Khảo sát biến động hàm lượng kháng thể kháng h ở gà được tiêm vacxin h5n2 của WEIKER trung quốc sản xuất

luận văn thạc sĩ, tiến sĩ, cao học, luận văn

Bộ giáo dục và đào tạo Trường đại học nông nghiệp i

- -

Nguyễn thị thanh hà

Khảo sát biến động hàm lượng kháng thể kháng H ở gà được tiêm vacxin H5N2 của WEIKER - Trung Quốc sản xuất

Lời cam đoan

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và ch−a từng đ−ợc

ai công bố trong bất cứ công trình nào khác

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đ1 đ−ợc cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đều

đ1 đ−ợc chỉ rõ nguồn gốc

Tác giả

Nguyễn Thị Thanh Hà

Lời cảm ơn

Trong suốt 2 năm học tập và hoàn thành luận văn, ngoài nỗ lực của bản thân, tôi còn nhận được sự giúp đỡ, hướng dẫn tận tình của nhiều cá nhân và tập thể, cho phép tôi được tỏ lòng biết ơn và cảm ơn chân thành tới: Ban Giám hiệu Trường Đại học Nông nghiệp I, khoa Sau Đại học, khoa Chăn nuôi-Thú y đ1 giúp đỡ, tạo điều kiện để tôi học tập, tiếp thu kiến thức của chương trình học

Thầy hướng dẫn TS Nguyễn Hưũ Vũ, Ban L1nh đạo và toàn thể cán

bộ ban nghiên cứu của công ty HANVET

Hà Nội, tháng 12 năm 2006

Tác giả

Nguyễn Thị Thanh Hà

Mục lục

Trang

Lời cam đoan i

Lời cảm ơn Error! Bookmark not defined Mục lục iii

Danh mục các chữ viết tắt v

Danh mục bảng vi

Danh mục hình vii

1 Mở đầu 1

2 Tổng quan tài liệu và cơ sở khoa học của đề tài 3

2.1 Giới thiệu chung về bệnh cúm gà 3

2.1.1 Lịch sử bệnh cúm gà 3

2.1.2 Bệnh cúm gia cầm ở thế giới và châu á 4

2.1.3 Tóm tắt tình hình bệnh cúm gia cầm ở Việt Nam 5

2.2 Virus học 8

2.2.1 Cấu trúc chung của virus 8

2.2.2 Sức đề kháng 10

2.2.3 Độc lực của virus 11

2.2.4 Nuôi cấy và lưu giữ virus cúm gà 12

2.2.5 Chẩn đoán lâm sàng 12

2.2.6 Chẩn đoán xét nghiệm phòng thí nghiệm 13

2.2.7 Chẩn đoán virus học: 13

2.3 Một số đặc điểm dịch tễ học 14

2.3.1 Loài nhiễm bệnh 14

2.3.2 Phương thức lây lan 14

2.4 Miễn dịch chống bệnh của gia cầm 16

2.4.1 Miễn dịch tự nhiên: 16

2.4.2 Miễn dịch đặc hiệu: 17

2.4.3 Miễn dịch chủ động 18

2.4.4 Miễn dịch thụ động 19 2.5 Tình hình sử dụng vacxin trên thế giới và khuyến cáo của Tổ chức

2.5.1 Các loại vacxin phòng bệnh hiện nay: 20

2.5.2 Yêu cầu cần đạt được đối với vacxin phòng bệnh cúm gà 23

2.5.3 Tình hình sử dụng vacxin cúm gia cầm trên thế giới 24

2.5.4 Khuyến cáo của OIE về việc sử dụng vacxin phòng chống cúm gia cầm 25

3 Nội dung, nguyên liệu, phương pháp nghiên cứu 27

3.1 Nội dung nghiên cứu 27

3.2 nguyên liệu dùng trong nghiên cứu 27

3.3 Phương pháp nghiên cứu 30

3.4 Bố trí thí nghiệm 32

4 Kết quả nghiên cứu và thảo luận 35

4.1 Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể trong huyết thanh của gà lô thí nghiệm I ( gà được tiêm 1 lần vacxin vào thời điểm 4 tuần tuổi ) 35

4.2 Kết quả khảo sát đáp ứng miễn dịch chủ động ở gà trong lô thí nghiệm II 38

4.3 Kết quả khảo sát đáp ứng miễn dịch chủ động ở gà trong lô thí nghiệm III 42

4.4 kết quả khảo sát đáp ứng miễn dịch trong huyết thanh gà và lòng đỏ của lô thí nghiệm I 47

4.5 Kết quả khảo sát đáp ứng miễn dịch trong huyết thanh gà và lòng đỏ của lô thí nghiệm II 49

4.6 Kết quả khảo sát đáp ứng miễn dịch trong huyết thanh gà và lòng đỏ của lô thí nghiệm III 51

4.7 Kết quả khảo sát hàm lượng KT và diễn biến KT thụ động ở gà con trong lô thí nghiệm I 565

4.8 Kết quả khảo sát hàm lượng KT và diễn biến KT thụ động ở gà con trong lô thí nghiệm II 57

4.9 Kết quả khảo sát hàm lượng KT và diễn biến KT thụ động ở gà con trong lô thí nghiệm III Error! Bookmark not defined 5 Kết luận và đề nghị 69

Tài liệu tham khảo 71

Một số hình ảnh minh hoạ 76

Danh môc c¸c ch÷ viÕt t¾t

KT : Kh¸ng thÓ

TN : ThÝ nghiÖm

ARN : Acid ribonucleic

cADN : Complementary ADN

GMT : Geographic Mean Titre

HA : Hemagglutination test

HI : Hemagglutination inhibitory test

HPAI : Highly Pathogenic Avian Influenza

LPAI : Lowly Pathogenic Avian Influenza

OIE : Office Internationale des Epizooties

PBS : Phosphate - Buffered - Saline

RT – PCR : Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction

Danh mục bảng

Trang Bảng 4.1 Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể trong huyết thanh của lô gà thí

TN 1 55 Bảng 4.2.3: Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể thụ động gà con của lô gà

TN 2 57 Bảng 4.3.3: Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể thụ động gà con của lô gà

TN3 59 Bảng 4.4 Tương quan hàm lượng kháng ở gà mẹ với kháng thể ở lòng

đỏ và gà con cùng diễn biến của nó 64

Danh mục hình

Trang Hình 2.1: Bản đồ dịch cúm ở các nước châu á 4 Hình 2.2: Các đợt dịch cúm gia cầm 6 Hình 2.3: Xác suất dịch cả nước dựa vào mô hình hồi quy logistic cho

đợt 1 7 Hình 2.4: Tiến triển của dịch từ 1/10/2005 đến nay 8 Hình 2.5: Cấu trúc virus cúm H5N1 10 Hình 2.6: Các kiểu đột biến Đột biến điểm (Drift): Hình 2.7: Đường

truyền lây của virus cúm 10 Hình 2.7: Đường truyền lây của virus cúm 15 Hình 4.1 Biến động hiệu giá KT trung bình và độ dài miễn dịch

của đàn gà thí nghiệm

Hình 4.2.1: Biến động KT trung bình và độ dài miễn dịch được tiêm 2 lần

vacxin 39 Hình 4.3.1: Diễn biến hiệu giá KT trung bình và độ dài miễn dịch của đàn

gà được tiêm 3 lần vacxin 45 Hình 4.3.1.2: Diễn biến hiệu giá KT trung bình và độ dài miễn dịch của 3

lô gà thí nghiệm .46 Hình 4.1.2: Tương quan giữa KT chủ động ở gà mẹ và KT thụ động ở

lòng đỏ của lô thí nghiệm I 48 Hình 4.2.2: Tương quan giữa KT chủ động ở gà mẹ và KT thụ động ở

lòng đỏ của lô thí nghiệm II 51 Hình 4.3.2: Tương quan giữa KT chủ động ở gà mẹ và KT thụ động ở

lòng đỏ của lô thí nghiệm II 53 Hình 4.1.3 Hàm lượng KT và diễn biến KT thụ động ở gà con trong lô thí

nghiệm I .56 Hình 4.23: Hàm lượng KT và diễn biến KT thụ động ở gà con trong lô thí

nghiệm II 58

Hình 4.3.3: Hàm lượng KT và diễn biến KT thụ động ở gà con trong lô thí

nghiệm III 60

Hình 3.1.4: Sự tương quan KT trong huyết thanh gà mẹ và KT thụ động

của gà con lúc 1 ngày tuổi trong lô thí nghiệm I 61

Hình 3.2.4: Sự tương quan KT trong huyết thanh gà mẹ và KT thụ động

của gà con lúc 1 ngày tuổi trong lô thí nghiệm II 62

Hình 3.2.4: Sự tương quan KT trong huyết thanh gà mẹ và KT thụ động

của gà con lúc 1 ngày tuổi trong lô thí nghiệm III 63

1 Mở đầu

Đặt vấn đề

Ngày nay, chăn nuôi gia cầm giữ một vai trò quan trọng trong nền kinh

tế nông nghiệp Việt Nam Sản phẩm gia cầm là nguồn cung cấp thực phẩm chủ yếu trong đời sống xq hội Hàng năm, ngành kinh tế này đq sản xuất 350 -

380 nghìn tấn thịt hơi và 4 – 4,8 tỷ quả trứng Có khoảng 70% hộ gia đình nông thôn chăn nuôi gia cầm Trong cơ cấu thu nhập của ngành chăn nuôi, mức thu nhập từ chăn nuôi gia cầm chiếm 19% [8]

Hiện nay, dịch cúm gia cầm đang là mối quan tâm và đáng lo ngại của toàn cầu, đq có hơn 50 nước trên thế giới xuất hiện dịch, dịch có chiều hướng diễn biến phức tạp

Dịch cúm ra cầm xảy ra đq gây thiệt hại nặng nề cho người chăn nuôi ngoài ra còn làm ảnh hưởng nghiêm trọng đến nhiều hoạt động kinh tế xq hội khác

Vậy làm thế nào để khống chế được dịch bệnh nguy hiểm này?

Tổ chức y tế thế giới đq cảnh báo các nước phải gia tăng các biện pháp phòng tránh bảo vệ cho hàng trăm triệu gia cầm trên thế giới

Để phòng chống bệnh cúm gia cầm typ A H5N1, nước ta đq nhập vacxin cúm vô hoạt H5N2 chủng A/Turkey/England - N-28/73 của WEIKER Trung Quốc sản xuất Vacxin này đq được các cơ quan chuyên môn có thẩm quyền trong nước kiểm nghiệm và cho phép sử dụng rộng rqi trong phòng chống dịch cúm gia cầm thời gian qua Nhằm mục đích nghiên cứu, sử dụng vacxin một cách hiệu quả và kinh tế nhất, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: "Khảo sát biến động hàm lượng kháng thể kháng H ở gà đựơc tiêm vacxin H5N2 của WEIKER - Trung Quốc sản xuất."

Mục tiêu của đề tài:

Khảo sát khả năng đáp ứng miễn dịch chủ động ở gà mẹ và miễn dịch thụ

động ở gà con nở ra từ trứng của gà mẹ được tiêm phòng vacxin vô hoạt H5N2 Tìm ra các lỗ hổng miễn dịch ở đàn gà đựơc tiêm vacxin, từ đó đưa ra các biện pháp làm giảm thiểu những nguy cơ đe dọa của virus đang tiềm ẩn

Giúp người chăn nuôi chủ động hơn trong công tác phòng chống dịch cúm gia cầm

2 Tổng quan tài liệu

và cơ sở khoa học của đề tài

2.1 Giới thiệu chung về bệnh cúm gà

Năm 1878, tại Italy đq xảy ra một bệnh gây tử vong cao cho đàn gia cầm

đq được Porroncito mô tả, lúc này được gọi là bệnh dịch hạch gia cầm và được coi là một bệnh nguy hiểm

Năm 1901, Centanni và Savunozzi đq đề cập đến ổ dịch mà căn nguyên là một virus siêu nhỏ qua lọc Nhưng phải đến năm 1995, Scharfet mới xác định

được virus thuộc type A thông qua kháng nguyên bề mặt H7N1 và H7N7 gây chết nhiều gà, gà tây và các loài khác [5]

Vào những năm 1918 - 1920, một đại dịch cúm xảy ra làm chết 40 – 50 triệu người trên thế giới, đặc biệt bệnh chỉ tấn công chủ yếu vào những người

ở lứa tuổi từ 20 - 50 Giai đoạn này, khoa học chưa có phương tiện để chẩn

đoán nguyên nhân gây bệnh, theo một số tài liệu ghi lại cho biết nguyên nhân gây bệnh là virus cúm A (H5N1) ở một số nước hiện nay, loại virus này vẫn xuất hiện và là nguyên nhân gây nên bệnh cúm ở lợn

Sau đó thêm 3 đại dịch được ghi nhận: Năm 1957, dịch cúm do virus thuộc type A gây nên, “Cúm Châu á - Asean flu”; Năm 1968 - ở Nga, dịch cúm xảy ra do virus cúm type A (H3N2), “Cúm Nga - Russian flu”; Năm

1977, đại dịch cúm xảy ra ở Châu á và Hồng Kông, nguyên nhân được xác

định là do virus cúm type A [5]

Sự lây nhiễm từ chim hoang dq sang gia cầm đq có bằng chứng từ trước những năm 1970 nhưng chỉ được thực sự công nhận khi xác định được tỷ lệ nhiễm virus cúm cao ở một số loài thuỷ cầm di trú [10]

2.1.2 Bệnh cúm gia cầm ở thế giới và châu á

Hình 2.1: Bản đồ dịch cúm ở các nước châu á Năm 2004, bệnh cúm gia cầm đq xảy ra với qui mô lớn và với tốc độ bùng phát rất nhanh ở các nước châu á với tổng số 10 quốc gia và vùng lqnh thổ: Việt Nam, Lào, Nhật Bản, Thái Lan, Campuchia, Hàn Quốc, Indonesia, Pakistan, Trung Quốc, Đài Loan Dịch xuất hiện đầu tiên ở Hàn Quốc từ đầu tháng 12/2003, sau đó dịch xảy ra ở nhiều nước khác với những diễn biến phức tạp Đến cuối tháng 2/2004 đq có 11 nước và vùng lqnh thổ công bố dịch

là Hàn Quốc, Nhật Bản, Thái Lan, Lào, Campuchia, Việt Nam, Indonesia, Trung Quốc, Hồng Kông, Đài Loan và Pakistan [10]

- Tại Hàn Quốc: Dịch cúm gia cầm H5N1 xảy ra từ 12/12/2003 đến 24/3/2003

- Nhật Bản: Dịch cúm H5N1 phát ra từ ngày 27/1/2004, ổ dịch sau cùng xảy ra ngày 5/03/2004

- Thái Lan: ổ dịch H5N1 đầu tiên được xác định vào ngày 23/01/2004 Tính đến giữa tháng 3/2003, Thái Lan đq phát hiện 11 tỉnh có dịch cúm gia cầm với tổng số gia cầm bị tiêu huỷ đợt 1 khoảng 30 triệu con Đợt dịch thứ 2 phát lại từ 3/7/2004 đến 14/2/2005

- Indonesia: Dịch cúm gia cầm xuất hiện vào tháng 1/2004 Dịch xuất hiện lần thứ hai vào 23/3/2005

- Trung Quốc: ổ dịch H5N1 đầu tiên phát ra ngày 27/1/2004 ở tỉnh Quảng Tây, sau đó lan ra 15 tỉnh khác, đặc biệt các tỉnh có biên giới với Việt Nam đều có dịch Từ ngày 28/7/2004 Trung Quốc không phát hiện thêm ổ dịch mới

- Campuchia: Dịch H5N1 xảy ra từ ngày 24/01/2004

- Lào: Dịch H5N1 xảy ra từ ngày 27/01/2004 đến 13/02/2004

- Malaysia: ổ dịch H5N1 đầu tiên phát ra ngày 19/8/2004, ổ dịch sau cùng xảy ra ngày 22/11/2004

- Hồng Kông: Dịch xảy ra ngày 26/01/2004

Trong tháng 2/2004, một số nước đq tuyên bố khống chế được dịch, song cũng có một số nước dịch lại tái phát lần thứ 2, thứ 3 như Thái Lan, Campuchia, Hàn Quốc, Nhật Bản, Việt Nam Đây là lần đầu tiên trong lịch sử bệnh cúm gia cầm xảy ra nhanh, trên diện rộng và diễn biến phức tạp ở các nước châu á [14]

2.1.3 Tóm tắt tình hình bệnh cúm gia cầm ở Việt Nam

Dịch cúm gia cầm ở nước ta xuất hiện lần đầu tiên vào cuối tháng 12/2003 và đến nay xảy ra thành 3 đợt chính như sau:

Hình 2.2: Các đợt dịch cúm gia cầm

Đợt dịch thứ nhất từ tháng 12/2003 đến 30/3/2004

Dịch cúm gia cầm thể độc lực cao với tác nhân gây bệnh là virus cúm gia cầm H5N1 Đây là lần đầu tiên bệnh xuất hiện tại Việt Nam vì thế nó có thể

được coi là một bệnh mới ở gia cầm

Đặc điểm của đợt dịch thứ nhất này là dịch lây lan một cách nhanh chóng với nhiều ổ bệnh xuất hiện cùng một lúc ở nhiều địa phương khác nhau đq gây thiệt hại lớn cho người chăn nuôi gia cầm Tổng số gia cầm bị chết do bệnh và bị tiêu hủy là hơn 43,9 triệu con, chiếm 16,8% tổng số gia cầm của cả nước Trong

đó, gà là 30,4 triệu con và thủy cầm là 13,5 triệu con Ngoài ra còn có 14,76 triệu con chim cút và các loại chim khác bị chết và bị tiêu huỷ

Trong đợt dịch thứ nhất có 57 tỉnh có dịch trên tổng số 61 tỉnh trong cả nước, số lượng xq có dịch ở các tỉnh cũng rất khác nhau, dao động từ 1% đến 99% số xq Có 4 tỉnh là Tuyên Quang, Phú Yên, Khánh Hòa và Bình Thuận không bị dịch Hầu hết ở các tỉnh có dịch đều có trên 10% số xq có dịch Theo

ðợt 1

ðợt 3 ðợt 2

thống kê cho đến cuối đợt dịch, đồng bằng sông Hồng và đồng bằng sông Cửu Long là những khu vực có tỷ lệ số xq có gia cầm bị mắc bệnh cao nhất [2 ]

Hình 2.3: Xác suất dịch cả nước dựa vào mô hình

hồi quy logistic cho đợt 1

Đợt dịch thứ hai từ tháng 4 đến tháng 11 năm 2004:

Các ổ dịch cúm gia cầm thể độc lực cao đq tái xuất hiện vào giữa tháng 4 năm 2004 ở một số tỉnh thuộc đồng bằng sông Cửu Long Trong đợt dịch tái lại này các ổ bệnh chủ yếu xuất hiện ở các hộ chăn nuôi nhỏ lẻ và hầu như không có trại chăn nuôi qui mô lớn bị nhiễm bệnh Dịch có khuynh hướng xuất hiện ở những vùng có chăn nuôi nhiều thủy cầm Bệnh xuất hiện ở 46

xq phường tại 32 quận, huyện, thị xq thuộc 17 tỉnh Tổng số gia cầm bị tiêu

Provinces

Outbreak probability

0-0.10.1-0.20.2-0.30.3-0.40.4-0.50.5-0.60.6-0.7

Xác xuất dịch

Đợt dịch thứ 3 từ tháng 12/2004 đến tháng 4 năm 2006:

Bệnh cúm gia cầm thể độc lực cao đq xuất hiện ở 670 xq tại 182 huyện thuộc 36 tỉnh thành phố (15 tỉnh phía Bắc, 21 tỉnh phía Nam) Thời điểm xuất hiện các ổ dịch nhiều nhất là vào tháng 1/2005 với 143 ổ dịch xảy ra ở 31 tỉnh thành Trong đợt dịch này 460320 con gà, hơn 825.000 vịt, ngan và 551.000 chim cút đq chết và bị tiêu hủy [14]

Cho đến nay, nguồn gốc của dịch cũng chưa được xác định chính xác, nhưng có giả thuyết cho rằng việc vận chuyển lậu gà bị nhiễm từ nước ngoài vào nước ta là một trong các nguyên nhân gây ra dịch Ngoài ra, với đặc điểm khí hậu

ấm áp và có nhiều sông ngòi, các loài chim và thủy cầm di cư thường xuyên ra vào Việt Nam và chúng cũng có thể là tác nhân truyền bệnh cơ giới [6]

Hình 2.4: Tiến triển của dịch từ 1/10/2005 đến nay 2.2 Virus học

2.2.1 Cấu trúc chung của virus

Virus cúm gia cầm là virus ARN phân mảnh có khả năng đột biến rất mạnh [19]

Virus cúm A là virus hệ gen là RNA âm đơn sợi (ss(-)RNA) bao gồm 8 phân đoạn, trong đó, phân đoạn 4 mq hoá cho protein hemagglutinin (HA) và

Số xã phát dịch theo tuần từ 1/10/05 đến nay

phân đoạn 6 mq hoá cho protein neuraminidase (NA) là những protein nằm trên bề mặt có tính kháng nguyên và gây bệnh Trong tự nhiên, virus cúm A tồn tại trong các subtype khác nhau, đó là kết quả tái tổ hợp của 15 HA (H1 - H15) và 9 NA (NA1 - NA9) Gần đây, người ta phát hiện thêm một subtype

HA mới (H16) từ chim hải âu đầu đen tại Thuỵ Điển Các subtype này gây nhiễm cho phần lớn các loài sinh vật bao gồm các loài lông vũ (gà và thuỷ cầm), lợn, ngựa, chồn đất, hải cẩu, cá voi và người Trên cơ sở trình tự gen và sắp xếp gen trong hệ gen, virus cúm A có 8 phân đoạn, độ dài tổng số khoảng 13.500 nucleotide Phân đoạn 1-3 mq hoá cho protein PB1, PB2 và PA có chức năng là enzym polymerase, điều khiển tổng hợp ribonucleic acid nguyên liệu cho hệ gen và RNA thông tin Phân đoạn 4 mq hoá cho protein haemagglutinin (HA) là protein “độc”, mang tính gây bênh, có tính kháng nguyên và có khả năng ngưng kết hồng cầu gà [49] Phân đoạn 5 mq hoá cho nucleoprotein (NP), là protein có trách nhiệm bao bọc hệ gen[22] Phân đoạn

6 là gen chịu trách nhiệm tổng hợp protein enzym neuraminidase (NA), cắt thụ thể giải phóng virus khỏi tế bào sau chu kỳ nhân lên của chúng Phân đoạn

7 mq hoá cho 2 tiểu phần protein đệm M1 và M2 (matrix protein) có chức năng tập hợp virus và tạo kênh chuyển vận ion qua màng nhân Phân đoạn 8

mq hoá cho 2 tiểu phần protein không cấu trúc NS1 và NS2 (non-structural protein) đa chức năng [36]

Thành phần hoá học của virus cũng đq được nghiên cứu, ARN của virus chiếm 0,8-1.1%, 70-75% protein, 20-24% lipid và 5-8% hydrocarbon [27] Lipid của virus tập trung ở phần vỏ, chủ yếu là phospholipid, phần còn lại là cholesterol, glucolipid và một ít hydrocarbon gồm các loại các loại đường manose, galactose, ribose, fructose và glucosamin [31] Thành phần chủ yếu của protein virus là glycoprotein

Hình 2.5: Cấu trúc virus cúm H5N1

Hình 2.6: Các kiểu đột biến Đột biến điểm (Drift):

A/Wuhan/95(H3N2) A/Sydney/96(H3N2)

Đột biến do tái tổ hợp di truyền (Shift): (H2N2)  A/Hongkong/68 H3N2)

2.2.2 Sức đề kháng

Virus cúm gia cầm có sức đề kháng yếu và bị bất hoạt dễ dàng trong môi

trường bên ngoài nếu không được bảo vệ bằng các chất hữu cơ trong nước bọt

hoặc phân

Virus rất nhạy cảm với nhiệt độ và một số chất sát trùng (Sodium

hypochloride 5,25%, sodium hydroxide 2%, hợp chất phenol, chlorine dioxide,

các chất oxy hoá mạnh, sodium carbonate 4 %, sodium silicate 1%, acid loqng, các ion amonium) ở nhiệt độ 56 - 600C chỉ trong vài phút là virus mất độc tính

ở 40C, virus có thể tồn tại ít nhất là 35 ngày trong các chất hữu cơ và khoảng 23 ngày trong thân thịt đông lạnh Người ta đq phân lập được virus từ nước ao, hồ nơi các loài thuỷ cầm sinh sống Nếu nguồn nước không được xử

lý thì nó sẽ là nguyên nhân lây nhiễm khi gia cầm khoẻ uống phải nước từ nguồn nước đó

Trong phủ tạng gà, virus tồn tại 24 - 39 ngày, ánh nắng chiếu trực tiếp sống được 40 giờ còn chiếu thường thì sống được 15 ngày [3]

2.2.3 Độc lực của virus

Để đánh giá độc lực của virus cúm, người ta sử dụng phương pháp gây bệnh cho gà 3 - 6 tuần tuổi bằng cách tiêm tĩnh mạch 0,2 ml dung dịch nước niệu nang trứng gà có phôi đq nhiễm virus với tỷ lệ pha loqng 1/10, sau đó

đánh giá mức độ bệnh của gà để cho điểm (chỉ số IVPI) Điểm tối đa là 3

điểm và đó là virus có độ độc lực cao nhất Theo qui định của Tổ chức Dịch tễ thế giới (OIE) [28], những virus cúm nào có chỉ số IVPI từ 1,2 trở lên là thuộc nhóm virus có độc lực cao Căn cứ vào độc lực, các nhà khoa học

đq thống nhất chia virus cúm gồm 3 loại:

Virus có độc lực cao: Nếu sau 10 ngày tiêm tĩnh mạch cho gà phải làm chết 75 - 100% gà thực nghiệm và virus gây cúm gà phải làm chết 20% số gà mẫn cảm thực nghiệm và phát triển tốt trên môi trường tế bào xơ phôi gà và tế bào thận gà trong môi trường nuôi cấy không có Tripsin [50]

Virus có độc lực trung bình: Là những chủng virus gây dịch cúm gà với triệu chứng lâm sàng rõ rệt nhưng gây chết không quá 15% số gà bị nhiễm bệnh tự nhiên hoặc không quá 20% số gà mẫn cảm thực nghiệm

Virus có độc lực thấp (nhược độc): Là những virus phát triển tốt trong cơ thể gà, có thể gây ra dịch cúm nhưng không có triệu chứng lâm sàng rõ rệt

và không tạo ra bệnh tích đại thể, không làm chết gà [11]

Trong thực tế người ta chia virus cúm gia cầm làm 2 loại: Loại virus có

độc lực thấp - LPAI và loại virus có độc lực cao - HPAI Các vụ dịch lớn đều do virus HPAI gây ra thường là virus có kháng nguyên H5, H7, và H9 Riêng H5

và H7 thông thường bắt nguồn từ virus độc lực thấp, sau quá trình lây truyền trên gà và chim cút thì độc lực tăng lên rất nhanh và gây ra các vụ dịch lớn [35] Nghiên cứu ở mức độ phân tử cho thấy, khả năng lây nhiễm virus phụ thuộc vào tác động của men proteaza vật chủ đến sự phá vỡ các liên kết hoá học sau khi dịch mq của phân tử ngưng kết Tính thụ cảm của ngưng kết tố và

sự phá vỡ liên kết của men proteaza lại phụ thuộc vào số lượng các amino axit cơ bản tại điểm bắt đầu vỡ liên kết Các enzym giống trypsin có khả năng phá

vỡ liên kết khi chỉ có 1 phần tử arginin, trong khi đó các men proteaza khác lại cần nhiều amino axit cơ bản, vì thế một số nước đánh giá độc lực của virus trên cơ sở gây nhiễm cho gia cầm và sau đó phân tích sự sắp xếp các amino axit của các virus [5]

2.2.4 Nuôi cấy và lưu giữ virus cúm gà

Virus cúm gà phát triển tốt trong phôi gà 9 - 11 ngày tuổi Trong nước phôi đó người ta thấy tập trung khá nhiều virus và có thể lưu giữ chúng sống

được trong nước phôi vài tuần ở điều kiện 40C Khả năng tồn tại của virus rất cao nếu bảo quản nước phôi đó ở - 700C hoặc cho đông khô [42]

Virus cúm gà cũng phát triển tốt trong môi trường tế bào xơ phôi gà (CEF) và tế bào dòng có nguồn gốc thận chó MDCK (Madin-Darby-Canine -Kidney cells) với điều kiện môi trường nuôi cấy tế bào không chứa trypsin 2.2.5 Chẩn đoán lâm sàng

Chẩn đoán phân biệt lâm sàng dựa vào triệu chứng, bệnh tích và tính chất dịch tễ để xác định bệnh cúm gia cầm với các bệnh khác Cần chẩn đoán phân biệt với các bệnh khác như: Newcastle, Viêm thanh khí quản truyền nhiễm (ILT), Viêm phế quản truyền nhiễm (IB), Bạch lỵ, Tụ huyết trùng và một số bệnh khác

2.2.6 Chẩn đoán xét nghiệm phòng thí nghiệm

Có thể sử dụng nhiều phương pháp để chẩn đoán xác định bệnh do nhiễm virus cúm A

Để chẩn đoán xác định virus và các serotype, có thể dùng phản ứng ngưng kết hồng cầu (HA) hoặc phương pháp RT-PCR [26]

Phản ứng ức chế ngưng kết hồng cầu (HI) để phát hiện kháng thể kháng

HA của virus có trong huyết thanh gia cầm hoặc định serotype của kháng nguyên HA

Phản ứng NA hoặc NI để xác định các subtyp của kháng nguyên NA Phản ứng miễn dịch khuyếch tán trong thạch (AGP) [50] để phát hiện kháng thể chống lại virus cúm sử dụng kháng nguyên đặc hiệu Ribonucleoprotein [48] dùng phát hiện kháng thể kháng virus cúm gia cầm trong huyêt thanh của gà (bộ kit ELISA của hqng Indexx)

Phản ứng miễn dịch huỳnh quang [38]

Phản ứng Real-Time RT-PCR phát hiện virus và các serotyp của chúng [50] Ngày nay, các nhà khoa học đq sản xuất bộ dụng cụ chẩn đoán nhanh virus H5N1 cho kết quả trong vòng 1 giờ đồng hồ [12] có khi chỉ cần 2 phút [11] đồng thời phát hiện các biến chủng, biến dị của các loại virus này hoặc phát hiện virus H5N1 thông qua xét nghiệm nước bọt [17]

Tuy nhiên vẫn còn nhiều ý kiến tranh luận cho rằng test nhanh không chẩn đoán được virus H5N1[13]

Một số ít chủng virus có độc lực cao có thể gây chết phôi sau khoảng

18-24 giờ Trứng thu hoạch để ở nhiệt độ 40C qua một đêm Virus nhân lên trong nước trứng có khả năng ngưng kết hồng cầu gà Nếu không gây ngưng kết hồng cầu thì có thể lấy nước trứng thu được tiêm lần 2 cho phôi gà Phần lớn các phôi bị tạp khuẩn sẽ chết trước 24 giờ phải bỏ đi Những phôi sống sau 24h tiếp tục được theo dõi đến 72h

Lấy nước trứng từ những phôi chết trong khoảng 48h và sau 48h hoặc từ phôi chưa chết đến 72h để giám định virus Đây là khoảng thời gian mà số lượng virus cúm (nếu có) đạt đến mức lý tưởng

Giám định virus bằng phương pháp nhân gen phiên mq ngược RT-PCR, dùng để xác định được Subtyp H và N

2.3 Một số đặc điểm dịch tễ học

2.3.1 Loài nhiễm bệnh

Virus gây nhiễm tự nhiên cho gia cầm nuôi và hoang dq (bao gồm gà, gà tây, vịt, ngỗng, cút, chim trĩ, đà điểu, gà nhật, mòng biển, chim biển, ), đặc biệt chim sống tự do dưới nước, một số virus cúm gia cầm gây nhiễm ở chim hoang

dq sống trên cạn, nhưng đây không phải là nguồn chứa virus chính

Người ta đq phân lập được virus từ hơn 90 loài chim sống tự do thuộc 13

bộ khác nhau: Anseriformes (vịt, ngỗng, thiên nga), Charadriiformes (mòng biển, nhạn biển), Ciconiiformes (con diệc, cò quăm), Columbiformes (bồ câu), Falconiformes (chim ăn thịt), Galliformes (gà gô, chim trĩ), Gaviiformes (chim lặn gavia), Gruiformes (sâm cầm, gà nước, Passeriformes (chim sẻ, chim sâu), Ngoài ra virus còn gây bệnh cho cả cá voi, hải cẩu, chồn, ngay cả người Trong nghiên cứu thí nghiệm virus cúm có thể nhiễm cho lợn, chuột cống, thỏ, chuột lang, chồn sương, chuột nhắt, mèo đồng, linh trưởng, người 2.3.2 Phương thức lây lan

Virus cúm gia cầm đựơc bài thải ra môi trường từ mũi, miệng, kết mạc mắt, lỗ huyệt Trong cơ thể gia cầm bị bệnh virus nhân lên trong cơ quan hô hấp, ruột, thận, đường sinh dục Virus lây lan do tiếp xúc trực tiếp giữa gia

cầm mẫn cảm với gia cầm bị bệnh hay tiếp xúc gián tiếp thông qua khí dung hay do con người (quần áo, dày dép ) trang thiết bị (dụng cụ chăn nuôi, phương tiện vận chuyển, ) nhiễm virus [5]

Tuy nhiên nhiều yếu tố ảnh hưởng tới sự lây nhiễm virus như: Giới hạn phân bố địa lý, sự trộn lẫn giữa các loài, mật độ chăn nuôi, tuổi loài gia cầm, thời tiết khí hậu Nguồn khởi đầu mang virus cúm vào trang trại gia cầm thương phẩm từ 4 nguồn: Gia cầm khác nuôi trong trại, thuỷ cầm di trú (chim hoang), lợn, chim cảnh

Sự truyền ngang của virus cúm gia cầm thường xảy ra nhưng hiện nay thiếu bằng chứng về sự truyền dọc Tuy nhiên, trên gà mái nhiễm virus cúm gia cầm, người ta có thể phân lập được virus cúm trên vỏ trứng và từ thành phần bên trong trứng

Hình 2.7: Đường truyền lây của virus cúm

Đường lây bệnh thành công thí nghiệm bao gồm: Khí dung đường mũi mũi, khí quản, miệng, kết mạc mắt, xoang bụng, túi khí, mạch máu và lỗ huyệt

2.4 Miễn dịch chống bệnh của gia cầm

Hệ thống miễn dịch đóng vai trò quyết định trong phòng chống bệnh của loài chim Tổ chức và hoạt động của hệ miễn dịch loài chim tương tự như ở

động vật có vú

Những tế bào miễn dịch hiện diện ở các cơ quan lympho sơ cấp hoặc các cơ quan lympho thứ cấp Tuyến ức và túi Fabricius là cơ quan sơ cấp, tại đó tiền tế bào T và tiền tế bào B biệt hoá và trải qua quá trình chín Tuyến ức là một cấu trúc phân thuỳ, mỗi tiểu thuỳ có 1 vùng vỏ ngoại vi là nơi các lympho bào tập trung dày đặc và 1 phần lõi trung tâm là nơi các lympho bào tập trung thưa hơn Túi Fabricius nằm ở trên lỗ huyệt và được tổ chức thành các nang, mỗi nang chứa đầy lympho bào Giống như trong tuyến ức, các lympho bào

được tập trung ở vùng vỏ ngoại vi và ở phần tuỷ trung tâm

Những tế bào lympho chức năng rời cơ quan lympho sơ cấp và cư trú ở cơ quan lympho thứ cấp, những khu vực diễn ra các phản ứng miễn dịch do kích thích của kháng nguyên Cơ quan lympho thứ cấp, được xác định bởi sự

tụ hợp của các lympho bào và các tế bào trình diện kháng nguyên, phân tán rải rác khắp cơ thể Cơ quan lympho thứ cấp bao gồm lách, tuyến harder, hạch phổi, mô lympho ruột (hạch ruột) Túi Fabricius cũng hoạt động như một cơ quan lympho thứ cấp Gia cầm thiếu một số hạch bạch huyết tương đương của

động vật có vú nhưng có một số hạch nhỏ dạng bạch huyết dọc theo mạch bạch huyết

2.4.1 Miễn dịch tự nhiên:

Gia cầm có cơ chế phòng chống tự nhiên rất phát triển Những hàng rào vật lý như da hoặc hệ lông nhầy bình thường ngăn cản tác nhân gây bệnh vào cơ thể Đối với mầm bệnh đầu tiên vào cơ thể, sự phòng thủ đầu tiên được cung cấp bởi cơ chế miễn dịch tự nhiên như các tế bào thực bào bao gồm các

đại thực bào, bổ thể và các tế bào diệt tự nhiên (NK)

Các bổ thể là những thành phần không bền bởi nhiệt, hiện diện trong huyết tương của gia cầm, là phần quan trọng và nhạy cảm của hệ phòng thủ

của gia cầm chống lại mầm bệnh vi khuẩn Hệ bổ thể có thể hoạt động theo nhiều cách: bằng sự kết hợp kháng thể trên bề mặt của mầm bệnh hoặc protein

bổ thể tự hoạt hoá phân huỷ vi khuẩn

Những tế bào diệt tự nhiên của gia cầm là tế bào lympho hạt lớn và gây nên sự phá huỷ của tế bào đích gắn kháng thể ở gia cầm, tế bào diệt tự nhiên

có thể tái tạo ở nhiều nơi như lách, máu và ruột… là một phần của hệ thống phòng vệ ở gà, những biểu hiện của tế bào diệt tự nhiên biến đổi theo tuổi, hệ gen, độ phơi nhiễm với tác nhân nhiễm trùng hoặc sự hiện diện của các khối u 2.4.2 Miễn dịch đặc hiệu:

Những mầm bệnh vượt qua hàng rào vật lý hoặc cơ chế phòng vệ miễn dịch tự nhiên sẽ kích thích một đáp ứng miễn dịch đặc hiệu Miễn dịch đặc hiệu có tính đặc hiệu cao đối với tác nhân kích thích đặc hiệu Những tế bào

đặc hiệu trung gian giữ một hồi ức với những lần gặp gỡ sau với mầm bệnh thậm chí cả khi mầm bệnh không còn trong cơ thể và đáp ứng miễn dịch tương ứng đq tạm thời lắng xuống [1]

Những tế bào nhớ có đáp ứng đối với lần phơi nhiễm sau với cùng mầm bệnh bằng cách kích thích một đáp ứng miễn dịch có tính đặc hiệu cao và rất nhanh chóng Chủng vacxin nhắc lại, sử dụng thường xuyên đối với gia cầm,

đưa đến những ưu điểm của đáp ứng hồi ức này

Tính hiệu quả chống bệnh của một vacxin phụ thuộc vào các phản ứng mạnh của hệ miễn dịch với vacxin

Trong miễn dịch qua trung gian tế bào, quan trọng nhất là các tế bào T,

tế bào B và các đại thực bào Tế bào T là các tế bào chính của miễn dịch trung gian tế bào, nhận biết kháng nguyên lạ sau khi kháng nguyên (như vi sinh vật)

đq được xử lý bởi các tế bào trình diện kháng nguyên

Sự nhận diện kháng nguyên của tế bào B không phụ thuộc vào quá trình

xử lý kháng nguyên Tế bào B có thể nhận dạng kháng nguyên khi nó tương tác với globulin miễn dịch nhô ra trên bề mặt tế bào Tế bào B có đáp ứng

Hầu hết các vi sinh vật kích thích miễn dịch dịch thể và miễn dịch trung gian tế bào, mặc dù kiểu miễn dịch tối ưu nhất cho phòng vệ có thể khác nhau

đối với từng loại

2.4.3 Miễn dịch chủ động

2.4.3.1 Khái niệm

Là đáp ứng miễn dịch của cơ thể vật chủ sau khi tiếp xúc với mầm bệnh

và các kháng nguyên của chúng Miễn dịch chủ động có đặc điểm là cơ thể phục hồi nhanh hơn và sức đề kháng (miễn dịch) mạnh hơn sau khi tiếp xúc với chính mầm bệnh đó vào những lần sau (trí nhớ miễn dịch) Miễn dịch chủ

2.4.3.2 Các đặc điểm của một đáp ứng miễn dịch chủ động

Khi các tế bào có thẩm quyền miễn dịch lần đầu tiên tiếp xúc với một kháng nguyên, giữa tế bào và kháng nguyên sẽ diễn ra một chuỗi các sự kiện rất phức tạp trong đó có kháng nguyên sẽ bị "bắt giữ", được "chế biến" và

đựơc trình diện tới các tế bào Lympho bào có các thụ cảm quan nhận biết kháng nguyên tương ứng ở con vật chưa bao giờ tiếp xúc với một kháng nguyên nào Số lượng tế bào có phản ứng với kháng nguyên là rất nhỏ và đáp ứng lần đầu tiên với kháng nguyên diễn ra từ từ với cường độ thấp Đáp ứng

đó được gọi là đáp ứng miễn dịch tiên phát

Khi tiếp xúc với kháng nguyên tương tự lần thứ hai và những lần sau đó, các tế bào này nhận biết nhanh hơn và quần thể tế bào này cũng trở lên lớn hơn Đáp ứng miễn dịch với kháng nguyên sẽ diễn ra với thời gian nhanh hơn

và cường độ lớn hơn và được gọi là đáp ứng miễn dịch thứ phát

Như vậy đáp ứng miễn dịch chủ động có thể chia thành đáp ứng miễn dịch tiên phát và đáp ứng miễn dịch thứ phát với các đặc điểm hoàn toàn khác nhau

Đáp ứng miễn dịch tiên phát

- Xuất hiện ngay khi tiếp xúc lần đầu tiên với kháng nguyên

- Không có tế bào nhớ

- Được đặc trưng bằng:

+ Một giai đoạn ẩn trong vòng vài ngày

+ Tăng sinh lympho bào đặc hiệu với kháng nguyên

- Đáp ứng cao nhất (đỉnh) ở mức độ trung bình (liên quan đến sự loại bỏ kháng nguyên hoặc khống chế kháng nguyên)

+ Độ dài miễn dịch ngắn

- Kết quả của đáp ứng miễn dịch là tạo ra một loạt tế bào lympho bào nhớ có tác dụng làm cho đáp ứng khi bị phơi nhiễm lần sau với cùng loại hay loại gần giống kháng nguyên được tăng cường và nhanh hơn

Đáp ứng miễn dịch thứ phát

- Xuất hiện khi tiếp xúc với kháng nguyên lần thứ hai hoặc các lần tiếp xúc sau đó

- Cần phải có hỗn hợp các lympho bào đặc hiệu với kháng nguyên là các

tế bào nhớ đq được tạo ra trong đáp ứng miễn dịch tiên phát

- Được đặc trưng bằng:

+ Giai đoạn ẩn tính ngắn ngày (tính bằng giờ)

+ Tăng sinh các lympho bào (đặc hiệu với kháng nguyên);

- Đáp ứng đỉnh cao hơn, lớn hơn so với khi nhiễm lần đầu tiên cùng với kháng nguyên đó

- Độ dài miễn dịch dài hơn với lượng kháng thể cao hơn (còn gọi là đáp ứng miễn dịch hồi ức) hàng tháng hoặc hàng năm sau khi có đáp ứng miễn dịch tiên phát

2.4.4 Miễn dịch thụ động (passive immunity)

Là trạng thái miễn dịch của một cơ thể nhờ các kháng thể chuyển từ ngoài vào, không phải do cơ thể tự sản xuất được Miễn dịch thụ động cũng

Miễn dịch thụ động tự nhiên

Khi kháng thể được truyền một cách tự nhiên từ cơ thể này sang cho cơ thể khác Ví dụ như mẹ truyền kháng thể sang cho con qua nhau thai (đối với gia súc ) hoặc qua lòng đỏ trứng (đối với gia cầm )

Miễn dịch thụ động nhân tạo

Khi kháng thể được con người đưa vào cơ thể gia súc, gia cầm ví dụ khi dùng liệu pháp huyết thanh (serotherapy), tức là tiêm kháng huyết thanh hoặc kháng thể chiết xuất từ kháng huyết thanh hoặc lòng đỏ trứng vào cơ thể để tạo kháng thể thụ động nhằm mục đích phòng và chữa bệnh cho con vật 2.5 Tình hình sử dụng vacxin trên thế giới và khuyến cáo của tổ chức dịch tễ thế giới

2.5.1 Các loại vacxin phòng bệnh hiện nay

Một trong những khó khăn trong sản xuất vacxin là việc chọn virus, vì kháng nguyên H có tầm quan trọng về miễn dịch nhưng do có nhiều các phân type với tính đa dạng khi phân lập trong cùng 1 phân type và sự xuất hiện của các phân type khác nhau khi đq trải qua nhiều năm

a.Vacxin truyền thống

Kháng nguyên virus cúm gia cầm được nuôi cấy trong phôi gà, sau đấy

được vô hoạt bằng hoá chất Kháng nguyên virus sau khi vô hoạt được bổ sung chất bổ trợ nhũ dầu để tăng khả năng đáp ứng miễn dịch Sự tương đồng giữa kháng nguyên trong vacxin và kháng nguyên của virus môi trường có cùng subtype H (heamaglutinin tương đồng) sẽ quyết định hiệu lực của vacxin [45] Việc sử dụng các vacxin vô hoạt đq đạt được những hiệu quả về phương diện sinh học và kinh tế ở một số nước

Vacxin vô hoạt đồng chủng (homologous):

Là vacxin chứa cùng những virus cúm gà giống như chủng gây bệnh trên thực địa Các loại vacxin này được sử dụng rộng rqi ở Mêxicô và Pakistan trong những trận dịch cúm gà

Hiệu lực của những vacxin này trong việc ngăn ngừa bệnh và giảm lượng virus thải ra môi trường đq được chứng minh thông qua các nghiên cứu trên thực địa và các thử nghiệm [46]

Nhược điểm của loại vacxin này là không thể phân biệt gia cầm được tiêm chủng với gia cầm tiếp xúc với mầm bệnh trên thực địa trừ khi có những con chưa được tiêm chủng được nhốt ở trong chuồng

Vacxin vô hoạt dị chủng (heterologous):

Ví dụ như vacxin vô hoạt H5N2 của Intervet (Hà Lan) và của Weiker (Trung Quốc)

Những vacxin này được sản xuất tương tự như vacxin vô hoạt đồng chủng Điểm khác biệt là các chủng virus sử dụng trong vacxin có kháng nguyên H giống chủng virus trên thực địa, nhưng có Neuraminidase (kháng nguyên N) dị chủng

Sau khi tiếp xúc với virus trên thực địa, bảo hộ lâm sàng và giảm bài thải virus ra ngoài môi trường được đảm bảo bằng phản ứng miễn dịch sản sinh bởi kháng nguyên nhóm H đồng chủng, trong khi kháng thể chống Neuraminidase sản sinh bởi virus thực địa có thể sử dụng như chất đánh dấu sự lây nhiễm trên thực địa [25]

Khi so sánh hai loại vacxin đồng chủng và dị chủng như trên sẽ thấy mức

độ bảo hộ lâm sàng và việc giảm bài thải virus ra môi trường bên ngoài của vacxin đồng chủng được cải thiện hơn do khối lượng kháng nguyên trong vacxin cao hơn [47]

b.Vacxin tái tổ hợp (recombinant vaccine):

Ví dụ như vacxin sống virus tái tổ hợp H5 Trovac của Merial (Liên doanh Pháp-Mỹ) và H5N1 của Weiker (Trung Quốc)

Một vài loại vacxin tái tổ hợp phối hợp virus đậu gà chứa kháng nguyên H5 đq và đang được nghiên cứu và phát triển và một vacxin gần đây đq được cấp phép ở Mêxicô [46]

Một số thí nghiệm cho thấy có thể phối hợp virus đậu gà với kháng nguyên H7 Một số virus khác có thể phối hợp với kháng nguyên H5 hoặc H7 như vacxin sử dụng virus viêm thanh khí quản truyền nhiễm (ILTV) [40] Một ưu diểm của vacxin tái tổ hợp hoặc của vacxin chứa kháng nguyên

H là sẽ không xảy ra phản ứng đối với phản ứng miễn dịch ngưng kết kép trên thạch Chính vì vậy các điều tra huyết thanh học khó có thể thực hiện được đối với loại vacxin này

Vacxin tái tổ hợp cho phép phân biệt giữa động vật nhiễm bệnh và động vật tiêm chủng vacxin bởi vì chúng không sản sinh kháng thể chống lại kháng nguyên Nucleoprotein phổ biến ở tất cả các virus cúm gà Chỉ những động vật nhiễm bệnh trên thực địa mới tạo ra kháng thể nhóm A (nucleoprotein) và phát hiện ra kháng thể này qua phản ứng ngưng kết trên thạch hoặc phản ứng ELISA

Việc sử dụng các vacxin này cũng được giới hạn với những loài mà virus

đích sẽ nhân lên hoặc sẽ chỉ được giới hạn trong đàn gà có huyết thanh âm tính với virus đích Ví dụ, ILTV sẽ không nhân lên ở gà tây và gà tây đặc biệt quan trọng trong vấn đề dịch tễ của bệnh cúm gà, việc sử dụng vắc xin được hạn chế ở vùng không có gà tây

c Chiến lược DIVA

Lựa chọn vacxin tương đồng không hoàn toàn cho phép áp dụng chiến lược “DIVA” (Phân biệt con vật nhiễm bệnh và con vật được tiêm phòng) để cho thấy không có virus môi trường đang lưu hành trong đàn gia cầm dùng vacxin Nhóm H tương đồng đảm bảo tính bảo hộ, còn khả năng phân biệt gà chủng ngừa và gà nhiễm bệnh dựa vào đáp ứng huyết thanh nhóm N bằng phản ứng miễn dịch huỳnh quang gián tiếp Gà chủng ngừa chỉ dương tính với nhóm N dùng trong vacxin, còn nếu dương tính với nhóm N của virus môi trường cho thấy đq nhiễm bệnh Sự phát triển của các vacxin mới và các xét nghiệm khác cho phép phát hiện được sự lây nhiễm trên thực địa ở đàn

đq tiêm chủng vacxin là một việc làm ưu tiên đối với công nghiệp dược và đối

với các viện nghiên cứu bởi tiêm chủng vacxin đq là một giải pháp để khống chế bệnh cúm gà [21]

Nếu việc tiêm chủng vacxin được xem xét thì kế hoạch dự phòng phải dự

đoán trước được ngân hàng vacxin đq được cấp phép, cho phép bắt buộc thực hiện được chiến lược “Phân biệt con vật bị nhiễm bệnh với con vật tiêm chủng vacxin”, như vậy đảm bảo được sức khoẻ động vật, đối xử nhân đạo với động vật và thương mại quốc tế [37]

2.5.2 Yêu cầu cần đạt được đối với vacxin phòng bệnh cúm gà

Mỗi loại vắc xin phòng bệnh Cúm gà cần đạt được những yêu cầu cơ bản sau:

a An toàn

Trong chế tạo vacxin, chỉ tiêu an toàn là chỉ tiêu cần được coi trọng hàng

đầu cần phải quan tâm An toàn của vacxin là khi dùng trên vật chủ không gây bệnh và bệnh tích cho các cơ quan trong cơ thể gia cầm Tuy nhiên những biểu hiện phản ứng cục bộ hoắc toàn thân nhẹ trong một thời gian ngắn (triệu chứng không đặc trưng) có thể được chấp nhận ở một số loại vacxin nếu sau

đó con vật trở lại khoẻ mạnh và có miễn dịch Tính an toàn của một vacxin còn phụ thuộc vào thời điểm đưa vacxin vào cơ thể con vật

Theo tiêu chuẩn của Tổ chức dịch tễ thế giới (OIE), vacxin cúm gà vô hoạt đạt tiêu chuẩn an toàn khi tiêm 2 liều sử dụng cho 10 gà 3 tuần tuổi, theo dõi 2 tuần không có biểu hiện của bệnh cũng như bệnh lý cục bộ

b Hiệu lực

Hiệu lực của vacxin còn có thể hiểu là khả năng kích thích tạo miễn dịch

đặc hiệu đủ sức chống bệnh của một vacxin ít nhất là trong giai đoạn mẫn cảm với bệnh

Hiệu lực của vacxin phụ thuộc vào nhiều yếu tố, trong đó tính kháng nguyên của virus vacxin và tính đặc hiệu giữa kháng thể sinh ra và kháng nguyên là quan trọng nhất Những virus có tính kháng nguyên cao và giữ được tính kháng nguyên cao sau khi được chế làm vacxin thì khả năng kích thích

2.5.3 Tình hình sử dụng vacxin cúm gia cầm trên thế giới

Mặc dù có một số loại vacxin đq được nghiên cứu và thử nghiệm trong phòng thí nghiệm về khả năng ứng dụng ngoài thực địa nhưng chỉ có hai loại vacxin được cấp giấy phép và được sử dụng đối với gia cầm: các vacxin virus cúm gia cầm toàn thân, vô hoạt và một vacxin vector virus đậu gà tái tổ hợp với gene AI H5 nhận từ vi rút AI của gà tây A/turkey/Ireland/83 [H5N8]) Công nghệ sản xuất hai loại vacxin này đảm bảo vacxin đạt độ an toàn, tinh khiết và hiệu lực theo yêu cầu Cả hai loại vacxin này đều đòi hỏi bắt và tiêm từng con vật [29]

Số lượng vacxin đq được sử dụng trên thực địa chưa được từng nước thông báo cụ thể, nhưng các nguồn tin đáng tin cậy cho rằng Mêxicô đq sử dụng 1 tỷ 300 triệu liều vacxin vô hoạt và 850 triệu liều vacxin tái tổ hợp đậu

gà trong chương trình sử dụng vacxin chống bệnh cúm gia cầm từ tháng 1 năm

1995 và đq thanh toán được bệnh cúm gia cầm thể độc lực cao do virus H5N2 vào tháng 6 năm 1995, mặc dù virus H5N2 thể độc lực thấp vẫn lưu hành Indonesia cũng sử dụng vacxin AI H5 vô hoạt Từ 1995 Pakistan bắt đầu sử dụng vacxin phòng chống cúm gia cầm ở các ổ dịch H7N3 thể độc lực cao (1995, 2001 và 2004) Các vacxin vô hoạt chế tạo từ chủng virus H9N2 độc lực thấp đq và đang được sử dụng ở một số nước châu á, vùng Cận Đông và

Đông Âu Gần đây, vacxin vô hoạt nhũ dầu H7 đq được dùng cho các vùng có nguy cơ cao ở phía Bắc Italy và tại một công ty nuôi gà con một ngày tuổi ở

+ Vacxin vô hoạt AI (chủng H5, N-28): Bộ Nông nghiệp Trung Quốc

đq phê chuẩn vacxin này là một sản phẩm mới dùng cho gia cầm từ tháng 12

năm 2003 Vacxin này đq được sử dụng rộng rqi ở Trung Quốc trong các ổ dịch cúm gia cầm thể độc lực cao vào đầu năm 2004

+ Vacxin vô hoạt vi rút cúm gia cầm tái tổ hợp (sub-typ H5N1, chủng 1) Bộ Nông nghiệp Trung Quốc đq phê chuẩn vacxin này là sản phẩm mới dùng cho gia cầm từ tháng 1 năm 2005 Vacxin rất có hiệu quả đối với bệnh cúm gia cầm, kích thích gia cầm sản xuất kháng thể với hiệu giá cao hơn và thời gian bảo

Re-hộ dài hơn Các thực nghiệm đq chứng minh rằng thủy cầm được tiêm chủng vacxin này không bị nhiễm và không bài thải virus cúm gia cầm Hiện nay, nhiều nước trên thế giới đq sử dụng kỹ thuật này để chế tạo chủng virus vacxin nhưng chỉ có Trung Quốc là thành công và đq thương mại hóa được vacxin [43]

+ Vacxin sống virus đậu tái tổ hợp phòng cúm gia cầm (H5) Bộ Nông nghiệp Trung Quốc đq phê chuẩn vacxin này là một sản phẩm mới dùng cho gia cầm từ tháng 1 năm 2005 Sử dụng vacxin này có thể phân biệt được miễn dịch do vacxin hay bị nhiễm tự nhiên

2.5.4 Khuyến cáo của OIE về việc sử dụng vacxin phòng chống cúm gia cầm

Đối với bệnh cúm gà, việc sử dụng, tiêm chủng vacxin như một giải pháp, một công cụ hỗ trợ tích cực để ngăn chặn, khống chế và tiến đến thanh toán bệnh cúm gà ở vùng nhiễm bệnh [28]

Theo quan điểm của OIE, vacxin nên được sử dụng như là một biện pháp trong chiến lược toàn diện phòng chống bệnh cúm gia cầm mà chiến lược đó bao gồm:

Lưu ý trước khi sử dụng vacxin:

- Vacxin phải cùng subtyp hemagglutinin và phải được chứng minh trên bản

- Vacxin phải được sản xuất theo công nghệ đq tiêu chuẩn hóa để đảm bảo có một vacxin hiệu quả và phù hợp về chủng virus

- Cần có các hoạch định trước về bảo quản tốt vắc xin, phân phối và sử dụng vacxin

- Đảm bảo được việc giám sát huyết thanh học và virus học để xác định virus cường độc có lưu hành trong đàn gia cầm được dùng vacxin hay không

- Phải có một kế hoạch loại trừ (exit strategy) để phòng tránh việc sử dụng vĩnh viễn vacxin

Lưu ý khi dùng vacxin virus toàn thân vô hoạt:

- Cần một lượng kháng nguyên đủ để kích thích một đáp ứng miễn dịch phòng hộ

- Cần đảm bảo an toàn sinh học cho nhân viên tiêm phòng vacxin ngoài thực địa để ngăn ngừa sự lây lan của virus cường độc

Ưu điểm của tiêm chủng:

- Giảm đáng kể virus bài xuất trong đàn gà nhiễm bệnh

- Giảm thiểu nhu cầu loại thải những đàn gia cầm khoẻ mạnh

- Là phương án thay thế khả thi đối với những đàn gà có giá trị cao và gà chăn nôi gia đình, gà cảnh

- Giảm thiệt hại kinh tế cho ngành chăn nuôi gia cầm công nghiệp Nhược điểm của việc tiêm chủng:

- Không phù hợp với qui định thương mại quốc tế Tiêm chủng được chấp nhận như một biện pháp khống chế dịch cúm gà của OIE

- Những đàn gà tiêm chủng không biểu hiện triệu chứng lâm sàng bệnh cúm Vai trò của việc tiêm phòng trong công tác kiểm soát dịch cúm gia cầm phải được bắt đầu với kết luận rằng bệnh cúm gia cầm độc lực thấp, nếu không được kiểm soát, có thể dẫn tới sự xuất hiện dịch cúm độc lực cao Những vacxin như vậy có thể giảm sự nghiêm trọng của bệnh và sự lan truyền của virus trong tình huống thực tế, nhưng virus có thể sẽ không bị loại hoàn toàn khỏi đàn gia cầm[41]

3 Nội dung, nguyên liệu, phương pháp nghiên cứu

3.1 Nội dung nghiên cứu

- Gây miễn dịch chủ động cho gà bằng vacxin cúm gia cầm H5N2 theo các lịch trình khác nhau

- Giám sát gà chỉ báo sau tiêm phòng

- Đánh giá đáp ứng miễn dịch và độ dài miễn dịch của gà sau khi tiêm phòng vacxin

- Đánh giá đáp ứng miễn dịch thụ động qua lòng đỏ trứng gà

- Đánh giá đáp ứng miễn dịch thụ động ở gà con

3.2 nguyên liệu dùng trong nghiên cứu

Các hoá chất dùng trong xét nghiệm

* Môi trường và hoá chất bảo quản bệnh phẩm

- Môi trường 199 chứa 0,5% BSA (Albumin huyết thanh bò) có bổ sung kháng sinh

- Dung dÞch n−íc muèi sinh lý 0,85%:

8,5 g NaCl trong 1 lÝt n−íc cÊt

HÊp v« trïng, b¶o qu¶n 4oC kh«ng qu¸ 3 tuÇn

- Dung dÞch hång cÇu gµ 1%:

+ Máu gà trống khoẻ mạnh đq trưởng thành, không có kháng thể cúm và Newcastle

+ Dùng bơm tiêm 5 - 10ml hút sẵn 1ml (10% thể tích) dung dịch chống

đông (Natri Citrat 4%) rồi lấy máu gà cho máu vào ống nghiệm

+ Ly tâm 1000 - 1500 vòng/phút, trong 15 phút, hút bỏ huyết tương, cho thêm nước sinh lý (NaCl 0,85%) vào hồng cầu, lắc đều Ly tâm như trên 3- 4 lần để rửa hồng cầu, sau lần ly tâm cuối hút bỏ nước ở trên

+ Pha hồng cầu thành huyễn dịch 1% bằng cách pha 1 ml hồng cầu với

99 ml nước muối sinh lý

+ Bảo quản huyễn dịch hồng cầu ở nhiệt độ 4 - 8oC Hồng cầu sau khi pha có thể dùng trong 4 - 5 ngày (nếu dung dịch hồng cầu bị dung huyết thì loại bỏ không dùng)

* Kháng huyết thanh chuẩn:

- Kháng huyết thanh chuẩn trên các loài như thỏ, dê, cừu cần được xử

lý bằng RDE (Receptor Destroying Enzyme) trước khi xét nghiệm

- Kháng huyết thanh chế trên gà không cần xử lý bằng RDE Tuy nhiên, nếu phản ứng cho kết quả không rõ ràng kháng huyết thanh có thể xử lý RDE

- ủ tiếp ở nồi đun cách thuỷ nhiệt độ 56oC/30 phút để vô hoạt RDE còn dư

- Kháng huyết thanh đq xử lý để nguội cho thêm 6 phần nước sinh lý (0,3ml HT + 1,8ml SL), độ pha loqng cuối cùng của kháng huyết thanh là 1/10 Lấy mẫu huyết thanh

- Mẫu huyết thanh: lấy 3 - 5 ml máu gia cầm vào ống nghiệm để nghiêng, chờ máu đông chắt lấy huyết thanh

Mẫu huyết thanh có thể để ở nhiệt độ 40C trong vòng một tuần, nếu giữ ở nhiệt độ - 200C sẽ bảo quản lâu hơn,

3.3 Phương pháp nghiên cứu

Phương pháp thu thập số liệu, lấy mẫu ngẫu nhiên, khách quan, trung thực Phương pháp vận chuyển, bảo quản, sử dụng vacxin và kỹ thuật tiêm phòng thực hiện theo quy trình của nhà sản xuất vacxin

Xác định hiệu giá kháng thể và độ dài miễn dịch của gà mẹ, gà con, lòng

Cho 25àl PBS (pH 7,2) vào tất cả các giếng

Cho 25 àl kháng nguyên chuẩn hoặc kháng nguyên phân lập vào các giếng từ

Pha loqng bậc 2 kháng nguyên kiểm tra Chuyển 25 àl từ giếng 1 đến giếng 11 rồi bỏ đi 25 àl

Cột 12 dùng làm đối chứng, chỉ chứa: 25 àl PBS và 25 àl hồng cầu gà 1%

Cho 25 àl hồng cầu gà 1% vào các giếng phản ứng

Lắc nhẹ bằng tay hoặc bằng máy Để ở nhiệt độ phòng trong 30 phút

Đọc kết quả

+ Đọc kết quả:

Phản ứng (-) : hồng cầu lắng đều ở dưới đáy

Phản ứng (+): xảy ra hiện tượng ngưng kết, hồng cầu ngưng kết thành cụm lấm tấm xung quanh giếng

Đọc hiệu giá ngưng kết: hiệu giá ngưng kết kháng nguyên được đánh giá

ở độ pha loqng cao nhất còn có phản ứng ngưng kết xảy ra

• Phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI)

Nhỏ 25 àl PBS vào các giếng đáy chữ V của đĩa 96 giếng

Nhỏ tiếp 25 àl huyết thanh vào giếng đầu tiên

Pha loqng huyết thanh theo cơ số 2, bằng cách chuyển 25 àl huyết thanh

từ giếng 1 sang giếng 2 và tuần tự đến giếng 11 và bỏ đi 25 àl cuối cùng Nhỏ 25 àl kháng nguyên 8 HA đq chuẩn bị vào các giếng từ giếng 1-11 Thêm 25 àl PBS vào hàng đối chứng hồng cầu (giếng 12)

Theo quy định 1361/KTY - DT ngày 02/12/2005 của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn:

Ngưỡng bảo hộ, hiệu giá (HI) = 4 log2

Kháng thể cao, hiệu giá (HI) > 4 log2

Không được bảo hộ, hiệu giá (HI) < 4 log2