosterol, saponine và vài chất nhựa Ở Việt Nam trong thân và rễ cây vàng đắng có alkaloid berberine với tỉ lệ 1,5 – 3% [2]

Nguyễn Liêm đã xác định thành phần hóa học của cây vàng đắng là berberine chiếm ít nhất là 82% so với alkaloid toàn phần, phần còn lại là palmatine, jatrorrhizin… Ngoài ra trong luận án này, ông đã khảo sát kỹ cây vàng đắng về hàm lượng alkaloid protoberberine trong các bộ phận khác nhau của cây Kết quả là ở thân cây già có 2 – 3%, cành nhỏ 1 – 1,5%, lá và quả 0,1 – 0,7%, vỏ thân trên 5%,

và phần thân gỗ 0,85% [10]

Điều kiện bảo quản có ảnh hưởng lớn đến chất lượng nguyên liệu, độ ẩm cao làm giảm nhanh hàm lượng alkaloid và có thể mất hết hoặc giảm từ 3% xuống còn 0,13% [40]

1.1.5 Ứng dụng của cây vàng đắng

Theo Đỗ Tất Lợi, nhân dân thường dùng thân và rễ cây làm thuốc hạ nhiệt, chữa sốt rét, chữa lị, ỉa chảy, đau mắt Dùng dạng thuốc bột hay thuốc viên, ngày uống 4 – 6 gam Vàng đắng dùng làm nguyên liệu để chiết xuất berberine Berberine clorid dùng để chữa lị, ỉa chảy, đau mắt Ngày uống 0,02 – 0,20 gam dưới dạng thuốc viên Người ta còn dùng để chữa bệnh về gan, vàng da, ăn uống khó tiêu hoặc pha dung dịch 0,5 – 1,0 % dùng để nhỏ trong bệnh đau mắt, hay để rửa mắt [12]

Ở Ấn Độ người ta dùng rễ vàng đắng để chữa lị và dùng ngoài rửa mụn nhọt, vết thương Nước sắc vỏ dùng chữa sốt, nước sắc thân dùng để trị rắn cắn [2]

Theo Phan Quốc Kinh berberine là một alkaloid có tác dụng thông mật, co bóp tử cung, có tác dụng điều trị bệnh Leishmania, Trichomonas, bệnh lỵ, tả, sốt rét

và đau mắt Gần đây đã phát hiện tác dụng chống ung thư của berberine [8]

Ngoài những ứng dụng trên, berberine còn được dùng làm chất tạo màu trong thực phẩm và trong các loại đồ uống có cồn [37]

Công thức hóa học dạng muối:

Công thức phân tử dạng muối C20H18NO4Cl.2H2O có tên khoa học là 5,6 – dihydro – 8,9 – dimethoxy – 1,3 – dioxa – 6a – azoniaindeno (5,6 – a) anthracen clorid dihydrat

Lý tính: Tinh thể hay bột kết tinh màu vàng, không mùi có vị rất đắng Nhiệt

độ nóng chảy khi ở dạng bazơ là 145oC (bị phân hủy) Độ tan dạng bazơ tan chậm trong nước, ít tan trong ethanol, khó tan trong ether Dạng muối clorid tan ở tỷ lệ 1/400 trong nước, dễ tan trong nước sôi, tan trong ethanol, thực tế không tan trong chloroform và ether Dạng muối sulfat dễ tan trong nước ở tỷ lệ 1/30, tan trong ethanol [40]

Berberine Berberinal

Hóa tính mạch kép: Berberine có thể mất mạch kép tại nhân giữa để cho các hydro alkaloid không màu

1.2.2 Tác dụng dược lý và ứng dụng

Berberine có tác dụng kháng khuẩn được dùng chủ yếu trong các bệnh rối loạn đường tiêu hóa [37] Berberine với liều nhỏ có tác dụng kích thích tim, làm giãn mạch vành, với liều lớn ức chế hô hấp làm tê liệt trung khu hô hấp trong khi tim vẫn đập Berberine giúp hạ nhiệt, gây tê, lợi mật, kháng lợi niệu, có tác dụng làm tăng đường huyết lúc đầu và sau đó làm hạ đường huyết Berberine đem khử hóa cho tetrahydroberberin có tác dụng an thần và mềm cơ, hạ huyết áp nhẹ [3] Ngoài ra, berberine còn có tác dụng chống co giật, bảo vệ các tế bào thần kinh trong các trường hợp tổn thương não do tắc mạch máu não gây ra [47]

Berberine được dùng phổ biến dưới dạng viên nén, viên bao hoặc viên nang với hàm lượng là 10 mg, 25 mg, 50 mg, 100 mg/viên Berberine được chỉ định với trực khuẩn, hội chứng lỵ, viêm ruột, tiêu chảy, viêm ống mật Ngoài ra, berberine còn được bào chế thành thuốc nhỏ mắt điều trị viêm kết mạc, đau mắt đỏ do kích thích bên ngoài (gió, nắng, bụi, khói…), berberine còn có tác dụng điều trị bệnh đau mắt hột ở các giai đoạn khác nhau [12] Berberine có thể được dùng ở dạng đơn chất hoặc có thể được dùng phối hợp với các thành phần hoạt chất khác

1.2.3 Nguồn nguyên liệu chiết xuất berberine

Berberine là một alkaloid được phát hiện trong khoảng 150 loài thuộc nhiều

họ thực vật khác nhau: Họ Mao lương (Ranunculaceae), họ Hoàng liên gai (Berberidaceae), họ Tiết dê (Menispermaceae), họ Cam (Rutaceae)… Berberine

thường có trong những cây thuộc chi Berberis, Berberis aristata DC., B buxifolia Lam., B canadonsis Mill., B glauca H.B.K., B licium Roile., B noranensis Schult., B sinosis Desf., B amurensis Rupr Trong từ điển cây thuốc của Võ Văn Chi đã cho biết trong thân và rễ của Hoàng liên gai (Berberis wallichiana D.C) có

chứa berberine [2]

Bên cạnh những cây thuộc chi Berberis cho berberine còn có những cây khác cũng cho berberine như các cây thuộc chi Coptis: Coptis teeta Wall., C.chinensis

Franch., C.teetoides C.Y Cheng., C.deltoidea C.Y Cheng với hàm lượng berberine

không ít hơn 4% [3], [6]

Berberine cũng có trong các cây thuộc chi Mahonia: M annamica Gagnep.,

M nepalensis D.C., M bealei Carr

Ngoài ra, berberine còn được tìm thấy trong vỏ các cây như: Hoàng bá

(Phellondendron amurense Rupr và P chinense Schneider.) với tỉ lệ 1,6%, vàng đắng (Coscinium fenestratum Colebr.) với hàm lượng không ít hơn 1,5% [6]

Chi Coscinium là một chi nhỏ trong họ tiết dê (Menispermaceae) phân bố

chủ yếu ở vùng núi miền Đông Nam Bộ, Nam Trung Bộ, Tây Nguyên, ngoài ra còn thấy mọc hoang nhiều ở Trung và Hạ Lào, Campuchia Phạm Hoàng Hộ đã mô tả 3

loài thuộc chi Coscinium: C fenestratum Colebr., C blumeanum Miers., C

colaniae Gagn phân bố ở vùng Tây Nguyên, Lục tỉnh [6] Hai loài C fenestratum

Coleb., C usitatum Pierre phân bố ở vùng núi miền Đông Nam Bộ, Tây Nguyên

[3]

Theo nghiên cứu của PGS TS Nguyễn Tập và các cộng sự ở Viện Dược liệu, vàng đắng ở nước ta chỉ có ở các tỉnh phía nam từ huyện Phú Lộc (Thừa Thiên Huế) trở vào đến huyện Châu Thành (Đồng Nai) Trong giới hạn này, đã thống kê được 140 xã, thị trấn thuộc 47 huyện của 16 tỉnh có vàng đắng Việt Nam vốn có nguồn vàng đắng tương đối dồi dào, phân bố phong phú như ở tiểu cao nguyên An Khê (tỉnh Gia Lai và Bình Định); Đắk Nông; Đắk Lắk và Trà My, Phước Sơn (Quảng Nam) [1]

Hiện nay, người ta thường dùng vàng đắng để đưa vào sản xuất berberine vì hàm lượng berberine trong thân và rễ cây cao, nguồn nguyên liệu nhiều, dễ thu hái,

có ở nhiều vùng của Việt Nam, biên giới Việt Lào, Campuchia Do đó, người ta coi vàng đắng là nguồn nguyên liệu chính để chiết xuất berberine

1.3 CHIẾT TÁCH VÀ TINH CHẾ BERBERINE

Hiện nay có nhiều phương pháp chiết tách berberine ở quy mô công nghiệp

và phòng thí nghiệm từ nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau

Đã có nhiều tài liệu nghiên cứu về phương pháp chiết xuất và tinh chế berberine từ cây vàng đắng như phương pháp của Phạm Viết Trang, Nguyễn Liêm [11], phương pháp chiết berberine bằng áp lực nóng của Nguyễn Liêm [9]

Berberine được chiết từ thân và rễ cây vàng đắng bằng dung dịch acid sulfuric 0,4% theo quy trình như Hình 1.3 Quy trình được mô tả như sau: Cân 300

g bột thân và rễ vàng đắng, thêm 1 lít dung dịch H2SO4 0,4%, khuấy đều, ngâm

Berberine clorid thô

Berberine clorid thô

trong 24 giờ Cứ 1 giờ khuấy lại 1 lần Rút dịch chiết Tiến hành chiết tương tự để thu được dịch chiết lần 3 Thêm 40 g NaCl vào dịch chiết Khuấy mạnh cho tan hết NaCl rồi để 24 giờ cho berberine kết tủa Gạn lấy phần tủa Lọc và rửa tủa cho hết phản ứng acid, thu được berberine clorid thô Tẩy màu: Berberine thô hòa tan trong

10 phần ethanol 96o Thêm than hoạt (lượng than hoạt bằng 2 – 5% lượng berberine thô) Lắp sinh hàn hồi lưu, đun sôi trong 10 phút Lọc nóng qua phễu Buchner để loại than hoạt Thu dịch lọc Dịch lọc để kết tinh qua đêm ở nhiệt độ phòng Lọc lấy tinh thể trên phễu Buchner Rửa tinh thể 2 lần bằng ethanol 96o Sấy tinh thể trong

tủ sấy ở 60oC trong 8 giờ, kiểm nghiệm theo tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam IV, đóng gói trong hai lần túi polyethylene, bảo quản nơi khô ráo, tránh ánh sáng Với quy trình này, berberine clorid thu được có hàm lượng 80% [4]

Các tác giả Trung Quốc đã nghiên cứu chiết xuất berberine từ Coptis

thấy khi thêm 1, 2 – propandiol vào thì cho hiệu suất chiết cao nhất [27]

Các tác giả Singapore đã nghiên cứu chiết xuất berberine từ Coptis zhiroma

bằng dung môi nước nóng có sử dụng áp lực cao Kết quả cho thấy khi chiết xuất berberine bằng áp lực nước nóng cho hiệu suất chiết cao hơn so với phương pháp chiết bằng ethanol 95% sử dụng bình soxhlet [33]

Ngoài ra, còn có phương pháp chiết xuất berberine từ Hoàng Liên chân gà

(Coptis teeta Wall.) bằng ethanol 96%: dược liệu khô (có chứa chủ yếu alkaloid

berberine) được tán thành bột, chiết kiệt với ethanol 96% trong Soxhlet Cô thu hồi ethanol, phần rắn thu được đem hòa tan trong nước nóng Chất nhựa sẽ tách ra, đem lọc nóng loại nhựa Thêm HCl dư vào dung dịch lọc và để yên cho berberine clorid kết tinh Lọc, thu lấy tinh thể berberine clorid, sau đó tinh chế bằng cách hòa tan trong ethanol và kết tinh lại [5]

1.4 HỆ HAI PHA NƯỚC – ATPS (AQUEOUS TWO – PHASE SYSTEMS)

Trong những năm gần đây, hệ hai pha nước (ATPS) đã trở thành một công

cụ được sử dụng trong công nghệ chiết tách và tinh chế ATPS có tính chọn lọc cao

và dễ dàng mở rộng quy mô ATPS cung cấp một giải pháp thay thế đáp ứng yêu cầu cao trong các quy trình công nghiệp và nó cũng là phương pháp ít tốn kém, thân

thiện với môi trường Đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về ATPS sử dụng các loại ATPS khác nhau và các ứng dụng của chúng trong chiết tách sản phẩm

Hệ hai pha nước là một kỹ thuật phân đoạn lỏng – lỏng và được quan tâm vì

có tiềm năng lớn để chiết, tách, tinh chế và làm giàu các protein, màng, virus, enzyme, acid nucleic và các phân tử sinh học khác trong công nghiệp và nghiên cứu Nghiên cứu hiện tại cho thấy nó cũng đã được sử dụng thành công trong việc phát hiện dư lượng thuốc thú y trong thực phẩm, tách kim loại quý, xử lý nước thải

và một loạt các mục đích khác ATPS có thể cho hiệu suất thu hồi và độ tinh khiết cao trong một bước duy nhất

1.4.1 Lịch sử hình thành hệ hai pha nước

Hệ hai pha nước là một phương pháp phân đoạn lỏng – lỏng Phương pháp này dựa trên sự không tương thích của hai dung dịch nước như hệ polymer/muối (ví dụ: polyethylen glycol (PEG)/kali photphat), hệ polymer/polymer (ví dụ: PEG/dextran), chất lỏng ion (ionic liquid (IL))/muối, alcohol (có trọng lượng phân

tử thấp)/muối Hơn nữa, ATPS micelle và micelle đảo cũng có thể được tạo thành bằng dung dịch chất hoạt động bề mặt ion hoặc không ion [22], [36]

Năm 1896, Martinus Willem Beijerinck đã vô tình tìm thấy ATPS trong khi trộn dung dịch tinh bột và gelatin Tuy nhiên, ứng dụng thực sự của ATPS đã được phát hiện bởi Albertsson Kể từ đó, ATPS đã được sử dụng cho nhiều mục đích khác nhau Các hệ hai pha nước này có thể được hình thành bằng cách trộn nhiều loại cấu tử trong nước Nhưng hệ polymer/polymer và polymer/muối đã phát triển nhanh chóng và được nghiên cứu nhiều Phương pháp này có những ưu điểm vượt trội so với các kỹ thuật chiết xuất thông thường như: thân thiện với môi trường, chi phí thấp, có khả năng hoạt động liên tục, dễ dàng mở rộng và hiệu quả đối với nhiều loại nghiên cứu đặc biệt cho làm giàu và tinh chế các phân tử sinh học [16], [29], [35]

Nước là thành phần chính của cả hai pha trong ATPS tạo ra môi trường nhẹ nhàng để các phân tử sinh học tách ra, các polymer ổn định cấu trúc và các hoạt động sinh học của chúng trong khi các phương pháp chiết lỏng – lỏng khác có thể

phá hủy các sản phẩm sinh học do điều kiện quá trình và các dung môi hữu cơ [16], [39]

ATPS có thể được sử dụng như quy trình một bước để loại bỏ các thành phần gây nhiễm và đồng thời tách ra sản phẩm mục tiêu mong muốn Việc phân tách dựa trên vùng chọn lọc của sản phẩm mục tiêu giữa hai pha Sự phân tách phụ thuộc vào các thông số có liên quan đến tính chất của hệ Các ATPS đã được áp dụng thành công trong việc thu hồi các sản phẩm dược phẩm sinh học bằng cách điều chỉnh các tương tác vật lý và hóa học phức tạp liên quan đến quá trình phân vùng

1.4.2 Các loại hệ hai pha nước

Các hệ hai pha phổ biến nhất được hình thành bởi hai polymer (thường là PEG và dextran) hoặc một loại polymer và một loại muối (ví dụ như muối phosphate, muối sulfate hoặc muối citrate) Các loại khác bao gồm chất lỏng ion/alcohol chuỗi ngắn [16], [29], các chất hoạt động bề mặt ion/không ion được sử dụng để hình thành các ATPS micelle và micelle đảo [20], [22] Các hệ polymer/polymer hoặc polymer/muối đã được các nhà khoa học nghiên cứu trong hơn năm thập kỷ Các hệ polymer/polymer thường được sử dụng để phân tách, thu hồi và tinh chế các chất ít hòa tan với môi trường ion vì các hệ này tạo ra lực ion thấp Ngược lại, môi trường có lực ion cao sẽ gây bất lợi đối với hệ tinh chế bằng polymer/muối [34] Các hệ ATPS alcohol/muối ít tốn kém hơn so với hệ polymer

và copolymer Ngoài ra, các hệ này có độ nhớt thấp, dễ dàng thu hồi và giảm thời gian tách pha; nhưng có một nhược điểm lớn của việc sử dụng hệ ATPS này là nhiều protein không tương thích với pha giàu alcohol [15], [18] Hệ hai pha micelle dạng nước được Bordier giới thiệu lần đầu tiên để tách các protein màng nguyên phân [19] Nhiều hệ micelle hỗn hợp đang trở nên phổ biến vì có tính chọn lọc cao [23] Gần đây nhất, hệ ATPS dựa trên chất lỏng ion đang được phát triển mạnh mẽ [14] Các hệ đa pha (ba hoặc bốn pha polymer) cũng đã được nghiên cứu để tách các phân tử sinh học [39] Hệ ATPS sử dụng một polymer cũng đã được báo cáo, các nhà nghiên cứu chỉ sử dụng một polymer để hình thành ATPS trong nước [24] Một số ứng dụng của hệ APTS trong chiết tách và tinh chế được thể hiện ở Bảng 1.1

Bảng 1.1 Các loại hệ ATPS điển hình Loại hệ

[26]

PEG/dextran

Nanospheres, dây nano và các dây nano dẫn xuất DNA

Liên kết thành công các nanospheres Au với các dây nano Au

[30]

Polymer/

muối

PEG/K2HPO4 B-phycoerythin

Hiệu suất thu hồi: 90%

Hệ số tinh chế: 4

[25]

PEG 4000/ sulfate + NaCl 8,8% α-Amylase Độ tinh sạch: 53 lần

Bacteriophages nằm ở pha nghèo micelle [20] Isooctane/

ethylhexanol/

methyltrioctyl ammonium chloride

DNA plasmid Tinh chế thành công

DNA và loại bỏ RNA [32]

ATPS

dựa trên

methylimidazo-lium

1-Butyl-3-Codeine và papaverine

Hiệu suất thu hồi:

> 90% (codeine), [41]

ILs chloride/muối > 99% (papaverine)

Imidazolium/

K2HPO4

Curcuminoids Hiệu suất chiết: 96%

Độ tinh khiết: > 51% [46]

1.4.3 Sự hình thành hai pha, nhiệt động và phân vùng

Các dung dịch có chứa polymer thường ít trộn lẫn vào nhau, tính chất này của các polymer dẫn đến sự hình thành của hai pha Trong hệ ATPS polymer/muối, muối hấp thụ một lượng lớn nước và có thể tách pha Sự tách pha trong ATPS bị ảnh hưởng bởi các yếu tố như: nồng độ và trọng lượng phân tử (molecular weight) của polymer, nồng độ và thành phần của muối Sự có mặt của muối cũng ảnh hưởng đến tính chất của pha, chủ yếu là do loại muối và nồng độ Sự phân vùng giữa hai pha phụ thuộc vào tính chất bề mặt của cấu tử và thành phần của hệ ATPS [31], [39]

Giản đồ pha (xem Hình 1.4) giống như dấu vân tay của hệ trong các điều kiện cụ thể là duy nhất và cho thấy vùng làm việc tiềm năng của hệ ATPS Giản đồ pha cung cấp các thông tin như nồng độ của các cấu tử cho sự hình thành hai pha và nồng độ của chúng trong pha trên và pha dưới Giản đồ cho thấy đường cong TCB phân chia vùng nồng độ của các cấu tử Đường cong này chia các nồng độ tạo thành hai phần riêng biệt: phần phía trên đường cong (tồn tại hai pha) và phần phía dưới đường cong (tồn tại một pha) Đường thẳng (TB) trong giản đồ gọi là đường nối, nối hai điểm T và B nằm trên đường cong TCB Tất cả các hệ tiềm năng (như S1, S2, S3) có cùng thành phần ở pha trên và pha dưới khi cân bằng do nằm trên cùng một đường nối Điểm C trên đường TCB được gọi là điểm tới hạn; ngay trên điểm này, thể tích của cả hai pha là bằng nhau về mặt lý thuyết Tại điểm C, độ dài đường nối (tie line length) có giá trị bằng 0

Hình 1.4 Giản đồ pha hệ hai pha nước

Đường cong giản đồ pha có thể được xác định bằng ba phương pháp: phương pháp chuẩn độ độ đục, phương pháp điểm đám mây và phương pháp xác định giao điểm (điểm nút) [38], [42] Trong nghiên cứu này, giản đồ pha được xây dựng bằng phương pháp chuẩn độ độ đục: Dung dịch rượu được nhỏ từng giọt vào dung dịch muối có khối lượng đã biết đến khi hỗn hợp bị đục Sau đó, thêm nước cất vào hỗn hợp để trong trở lại Khối lượng rượu và nước cất đã dùng được ghi lại Quy trình trên được lặp lại nhiều lần để thu được đủ dữ liệu xây dựng giản đồ pha [38]

Cho đến nay, các mô hình khác nhau đã được các nhà nghiên cứu đưa ra nhằm hiểu rõ sự phân vùng trong ATPS Không có lý thuyết nào toàn diện nhất về

sự pha trộn của hai pha lỏng – lỏng Mô hình của Albertsson đã được sử dụng phổ biến để mô tả về ATPS Ông đề nghị sáu loại phân vùng khác nhau, mỗi loại có cơ chế khác nhau [34] Theo mô hình của ông, tính chất phân vùng được xác định bởi các yếu tố này, có thể riêng biệt hoặc kết hợp các yếu tố

- Điện hóa: điện thế điều khiển sự phân vùng

- Tính kị nước: tính ưa nước của các phân tử và các pha xác định sự phân tách

- Ái lực sinh học riêng: loại phân vùng này xảy ra khi các phân tử liên kết tại một vị trí nhất định trên polymer

- Kích thước: kích thước phân tử hoặc diện tích bề mặt của các phân tử là yếu tố chi phối sự phân vùng

- Sự phụ thuộc về hình dạng: sự phân vùng phụ thuộc vào cấu tạo của phân tử

1.4.4 Ứng dụng trong tách, tinh chế hợp chất tự nhiên bằng hệ alcohol/muối

Có một số nhược điểm khi sử dụng ATPS IL/muối, đó là chi phí cao, độ nhớt cao, tách pha chậm Trong những năm gần đây, ATPS alcohol/muối có nhiều ưu điểm như chi phí thấp, độ nhớt thấp, thân thiện với môi trường, dễ dàng thu hồi rượu bằng cách bay hơi và dễ dàng mở rộng quy mô sản xuất công nghiệp ATPS alcohol/muối được hình thành bằng cách trộn hai pha không hòa lẫn vào nhau là các dung dịch rượu và muối Hệ alcohol/muối đã được áp dụng để chiết xuất và tinh chế rất nhiều hợp chất trong quy trình một bước

ATPS alcohol/muối đã được sử dụng để tinh chế sự tái tổ hợp nội bào của con người interferon – α2b (IFN – α2b) từ E coli Nghiên cứu tinh chế IFN – α2b bằng 9 hệ hai pha với sự kết hợp của pha trên là rượu (ethanol, 1 – propanol và 2 – propanol) và pha dưới là muối ((NH4)2SO4, K2HPO4 và NaC6H7O7) đã được nghiên cứu bởi Lin và các cộng sự Điều kiện tối ưu để tinh chế IFN – α2b bằng ATPS là

sử dụng hệ 2 – propanol 18% w/w và (NH4)2SO4 22% trong NaCl 1% w/w Hệ số tinh chế của IFN – α2b thu được là 16,2 với hiệu suất 74,6% [45]

Một hệ alcohol/muối khác cũng đã được áp dụng để tinh chế protease từ vỏ

xoài (Mangifera Indica Cv Chokanan) của Amid, Shuhaimi, Islam Sarker và Abdul

Manap Trong thí nghiệm này, các loại rượu và nồng độ rượu khác nhau (1– propanol, 2 – propanol và ethanol) và các loại muối khác nhau (Na3C6H5O7, K3PO4

và (NH4)2SO4) đã được sử dụng để nghiên cứu quá trình tinh chế và tách chọn lọc protease ở pH và nồng độ NaCl khác nhau Việc tinh chế protease đạt được hệ số phân bố là 64,5 và độ chọn lọc 343,2 bằng cách sử dụng hệ ATPS 2 – propanol 16% w/w, K3PO4 19% w/w và NaCl 5% w/w ở pH = 7,5 với 96,7% protease được thu hồi và hệ số tinh chế là 11,6 [28]

Một phương pháp chiết tách và tinh chế bằng hệ ATPS cải tiến là chiết hai pha nước kết hợp lò vi sóng (microwave – assisted aqueous two – phase extraction)

đang được nghiên cứu rộng rãi Đây là một kỹ thuật mới dùng trong chiết các

alkaloid từ cây dược liệu khổ sâm (Sophora flavescens Ait) Trong nghiên cứu này,

các tác giả đã chọn hệ ATPS ethanol/(NH4)2SO4 vì cho độ nhớt thấp, dễ tách pha, tái chế được dung môi và thân thiện với môi trường so với các thành phần tạo pha khác Các điều kiện tối ưu cho chiết tách và tinh chế alkaloid từ cây khổ sâm là: ethanol 28% w/w/(NH4)2SO4 18% w/w, tỷ lệ dung môi/vật liệu là 60/1, nhiệt độ chiết 90C, thời gian chiết 5 phút và công suất lò vi sóng 780 W Phương pháp chiết hai pha nước hỗ trợ lò vi sóng cho thấy các tạp chất ít hơn với năng suất tốt hơn 63,78 ± 0,45 mg/g và hiệu suất thu hồi cao hơn (92,09 ± 0,14%) [44]

Cho đến hiện tại, vẫn chưa có một công trình nào nghiên cứu tinh chế berberine bằng hệ hai pha nước alcohol/muối Đây là một hướng nghiên cứu mới góp phần hạn chế những nhược điểm của phương pháp tinh chế berberine truyền thống

1.4.5 Xu hướng trong tương lai

ATPS là một kỹ thuật phân tách đơn giản, chọn lọc và có chi phí thấp Khả năng ứng dụng dễ dàng của kỹ thuật này làm cho ATPS được các ngành công nghiệp dùng để thu hồi sản phẩm Tuy nhiên, ATPS không được sử dụng rộng rãi ở quy mô thương mại Nguyên nhân chính là do cơ chế phân vùng của ATPS vẫn chưa được giải thích rõ ràng Sự nghiên cứu về các cơ chế phân vùng của ATPS sẽ dẫn đến một cuộc cách mạng trong khoa học chiết tách Việc phát triển các loại hệ ATPS mới sẽ giúp cho ATPS được ứng dụng rộng rãi hơn Việc tích hợp ATPS với các công cụ phân tích khác cũng sẽ là một bước đột phá để thu hồi các sản phẩm có giá trị cao

CHƯƠNG 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ

2.1.1 Nguyên liệu

Thân cây vàng đắng được lựa chọn ngẫu nhiên trên địa bàn tỉnh Quảng Nam Thân cây vàng đắng được làm sạch, cắt lát, phơi khô, nghiền nhỏ sau đó đem rây ở kích thước lỗ rây 0,5 mm và bảo quản trong bình kín

Hình 2.1 Vàng đắng sau khi xử lý sơ bộ

2.1.2 Hóa chất

Hóa chất sử dụng cho nghiên cứu được trình bày trong Bảng 2.1

Bảng 2.1 Hóa chất sử dụng STT Tên hóa chất Công thức Xuất xứ Độ tinh khiết

1 Amoni sunfat (NH4)2SO4 Trung Quốc  99%

2 Kali hydrophotphate K2HPO4 Trung Quốc  99%

3 Natri citrat Na3C6H5O7 Trung Quốc  99%

7 Ancol etylic C2H5OH Việt Nam ≥ 99,7%

9 Isopropanol (CH3)2CHOH Trung Quốc ≥ 99,7%

13 Berberine clorid C20H18NO4Cl Việt Nam 87,89%

2.1.3 Thiết bị và dụng cụ

Thiết bị và dụng cụ cho nghiên cứu được trình bày trong Bảng 2.2

Bảng 2.2 Thiết bị và dụng cụ

- Cân phân tích Ohaus (Mỹ), độ chính xác 0,0001 g

- Máy quang phổ Jasco V – 730 (Nhật)

- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Agilent (Mỹ)

- Máy đo pH Branson (Anh)

- Máy cô quay chân không IKA RV 10 digital (Đức)

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU THỰC NGHIỆM

2.2.1 Phương pháp xác định một số chỉ tiêu hóa lý

a Xác định độ ẩm

Để xác định độ ẩm sử dụng phương pháp trọng lượng [1]

Nguyên tắc: Sấy nguyên liệu ở 105oC đến khối lượng không đổi Cân khối lượng mẫu trước và sau khi sấy từ đó tính được độ ẩm của mẫu nguyên liệu

b Xác định hàm lượng tro toàn phần [1]

Nguyên tắc: Bột nguyên liệu được nung ở 550C, cacbon trong mẫu sẽ cháy thành tro làm giảm khối lượng mẫu, cân khối lượng mẫu sau khi nung sẽ tính được

độ tro toàn phần của mẫu nguyên liệu

2.2.2 Phương pháp chiết berberine từ dược liệu vàng đắng

Phương pháp ngâm chiết được sử dụng để chiết berberine từ thân cây vàng đắng Ngâm dầm dược liệu trong dung môi thích hợp, kết hợp với các điều kiện khác (nhiệt độ, thời gian, pH,…) giúp tối ưu hóa quá trình chiết, tăng năng suất chiết Sử dụng ngâm chiết để chiết berberine trong vàng đắng là phương pháp đơn giản, dễ thực hiện và chi phí thấp

Hình 2.2 Máy quang phổ hấp thụ phân tử UV – Vis

Để đánh giá hiệu quả chiết sử dụng phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử

UV – Vis (Hình 2.2) Vì mật độ quang tỉ lệ thuận với nồng độ, nên việc đo UV – Vis ở bước sóng cực đại giúp dự đoán lượng berberine chiết ra

2.2.3 Phương pháp tinh chế berberine

Trong nghiên cứu này, berberine chiết từ cây vàng đắng được tinh chế bằng một kỹ thuật đơn giản, hiệu quả và rẻ tiền Khi hệ ATPS alcohol/muối đạt đến trạng thái cân bằng pha, phần lớn berberine đã di chuyển lên pha trên giàu rượu, trong khi các tạp chất, protein và khoáng chất đã chuyển sang pha dưới giàu muối Rượu có

thể được thu hồi bằng cách cô quay chân không còn muối có thể được kết tinh lại bằng cách hạ nhiệt độ

Mối quan hệ cân bằng giữa pha trên và pha dưới của ATPS xác định sự phân vùng của các cấu tử và hệ số phân bố (K) được xác định bằng phương trình (2.1):

𝐊 = 𝐂𝐭

𝐂𝐛 (𝟐 𝟏) Trong đó Ct và Cb lần lượt là nồng độ của berberine có trong pha trên và pha dưới ở trạng thái cân bằng [42], [43] Ct và Cb được xác định bằng phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử UV – Vis [13] Hệ số phân bố càng lớn thì berberine di chuyển lên pha trên càng nhiều, là cơ sở để lựa chọn hệ tinh chế berberine

Hàm lượng berberine trước và sau tinh chế được xác định bằng phương pháp HPLC Phương pháp này có độ nhạy cao, khả năng định lượng tốt Phạm vi ứng dụng của phương pháp HPLC rất rộng, như phân tích các hợp chất thuốc trừ sâu, thuốc kháng sinh, các chất phụ gia thực phẩm trong lĩnh vực thực phẩm, dược phẩm, môi trường…

Hình 2.3 Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC