Nghiên cứu đánh giá đặc tính nông sinh học của một số dòng hoa đồng tiền (gerbera jamesonii) đột biến tạo được trong nuôi cấy in vitro và in vivo

luận văn thạc sĩ, tiến sĩ, cao học, luận văn

Bộ giáo dục và đào tạo Trường đại học nông nghiệp hà nội

- & -

Nguyễn tuấn phong

Nghiên cứu đánh giá đặc tính nông sinh học của một

số dòng hoa đồng tiền (Gerbera jamesonii) đột biến tạo được trong nuôi cấy in vitro và in vivo

Luận văn thạc sĩ NÔNG NGHIệP

Chuyên ngành: TRồNG TRọT Mã số : 60.62.01

Người hướng dẫn khoa học : gs.ts nguyễn quang thạch

Hà nội - 2008

Lời cam đoan

Tôi xin cam đoan rằng số liệu kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa sử dụng để bảo vệ trong một học vị nào

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ trong luận văn này đã được cảm

ơn, mọi thông tin trích trong luận văn đều đã được chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, tháng 09 năm 2008

Tác giả

Nguyễn Tuấn Phong

Lời cảm ơn

Đến nay Luận văn của tôi đã hoàn thành, kết quả này là nhờ công lao dạy bảo, đào tạo và động viên của các Thầy, Cô giáo trong thời gian tôi học tập và nghiên cứu tại trường Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến các Thầy giáo, Cô giáo khoa Nông học, khoa Sau Đại học, trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội đã giúp đỡ tôi thực hiện luận văn này

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn, sự kính trọng sâu sắc nhất tới Thầy giáo - GS.TS Nguyễn Quang Thạch, người đã tận tình chỉ bảo, trực tiếp hướng dẫn giúp đỡ tôi thực hiện luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ công nhân viên Viện Sinh học Nông nghiệp, trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi trong quá trình thực hiện luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn các bạn bè đồng nghiệp đã động viên giúp

đỡ tôi hoàn thành khoá học!

Hà Nội, tháng 09 năm 2008

Tác giả

Nguyễn Tuấn Phong

2.1.1 Nguồn gốc, phân bố, vị trí phân loại cây hoa Đồng Tiền 3 2.1.2 Đặc điểm thực vật học và yêu cầu sinh thái cây hoa Đồng Tiền 3 2.1.3 Giá trị sử dụng và hiệu quả kinh tế của cây hoa Đồng Tiền 5 2.1.4 Các phương pháp nhân giống hoa Đồng Tiền 6 2.1.5 Tình hình sản xuất, tiêu thụ hoa trên thế giới và Việt Nam 8 2.1.6 Một số nghiên cứu hoa Đồng Tiền trên thế giới và Việt Nam 10 2.2 Chọn lọc đột biến và ứng dụng của đột biến trong công tác chọn tạo

2.2.2 Các tác nhân gây đột biến 13

2.2.3 Cơ sở khoa học của tạo giống cây trồng đột biến in vitro 20 2.3 Các nghiên cứu về chọn tạo giống cây trồng bằng con đường gây đột

2.4 Nuôi cấy mô tế bào và ứng dụng của nuôi cấy mô tế bào trong công

2.4.1 Cơ sở khoa học của công nghệ nuôi cấy mô tế bào 30 2.4.2 Các yếu tố gây biến dị trong quá trình nuôi cấy mô 31 2.4.3 Một số ứng dụng của nuôi cấy mô tế bào trong công tác chọn tạo

3.1 Đối tượng, vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu nghiên cứu 35

4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ ĐỀ NGHỊ 42 4.1 Thí nghiệm 1 Đánh giá khả năng duy trì các dạng đột biến trong nuôi

4.3 Thí nghiệm 3 Nghiên cứu và đánh giá khả năng sinh trưởng của các

dạng cây Đồng Tiền đột biến đã tạo ra ngoài vườn ươm 59 4.4 Thí nghiệm 4 Nghiên cứu tình hình sinh trưởng, phát triển, ra hoa của

các dạng đột biến đã tạo ra ngoài vườn sản xuất 64 4.5 Thí nghiệm 5 Nghiên cứu khả năng duy trì dòng đột biến qua nhân

BẢNG KÝ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ADN : Acid deoxy ribo nucleic ATP : Adenosine triphosphate BAP : 6-Benzylaminopurine

CV : Correlation of Variants

D : Đỏ DMSO : Dimethyl sulphoxide EMS : Ethyl methane sulphonate

Ki : Kinetin (6-Furfurylaminopurine) LSD : Least Significant Difference

MS : Murashige & Skoog, 1962 RAPD : Random Amplified Polymorphism DNA

T : Trắng α-NAA : α-Naphtalenacetic acid

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1 Khả năng duy trì của các dạng cây Đồng Tiền thu được sau các lần

Bảng 2 Khả năng duy trì của các dạng cây Đồng Tiền thu được sau các lần

Bảng 3 Khả năng duy trì của các dạng cây Đồng Tiền thu được sau các lần

Bảng 4 Khả năng sinh trưởng và nhân nhanh của các dạng chồi Đồng Tiền

Bảng 5 Khả năng sinh trưởng và nhân nhanh của các dạng chồi Đồng Tiền

Bảng 6 Khả năng sinh trưởng và nhân nhanh của các dạng chồi Đồng Tiền

Bảng 7 Khả năng ra rễ của các dạng đột biến (giống T) 55Bảng 8 Khả năng ra rễ của các dạng đột biến (giống D) 56Bảng 9 Khả năng ra rễ của các dạng đột biến(giống G) 57Bảng 10 Kết quả khảo sát sự sinh trưởng của các dạng cây đột biến ngoài

Bảng 11 Kết quả khảo sát sự sinh trưởng của các dạng cây đột biến ngoài

Bảng 12 Kết quả khảo sát sự sinh trưởng của các dạng cây đột biến ngoài

Bảng 13 Kết quả khảo sát sự sinh trưởng của các dạng cây Đồng Tiền đột

biến sau trồng 2 tháng ngoài vườn sản xuất (giống T) 66Bảng 14 Kết quả khảo sát sự sinh trưởng của các dạng cây Đồng Tiền đột

biến sau trồng 2 tháng ngoài vườn sản xuất (giống D) 67

Bảng 15 Kết quả khảo sát sự sinh trưởng của các dạng cây Đồng Tiền đột

biến sau trồng 2 tháng ngoài vườn sản xuất (giống G) 68Bảng 16 Đánh giá sự duy trì khả năng sinh trưởng phát triển của các dạng

cây Đồng Tiền sau tách nhánh và trồng trở lại được 2 tháng 71Bảng 17 Đánh giá sự duy trì một số chỉ tiêu về chất lượng cành hoa Đồng

Bảng 18 Đánh giá sự duy trì một số chỉ tiêu về chất lượng cành hoa Đồng

Bảng 19 Đánh giá sự duy trì một số chỉ tiêu về chất lượng cành hoa Đồng

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 1: Tỉ lệ đóng góp của bức xạ trong việc tạo giống mới 15Biểu đồ 2: Số lượng cây trồng được tạo ra nhờ gây đột biến trên thế giới 22Biểu đồ 3: Khả năng duy trì của các dạng cây Đồng Tiền thu được qua các

Biểu đồ 4: Khả năng duy trì của các dạng cây Đồng Tiền thu được qua các

Biểu đồ 5: Khả năng duy trì của các dạng cây Đồng Tiền thu được qua các

Biểu đồ 6: Khả năng sinh trưởng và nhân nhanh của các dạng chồi Đồng

Biểu đồ 7: Khả năng sinh trưởng và nhân nhanh của các dạng chồi Đồng

Biểu đồ 8: Khả năng sinh trưởng và nhân nhanh của các dạng chồi Đồng

Biểu đồ 9: Khả năng ra rễ của các dạng đột biến (giống T) 56Biểu đồ 10: Khả năng ra rễ của các dạng đột biến (giống D) 57Biểu đồ 11: Khả năng ra rễ của các dạng đột biến (giống G) 58Biểu đồ 12: Kết quả khảo sát sự sinh trưởng của các dạng cây đột biến ngoài

Biểu đồ 13: Kết quả khảo sát sự sinh trưởng của các dạng cây đột biến ngoài

Biểu đồ 14: Kết quả khảo sát sự sinh trưởng của các dạng cây đột biến ngoài

Biểu đồ 15: Động thái tăng trưởng cây hoa Đồng Tiền ngoài ruộng sản xuất

Biểu đồ 16: Động thái tăng trưởng cây hoa Đồng Tiền ngoài ruộng sản xuất

Biểu đồ 17: Động thái tăng trưởng cây hoa Đồng Tiền ngoài ruộng sản xuất

Biểu đồ 18: Sự sinh trưởng các dạng cây Đồng Tiền đột biến sau trồng 2

Biểu đồ 19: Sự sinh trưởng các dạng cây Đồng Tiền đột biến sau trồng 2

Biểu đồ 20: Sự sinh trưởng các dạng cây Đồng Tiền đột biến sau trồng 2

DANH MỤC ẢNH

Ảnh 2: Các dòng đột biến so với đối chứng của 3 giống hoa: trắng, đỏ, gạch 43

Ảnh 4 Khảo sát khả năng ra rễ của các dòng đột biến in vitro giống T 54Ảnh 5 Khảo sát khả năng ra rễ của các dòng đột biến in vitro giống D 54Ảnh 6 Khảo sát khả năng ra rễ của các dòng đột biến in vitro giống G 55Ảnh 7 Cây Đồng Tiền ngoài vườn ươm (ra cây đợt 1) 63Ảnh 8 Cây Đồng Tiền ngoài vườn sản xuất (sau trồng 45 ngày) 69Ảnh 9 Khảo sát sự duy trì của các dạng hoa trước, sau khi tách nhánh và

Ảnh 10 Khảo sát sự duy trì của các dạng hoa trước, sau khi tách nhánh và

Ảnh 11 Khảo sát sự duy trì của các dạng hoa trước, sau khi tách nhánh và

Ảnh 12 Cây Đồng Tiền tách nhánh ngoài vườn sản xuất (sau trồng 2 tháng) 76

1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Hiện nay trên thị trường có rất nhiều loại hoa được ưa chuộng, trong đó hoa Đồng Tiền kép nổi lên là một loài hoa đẹp, được nhiều người tiêu dùng

lựa chọn Hoa Đồng Tiền kép(Gebera jamesonii) là cây thân thảo, nhị bội

biệt thích hợp với khí hậu nhiệt đới gió mùa Việt Nam

Ngày nay, ở Việt Nam chủng loại và màu sắc các loài nói chung, cũng như hoa Đồng Tiền nói riêng ngày càng phong phú và đa dạng Tuy nhiên hầu hết các giống hoa Đồng Tiền kép đẹp, quý ở nước ta lại chủ yếu được nhập nội từ Hà Lan, Đài Loan, Trung Quốc…cây lại không rõ nguồn gốc, thiếu chủ động, đây chính là nguyên nhân khiến giá của một số loại hoa Đồng Tiền còn khá cao, chưa đáp ứng được nhu cầu thưởng thức của người dân Vì vậy trong những năm gần đây, công tác chọn tạo giống hoa Đồng Tiền ở Việt Nam đã bắt đầu được quan tâm nghiên cứu

Từ lâu, công tác chọn tạo giống cây trồng đã được các nhà khoa học quan tâm, nghiên cứu nhằm tìm ra được các giống cây cho năng suất phẩm chất như mong muốn Hiện tại trong các phương pháp chọn tạo giống được

sử dụng phổ biến như: Phương pháp truyền thống là lai tạo; chọn tạo giống

ưu thế lai; chọn tạo giống đột biến và đa bội thể; chuyển gen hay kỹ thuật

di truyền…thì việc chọn tạo giống đột biến bởi các tác nhân hoá học hoặc

vật lý trong nuôi cấy in vitro có nhiều ưu điểm và khá thuận lợi với cây Đồng Tiền kép bởi khả năng gây tạo đột biến và đa bội in vitro là phương

pháp dễ ứng dụng trong điều kiện phòng thí nghiệm Các dòng biến dị tạo được có thể tiếp tục nhân nhanh cung cấp số lượng lớn cá thể phục vụ cho khảo sát và chọn lọc

Tại Viện Sinh học Nông nghiệp đã tiến hành nghiên cứu đề tài gây đột biến giống hoa Đồng Tiền bằng phương pháp chiếu xạ và đã xác định được hàm lượng chiếu xạ có hiệu quả, phân loại thành các dạng đột biến khác nhau Tuy nhiên, việc duy trì các dạng đột biến này trong nuôi cấy mô cũng như sự sinh trưởng và phát triển của chúng ngoài đồng ruộng cần làm rõ hơn nhằm lựa chọn được những vật liệu khởi đầu có ý nghĩa trong việc chọn tạo giống Qua đó, chúng tôi đã được giao thực hiện đề tài:

“Nghiên cứu đánh giá đặc tính nông sinh học của một số dòng hoa Đồng Tiền (Gerbera jamesonii) đột biến tạo được trong nuôi cấy in vitro và

1.2.2 Yêu cầu

- Đánh giá khả năng duy trì, sự sinh trưởng, ra hoa của các dòng đột

biến trong nuôi cấy in vitro và đem trồng trọt trên đồng ruộng

- Đánh giá khả năng duy trì của nguồn vật liệu đã khẳng định trên đồng

ruộng thông qua nhân nhanh in vivo

1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Một số nét về cây hoa Đồng Tiền

2.1.1 Nguồn gốc, phân bố, vị trí phân loại cây hoa Đồng Tiền

2.1.1.2 Phân loại thực vật

Trong hệ thống phân loại thực vật, cây hoa Đồng Tiền được xếp vào

nhóm hai lá mầm (Dicotyleon), thuộc phân lớp Cúc (Asteridae), bộ Cúc (Asterales), họ Cúc (Asteraceae) và có tên khoa học là Gerbera jamesonii [9]

2.1.2 Đặc điểm thực vật học và yêu cầu sinh thái cây hoa Đồng Tiền

2.1.2.1 Đặc điểm thực vật học

Cây Đồng Tiền là cây thân thảo, không phân cành mà chỉ đẻ nhánh, thân cây thấp, nhiều lá, trên thân và lá có nhiều lông Lá nhị có bản rộng xẻ thuỳ, mọc sát gốc

Rễ Đồng Tiền thuộc dạng rễ chùm, phát triển khoẻ ăn ngang và nổi gần lớp đất mặt

Quả Đồng Tiền thuộc loại quả bé có lông, không có nội nhũ, hạt rất nhỏ, trung bình có 280 - 300 hạt/ 1 gam hạt [15]

Hoa Đồng Tiền có khoảng 40 loài, thuộc loại hoa lưu niên, ra hoa quanh năm, gồm hai loại: Đồng Tiền đơn và Đồng Tiền kép

- Đồng Tiền kép: Hoa có nhiều tầng cánh xếp xít vào nhau tạo thành nhiều vòng Điển hình là các loại kép đỏ, kép trắng, kép vàng…

- Đồng Tiền đơn: Hoa chỉ có một hoặc hai tầng cánh xếp xen kẽ, mỏng

và yếu hơn so với hoa Đồng Tiền kép Điển hình là các loại đơn trắng, đơn

đỏ, đơn hồng…[6]

2.1.2.2 Yêu cầu về sinh thái

Yêu cầu về ngoại cảnh của các loài hoa rất đa dạng và khác nhau, nhưng tập trung ở một số yếu tố sau: Nhiệt độ, ánh sáng, ẩm độ, dinh dưỡng

Đối với cây hoa Đồng Tiền vốn là giống nhập nội nên cũng có những điều kiện sống riêng trong những giai đoạn phát triển của cây

- Nhiệt độ: Thích hợp cho cây sinh trưởng phát triển là 15 - 250C, cũng có giống chịu được ở nhiệt độ 30 - 430C Nếu nhiệt độ < 120C hoặc >

350C thì năng suất hoặc phẩm chất giảm

- Ánh sáng: Hoa Đồng Tiền là cây ưa ánh sáng tán xạ, không thích hợp

cường độ chiếu sáng mạnh Vì vậy trồng Đồng Tiền phải có lưới phản quang

- Nước và ẩm độ: Ẩm độ thích hợp sẽ giúp cây sinh trưởng phát triển

tốt, ít sâu bệnh và chất lượng hoa cao Độ ẩm đất thích hợp từ 60 - 70%, độ

ẩm không khí từ 55 - 60% là thuận lợi cho cây phát triển Trong quá trình sinh trưởng và phát triển phải cung cấp đủ lượng nước cho cây hoa bằng các biện pháp khác nhau

- Dinh dưỡng: Yếu tố dinh dưỡng là yếu tố quyết định năng suất, chất

lượng hoa Cần cung cấp dinh dưỡng đầy đủ cân đối Các loại phân chủ yếu trong trong thâm canh hoa là: Phân tổng hợp NPK, phân hữu cơ (phân chuồng, phân xanh, phân bắc), phân vi lượng (Cu, Fe, Zn, Mo, Ca), vitamin

Đối với cây hoa Đồng Tiền [27]:

+ Đồng Tiền cần nhiều đạm vào giai đoạn sinh trưởng sinh dưỡng Lượng đạm nguyên chất sử dụng cho một ha Đồng Tiền là 120-140 kg/ năm

+ Kali cần cho Đồng Tiền vào giai đoạn kết nụ và nở hoa Lượng Kali nguyên chất cần cho một ha Đồng Tiền là 120-140 kg /năm

+ Đồng Tiền cần đất tơi xốp, thoáng khí nên yêu cầu lượng phân hữu

cơ cao để tạo mùn Cần bón khoảng 1500 kg/sào/năm

2.1.3 Giá trị sử dụng và hiệu quả kinh tế của cây hoa Đồng Tiền

Hoa Đồng Tiền có màu sắc tươi sáng, phong phú, từ đỏ cam, vàng, trắng… Trên một bông hoa có thể có một màu nhị hoặc màu xen kẽ Bông hoa to cánh cứng, lý tưởng để làm hoa bó, lẵng hoa và cắm hoa nghệ thuật rất được ưa thích Ngoài ra hoa Đồng Tiền có thể dùng trồng trong chậu để chơi trong thời gian dài

Đồng Tiền là loại có sản lượng kinh tế cao, trong điều kiện thích hợp cây có thể ra hoa quanh năm, tỉ lệ cành cắt và tỉ lệ hoa thương phẩm có chất lưọng tốt đều cao Thêm vào đó việc chăm sóc cây hoa nhị đơn giản, ít tốn công, đầu tư một lần có thể cho thu hoạch từ 3-4 năm, hình dáng hoa cân đối hài hoà, giá trị thẩm mỹ cao, tươi lâu và là một trong 10 loại hoa tiêu thụ nhiều nhất thế giới Các nước có sản lượng hoa lớn là: Hà Lan, Colombia, Pháp, Trung Quốc

Ở Việt Nam, trong công cuộc chuyển đổi cơ cấu cây trồng theo hướng cho giá trị cao nhất trên đơn vị diện tích, thì ngành thương mại hoa đang trở thành lĩnh vực có giá trị kinh tế cao, được nhiều địa phương quan tâm chú

trọng phát triển Trong đó hoa Đồng Tiền nổi lên là một trong những loài hoa cho giá trị kinh tế cao nhất Trồng một sào Đồng Tiền giống mới có thể cho thu nhập khoảng 50 triệu đồng/sào [13]

2.1.4 Các phương pháp nhân giống hoa Đồng Tiền

2.1.4.1 Phương pháp nhân giống bằng hạt

Nhân giống bằng hạt là phương pháp nhân giống hữu tính, hạt là sản phẩm của sự kết hợp giữa giao tử đực và giao tử cái, chính vì vậy nếu ta muốn có cây có giống to, khoẻ, sinh trưởng phát triển tốt cần phải chọn giống

bố mẹ sinh trưởng tốt năng suất cao và ổn định, phẩm chất hoa tốt, màu sắc hoa đẹp, tính chống chịu tốt Từ những giống tốt dó, chọn những cây điển hình mang đầy đủ đặc điểm của giống muốn nhận, sau đó cần chú ý chăm sóc chu đáo giống đã chọn, khi hạt chín nên chọn những hạt to mẩy, cân đối, không có vết sâu bệnh rồi gieo hạt ra ngoài vườn ươm, trong bầu, trong hay hay bảo quản trong túi chống ẩm để mơi thoáng mát tránh ánh sáng mặt trời chiếu trực tiếp vào cho tới lúc đem gieo, khi đã mở túi hạt thì nên gieo ngay

cả số hạt đó vì chúnh mất khả năng nảy mầm rất nhanh trong điều kiện bình thường Nhưng nếu hạt chưa dùng có thể gói lại vào túi và để trong tủ lạnh trong thời gian ngắn

2.1.4.2 Nhân giống bằng phương pháp tách chồi

Đây là phương pháp nhân giống vô tính tự nhiên, lợi dụng khả năng tự phân chia của các cơ quan dinh dưỡng thành các cơ quan mới, có thể tạo thành một cá thể mới, có khả năng sống độc lập và mang đặc điểm di truyền giống cây mẹ

Từ trước đến nay phương pháp này là tốt nhất và được các nhà trồng hoa Đồng Tiền ưa sử dụng Các nhóm cây mẹ trồng từ 1 - 2 năm được đào lên, cắt bỏ 2/3 lá và rễ, sau đó nhập lại từ 3 - 4 thân thành một khóm rồi đem trồng với mật độ 20 x 30 cm, sau 30 - 40 ngày sẽ cho ra hoa

Phương pháp này có ưu điểm là nhanh ra hoa nhưng khả năng đồng đều kém, thường hay mang mầm mống sâu bệnh, yêu cầu điều kiện chăm sóc nghiêm ngặt sau khi tách cây

2.1.4.3 Nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào

Nuôi cấy mô tế bào thực vật là phương pháp nuôi các mô tế bào thực vật trên môi trường dinh dưỡng thích hợp để các tế bào nhân lên thành khối tế bào soma, sau đó các tế bào phân hoá thành chồi sau một loạt các quá trình nhân chồi, ra rễ tạo thành cây hoàn chỉnh Nuôi cấy mô tế bào là việc tạo điều kiện để các tế bào phát huy tính toàn năng của tế bào thực vật

Tính toàn năng của tế bào

Haberlandt (1902) lần đầu tiên đã quan niệm rằng mỗi tế bào bất kì của một cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một

cơ thể hoàn chỉnh Theo quan niệm của sinh học hiện đại thì mỗi tế bào riêng

rẽ đã phân hoá đều mang đầy đủ lượng thông tin di truyền của cả cơ thể sinh vật đó Khi gặp điều kiện thích hợp mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một

2.1.5 Tình hình sản xuất, tiêu thụ hoa trên thế giới và Việt Nam

Cùng với sự phát triển không ngừng của khoa học kỹ thuật và kinh tế xã hội, ngày càng có nhiều giống hoa mới được lai tạo và hoa trở thành nhu cầu không thể thiếu trong đời sống hằng ngày của con người Cũng vì thế, ngành sản xuất hoa ngày càng phát triển đã và đang mang lại những lợi ích to lớn về lĩnh vực kinh tế cho nhiều quốc gia trên thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng

2.1.5.1 Tình hình sản xuất, tiêu thụ hoa trên thế giới

Hiện nay trên thế giới sản xuất hoa cây cảnh là ngành thương mại mang lại hiệu quả kinh tế cao Bên cạnh những nước có truyền thống sản xuất, xuất khẩu hoa lâu đời như: Hà Lan, Pháp, Mỹ… Một loạt các nước như: Thái Lan, Trung Quốc, Đài Loan…đang dần nổi lên là những cường quốc sản xuất hoa Các sản phẩm hoa thương mại bao gồm: Hoa cắt, hoa trồng chậu, hoa trồng thảm, cây lá màu… Tuy nhiên, buôn bán trên thị trường thế giới chủ yếu bao gồm hai loại: Hoa cắt và hoa trồng chậu

Những năm gần đây, nhu cầu hoa trên thế giới tăng từ 6 - 9%/năm Năm 1995, tổng giá trị hoa cắt tiêu thụ trên thị trường thế giới là 31 tỉ USD và dự đoán trong những năm tới nhu cầu tiêu thụ sẽ tăng lên tới 35 tỉ USD, gồm chủ yếu là hoa Đồng Tiền, hoa Hồng, hoa Cẩm Chướng…

Các thị trường lớn bao gồm: Tây Âu, Bắc Mỹ và Nhật Bản, trong đó thị trường Nhật Bản tăng mạnh nhất, thị trường Tây Âu được coi là già cỗi và đã bão hoà, thị trường các nước châu Á tăng do thu nhập của người dân ngày càng tăng

Giá trị nhập khẩu hoa, cây cảnh trên thế giới tăng hằng năm Năm 1982

là 2,5 tỉ USD; năm 1996 là 7,5 tỉ USD Giá trị nhập khẩu tăng từ 1,2 tỉ USD năm 1982 lên 3,6 tỉ USD năm 1996 Trong đó Hà Lan, Colombia, Ecuador là những nước xuất khẩu lớn nhất [10]

Châu Á là khu vực thuận lợi cho nghề trồng hoa phát triển, với khí hậu

đa dạng, chi phí lao động thấp, đất đai màu mỡ dồi dào Mặt khác, ở đây nghề trồng hoa đã có từ lâu đời, mặc dù trồng hoa thương mại mới chỉ phát triển từ những năm 80 của thế kỷ XX Diện tích trồng hoa ở Châu Á - Thái Bình Dương khoảng 134.000 ha, chiếm gần 60% diện tích trồng hoa trên thế giới Tuy nhiên thị trường hoa ở các nước đang phát triển chỉ chiếm khoảng 20% thị trường hoa trên thế giới mà nguyên nhân chủ yếu là thiếu trang thiết bị kỹ thuật Những nước xuất khẩu nhiều hoa nhất là: Thái Lan, Malaysia, Philippin – 3 nước sản xuất hoa chính trong vùng [8]

Sản xuất hoa đang tăng ở các nước phát triển, sản phẩm xuất khẩu chủ yếu là bonsai và hoa trồng chậu đang gia tăng [30]

2.1.5.2 Tình hình sản xuất, tiêu thụ hoa ở Việt Nam

Hiện tại, so với diện tích tự nhiên sẵn có (33 triệu ha) thì diện tích trồng hoa ở nước ta còn quá nhỏ (khoảng 2000 ha), tập trung chủ yếu ở các vùng truyền thống như: Tây Tựu, Ngọc Hà, Mê Linh, Sa Pa, Đà Lạt Từ những năm

90 trở lại đây trên cả nước đã có nhiều vùng trồng hoa mới làm cho diện tích đất trồng hoa tăng lên đáng kể với việc chú trọng sản xuất các loại hoa được

ưa chuộng, mang lại giá trị kinh tế cao như: Ly ly, Đồng Tiền, hoa Hồng… Trước đây, kỹ thuật trồng hoa cây cảnh tại Việt Nam chủ yếu dựa vào kinh nghiệm truyền thống với các giống hoa cũ nên sản lượng và chất lượng hoa còn thấp Những năm gần đây cùng với việc nhập khẩu nhiều giống hoa cắt, hoa trồng chậu khác nhau từ Trung Quốc, Thái Lan đã góp phần làm phong phú tập đoàn hoa giống Thêm vào đó, là sự phát triển vũ bão của khoa học - kỹ thuật đã thúc đẩy công tác chọn giống và nhân giống bằng các

phương pháp tiến bộ như: Nhân giống in vitro, công nghệ chuyển gen, chọn

tạo dòng tế bào thực vật… nhằm tạo ra cây khoẻ, sạch bệnh, Hệ số nhân cao,

làm tăng chất lượng và sản lượng hoa Tổng giá trị sản lượng hoa cắt trên toàn quốc đạt khoảng 700 - 1000 tỉ VNĐ [10]

2.1.6 Một số nghiên cứu hoa Đồng Tiền trên thế giới và Việt Nam

* M.Osiecki (1962) nghiên cứu phương pháp nuôi cấy mô hoa Đồng Tiền sau đó nuôi trồng trong nhà kính Tác giả đã tìm ra được hàm lượng các

chất điều tiết tối ưu cho nuôi cấy mô cây hoa Đồng Tiền in vitro [25]

U.Soczek, M.Hempel (1972) đã nghiên cứu ảnh hưởng của các hợp chất

hữu cơ trong nuôi cấy hoa Đông Tiền in vitro, tác giả đã đưa ra kết luận về vai

trò của các chất điều tiết sinh trưởng là: BA, Kinetine, α NAA [26]

A.lisiecka (1990) nghiên cứu ảnh hưởng về sự sinh trưởng đến các phương pháp nhân giống và sản lượng hoa Đồng Tiền Tác giả đưa ra kết luận: Giai đoạn tốt nhất cho quá trình nhân giống là giai đoạn sau trồng 2,5 tháng khi cây có từ 4 - 5 nhánh Để thu được sản lượng hoa cao nhất cần cung cấp đầy đủ dinh dưỡng, nước và nhiệt độ thích hợp cho cây hoa [26]

Van Der Gaag DJ; Kerssies A; Lanser C người Pháp (2001) đã nghiên cứu phương pháp sự lan rộng của bệnh mốc sương ở rễ cây hoa Đồng Tiền bằng xử lý đất trước khi trồng và hàm lượng dinh dưỡng trong đất Họ trồng cây nhiễm bệnh vào đất đã được xử lý, kết quả hơn 80% số cây trồng vào đất trên thì bệnh mốc sương không lan rộng nữa [27]

Maurer (1968) đã thực hiện nghiên cứu lai giống hoa Đồng Tiền Kết quả ông đã công bố hai giống hoa Đồng Tiền mới được tạo ra bằng phương pháp lai giống [27]

Adnet (1909) đã tiến hành trồng, lai giống giữa giống Đồng Tiền màu

đỏ và giống Đồng Tiền màu hồng nhạt, kết quả ông đã thu được hai giống màu mới là đỏ nhạt và hồng da cam [27]

* Tại Việt Nam cây Đồng Tiền đã được trồng từ rất lâu, song chủ yếu

là những giống hoa Đồng Tiền đơn cho nên việc nghiên cứu về giống hoa này

còn hạn chế Từ những năm 1990 trở lại đây, với sự xuất hiện của nhiều giống hoa Đồng Tiền kép mới nhập nội đã làm thay đổi cơ cấu trồng Đồng Tiền ở nhiều vùng trồng hoa và nhận được nhiều sự quan tâm của các nhà khoa học trong nước

Hàng loạt các giống hoa Đồng Tiền kép đã được nghiên cứu thành công và đưa vào sản xuất bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào nhằm đáp ứng nhu cầu cây giống có chất lượng cao:

Từ năm 1996, Nguyễn Quang Thạch, Mai Kim Tân, Đinh Trường Sơn (Viện Sinh học Nông nghiệp - Đại học Nông nghiệp Hà Nội) đã nghiên cứu

phương pháp nuôi cấy mô in vitro giống hoa Đồng Tiền từ Tiệp Khắc, kết quả

nghiên cứu trên đã hoàn thành quy trình nhân giống hoa Đồng Tiền bằng kỹ thuật nuôi cấy mô được Bộ Nông nghiệp & Phát triển Nông thôn công nhận là tiến bộ kỹ thuật cho áp dụng rộng rãi ngoài sản xuất

Hiện nay Viện Sinh học Nông nghiệp đang tiếp tục nghiên cứu nhân các dòng hoa Đồng Tiền mới bằng phương pháp khí canh, thuỷ canh Bên cạnh đó bước đầu nghiên cứu tạo giống hoa Đồng Tiền mới bằng phương pháp gây đột biến bằng hoá chất (Colchicine), chiếu xạ (tia Gamma)

Công ty Hafarm (Đà Lạt - Lâm Đồng) đã ứng dụng công nghệ trồng hoa Đồng Tiền trong nhà lưới thu được hiệu quả rất cao, sản lượng gấp 10 -

15 lần so với trồng hoa thông thường

Viện Nghiên cứu Rau quả từ năm 1999 - 2002 cũng đã nghiên cứu quy trình trồng trọt để sản xuất hoa Đồng Tiền, cho nở hoa Đồng Tiền đúng vụ

Từ đầu năm 2006 đến nay anh Trần Phạm Anh Tuấn - một nông dân ở

Đà Lạt đã tạo ra được một số giống hoa Đồng Tiền mới từ nguồn gen của các giống hoa Đồng Tiền lâu năm tại Đà Lạt, và các giống mới nhập nội từ Hà Lan, Nhật Bản… bằng phương pháp nhân giống vô tính nuôi cấy mô tế bào

và lai giống

2.2 Chọn lọc đột biến và ứng dụng của đột biến trong công tác chọn tạo

giống cây trồng in vitro

2.2.1 Khái niệm và phân loại đột biến

2.2.1.1 Khái niệm

Đột biến là những biến đổi về vật chất di truyền, xảy ra ở cấp độ phân

tử (ADN) hoặc cấp độ tế bào (NST) [4]

2.2.1.2 Phân loại đột biến

Phân loại đột biến có thể chia làm hai loại: Đột biến tự nhiên và đột biến nhân tạo

Những đột biến xuất hiện do các điều kiện tự nhiên của môi trường tác động gọi là đột biến tự nhiên, còn những đột biến xuất hiện do con người chủ động xử lý bằng các tác nhân vật lý, hoá học tạo nên gọi là đột biến nhân tạo Hầu hết những biến đổi di truyền có lợi ở thực vật xảy ra bởi điều kiện tự nhiên đều được sử dụng trong các chương trình chọn giống cây trồng, cây dại và các nguồn gen Thông qua lai tạo, các gen được tái tổ hợp thành các tổ hợp gen mới triển vọng Đột biến tự nhiên xảy ra với tần xuất thấp hơn 1000 lần so với đột biến nhân tạo bằng phóng xạ và hầu hết là các đột biến lặn và có hại Bằng

kỹ thuật gây đột biến nhân tạo, các nhà khoa học đã tạo và làm tăng các đột biến

có giá trị kinh tế từ các loài thực vật nói chung cũng như ở cây trồng nói riêng Mặc dù còn có nhiều hạn chế, song đột biến nhân tạo đã và đang có những đóng góp rất có ý nghĩa trong công tác chọn giống cây trồng

Bên cạnh đó, ngày nay còn có nhiều nguyên tắc phân loại đột biến như: Phân loại đột biến dựa theo dạng hình, phân loại đột biến theo giá trị thích ứng hoặc theo đặc tính thay đổi của dạng gen [17] Tuy nhiên, nguyên tắc phân loại chủ yếu là phương pháp phân loại đột biến theo đặc tính thay đổi của gen Theo phương pháp này đột biến gồm có hai loại: Đột biến gen và đột biến nhiễm sắc thể

Đột biến gen còn gọi là đột biến điểm, là những biến đổi trong cấu trúc ADN Đột biến có thể xảy ra ở tất cả các loài sinh vật, trong tế bào riêng rẽ hay trên toàn bộ cơ thể, trong mọi thời kỳ sinh trưởng phát triển của cây trồng nhưng ở mức độ khác nhau

Đột biến nhiễm sắc thể là những biến đổi của nhiễm sắc thể, gây nên các hậu quả di truyền kiểu hình Khác với đột biến gen, đột biến nhiễm sắc thể là những biến đổi trong cấu trúc của từng nhiễm sắc thể hay toàn bộ nhiễm sắc thể

Đột biến có thể “sửa chữa” một số khuyết tật của các giống đang phát triển trong sản xuất, có khả năng tạo giống nhanh vì thế hệ sau dễ ổn định, ít phân ly tính trạng như ở các giống khác Bằng phương pháp gây đột biến đã tạo ra nguồn vật liệu khởi đầu rất phong phú Từ nguồn vật liệu này có thể lai tạo và chọn lọc các giống mới theo mục đích của nhà chọn giống [5]

2.2.2 Các tác nhân gây đột biến

Theo Rieger và cộng sự (1976 ), có hai loại tác nhân gây đột biến là tác nhân hoá học và tác nhân vật lý Ngoài ra, còn có một số tác nhân khác như:

- Gây đột biến thông qua công nghệ nuôi cấy in vitro (đột biến soma)

- Gây đột biến bằng các tác nhân sinh học như sử dụng các yếu tố chuyển nạp vật liệu di truyền

- Gây đột biến bằng cách phối hợp các yếu tố trên

Sử dụng phương pháp nào tuỳ thuộc vào đối tượng, kiểu sinh sản của cây trồng, tính đặc hiệu của loại tính trạng mong đợi tạo ra…

2.2.2.1 Tác nhân vật lý gây đột biến

Tác nhân vật lý bao gồm những dạng phóng xạ có khả năng ion hoá mạnh Các nghiên cứu đột biến phóng xạ được nghiên cứu từ những năm

1925 ở Ruồi giấm của Nuller và ở Ngô của Stadler Những năm gần đây, nhờ

những phát hiện mới trong vật lý nguyên tử đã mở rộng phạm vi nghiên cứu, tạo giống đột biến phóng xạ, bao gồm dạng phóng xạ hạt và phóng xạ điện từ

- Phóng xạ hạt là dòng chuyển động của các hạt cơ bản: Proton, điện tử, nơtron…

- Phóng xạ điện từ là các sóng điện từ: Tia Gama, tia X…

Các dạng phóng xạ thường được sử dụng để gây đột biến là tia X, hạt Nơtron và phổ biến là tia Gama với nguồn thường dùng là Co60 và Cs137

Có hai cách tác động của phóng xạ lên vật chất di truyền (ADN): Trực tiếp và gián tiếp

- Tác động trực tiếp: ADN chịu tác động trực tiếp của năng lượng bức xạ

- Tác động gián tiếp: Bức xạ tác động lên các phần tử không thuộc ADN làm các phần tử này có năng lượng cao gây tổn thương tới ADN

Hiệu quả chủ yếu của tia phóng xạ khi xử lý đột biến là: Làm đứt gãy mạch ADN dẫn đến đột biến nhiễm sắc thể; làm thay đổi cấu tạo hoá học bazơ nitơ dẫn đến biến đổi gen; tạo sự liên kết chéo giữa hai phân tử ADN gây chết tế bào

Thường những đột biến do phóng xạ gây lên là những đột biến tới hạn hay đột biến làm giảm sức sống Những đột biến này có thể là trội hay lặn, trong đó thì đột biến trội có thể phát hiện ngay từ thế hệ đầu tiên còn những đột biến lặn thì đến F1, F2 mới phát hiện được

Tuy nhiên trong quá trình chiếu xạ cũng gặp phải một số khó khăn nhất định có thể ảnh hưởng đến hiệu quả chiếu xạ như :

Các tác nhân môi trường

Các tác nhân sinh học

+ Số lượng nhiễm sắc thể ở kỳ trung gian

+ Các nhân tố di truyền và các nhân tố khác

- Đóng góp của bức xạ trong việc tạo giống mới trong nông nghiệp thế giới nói chung :

Biểu đồ 1: Tỉ lệ đóng góp của bức xạ trong việc tạo giống mới

* Cơ chế gây đột biến của tác nhân bức xạ

Theo lý thuyết của A.M.Kuzin, cơ chế của quá trình tương tác gây đột biến gồm 3 giai đoạn chính:

- Giai đoạn 1: Có tính chất vật lý, sự tương tác của các bức xạ tạo ra các quá trình ion hoá và sự biến đổi các hợp chất ở mức dưới phân tử và mức phân tử

- Giai đoạn 2: Có tính chất hoá học, ở giai đoạn này xảy ra các phản ứng tương tác của các sản phẩm sơ cấp do kết quả tương tác của bức xạ với các đại phân tử chưa bị biến tính cấu trúc sinh học, tạo ra peoxit hữu cơ, đồng

thời diễn ra các phản ứng oxy hoá dẫn tới sự tạo thành một số hợp chất mới

và các gốc độc tính

- Giai đoạn 3: Có tính chất sinh học, là giai đoạn phát huy tác dụng của các phản ứng lên hoạt động của các tế bào sống Điều này có nghĩa là: Các biến đổi hoá học gây lên do bức xạ dưới mức tế bào trở thành các biến đổi trong tổ chức của tế bào, chẳng hạn như làm thay đổi cấu trúc và tính thấm của màng tế bào

Những biến đổi này dẫn tới sự giải phóng một số enzyme và hoạt hoá tác động của các enzyme này Sự hoạt động của các enzyme mở đầu cho một chuỗi các phản ứng tổng hợp hợp chất quan trọng cho hoạt động và phân chia

tế bào như: Tổng hợp ATP, ADN và các protein cần thiết

Quá trình tác động qua nhiều giai đoạn như thế gọi là tác động gián tiếp của bức xạ lên tế bào sống Ngoài ra các nghiên cứu cho thấy, các tia bức xạ còn gây tác động trực tiếp lên một số cấu trúc dưới tế bào gây ảnh hưởng trực tiếp tới quá trình tổng hợp ADN và tổng hợp protit trong tế bào sống, đặc biệt

là các biến đổi trong cấu trúc ADN, làm phát sinh đột biến di truyền Tác dụng trực tiếp của bức xạ được giải thích khá thành công nhờ lý thuyết bắn bia của sinh học phóng xạ

Tính đến tháng 7/2006 (dữ liệu của FAO/IAEA mutant varieties database) có 2428 giống cây trồng được tạo ra bằng phương pháp gây đột biến, trong đó chiếu xạ chiếm 88,8%

Quá trình tạo ra đột biến là một quá trình phức tạp được chúng tôi minh hoạ qua sơ đồ sau:

Sơ đồ 1: Minh hoạ tỏc động trực tiếp của bức xạ [6]

Tác nhân

(n,h,γ)

- Các phản ứng hoá học của các gốc làm xuất hiện phản ứng dây truyền

- Sự dịch chuyển của các ion

Gây sai hỏng cấu trúc ở mức phân

tử và dưới phân tử

Sự biến đổi các cấu trúc lý hoá của

các cấu trúc sinh học (tính thấm, tính

hấp thụ, trật tự cấu trúc

Tổng hợp Protit

Các phản ứng trao đổi

Tạo thành các dạng độc tố

Tạo ra các đột biến

Sự photphorin

hoá các axit

Làm chậm phân

chia tế bào

Di chuyển năng lượng Thay đổi trạng thái điện tích, tính thấm

Những biến đổi suy yếu

2.2.2.2 Tác nhân hoá học

Phương pháp tạo giống đột biến hoá học được ứng dụng rộng rãi trong vài chục năm gần đây, và ở nhiều nước trên thế giới đã thu được kết quả rất tốt Một chất hoá học có hiệu quả gây đột biến lớn nhất phải đạt được 2 yếu

tố sau: Một là chất đó phải đột nhập được vào tế bào và giữ nguyên hoạt tính Hai là chất đó phải tác động vào cấu trúc hoá học của nhiễm sắc thể và gây lên những quá trình hoá học

Hiện nay người ta biết đến hàng chục nhóm chất hoá học và hàng ngàn dẫn xuất của chúng gây đột biến Các chất hoá học gây đột biến có thể làm thay đổi cấu trúc nhiễm sắc thể và gen gây lên đột biến ở thực vật với tần số đột biến cao hơn, tinh vi hơn và đặc hiệu hơn các tác nhân vật lý

Các chất hoá học gây đột biến như: Các chất oxy hoá, methyl hoá hay ethyl hoá Cho đến nay các chất hoá học thường được sử dụng là các chất thuộc nhóm ankyl hoá như: Ntrozoethyl ure, Colchicine, Ntrozomethyl ure… Đây là những chất hoá học đã được thử nghiệm và chứng tỏ có khả năng gây đột biến cao nhờ khả năng thẩm thấu cao qua màng tế bào và màng nhân, có đặc điểm làm thay đổi trạng thái hoá học của nhiễm sắc thể

* Cơ chế gây đột biến

Gen là một đoạn của phân tử ADN gồm một số nucleotit có trình tự sắp xếp nhất định, quyết định trình tự sắp xếp các axit amin trong mạch polipeptit

Mã di truyền của sinh vật do các “bộ ba” nucleotit quyết định Nếu trình tự của các nucleotit trong các “bộ ba” thay đổi, hoặc một nucleotit này được thay thế bằng nucleotit khác sẽ gây nên hiện tượng đột biến gen, dẫn đến thay đổi các axit amin trong phân tử protein, làm thay đổi tính trạng của sinh vật

Các chất hoá học gây đột biến (chất oxy hoá, chất methyl hoá ) khi tác động vào cơ thể sinh vật sẽ oxy hoá hay methyl hoá các bazơ nitơ trong nucleotit, do đó làm thay đổi cấu trúc hoá học của gen

Đối với các tia phóng xạ, khi chiếu vào cơ thể sinh vật sẽ gây tác dụng chủ yếu là ion hoá các nguyên tử và phân tử sinh vật cũng như môi trường xung quanh Sự ion hoá trực tiếp và kích thích các nguyên tử của phân tử ADN làm thay đổi cấu tạo hoá học của gen, kết quả là gây ra những biến đổi khác so với ban đầu

Kết quả của sự tác động này phụ thuộc rất nhiều vào mức độ năng lượng dự trữ trong các gốc tự do Nếu mức năng lượng yếu sẽ gây ra đột biến điểm, nếu mức năng lượng mạnh sẽ làm tổn thương tới cấu trúc phân tử ADN, có thể xảy ra đột biến gây chết hoặc hình thành các nhóm đột biến nhiễm sắc thể

pháp gây đột biến nói trên Mỗi phương pháp đều cho thấy những ưu nhược điểm:

- Đối với tác nhân vật lý: (X-rays, gamma rays, i-on beam, UV light, fast neutrons )

Thuận lợi

+ Dễ xác định liều lượng

+ Tia gamma có khả năng đâm xuyên vào nhiều tế bào

Bất lợi

+ Đòi hỏi phải có nguồn chiếu xạ

+ Tia UV chỉ có thể ứng dụng cho 1 lớp tế bào

+ Đột biến gen và đột biến nhiễm sắc thể có thể xảy ra đồng thời

- Đối với tác nhân hoá học: (Ethyl methane sulphonate, sodium azide, ethidium bromide, methyl nitroso urea)

Thuận lợi

+ Tạo các đột biến điểm

+ Tỷ lệ đột biến cao, rẻ tiền

Bất lợi

+ Khó khăn trong việc xác định liều lượng thích hợp

+ Không có khả năng đâm xuyên vào nhiều tế bào

+ Có thể gây ung thư

* Ưu điểm của chọn giống đột biến thực nghiệm:

- Sử dụng đột biến thực nghiệm sẽ rút ngắn được thời gian chọn tạo ra một giống mới so với việc sử dụng phương pháp lai Phương pháp chọn giống đột biến có hiệu quả cao trên những cây có hiệu quả ưu thế về chọn lọc cá thể, như ở các cây thụ phấn và cây sinh sản vô tính các cá thể của giống sinh sản

vô tính (dòng vô tính) đều mang gen đột biến, còn đối với cây thụ phấn chéo thì cây mang gen đột biến trong nhiều thế hệ chọn lọc vẫn có thể chỉ chiếm một tỉ lệ nhất định trong quần thể

- Thay đổi một hoặc một vài tính trạng mà không làm ảnh hưởng tới những tính trạng còn lại của cây trồng

* Những hạn chế của phương pháp chọn giống đột biến

- Khó dự đoán chính xác tỷ lệ thành công của phương pháp chọn giống đột biến vì:

+ Thể đột biến nằm trên các locus khác nhau

+ Các locus khác nhau khi đột biến gây ra sự thay đổi về mặt di truyền (như hiện tượng đơn gen, đa gen, hiện tượng gây chết thể đột biến, hiện tượng locus giống nhau có thể át mất thể đột biến được tạo ra)

2.2.3 Cơ sở khoa học của tạo giống cây trồng đột biến in vitro

Sơ đồ nuôi cấy không có mô phân sinh:

Mô → Mô sẹo (callus) → Cụm chồi → Ra rễ → Cây hoàn chỉnh

Trong quá trình nuôi cấy thì giai đoạn callus là một tổ chức mô vô tính

mà từ đó các cây con được phát triển từ một tế bào, nếu đột biến ở giai đoạn callus thì tần số xuất hiện đột biến sẽ rất cao vì ở giai đoạn callus rất mẫn cảm với các yếu tố bên ngoài như (nhiệt độ, ánh sáng, yếu tố vật lý, hoá học…), khi các callus ở trạng thái hợp tử đơn bào mà xảy ra đột biến thì qua giai đoạn phân chia nguyên nhiễm sẽ tạo ra một cơ thể có sự đồng nhất về kiểu gen mà

ít có hiện tượng khảm Đó là sự khác biệt giữa việc gây đột biến thực nghiệm callus với đột biến thực nghiệm mầm hoặc chồi, bởi việc gây đột biến thực nghiệm mầm hoặc chồi dễ tạo ra các thể khảm (khảm là hiện tượng có hai hay nhiều kiểu gen cùng tồn tại) Hơn nữa, đột biến mầm hoặc chồi thì khả năng tạo ra đột bến đồng nhất là rất khó, hoặc nếu có được những thể khảm rồi sau

đó phải tiếp tục nhân để tách dòng đột biến đồng nhất là một công việc rất lâu dài và khó khăn

Vì vậy, kỹ thuật gây đột biến kết hợp với nuôi cấy in vitro đã được áp

dụng đối với cây nhân giống vô tính nhờ tiềm năng rất lớn về nhân số lượng

cây trong in vitro không cần thời gian dài, có thể rút ngắn được chu kỳ chọn

lọc đột biến, nhanh chóng đưa sản phẩm ra phục vụ sản xuất

2.3 Các nghiên cứu về chọn tạo giống cây trồng bằng con đường gây đột biến trên thế giới và Việt Nam

2.3.1 Các nghiên cứu về chọn tạo giống cây trồng bằng con đường gây đột biến trên thế giới

Từ những năm 1970, cơ quan năng lượng nguyên tử quốc tế (IAEA) và

tổ chức nông lương thế giới (FAO) đã tài trợ mở rộng hướng nghiên cứu gây đột biến cải tạo những giống cây nông nghiệp và cây công nghiệp ở nhiều nước trên thế giới và đã chọn tạo thành công hàng loạt giống cây trồng mới như giống Lúa, Lúa mì, Táo, Chanh, Chuối, hoa cây cảnh… Theo FAO/IAEA năm 1960 có 7 gièng được tạo ra bằng con đường chọn tạo giống đột biến đến

7/2007 (dữ liệu của FAO/IAEA mutant varieties databases) đã có tới gần

2500 giống cây trồng được tạo ra bằng phương pháp gây đột biến thực nghiệm Riêng đối với loại cây nhân giống vô tính thì số lượng giống tạo ra

do gây đột biến là 102 giống chiếm 24% trong tổng số giống đột biến Trong

đó chiếu xạ chiếm 88,8%, các tác nhân hoá chất chiếm 9,5%, tác nhân khác là 1,7% [26] Số lượng giống cây trồng được tạo ra nhờ gây đột biến trên thế giới (tính đến tháng 7 - 2007) biểu hiện thông qua biểu đồ sau:

0 500

Biểu đồ 2: Số lượng cây trồng được tạo ra nhờ gây đột biến trên thế giới

Năm 1962, các tác giả người Mỹ đã sử dụng tia gama để tạo đột biến trên giống Ucom White Sim No.1 và đã thu được các dòng cẩm chướng đột biến về màu sắc hoa

Năm 1972, các tác giả người Pháp đã sử dụng tia Gama để tạo đột biến trên giống Cẩm chướng Sim Feu Follet và đã thu được các dòng đột biến về màu sắc hoa

Jame (1983) đã tạo thành công giống đột biến Paula từ giống Queen

Elizabeth và giống Pink Hat từ giống Hồng không rõ tên của loài Rosa

lượng 0, 20, 30, 40 và 60 Gy Kết quả cho thấy ở liều lượng 40 - 50 Gy là liều lượng thích hợp nhất để tạo giống đột biến [26]

Các nghiên cứu khác còn cho thấy những biến đổi về khả năng ra hoa,

xuất hiện dạng lùn trong loài R.chinensis và những loài hoa Hồng khác là kết

quả của con đường đột biến Gần đây, nhiều giống hoa Hồng màu sắc cổ điển

đã được thay đổi, do đột biến nhân tạo Có những giống được tạo ra bằng đột biến mầm với tia X, chất đồng vị phóng xạ gama với nguồn Co60 hoặc những hoá chất đột biến khác [33]

Datta (1989) đã xử lí tia gama với chồi của 9 giống hoa hồng 3 - 4

Krad, sau đó ghép lên gốc ghép Rsaindoca var.odorata Kết quả cho thấy, giống “Orange sensation” mẫn cảm nhất với tia gama, còn giống kiss là giống

ít mẫn cảm nhất Kết quả đã tạo ta được các đột biến thấp cây và đột biến soma về màu hoa ở tất cả các giống [32]

Năm 1986, Walter và Sauer chiếu xạ tia X vào đỉnh chồi hoa hồng

nhất và có đến 73% đột biến thu được từ những liều chiếu lớn là liên quan tới đặc tính của hoa, điều này được khẳng định chính xác sau khi đã tiến hành phân tích sắc tố liên quan đến màu sắc của hoa để xác định rõ đặc điểm của hoa hồng đột biến [33]

Datta (1989) xử lí chồi hoa hồng bằng tia gama với nồng độ 3 - 4 Krad Kết quả cho thấy xử lí với 3 Krad là hiệu quả nhất Thể đột biến khảm về màu sắc và hình dạng hoa xảy ra ở 21 giống Từ 1 vạch nhỏ trên cánh hoa đến biến màu cả cánh hoa

Ngoài khả năng tạo các giống mới, tia gama còn có tác dụng kích thích năng suất và sản lượng cây trồng

Tại hội nghị di truyền quốc tế (1993) Sidorova va Morgun đã công bố việc tạo thành công 2 giống lúa mì mùa đông thông qua biến dị tái sinh từ callus và chiếu xạ tia gama lên hạt [17]

Rusli Ibrahim (1999) chiếu xạ đột biến bằng tia X với liều lượng 0 -

100 Gy, trên chồi in vitro của 3 giống Hồng (Rosa hybrida) là Inka, Rui 317,

Rui 319 đã thu được 10% cá thể có đột biến chặt về hoa ở Rui 317,7% số cá thể ở Rui 319 và 18% ở giống Inka Tương tự xử lý EMS ở nồng độ 0; 0.25; 0,5; 1% có kết hợp với DMSO 4% trong 1 - 3 giờ ở 28oC Kết quả EMS 0,5% thu được 3% dòng đột biến ở giống Rui 317, 2% dòng ở Rui 319 và 7% dòng

ở giống Inka [34]

Datta và cộng sự (2001) xử lý tia Gama với liều lượng chiếu xạ 1,5; 2

và 2,5 Gy vào đoạn rễ của giống Cúc D Grandiflorum Đột biến điểm soma

trong cấu trúc và màu sắc hoa được phát hiện ở tất cả các liều lượng chiếu xạ

Màu nguyên thuỷ của hoa non giống Cúc D Grandiflorum là màu đỏ tím và

cánh hoa có dạng hình muỗng nông Một hoa non đột biến có màu vàng cam với hoa non nguyên thuỷ và một hoa non đột biến khác có màu vàng cam với hoa non hình ống [21]

Datta và cộng sự (2005) đã nghiên cứu xử lý chiếu xạ cánh hoa non của

các giống Cúc Chrysanthemum morifolium Ramat, Flirt, Puja, Maghi và Sunil

nồng độ 500 - 1000 rad Kết quả chiều cao cây và kích thước lá, hoa bị thay đổi Làm biến dị 5 dạng hoa với sự sắp xếp cánh hoa khác nhau, hình thái cánh hoa cũng thay đổi [22]

Kumar và cộng sự (2006) đã tạo 11 dòng đột biến từ 2 giống Cúc Ajay và Thai Chen Queen Qua phân tích RADP có 3 nhóm chính Dòng Cúc Yellow và dòng Cúc Bright Orange được xếp 1 nhóm riêng không giống với 2 giống Cúc ban đầu Có 3 nồng độ được xử lý 10, 20, 30 Gray

được xử lý lần 1, lần 2 chiếu thêm 1 liều 15 Gy (1 Gy = 100 rads) cho cả 3 nồng độ đã xử lí [28]

Kim và cộng sự (2006) đã chiếu xạ tia Gama chồi cây hoa Hồng Rosa

cấy 4 tuần trong môi trường MS có bổ sung BAP 0,5 g/l với các liều lượng

0 - 150 Gy Gần 50% chồi bị chết đã đuợc ghi nhận tại liều lượng chiếu xạ

110 - 130 Gy, với liều lượng chiếu xạ 150 Gy thì tất cả các mẫu chồi chiếu

xạ đều bị chết Phần lớn các chồi đều xuất hiện rễ ở tuần thứ 3 nhưng chiều dài và số rễ giảm theo mức tăng của liều lượng chiếu xạ Màu sắc cánh hoa

bị đột biến, màu hồng từ giống Amadeus, màu hồng và cam đổ từ giống Little Marble [29]

2.3.2 Các nghiên cứu về chọn tạo giống cây trồng bằng phương pháp gây đột biến tại Việt Nam

Ở Việt Nam, các nghiên cứu và ứng dụng của phương pháp gây đột biến thực nghiệm và chọn giống thực vật đã được bắt đầu khá sớm Năm

1966, bộ môn di truyền giống - Đại học Tổng hợp bắt đầu nghiên cứu trên cây lúa và cây đậu tương Sau đó nghiên cứu này được triển khai ở một số cơ sở như : Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp, Viện Cây lương thực và Thực phẩm, Viện Di truyền Nông nghiệp, trường Đại học Sư phạm I Hà Nội, Đại học Nông nghiệp Trong đó có một vài tác giả đã thành công về tạo giống lúa đột biến như: Vũ Tuyên Hoàng (1982), Nguyễn Minh Công và cộng sự (1995, 1996, 1999), Trần Duy Quý (1978, 1999), trên Ngô có Nguyễn Hữu Đống và cộng sự (1997, 1998, 2000), Đặng Văn Hạnh và cộng sự năm 1994, trên cây Đậu tương có các tác giả như : Trần Đình Long (1980), Võ Hùng và cộng sự (1982)

Trong 20 năm trở lại đây, nước ta đã thu được nhiều thành tựu đáng kể trong việc nâng cao sản lượng lương thực, đặc biệt là lúa nhờ phương pháp

gây đột biến thực nghiệm Từ năm 1989 – 2000, Viện Di truyền Nông nghiệp

đã công bố 6 giống lúa quốc gia như DT10, DT11, DT13, DT33, DT16 và nếp thơm DT21 Năm 2003, Lê Xuân Đắc, Bùi Văn Thắng và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của tia gama nguồn Co60 đến khả năng sống sót

và tái sinh cây từ mô sẹo trên một số giống địa phương Kết quả cho thấy liều chiếu xạ thích hợp cho mô sẹo của 4 giống (Tám Xoan, Tám ấp bẹ , Dư thơm,

Tẻ Di hương ) từ 7 Krad đến 9 Krad Tác giả tiến hành chiếu xạ với các liều khác nhau trên 6000 khối mô sẹo và đã thu được 1271 dòng cây, một số dòng

có biểu hiện thấp cây được các tác giả nghiên cứu trên đồng ruộng để chọn ra các dòng có triển vọng làm giống

Hiện nay Việt Nam có 44 giống cây trồng tạo được nhờ các tác nhân gây đột biến vật lí và hoá học Phần lớn các giống cây trồng này tập trung trên các đối tượng như : Lúa, Ngô, Đậu tương, còn các đối tượng khác như hoa cây cảnh vẫn còn hạn chế

Năm 2002, Đỗ Quang Minh, Nguyễn Xuân Linh đã bước đầu tạo nguồn vật liệu khởi đầu cho chọn tạo giống Cúc bằng việc gây đột biến thực nghiệm từ việc chiếu xạ tia gama (Co60) trên chồi in vitro Tác giả cho rằng

tia gama (Co60) đã gây ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng và phát triển của

câu hoa Cúc in vitro, ảnh hưởng đến hình thái và gây hiện tượng bạch tạng di

dạng thân lá

Năm 2005, Đào Thanh Bằng, Nguyễn Phương Đoài, Nguyễn Quang Minh và cộng sự thuộc Viện Di truyền Nông nghiệp đã công bố kết quả chọn

giống hoa cúc bằng chiếu xạ in vitro và đã thu được nhiều màu sắc hoa khác

nhau, dạng hoa khác nhau Đối tượng cụ thể đem chiếu xạ là khối callus của giống hoa Cúc màu trắng CN43, các tác giả đã sử dụng dải liều lượng chiếu

xạ từ 1,0 đến 15 Krad Kết quả thu được cho thấy liều lượng gây chết 50% về

khả năng tái sinh chồi là từ 5,0 Krad và thu được 3 thể đột biến màu hoa (màu vàng, màu hồng và màu chóp cánh màu xanh [1]

Như vậy, thực tế gần 20 năm qua nhờ áp dụng kỹ thuật hạt nhân như chiếu xạ hạt giống trước khi gieo, chiếu xạ hạt giống để gây các đột biến di truyền những tính trạng quý như cây thấp, chống đổ, chín sớm, năng suất cao, chống chịu sâu bệnh Chiếu xạ hạt, củ khi bảo quản để tránh thất thu và hao hụt khi bảo quản nông sản đã được phát triển mạnh Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn, một số trung tâm đã tạo được 20 giống cây trồng gồm: Lúa, Ngô, Đậu tương, Lạc, Cà chua, Táo, các giống cây ăn quả không hạt bằng phương pháp đột biến cảm ứng bổ sung vào cơ cấu cây trồng, góp phần vào tăng năng suất và sản lượng lương thực thực phẩm hàng năm một cách ổn định [24]

Trong thời gian vừa qua và hiện nay đã có khá nhiều nghiên cứu nhằm ứng dụng kỹ thuật hạt nhân vào nông nghiệp, cụ thể là :

Sử dụng kỹ thuật đồng vị phóng xạ để nghiên cứu hàm lượng dinh dưỡng của cây trồng nhằm sử dụng có hiệu quả nhất phân bón để thu được năng suất và chất lượng cao

Sử dụng kỹ thuật chiếu xạ ở liều lượng thấp cho hạt giống trước khi gieo có tác dụng kích thích độ nảy mầm, sinh trưởng và phát triển cũng như khả năng chống chịu sâu bệnh

Sử dụng chiếu xạ để bảo quản hạt giống, củ giống, chống mối mọt, chống nảy mầm làm hao hụt và suy giảm chất lượng củ giống và hạt giống

Sử dụng chiếu xạ hạt khô, hạt nảy mầm, bao phấn, hợp tử và tiền phôi của cây lúa, ngô, đậu tương, hoa, cây cảnh để tạo ra các đột biến có lợi như thấp cây, chín sớm, năng suất cao, chống chịu sâu bệnh và các điều kiện bất lợi Làm tăng hàm lượng protein trong hạt, thay đổi màu sắc hoa, các dạng bất dục đực để sử dụng vào công nghệ lúa lai, ngô lai

CÁC NGHIÊN CỨU VỀ CHỌN TẠO GIỐNG HOA ĐỒNG TIỀN BẰNG KỸ THUẬT ĐỘT BIẾN

Hoa Đồng Tiền được phân loại theo màu sắc thành 8 nhóm màu cơ bản: vàng đậm, cam, vàng, hồng đào, đỏ, trắng – kem, hồng thắm và hồng sáng Trong mỗi nhóm, hoa cvó thể đậm nhạt hoặc pha trộn sặc sỡ trong phạm vi nhóm tông màu trên Kiểu dáng có thể là cánh đơn, trung gian hoặc cánh kép với vòng tâm đen, nâu, vàng hoặc xanh Kiểu đặc biệt là kiểu cánh chân nhện (cánh mảnh, có dạng tua) Các chương trình tạo giống thường định hướng hình thức theo nhu cầu thị hiếu của thị trường mục tiêu, nhưng đều nhắm tới việc tạo ra các kiểu dáng, hình thức mới lạ

Đột biến về màu sắc xảy ra theo hướng xác định, ví dụ, giống màu hồng có thể tạo ra giống đột biến màu đồng, vàng hoặc trắng, nhưng điều ngược lại không xảy ra Cây màu đồng thường tạo ra cây đột biến màu đỏ và vàng, cây màu trắng sẽ tạo cây màu vàng Sơ đồ minh hoạ hướng này được biểu diễn sơ lược dưới sơ đồ bên dưới

màu sắc này nhưng cũng có các genes tương hỗ khác có ảnh hưởng Genes fns+ kiểm soát quá trình tổng hợp flavone và có hiệu ứng tương hỗ mạnh với các gene điều khiển tổng hợp anthocyanins [35]

Tác giả A.Tosca, R.Pandolfi ca CS người Đức (1994) đã nghiên cứu khả năng lưỡng bội hoá các dòng Đồng Tiền đơn bội trên 2 loại hoá chất là Colchicine và Dimethyl sulfoxide, so sánh khả năng ức chế quá trình giảm phân của chúng và đã có kết quả về hiệu quả lưỡng bội hoá của Colchicine tốt hơn Dimethyl sulfoxide dựa trên số lượng cây tái sinh có bộ NST ở dạng lưỡng bội [31]

Tác giả J Honkanen và cộng sự (2001) đã nghiên cứu khả năng lưỡng bội hoá của các dòng Đồng Tiền đơn bội dựa trên hai phương pháp xử lí colchicine khác nhau và đã thu được 60% các dòng Đồng Tiền xử lí là nhị bội

và tứ bội [32]

Tác giả Miyoshik và Askuran người Nhật (1981) đã thành công trong

nghiên cứu nuôi cấy đơn bội Đồng Tiền in vitro và xử lí lưỡng bội hoá bằng

colchicine ở liều lượng 0,05% - 1% kết quả thu được các thể lưỡng bội và tứ bội trong đó thể lưỡng bội chiếm số lượng lớn [33]

Viện Sinh học Nông nghiệp - Đại học Nông nghiệp Hà Nội (2005) đã nghiên cứu xử lí gây tứ bội hoá trên giống hoa Đồng Tiền trên các nồng độ 0.1% trong 48h cho tỉ lệ chồi đa bội cao nhất - đạt 55,9% [24]

Tác giả Xiao - Shan Shen, Jue - Zhen wan Wie - Yi Luo và cộng sự (2004) người Trung Quốc đã nghiên cứu ảnh hưởng của liều chiếu xạ đến chồi Đồng Tiền trong các môi trường nuôi cấy M1, M2, M3 (là các môi

trường tái sinh callus, môi trường tái sinh chồi và môi trường tạo rễ) trong in

được liều chiếu xạ gây chết callus Đồng Tiền là từ 8 - 9 Krad (1990) và liều chiếu xạ có hiệu quả gây đột biến là 5 - 6 Krad [24]