xác định tính đa hình exon 14 gen mx và một số giống gà đa phương của việt nam

luận văn thạc sĩ, tiến sĩ, cao học, luận văn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

-
-

ðỒNG THỊ HỒNG LIÊN

XÁC ðỊNH TÍNH ðA HÌNH EXON 14 GEN Mx

Ở MỘT SỐ GIỐNG GÀ ðỊA PHƯƠNG CỦA VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP

Chuyên ngành : Thú y

Mã số : 60.62.50

Người hướng dẫn khoa học : TS BÙI TRẦN ANH ðÀO

TS NGUYỄN THỊ PHƯƠNG THẢO

HÀ NỘI – 2011

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của riêng tôi với sự giúp

ñỡ của các cá nhân và tập thể Các số liệu, kết quả trong luận văn là trung thực và chưa từng ñược ai công bố trong bất kì công trình nào khác

Tôi xin cam ñoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, tháng 11 năm 2011

Tác giả luận văn

ðồng Thị Hồng Liên

LỜI CẢM ƠN

để hoàn thành chương trình cao học và viết luận văn này, tôi ựã nhận ựược sự hướng dẫn, giúp ựỡ và góp ý nhiệt tình của các cấp lãnh ựạo, ựơn vị tập thể và nhiều cá nhân:

Trước hết, tôi xin chân thành cảm ơn ựến Ban Giám hiệu, Viện đào tạo sau ựại học, các thầy cô trường đại học Nông nghiệp Hà Nội và ựặc biệt là các thầy cô khoa Thú Y ựã tạo ựiều kiện và giúp ựỡ tôi suốt khóa học

Tôi xin gửi lời biết ơn sâu sắc ựến TS Bùi Trần Anh đào và TS Nguyễn Thị Phương Thảo ựã dành nhiều thời gian và tâm huyết hướng dẫn nghiên cứu và giúp tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp

Nhân ựây tôi xin cảm ơn các anh chị và các bạn công tác tại phòng thắ nghiệm Công nghệ sinh thuộc khoa Công nghệ sinh học; các cô chú tại những ựịa ựiểm thu thập mẫu ựã tạo ựiều kiện và nhiệt tình giúp tôi hoàn thành tốt ựề tài nghiên cứu của mình

đồng thời, tôi xin cảm ơn Ban Giám ựốc, các cô chú, các anh chị và các bạn ựồng nghiệp tại Trung tâm Thực nghiệm và đào tạo nghề nơi tôi công tác ựã tạo ựiều kiện về thời gian cũng như công việc giúp tôi hoàn thành khóa học cao học ựúng hạn

Xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong Hội ựồng chấm luận văn ựã cho tôi những ựóng góp quý báu ựể hoàn chỉnh luận văn này

Dù ựã có nhiều cố gắng, tuy nhiên trong quá trong nghiên cứu ựề tài và viết luận văn vẫn còn những thiếu sót, rất mong nhận ựược sự ựóng góp ý kiến từ các thầy cô, các cô chú, các anh chị và các bạn

Xin trân trọng cảm ơn!

Hà Nội, tháng 11 năm 2011

Tác giả luận văn

đồng Thị Hồng Liên

4.5 So sánh trình tự exon 14 giữa 7 giống gà ñịa phương với các

4.6 Kết quả phân tích trình tự amino axit của exon 14 51

CÁC CHỮ VIẾT TẮT

3’-UTR 3’ untranslated region

5’-UTR 5’ untranslated region

ISRE interferon stimulated response element

LB agar Luria broth

M Matrix protein

MHC Major histocompatibility complex

mRNA Messenger RNA

PB2 Transcriptase: cap binding

PCR Polymerase chain reaction

RFLP Restriction fragment length polymorphism

Ser (S) Serine

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC HÌNH

2.4 Real time PCR sử dụng mồi ñặc hiệu alen xác ñịnh ña hình

1 MỞ ðẦU

Gen Mx (Myxovirus resistence) thuộc nhóm các gen nhỏ có mặt ở tất

cả các loài có xương sống từ lớp cá ñến ñộng vật bậc cao và chỉ ñược kích hoạt bởi interferon type I Sản phẩm của gen Mx hoạt hóa protein Mx tồn tại dưới nhiều dạng (isoform) với hoạt tính kháng virus không giống nhau Ở gà

(Gallus domesticus, Gallus gallus spp), gen Mx có kích thước khoảng 21kb

nằm trên nhiễm sắc thể số 1

Nghiên cứu so sánh trình tự gen Mx của các giống gà khác nhau [14] cho thấy: (1) có tới 14/25 nucleotide sai khác dẫn tới sự thay ñổi amino axit (non-synonymous), (2) chỉ có sai khác ở vị trí axit amin 631 của protein Mx quyết ñịnh tới khả năng ñề kháng sự xâm nhiễm của virus in vitro (kháng vesicular stomatitis virus và H5N1 influenza virus) Sự sai khác ở amino axit thứ 631 này ñược quy ñịnh bởi ña hình nucleotide G/A tại vị trí 2032 của Mx cDNA hay vị trí 1892 của Mx mRNA Ngược lại, một số nghiên cứu chỉ ra rằng ña hình nucleotide kể trên không liên quan ñến hoạt tính kháng virus [6,

7, 27, 30] Tuy nhiên, nghiên cứu của Ewald và cộng sự [9] cho thấy Mx protein, cụ thể là sự thay ñổi ở amino axit 631 có liên quan tới hiệu lực kháng virus cúm gia cầm Nhóm tác giả nhấn mạnh: (1) hiệu lực kháng virus này có

sự khác biệt rõ rệt giữa kết quả in vitro và in vivo (trên bản ñộng vật); (2) việc lựa chọn chủng virus thí nghiệm là yếu tố quyết ñịnh ñến kết quả thí nghiệm xác ñịnh hiệu lực kháng/không kháng virus của protein này

Bên cạnh các nghiên cứu kể trên, các nghiên cứu về tần số alen G/A

2032 của gen Mx quy ñịnh tính mẫn cảm hoặc kháng virus chỉ ra có sự khác biệt rõ rệt giữa các giống gà Nhìn chung các giống gà bản ñịa, thường có tần

số alen kháng virus (alen A) cao hơn so với những giống gà thương phẩm [5,

19, 28]

Trong bối cảnh dịch cúm A H5N1 thể ựộc lực cao xuất hiện ở Hồng Kông năm 1997 và bùng phát ở nhiều châu lục kéo dài cho ựến hiện nay, bên cạnh giải pháp vacxin và áp dụng các biện pháp an toàn sinh học trong chăn nuôi, một trong những giải pháp khả dĩ là nghiên cứu và chọn tạo những giống gà ựề kháng với virus cúm A dựa trên cơ sở lựa chọn giống mang alen quy ựịnh tắnh kháng virus Hiện trên thế giới ựã có nhiều công trình nghiên cứu công bố về ựa hình nucleotide 2032 của Mx cDNA trên các giống gà bản ựịa của Nhật Bản [14], Trung Quốc [19], Indonesia [31] v.vẦ Tuy nhiên, ở Việt Nam chưa có công bố về trình tự exon 14 gen Mx ở các giống gà bản ựịa

Do vậy, ựược sự phân công của Viện đào tạo sau ựại học, dưới sự hướng dẫn của TS Bùi Trần Anh đào và TS Nguyễn Thị Phương Thảo, chúng tôi tiến

hành ựề tài: ỘXác ựịnh tắnh ựa hình exon 14 gen Mx ở một số giống gà ựịa

phương của Việt NamỢ

Mục tiêu của ựề tài

Xác ựịnh ựa hình nucleotide ở vị trắ 2032 của Mx cDNA ở một số giống gà ựịa phương của Việt Nam

Ý nghĩa của ựề tài

Tạo cơ sở cho những nghiên cứu ựánh giá khả năng kháng virus cúm của các giống gà ựịa phương của Việt Nam và những nghiên cứu chọn, tạo giống, dòng kháng bệnh cúm gia cầm trong tương lai

2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Gen Mx và Mx protein ở ñộng vật có xương sống

2.1.1 Phân loại gen Mx và Mx protein

Trên cơ sở so sánh tính tương ñồng về trình tự amino axit, Mx protein

ở ñộng vật có xương sống ñược chia thành 5 phân nhóm: Mx ở gia cầm, Mx ở

cá, Mx ở loài gặm nhấm, phân nhóm giống MxA và phân nhóm giống MxB [11] Bên cạnh ñó, kết quả phân tích ñặc ñiểm tiến hóa của gen Mx [13] ñã chỉ ra áp lực chọn lọc là không giống nhau giữa các nhánh của cây tiến hóa Dựa vào giá trị omega (ω = dN/dS, biểu thị tần số giữa biến ñổi nucleotide dẫn tới thay ñổi amino axit ñược mã hóa và biến ñổi nucleotide không dẫn tới thay ñổi amino axit ñược mã hóa), nhóm tác giả nhận thấy nhánh của gà và vịt

có sự khác biệt rõ rệt so với các nhánh còn lại và chịu ảnh hưởng của chọn lọc dương tính Ngược lại giá trị omega thấp cho thấy sự tiến hóa của gen Mx ở ñộng vật có vú chủ yếu chịu ảnh hưởng của chọn lọc âm tính hay có xu hướng bảo tồn trình tự amino axit

2.1.2 Cấu trúc của Mx protein

Mx protein thuộc nhóm GTPase có cấu trúc phân vùng chức năng, gồm

3 vùng riêng biệt: ñầu N (300 amino axit), vùng giữa (150 amino axit) và vùng hiệu ứng (GED, 100 amino axit) Cả 3 vùng này có mức ñộ bảo thủ khác nhau, trong ñó trình tự ở ñầu N có tính bảo thủ cao So sánh trình tự chuỗi peptide ở ñầu C cho thấy mức ñộ tương ñồng là 22% giữa các Mx protein, trong khi mức ñộ này ở các vùng còn lại là 38% Sự khác biệt về trình tự amino axit ñã dẫn tới sự khác biệt về chức năng giữa các dạng của Mx protein ðặc biệt, vùng hiệu ứng GED ñược xác ñịnh có vai trò quan trọng liên quan tới hoạt tính kháng virus (hình 2.1, [17])

Hình 2.1 Cấu trúc Mx protein và vị trí ñột biến ñiểm ở vùng hiệu ứng

Ghi chú:

1 N631S Mx protein của gà

2 R588C Mx2 protein của chuột (rat)

3 L612K MxA của người

4 H630K Mx2 protein của chuột (rat)

5 L612K Mx1 protein của chuột (mouse)

E645R MxA của người: không có hoạt tính kháng Vesicular stomatitis virus trong khi vẫn có hoạt tính kháng orthomyxovirus

6

R614E Mx1 của chuột (mouse): dạng tồn tại trong nguyên sinh chất không có hoạt tính kháng virus cúm Trường hợp xảy ra sự chuyển vị

(translocation), dạng tồn tại trong nhân tế bào thể hiện khả năng kháng virus cúm

7 L619P Mx1 của chuột (mouse): làm thay ñổi cấu trúc xoắn dạng α-helix, không có hoạt tính kháng virus

Vắ dụ: sự thay ựổi amino axit L612K ở MxA protein làm mất hoạt tắnh của GTPase trong khi vẫn giữ nguyên hoạt tắnh kháng virus ựối với Thogoto virus và Vesicular stomatitis virus đáng chú ý là ựột biến ựiểm E645R ở MxA protein của người làm mất hoạt tắnh kháng Vesicular stomatitis virus nhưng không ảnh hưởng tới hoạt tắnh kháng virus cúm và Thogoto virus Một

vắ dụ khác về vai trò quan trọng của vùng hiệu ứng tới hoạt tắnh kháng virus

là Mx protein ở loài gặm nhấm So sánh trình tự amino axit giữa dạng hoạt ựộng (Mx2) và dạng không hoạt ựộng (Mx3) cho thấy có 8 amino axit khác biệt Mặc dù vậy, hoạt tắnh kháng virus chỉ mất ựi khi xảy ra ựột biến tại vùng hiệu ứng [17]

2.1.3 Vị trắ phân bố của Mx protein

Ở hầu hết các loài, thường tồn tại từ 1 ựến 3 dạng Mx protein phân bố ở các khu vực khác nhau của tế bào và có hoạt tắnh kháng virus không giống nhau Vắ dụ Mx1 protein tồn tại ở trong nhân tế bào chủ yếu ức chế orthomyxovirus, trong khi ựó dạng tồn tại ở nguyên sinh chất ức chế RNA virus [17] Bảng 2.1 dưới ựây tóm tắt một số ựặc ựiểm chắnh của Mx protein ở người, chuột và gia cầm

Bảng 2.1 Vị trí phân bố và hoạt tính kháng virus của Mx protein*

Hoạt tính kháng virus Loài Gen

Kích thước (aa)

Phân

Influenza virus, Thogoto

Vesicular stomatitis virus Rhabdoviridae

Mx1 652 Nh Ifluenza virus, Thogoto

Mx2 659 NSC Vesicular stomatitis virus Rhabdoviridae

LaCrosse virus, Rift Valley fever virus Bunyaviridae

Chuột

(rat)

Gà

Vesicular stomatitis virus Rhabdoviridae

NSC Chưa hoạt hóa

Ghi chú: NSC: nguyên sinh chất; Nh: nhân tế bào * trích theo [17]

Hình 2.2 Cấu trúc gen Mx và Mx mRNA của gà

Ghi chú: tương quan giữa các exon của Mx mRNA theo cách phân chia khác nhau (mũi tên) Mx mRNA gồm 14 exon (hình 2.2A) theo Yin và cộng sự [38] Cách phân chia Mx mRNA gồm 13 exon (hình 2.2B) và cấu trúc ñầu 5’-UTR, 3’-UTR theo Li và cộng sự [18] Hình 2.2C, sơ ñồ biểu diễn vị trí của các exon mở ñầu của Mx mRNA ở gà theo Schumacher và cộng sự [26]

Theo Li và cộng sự [18], Mx mRNA gồm 13 exon, theo chiều từ 5’ ñến 3’ có kích thước lần lượt là: 237, 193, 138, 155, 139, 199, 79, 123, 142, 159,

77, 243 và 234 nucleotide (hình 2.2B) ðầu 5’-UTR không mã hóa cho amino axit có trình tự khởi ñầu dịch mã (promoter) gồm 215 nucleotide ðoạn promoter này chứa trình tự tiếp nhận tác nhân kích thích là interferon, gọi tắt

là ISRE (interferon stimulated response element) ðầu 3’-UTR có kích thước

288 nucleotide, theo sau bởi ñuôi polyadenosine (poly A)

Theo Schumacher và cộng sự [26], hình 2.2C, phía 5’-UTR gồm exon 1 (48 nucleotide), exon 1’ (125 nucleotide) và exon 2 (329 nucleotide) Thực chất exon 2 gồm (i) 92 nucleotide ở phía trước codon khởi ñầu dịch mã không mã hóa amino axit (ii) 237 nucleotide mã hóa cho amino axit 237 nucleotide này chính là exon thứ nhất của Mx mRNA theo phân loại của Li và cộng sự [18]

Một nghiên cứu khác về cấu trúc của gen Mx ở gà [38] Mx mRNA ñược phân chia gồm 14 exon (E1 ñến E14, hình 2.2A) Theo cách phân loại này, exon 14 (463 nucleotide) bao gồm 234 nucleotide phía trước mã hóa cho amino axit (hay exon 13 theo cách phân loại của Li và cộng sự [18]) và phần còn lại chứa 3’-UTR và ñuôi poly A

2.2.2 Tính ña hình nucleotide của Mx cDNA ở gà

Kết quả so sánh trình tự nucleotide của Mx cDNA (bao gồm 141 nucleotide phía trước codon khởi ñầu dịch mã không mã hóa amino axit) trên

15 giống gà bản ñịa của Nhật Bản [14] ñã xác ñịnh 25 vị trí nucleotide là ña hình (bảng 2.2), trong ñó 14 thay ñổi dẫn tới thay ñổi amino axit ñược mã hóa (non-synonymous substitution) Nghiên cứu cũng chỉ ra tính ña hình tại nucleotide thứ 2032 của Mx cDNA (hay amino axit thứ 631) có liên quan tới tính kháng/ không kháng virus cúm gia cầm H5N1 Sự sai khác ở vị trí 631 này ñược quyết ñịnh bởi tính ña hình nucleotide G/A tại vị trí 2032 thuộc exon 14 của gen Mx

Bảng 2.2 Vị trí ña hình ở Mx cDNA của một số giống gà *

WLR 153 202 262 265 296 394 421 491 694 735 745 836 932 953 1062 1155 1343 1388 1469 1595 1685 1783 1887 2032 2159

KS T A C C A T A T A G G G C G A G C G C C G C G G G

AP, GSP T A G C A T A T A G G G C G A G A G C C G C G G G BMC, NG,

SHS-2 C G C T T T G T A G G G T A G A A A C C G C A G G WLF-1 C G C T T T G C A G G G T A G A A G T C G C A G G

WLK-2 C G C T T T G T A G G C T A G A A A C C G T A A G WLO-2 C G C T T T G C A G G G T A G A A G C T A T A A A

2.2.3 ða hình 2032-G/A exon 14 với ñặc ñiểm kháng virus và sự biểu hiện tính trạng

Nghiên cứu của Ko và cộng sự [15] sử dụng kỹ thuật gây ñột biến ñiểm

ñã khẳng ñịnh khả năng ñề kháng với vesicular stomatitis virus phụ thuộc vào sai khác amino acid ở vị trí 631 Cụ thể: kiểu gen mã hóa Asn quy ñịnh khả năng kháng, kiểu gen mã hóa Ser không quy ñịnh khả năng kháng virus

Trong một nghiên cứu về khả năng biểu hiện và ñặc tính kháng virus liên quan tới amino axit thứ 631 của Mx protein trên 8 giống gà bản ñịa và 2 giống gà ngoại nhập ñã xác ñịnh ñược mức ñộ biểu hiện gen Mx là khác nhau giữa các kiểu gen Mx khác nhau Ví dụ, ở giống gà Beijing-You và Leghorn trắng, các cá thể mang kiểu gen A/A có mức ñộ biểu hiện protein Mx cao hơn

cá thể mang kiểu gen G/G Thí nghiệm trên môi trường tế bào xơ phôi gà có kiểu gen A/A cũng cho thấy kiểu gen này ñề kháng hơn với vesicular stomatitis virus và virus gây bệnh Newcastle ở gà Bên cạnh ñó, nghiên cứu cũng cho biểu hiện gen Mx ở gan, tim, lách cao hơn ở cơ và thận [39]

Bên cạnh các nghiên cứu về hoạt tính kháng virus Cúm gia cầm của kiểu gen Mx Asn631 và Mx Ser631, O’Neill và cộng sự [23] ñặt vấn ñề nghiên cứu vai trò của kiểu gen Mx ñối với virus gây bệnh Gumboro (IBDV) Kết quả nghiên cứu in vitro trên tế bào xơ phôi gà mang kiểu gen Mx khác nhau cho thấy không có sự khác biệt rõ rệt trong việc chống lại sự xâm nhiễm

và nhân lên của IBDV Nhóm tác giả kết luận: Mx Asn631 không là nhân tố

có vai trò quan trọng tới khả năng kháng IBDV trên tế bào xơ phôi gà

Nghiên cứu nhằm chỉ ra ảnh hưởng của kiểu gen ñồng hợp tử

(2032-AA hoặc 2032-GG) và kiểu gen dị hợp tử (2032-AG) tới ñáp ứng miễn dịch với vacxin H5N2 phòng bệnh Cúm gia cầm, Qu và cộng sự [25] thấy rằng hàm lượng kháng thể ñặc hiệu ở những cá thể ñồng hợp tử AA là thấp nhất trong 3 loại kiểu gen và những cá thể mang kiểu gen dị hợp tử AG có hàm

lượng kháng thể cao nhất Sự khác biệt này rõ rệt nhất sau khi tiêm vacxin nhắc lại 5 tuần Tuy vậy, nhóm tác giả cũng lưu ý tính trạng kháng bệnh tật thường do nhiều gen quy ñịnh và khả năng sản sinh ñáp ứng miễn dịch của các kiểu gen AA, GG hoặc AG có thể khác nhau với từng mầm bệnh

Chang và cộng sự [8] ñặt vấn ñề nghiên cứu hoạt tính kháng virus của

Mx protein ñối với virus gây bệnh Newcastle, Marek ở những cá thể gà mang kiểu gen MHC khác nhau Qua kết quả giải trình tự 2.118bp của Mx mRNA, nghiên cứu ñã xác ñịnh ñược 3 kiểu gen Mx ở gà có kiểu gen liên kết MHC

là B19 (N), B15 (F) và B21 (GSP) Các kiểu gen liên kết MHC nói trên ñã ñược xác nhận là liên quan tới mức ñộ mẫn cảm khác nhau với bệnh Marek Kết quả xác ñịnh khả năng kháng virus cho thấy amino axit 548 (Val) và 631 (Asn) của Mx protein ở gà có kiểu gen liên kết MHC là N và F mẫn cảm với virus gây bệnh Marek, ñóng vai trò quan trọng ñối với hoạt tính kháng virus

Nghiên cứu của Livant và cộng sự [20] ñã chỉ ra mối liên hệ giữa ña hình nucleotide 2032-G/A với các tính trạng phẩm chất, trong các ñiều kiện

vệ sinh khác nhau Ý tưởng của nghiên cứu xuất phát từ nhận thức về kiểu hình là kết quả tương tác giữa kiểu gen với môi trường Kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng alen 2032-A có ảnh hưởng rõ rệt tới khối lượng cơ thể ở 40 ngày tuổi trong ñiều kiện gà ñược chăn nuôi ở ñiều kiện vệ sinh kém Ở trong ñiều kiện vệ sinh chăn nuôi tốt, alen 2032-A ảnh hưởng làm tăng hàm lượng kháng thể khi ñược vacxin chống virus Gumboro Ngược lại, alen này cũng có những ảnh hưởng không tốt tới một số tính trạng như tăng tỷ lệ gà mắc hội chứng giảm sản xương chày (sub-clinical tibial dyschrondoplasia)

2.2.4 Tần số alen kháng virus của gen Mx ở gà

Các nghiên cứu về tần số alen G/A 2032 của gen Mx quy ñịnh tính mẫn cảm hoặc kháng với virus ñã chỉ rõ sự khác biệt giữa các giống gà Nhìn chung các giống gà bản ñịa, thường có tần số alen kháng virus (alen A) cao

hơn so với những giống gà thương phẩm Theo kết quả nghiên cứu của Li và cộng sự [19] trên 15 giống gà Trung Quốc bản ñịa và 4 giống gà thương phẩm cho thấy tần số alen A thường cao hơn (0,7241 ñến 0,9554) ở giống gà bản ñịa so với giống gà thương phẩm (0,0565 ñến 0,2742), bảng 2.3

Bảng 2.3 Tần số alen G/A 2032 và tần số kiểu gen của một số giống gà *

Tần số alen Tần số kiểu gen

G A GG GA AA Xinghua 57 0,0446 0,9554 0,0000 0,0893 0,9107 Beijing-You 72 0,0493 0,9507 0,0000 0,0986 0,9014 Langshan 33 0,0500 0,9500 0,0000 0,1000 0,9000 Dongxiang Blue-shell 64 0,0508 0,9492 0,0000 0,1017 0,8983 Silkie 64 0,0556 0,9444 0,0159 0,0794 0,9048 Xishuangbanna Game 54 0,0761 0,9239 0,0213 0,1277 0,8511 Wenchang 38 0,0857 0,9143 0,0571 0,0571 0,8857 Tibetan 64 0,1140 0,8860 0,0702 0,0877 0,8421 Xianju 32 0,1154 0,8846 0,0769 0,0769 0,8462 Xiayan 60 0,1379 0,8621 0,0517 0,1724 0,7759 Dagu 36 0,1618 0,8382 0,0882 0,1471 0,7647 Luxi Game 38 0,1875 0,8125 0,0625 0,2500 0,6875 Shouguang 64 0,1953 0,8047 0,1406 0,1094 0,7500 Gushi 38 0,2639 0,7361 0,2222 0,0833 0,6944 Tulufan Game 33 0,2759 0,7241 0,0690 0,4133 0,5172 Red Jungle Fowl 32 0,6250 0,3750 0,3750 0,5000 0,1250 White Plymouth Rock 64 0,7258 0,2742 0,5968 0,2581 0,1452 White Leghorn 64 0,8387 0,1613 0,7903 0,0968 0,1129 Rhode Island Red 64 0,8387 0,1613 0,7903 0,0968 0,1129 Dwarf White Plymouth Rock 64 0,9435 0,0565 0,9032 0,0806 0,0161

Ghi chú: * theo [19]

Kết quả nghiên cứu tiến hành nghiên cứu trên 28 giống gà khác nhau ở

3 nhóm gà kiêm dụng, gà ñẻ và gà thịt [5] cho thấy: alen không quy ñịnh tính

kháng virus (susceptibility allele) lưu hành với tần suất cao ở giống gà hướng thịt so với giống gà hướng trứng (bảng 2.4) Bên cạnh ñó, phân tích so sánh trình tự gen của giống tổ tiên (ancestral breed) chỉ ra sự khác biệt này ñã có ở giống tổ tiên so với các giống hiện thời

Bảng 2.4 Tần số alen và tần số kiểu gen mã hóa aa thứ 631 Mx protein *

Tần số kiểu gen (Codon/codon; aa/aa) Tần số alen Giống gà Cá

Giống gà trứng (hiện thời

Line Z,1 15 0,87 0,13 0,00 0,93 0,07

Giống gà trứng (tổ tiên)

Line 7 2 15 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 Line 6 1 13 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 Line 151 15 0,86 0,07 0,07 0,93 0,07 Line 0 14 0,86 0,07 0,07 0,93 0,07 Line N 15 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 Line P2A 15 0,93 0,07 0,00 0,97 0,03 Line C 28 0,00 0,00 1,00 0,00 1,00 Wellcome line 15 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00

Giống gà thịt (hiện thời)

Line X,1 15 0,00 0,00 1,00 0,00 1,00 Line X,2 12 0,00 0,00 1,00 0,00 1,00

Tần số kiểu gen (Codon/codon; aa/aa) Tần số alen Giống gà Cá

Giống gà thịt (tổ tiên)

Indian Game a 8 0,00 0,00 1,00 0,00 1,00 Indian Game b 14 0,00 0,00 1,00 0,00 1,00 Brd, P, Rock a 20 0,00 0,00 1,00 0,00 1,00 Brd, P, Rock b 14 0,00 0,00 1,00 0,00 1,00

Ghi chú: Nucleotide ña hình ñược viết dưới dạng gạch chân; * theo [5]

N/N: Asparagine/Asparagine; N/S: Asparagine/Serine; S/S: Serine/Serine

2.2.5 Phương pháp xác ñịnh ña hình nucleotide 2032-G/A exon 14

ðể xác ñịnh tính ña hình nucleotide ở vị trí 2032 của Mx cDNA, một số phương pháp ñược dùng như: giải trình tự gen [14], PCR-RFLP [29] dựa vào khả năng nhận biết và cắt trình tự nucleotide ñặc hiệu của enzyme giới hạn, hoặc phương pháp phân tích ñường cong biến tính nhiệt của sản phẩm PCR [36, 37] Dưới ñây chúng tôi trình bày phương pháp xác ñịnh ña hình nucleotide gen Mx tại vị trí 2032 bằng phương pháp PCR-RFLP [29] và phương pháp phân tích ñường cong biến tính nhiệt của Realtime-PCR sử dụng mồi ñược thiết kế ñặc hiệu cho từng alen [37]

2.2.5.1 Phương pháp PCR-RFLP xác ñịnh ña hình nucleotide 2032-G/A

Trong phương pháp này mồi xuôi F ñược thiết kế bắt cặp bổ xung với intron cuối cùng của gen Mx, mồi ngược R bắt cặp với exon cuối cùng gen

Mx Sản phẩm PCR nhân lên bởi cặp mồi này có kích thước 299bp chứa trình

tự ña hình nucleotide Trình tự này ñược nhận biết ñặc hiệu bởi enzyme giới

hạn Hpy8I (trình tự nhận biết 5’-GTN|NAC-3’) Trường hợp ña hình là alen G,

sản phẩm sẽ bị cắt thành hai ñoạn có kích thước 200bp và 99bp) Ngược lại,

ña hình là alen A, sản phẩm PCR sẽ không bị cắt (hình 2.3)

Hình 2.3 PCR-RFLP xác ñịnh ña hình nucleotide 2032-G/A

Ghi chú: trình tự gen ñược nhân lên bởi cặp mồi FR (phần ñánh dấu màu xám) chứa trình

tự nhận biết ñặc hiệu bởi enzyme giới hạn Hpy8I (trình tự gạch chân) Hình phía dưới thể hiện kết quả xác ñịnh ña hình: (i) GG quan sát ñược 2 vạch 200bp và 99bp, (ii) AA chỉ quan sát ñược vạch 299bp, (iii) trường hợp dị hợp tử AG, quan sát ñược 3 vạch 299bp, 200bp và 99bp

2.2.5.2 Phương pháp realtime-PCR sử dụng mồi ñặc hiệu alen 2032-G/A

ðể xác ñịnh ña hình nucleotide 2032-G/A, Ye và cộng sự [37] sử dụng phương pháp realtime-nested PCR với 3 cặp mồi: (i) cặp mồi ngoài NF/NR nhân lên 298bp không ñặc hiệu cho alen, (ii) cặp mồi trong NF/2032GR ñặc hiệu alen G, (iii) cặp mồi 2032AF/NR ñặc hiệu alen A Như vậy, sẽ có từ 2 ñến 3 sản phẩm PCR ñược nhân lên với kích thước khác nhau Trình tự mồi

và kết quả của phản ứng ñược trình bày ở hình 2.4 và bảng 2.5

Hình 2.4 Real time PCR sử dụng mồi ñặc hiệu alen xác ñịnh ña hình

nucleotide 2032-G/A

Ghi chú: phản ứng ñược thiết kế thực hiện dưới dạng multiplex – nested PCR, nhân lên ñồng thời sản phẩm PCR vòng ngoài ñóng vai trò làm sợi khuôn cho mồi ñặc hiệu alen (PCR vòng trong hay nested) Sản phẩm PCR ñược sinh tổng hợp có kích thước khác nhau nên cũng có nhiệt ñộ biến tính khác nhau (hình A, B, C) Kết quả xác ñịnh ña hình: (i) GG quan sát ñược 2 vạch 298bp và 97bp, (ii) AA quan sát ñược vạch 298bp và 239bp, (iii) trường hợp dị hợp tử AG, quan sát ñược 3 vạch 298bp, 239bp và 97bp

Bảng 2.5 Trình tự mồi ựặc hiệu alen trong phản ứng Realtime PCR

sản phẩm (bp)

Nhiệt ựộ biến tắnh sản phẩm

ở ựàn gia cầm Tiếp ựó năm 1901, Centani và Savunozzi ựã ựề cập ựến bệnh này ựược gây ra bởi virus qua lọc Nhưng phải ựến năm 1955 người ta mới chứng minh ựược rằng virus gây dịch tả gà thực chất là virus cúm týp A (H7N1 và H7N7) gây chết nhiều ở gà, gà tây và các loại gia cầm khác Chủng virus ựặc biệt này ựã gây ra dịch Cúm gia cầm ở nhiều quốc gia trên thế giới vào cuối thế kỉ 19 ựầu thế kỉ 20 như: Bắc Mỹ, Nam Phi, Trung đông, Viễn đông, Châu Âu, Liên Xô (cũ)

Từ sau khi phát hiện ra virus cúm týp A, các nhà khoa học ñã tăng cường nghiên cứu và thấy virus cúm có nhiều ở các loài chim hoang dã và gia cầm nuôi ở nhiều vùng khác nhau trên thế giới Dịch cúm nghiêm trọng nhất xảy ra ñối với gia cầm do những chủng gây bệnh cao thuộc các týp H5 và H7 Năm 1963 virus cúm týp A ñược phân lập từ gà tây ở Bắc Mỹ do loài thuỷ cầm di trú, dẫn nhập virus vào ñàn gà Phân týp H1N1 thấy ở lợn và có liên quan ñến những ổ dịch ở gà tây với biểu hiện ñặc trưng là những triệu chứng

ở ñường hô hấp và giảm ñẻ

ðồng thời mối liên quan giữa lợn và gà tây là những dấu hiệu ñầu tiên

về virus cúm ở ñộng vật có vú có thể lây nhiễm và gây bệnh cho gia cầm Những nghiên cứu về phân týp H1N1 ñều cho thấy virus cúm týp A ở lợn truyền cho gà tây và ngoài ra phân týp H1N1 ở vịt còn truyền cho lợn

2.3.1 ðặc ñiểm virus cúm

Virus cúm là loại virus ña hình thái với cấu trúc bộ gen gồm 8 phân ñoạn RNA sợi ñơn, âm Các phân ñoạn gen mã hóa cho protein cấu trúc và phi cấu trúc của virus cúm gồm: HA, NA, M, NS, NP, PA, PB1 và PB2 Virus cúm týp A thuộc họ Orthomyxoviridae, gây bệnh cho mọi loài chim, một số ñộng vật có vú và có thể lây sang người Cùng với virus cúm A, họ Orthomyxoviridae còn có 3 týp virus khác là: virus cúm týp B chỉ gây bệnh cho người, virus cúm týp C gây bệnh cho người

Loại virus cĩ độc lực thấp này lây truyền rộng rãi và tạo thành các ổ bệnh trong tự nhiên Mối nguy hiểm tiềm tàng của virus cúm A cĩ độc lực thấp là

nĩ cĩ thể trao đổi gen với các chủng virus cĩ độc lực cao để trở thành một loại virus mới nguy hiểm [35]

2.3.1.2 Khả năng gây bệnh virus cúm A

Virus cúm A cĩ tính hướng biểu mơ đường hơ hấp, do vậy gây bệnh chủ yếu ở đường hơ hấp Khả năng gây bệnh của virus cúm A phụ thuộc vào độc lực và tính thích nghi vật chủ của từng chủng virus Thơng thường chúng khơng gây bệnh hoặc gây bệnh ở thể nhẹ giới hạn ở đường hơ hấp của chim hoang dã và gia cầm Ngược lại, một số chủng cường độc như H5, H7, H1, H2 và H3 cĩ thể gây bệnh nặng ở hầu hết các cơ quan phủ tạng [22]

2.3.1.3 ðặc điểm miễn dịch kháng virus cúm A

Sau khi bị nhiễm virus cúm A, cơ thể vật chủ sản sinh đáp ứng miễn dịch chống lại virus Tuy nhiên, đáp ứng miễn dịch này khơng cĩ tác dụng bảo vệ hồn tồn cơ thể khỏi hiện tượng tái nhiễm ðiều này là do virus cúm

A cĩ sự biến đổi kháng nguyên trong quá trình lưu hành và khơng gây đáp ứng miễn dịch chéo giữa các chủng Do vậy, khi xuất hiện những biến chủng virus cúm A cĩ đặc tính kháng nguyên khác với các chủng virus đã nhiễm trước đĩ, cơ thể nhiễm sẽ khơng hoặc ít cĩ đáp ứng miễn dịch thích ứng với chủng virus mới Nguyên nhân kể trên dẫn tới hiên tượng người hoặc gia cầm

cĩ khả năng mắc lại bệnh cúm nhiều lần

2.3.1.4 Các phương thức biến đổi kháng nguyên của virus cúm A

ðặc điểm của virus cúm A là luơn luơn cĩ sự đột biến ở bên trong bộ gen Hiện tượng thay đổi kháng nguyên của virus cúm A theo thời gian thường khơng thể dự đốn được ðiều này giúp cho virus lưu hành liên tục và

rộng rãi trong tự nhiên, ở nhiều loại vật chủ khác nhau Có ba phương thức biến ñổi kháng nguyên chủ yếu của virus cúm:

- Hiện tượng lệch kháng nguyên: ñây thực chất là các ñột biến ñiểm xảy ra ở các phân ñoạn của hệ gen virus, do virus không có cơ chế ‘ñọc và sửa chữa bản sao_ proof reading’ trong quá trình phiên mã Tùy thuộc vào vị trí xảy ra ñột biến trong bộ ba mã hóa mà có thể dẫn tới sự thay ñổi hoặc không thay ñổi axit amin ñược mã hóa Tần suất xảy ra ñột biến ñiểm có thể cao hoặc thấp tùy từng loại virus Gần như mỗi hạt virus ñược tạo mới ñều chứa một ñột biến ñiểm nào ñó trong hệ gen, ñột biến này tích lũy qua nhiều thế hệ làm xuất hiện một phân type virus mới Hiện tượng này thường xảy ra

ở phân ñoạn gen mã hóa kháng nguyên NA và HA Kết quả làm thay ñổi cấu trúc dẫn tới thay ñổi ñặc tính của protein hoặc có khả năng glycosyl hóa rất cao trong cấu trúc chuỗi polypeptide kháng nguyên

- Hiện tượng trộn kháng nguyên: hiện tượng này còn ñược gọi là trao ñổi hoặc tái tổ hợp các gen mã hóa kháng nguyên Do bộ gen của virus cúm gồm 8 phân ñoạn riêng biệt, do vậy trong trường hợp 2 chủng virus cúm ñồng thời nhiễm vào một tế bào có thể xảy ra sự hòa trộn hoặc trao ñổi các phân ñoạn gen của hai chủng virus Kết quả là tạo ra các trạng thái khác nhau của RNA của hạt virus mới, ñôi khi giúp cho chúng có khả năng lây nhiễm ở loài mới hoặc gia tăng ñột lực gây bệnh [12]

Hiện tượng lệch kháng nguyên và thay ñổi amino axit ñược glycosyl hóa xảy ra liên tục trong quá trình nhân lên của virus, trong khi ñó hiện tượng trộn kháng nguyên có thể xảy ra với tất cả các chủng virus cúm khi chúng ñồng nhiễm vào tế bào ở tất cả các loài vật chủ khác nhau ðây chính là vấn

ñề ñáng quan ngại nhất ñối với virus cúm A/H5N1 Mặc dù virus này chưa có

sự thích nghi và lây nhiễm dễ dàng ở người, nhưng nó có khả năng gây bệnh

ñược cho người, và rất có thể virus này tái tổ hợp gen HA hoặc NA hoặc cả 2 gen nói trên ñể tạo ra biến chủng virus thích nghi trên người

- Hiện tượng glycosyl hóa là sự gắn kết của một chuỗi carbonhydrate vào Asparagine (N) ở một số vị trí nhất ñịnh trong chuỗi peptide HA hoặc NA Thông thường chuỗi oligosaccharide ñược gắn tại vị trí N-X-S/T (X: amino axit bất kỳ trừ Prolin, S/T: Serine hoặc Threonine) [4] Vị trí ñược glycosyl làm che khuất vị trí kháng nguyên ñược nhận biết bởi kháng thể ñặc hiệu, do

ñó giúp cho virus ‘lẩn tránh’ tác ñộng của kháng thể kích thích sinh ra bởi virus

2.3.2 Cơ chế xâm nhiễm của virus cúm A

Virus cúm A ký sinh nội bào bắt buộc, quá trình xâm nhiễm, nhân lên của virus chủ yếu ở tế bào biểu mô ñường hô hấp, ñường tiêu hóa [22] Quá trình xâm nhiễm mở ñầu bằng sự kết hợp của HA và thụ thể trên bề mặt tế bào vật chủ, cuối cùng là giải phóng bộ gen của virus vào nguyên sinh chất tế bào vật chủ Quá trình nhân lên của ARN virus chỉ xảy ra trong nhân tế bào, ñây là ñặc ñiểm khác so với các ARN virus khác (quá trình này xảy ra ở nguyên sinh chất) và cuối cùng là giải phóng hạt virus ra khỏi tế bào nhờ hoạt tính enzyme của kháng nguyên NA Chu trình xâm nhiễm- giải phóng các hạt virus mới của virus cúm chỉ khoảng vài giờ Sự giải phóng hạt virus không dẫn tới phá hủy tế bào bị nhiễm, nhưng các tế bào này bị rối loạn hệ thống tổng hợp các ñại phân tử, rơi vào trạng thái chết theo chương trình và hậu quả

là tổn thương mô bào của vật chủ Quá trình này diễn ra theo các giai ñoạn:

- Sau khi bộ gen virus ñược giải phóng vào nguyên sinh chất tế bào vật chủ, bộ gen sử dụng bộ máy sinh học của tế bào tổng hợp các protein của virus và các ARN vận chuyển phụ thuộc Phức hợp protein-ARN của virus ñược vận chuyển vào trong nhân tế bào

- Trong nhân tế bào, các ARN hệ gen của virus tổng hợp nên các sợi dương của nó, từ các sợi dương này chúng tổng hợp nên ARN hệ gen của virus mới nhờ RNA-polymerase Các sợi này không ựược adenin hóa, chúng kết hợp với nucleocapsid protein ựể tạo thành phức hợp ARN-NP ựể vận chuyển ra bào tương đồng thời, các ARN thông tin của virus cũng sao chép nhờ hệ thống enzyme ựược mã hóa bởi một số phân ựoạn của virus và ựược enzyme PB2 gắn thêm 10- 12 adenine ở ựầu 5Ỗ sau ựó ựược vận chuyển ra bào tương và ựược dịch mã tại lưới nội bào

- Các phân tử NA và HA của virus sau khi ựược tổng hợp ựược chuyển lên màng tế bào nhờ bộ máy golgi của vật chủ (hiện tượng Ổnảy chồiỖ)

- Sau cùng các ARN-NP của virus ựược hợp nhất với vùng nảy chồi tạo thành các ỔchồiỖ virus gắn chặt vào màng tế bào vật chủ bởi liên kết giữa

HA với thụ thể axit sialic Sự giải phóng hạt virus ựược thực hiện bởi chức năng enzyme của NA protein [21]

2.3.3 đáp ứng của vật chủ ựối với virus cúm gia cầm

Interferons type 1 sản sinh bởi tế bào bị nhiễm virus ựóng vai trò cực

kỳ quan trọng trong cơ chế phòng vệ của vật chủ trước sự xâm nhiễm của virus cúm, ựặc biệt là trong giai ựoạn ựầu Sau khi ựược sản sinh, interferon

sẽ kắch hoạt một loạt gen ở các tế bào xung quanh (chưa bị nhiễm virus), trong ựó có gen Mx ựể chống lại sự xâm nhiễm của mầm bệnh Theo phương thức này, interferon góp phần hạn chế sự lan tràn của mầm bệnh giữa các tế bào vật chủ

Sự hoạt hóa gen Mx bởi interferon type 1 ựược thực hiện thông qua cơ chế Janus kinase/signal transducer and activator of transcription (JAK/STAT) Trong cơ chế này, thoạt tiên interferon ựược nhận biết bởi receptor ựặc hiệu trên bề mặt tế bào và dẫn ựến quá trình phosphoryl hóa và kắch hoạt yếu tố

dẫn truyền thông tin STAT1 và STAT2 Các yếu tố dẫn truyền này sẽ di chuyển vào nhân tế bào, kắch hoạt quá trình sao mã của bộ gen

2.4 Một số giống gà ựịa phương của Việt Nam

Theo nhiều nghiên cứu, các giống gà ựịa phương có khả năng ựề kháng bệnh cao hơn các giống gà nhập ngoại Các giống gà như: gà Hồ, gà Mắa, gà đông Tảo, gà Móng, gà HỖmông, gà Ri, và gà Ác là các giống ựược Viện chăn nuôi chọn lọc, nhân thuần và quy hoạch thành các vùng bảo tồn giống hoặc bảo tồn giống tại Viện chăn nuôi và ựược nuôi phổ biến ở một số vùng xung quanh Hà Nội Chắnh vì thế tập trung vào nghiên cứu về các giống

gà này có ý nghĩa thực tiễn cho hoạt ựộng chăn nuôi cũng như công tác nghiên cứu

2.4.1 Gà Ác

Gà Ác có nguồn gốc ở miền Nam, Việt Nam, ựược nuôi nhiều nhất tại tỉnh Long An và Thành phố Hà Nội

đặc ựiểm của phẩm giống:

+) Gà Ác có tầm vóc nhỏ, lông màu trắng tuyền, lông mọc cả ở ngón Con trống có mào dạng mào cờ, ựỏ nhạt và pha màu xanh ựen Chân thường

có 5 ngón

+) Gà Ác có ựặc ựiểm nổi bật là mỏ, chân, da, thịt, xương ựều ựen Hàm lượng axit glutamic trong thịt khá cao Thịt hơi tanh do hàm lượng sắt cao Gà Ác ựược xem là loại Ộgà thuốcỢ

+) Khối lượng gà con mới nở từ 18-20 gam/con Gà trống trưởng thành con nặng khoảng 700-750 gam, gà mái nặng 550-600 gam/con

+ Năng suất: gà Ác bắt ựầu ựẻ lúc 110-120 ngày tuổi Nếu ựể gà ựẻ rồi tự ấp, một năm ựẻ 90-100 quả trứng (trứng 30 gam/quả)

2.4.2 Gà đông Tảo

Gà đông Tảo có nguồn gốc ở xã đông Tảo, huyện Khoái Châu, tỉnh Hưng Yên Hiện nay, gà đông Tảo ựược nuôi chủ yếu ở huyện Khoái Châu (Hưng Yên) và một số vùng của Hà Nội

đặc ựiểm của phẩm giống:

+) Gà đông Tảo có ựặc ựiểm ngoại hình nổi bật là chân to và thô Gà mới nở có lông màu trắng ựục, mọc lông chậm Gà mái trưởng thành có lông màu vàng nhạt, nâu nhạt Gà trống có màu lông mận chắn pha ựen, ựỉnh ựuôi

và cánh có màu lông ựen ánh xanh Hình dạng mào của gà đông Tảo tương ựối ựa dạng như dạng mào kép, mào nụ, Ộhoa hồngỢ, Ộbèo dâuỢ Gà trưởng thành có thân hình to, ngực sâu, lườn rộng dài Xương to, dáng ựi chậm chạp, nặng nề

+) Khối lượng gà con mới nở dao ựộng từ 38-40 gam Lúc trưởng thành con trống nặng 4,5 kg/con, con mái nặng 3,5 kg/con

+) Năng suất, sản phẩm: Bắt ựầu ựẻ lúc 160 ngày tuổi Nếu ựể gà ựẻ rồi

tự ấp, 10 tháng ựẻ 70 quả Khối lượng trứng khoảng 48-55 gam/quả

2.4.3 Gà Hồ

Gà Hồ là giống gà có nguồn gốc ở vùng Hồ nay là làng Lạc Thổ, thị trấn Hồ, huyện Thuận Thành, tỉnh Bắc Ninh

đặc ựiểm của phẩm giống:

+) Con trống: ựầu hình công, mình hình cốc, cánh hình vỏ trai, ựuôi hình nơm, da chân ựỗ nành, mào xuýt, diều cân ở giữa, bàn chân ngắn, ựùi dài, vòng chân tròn, các ngón tách rời nhau, da vàng, màu lông mận chắn

+) Con mái: màu ựất thó hay màu quả nhãn, ngực nở, chân cao vừa phải, mào xuýt, thân hình chắc chắn

+) Khối lượng gà mới nở khoảng 45 gam/con, lúc trưởng thành con trống nặng 4,5-5,5 kg/con, con mái nặng 3,5-4,0 kg/con

+) Năng suất: gà mái bắt ñầu ñẻ lúc 185 ngày tuổi Một năm ñẻ 3-4 lứa, mỗi lứa ñẻ ñược 10-15 quả Khối lượng trứng dao ñộng từ 50-55 gam/quả

2.4.4 Gà H’mông

Gà H’mông xuất xứ từ vùng núi cao nơi có người H’mông và các dân tộc thiểu số sinh sống Giống ñược phân bố ở các các tỉnh miền núi như Sơn

La, Yên Bái, Lào Cai, Nghệ An, v.v…

ðặc ñiểm của phẩm giống:

+) Gà H’mông có nhiều loại hình và màu lông Có 3 màu phổ biến là: hoa mơ, ñen và trắng ðặc ñiểm nổi bật nhất của gà H’mông là xương ñen, thịt ñen, phủ tạng ñen và da ngăm ñen

+) Khối lượng gà con mới nở từ 28-30 gam/con Lúc trưởng thành con trống nặng 2,2-2,5 kg/con, con mái nặng 1,6-2,0 kg/con

+) Năng suất: gà mái bắt ñầu ñẻ lúc 110 ngày tuổi Nếu ñể gà ñẻ rồi tự

ấp, có thể ñẻ 4-5 lứa/năm, một lứa 10-15 quả trứng Khối lượng trứng: 50 gam/quả, màu nâu nhạt

2.4.5 Gà Mía

Gà Mía có nguồn gốc ở thôn Mông Phụ, xã ðường Lâm, thị xã Sơn Tây, Hà Nội Giống gà Mía ñược nuôi ở các tỉnh ðồng bằng sông Hồng, và ñược nuôi nhiều tại các ñịa phương lân cận với nơi xuất xứ của phẩm giống

ðặc ñiểm của phẩm giống:

+) Con trống có thân hình to, dài, hình chữ nhật, phần lớn có màu mận chín, tuy nhiên cũng có màu ñen Con mái có màu vàng của lá chuối khô.Cả con trống và mái ñều có mào cờ (ñơn), tích tai chảy, da chân màu vàng nhạt Sau khi ñẻ ñược 3-4 tháng lườn chảy xuống giống yếm bò

+) Khối lượng gà con mới nở khoảng 43 gam/con Gà trống trưởng thành nặng khoảng 3 kg/con, con mái nặng 2,3 kg/con

+) Năng suất: gà bắt ñầu ñẻ lúc 165-170 ngày tuổi Một năm ñẻ 4-5 lứa/năm và ñẻ ñược 55–60 quả Khối lượng trứng: 55-58 gam/quả

2.4.6 Gà Móng

Giống gà Móng có nguồn gốc ở xã Tiên Phong, huyện Duy Tiên, tỉnh

Hà Nam Giống gà này ñã ñược ñưa vào sách ðỏ của Việt Nam

ðặc ñiểm của phẩm giống:

+) Gà Móng con mới nở có lông màu trắng giống ngà voi Gà trưởng thành chân rất to, chiều cao của chân ở mức trung bình, kẽ chân gà có các ñường viền ñỏ, tiếng gáy thì trầm

+) Khối lượng gà mái trưởng thành từ 2,5 - 3kg, gà trống từ 4 - 5kg +) Năng suất: gà Móng bắt ñầu ñẻ khi ñược khoảng 180 ngày tuổi Một lứa gà mái ñẻ từ 10 ñến 15 quả trứng, một năm gà ñẻ từ 5 ñến 6 lứa, tỉ lệ ấp

+) Khối lượng gà mới nở khoảng 30 gam/con Lúc trưởng thành, con trống nặng 2,7kg/con, con mái nặng 1,2 kg/con

+) Năng suất: gà bắt ñầu ñẻ lúc 130 ngày tuổi Nếu ñể gà ñẻ rồi tự ấp ñẻ 10-15 quả/lứa, có thể ñẻ 4-5 lứa/năm Khối lượng trứng 42-45 gam/quả, màu nâu nhạt

3 ðỐI TƯỢNG, ðỊA ðIỂM, NỘI DUNG PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 ðối tượng nghiên cứu

Exon 14 gen Mx ở một số giống gà bản ñịa của Việt Nam

3.2 ðịa ñiểm, thời gian thực hiện

Nghiên cứu ñược tiến hành tại (1) Bộ môn Bệnh lý Thú y và (2) Phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học, Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội

ðề tài ñược thực hiện từ tháng 7/2010 ñến tháng 6/2011

o Sinh phẩm, hóa chất dùng cho phản ứng PCR:

- DreamTaq™ DNA Polymerase (#EP0701, Fermentas): 10X PCR buffer, 20mM MgCl2, 0,2mM mỗi loại dNTP, 1,25U Taq

- Mồi ñặc nhân ñặc hiệu exon 14 gen Mx (bảng 3.1)

o Hóa chất dùng cho chạy ñiện di:

- Agarose; 1X TBE, 6X loading dye, DNA marker

o Bộ kít dùng tinh sạch sản phẩm PCR:

- GeneJET™ PCR Purification Kit (#K0701, Fermentas)

o Bộ kít dòng hóa sản phẩm PCR:

- CloneJET™ PCR Cloning Kit (#K1231, Fermentas)

- Tế bào E.coli khả biến (competent cell)

- SOC medium

- LB agar

- Ampicillin

o Bộ kít tách chiết plasmid vi khuẩn:

- GeneJETTM Plasmid Miniprep kit (#K0503, Fermentas)

- Buồng cấy vô trùng

- Micro pipette, ñầu típ (Rnase, Dnase free)

- Eppendorf 1,5ml (Rnase, Dnase free)

- Ống PCR 0,25