đánh giá sự đa dạng của các dòng, giống đậu tương dựa trên chỉ thị hình thái và chỉ thị phân tử SSR

Tr ường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦiBỘ GIÁO DỤC VÀ đÀO TẠO TRƯỜNG đẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI ------ TRIỆU THỊ THỊNH đÁNH GIÁ SỰ đA DẠNG CỦA C

Tr ường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦi

BỘ GIÁO DỤC VÀ đÀO TẠO TRƯỜNG đẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

-
-

TRIỆU THỊ THỊNH

đÁNH GIÁ SỰ đA DẠNG CỦA CÁC DÒNG, GIỐNG đẬU TƯƠNG

DỰA TRÊN CHỈ THỊ HÌNH THÁI VÀ CHỈ THỊ PHÂN TỬ SSR

LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP

Chuyên nghành: Trồng trọt

Mã số: 60.62.01

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Vũ đình Hòa

HÀ NỘI- 2009

Tr ường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………ii

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan các số liệu kết quả nêu trong luận văn là trung thực

và chưa từng ñược ai công bố trong bất kì công trình nào khác

Tôi xin cam ñoan các thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc, những tập thể và cá nhân giúp ñỡ ñã ñược cảm ơn

Tác giả luận văn

Triệu Thị Thịnh

Tr ường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦiii

LỜI CẢM ƠN

Hoàn thành cuốn luận văn này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới PGS.TS Vũ đình Hòa người ựã tận tình hướng dẫn, giúp ựỡ tạo ựiều kiện

ựể tôi hoàn thành luận văn này

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn sự giúp ựỡ tận tình của cô Vũ Thị Thúy Hằng, giáo viên Bộ môn Di truyền Ờ Giống ựã giúp ựỡ tôi trong quá trình thực hiện luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp ựỡ của thầy cô giáo trong Khoa Nông học, Viện đào Tạo Sau đại Học, Khoa Công nghệ sinh học, Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh ựạo Trung Tâm Nghiên Cứu Bệnh Cây Nhiệt đới cùng các anh chị trong Trung Tâm ựã giúp ựỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện luận văn này

Tôi cũng xin gửi lời cám ơn tới bạn bè, ựồng nghiệp, gia ựình ựã ựộng viên, giúp ựỡ, tạo mọi ựiều kiện ựể tôi hoàn thành luận văn này

Tác giả luận văn

Triệu Thị Thịnh

Tr ường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………iv

MỤC LỤC PHẦN I MỞ ðẦU i

1.1 ðặt vấn ñề 1

1.2 Mục ñích và yêu cầu của ñề tài 3

1.2.1 Mục ñích 3

1.2.2 Yêu cầu 3

1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của ñề tài 4

1.3.1 Ý nghĩa khoa học của ñề tài 4

1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn 4

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

2.1 Mở ñầu 5

2.2 Tình hình nghiên cứu ñậu tương ở trên thế giới và Việt Nam 6

2.2.1 Tình hình nghiên cứu ñậu tương trên thế giới 6

2.2.2 Tình hình nghiên cứu ñậu tương ở Việt Nam 13

2.3 ða dạng di truyền và chỉ thị phân tử 16

2.3.1 ða dạng di truyền 16

2.3.2 Chỉ thị di truyền 17

2.3.3 Một số chỉ thị phân tử 20

2.4 Ứng dụng chỉ thị phân tử trong ñánh giá ña dạng di truyền 23

2.5 Ứng dụng chỉ thị phân tử trong ñánh giá ña dạng di truyền của ñậu tương 26

PHẦN 3 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29

3.1 Vật liệu nghiên cứu 29

3.2 Nội dung nghiên cứu 29

Tr ường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………v

3.3 Gieo trồng và theo dõi các chỉ tiêu hình thái 29

3.3.1 ðặc ñiểm sinh trưởng và hình thái 29

3.3.2 Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất 34

3.4 Phân tích chỉ thị SSR 34

3.4.1 Tách chiết ADN 34

3.4.2 Phản ứng PCR 35

3.4.3 ðiện di và score vạch 37

3.5 Phương pháp xử lý số liệu 37

3.5.1 Phân tích ña dạng di truyền dựa trên hình thái 37

3.5.2 Phân tích ña dạng di truyền dựa trên chỉ thị SSR 37

PHẦN 4 KẾT QỦA NGHIÊN CỨU 38

4.1 ðặc ñiểm sinh trưởng và phát triển của các mẫu giống ñậu tương 38

4.1.1 Kiểu thời gian sinh trưởng 38

4.1.2 Thời gian sinh trưởng và phát triển 39

4.1.3 ðặc ñiểm chiều cao cây 43

4.2 Khả năng chống chịu của một số mẫu giống ñậu tương 45

4.2.1 Mức ñộ nhiễm sâu bệnh 45

4.2.2 Khả năng chống ñổ 49

4.3 Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất của các mẫu giống ñậu tương 51

4.3.1 Số cành cấp 1 và số ñốt hữu hiệu của các mẫu giống ñậu tương 51

4.3.2 Tổng số quả/cây và khối lượng 1000 hạt 53

4.3.3 Năng suất của các mẫu giống ñậu tương 57

Tr ường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦvi

4.4 Mối tương quan giữa một số tắnh trạng tới năng suất của các mẫu giống ựậu tương trong thắ nghiệm 60

4.5 Sự ựa dạng của các mẫu giống ựậu tương dựa trên ựặc ựiểm hình thái61 4.5.1 đặc ựiểm thân mầm 61

4.5.2 đặc ựiểm lá ựậu tương 64

4.5.3 đặc ựiểm hoa, quả và hạt ựậu tương 67

4.6 Sự ựa dạng di truyền của các mẫu giống ựậu tương dựa trên chỉ thị hình thái 70

4.7 Tắnh ựa hình về chỉ thị phân tử SSR của các mẫu giống ựậu tương 73

4.7.1 Kết quả tách chiết ADN 73

4.7.2 Mức ựa hình của 10 cặp mồi SSR 74

4.7.3 đa dạng di truyền của các mẫu giống ựậu tương dựa trên chỉ thị phân tử SSR 76

4.7.4 So sánh giữa sự ựa dạng dựa vào chỉ thị hình thái và chỉ thị phân tử SSR 79

PHẦN 5 KẾT LUẬN VÀ đỀ NGHỊ 81

5.1 Kết luận 81

5.1.1 Khả năng sinh trưởng, phát triển và năng suất của các mẫu giống ựậu tương 81

5.1.2 đánh giá 36 mẫu giống ựậu tương bằng tắnh trạng hình thái 81

5.1.3 đánh giá 36 mẫu giống ựậu tương bằng chỉ thị phân tử SSR 81

5.2 đề nghị 82

TÀI LIỆU THAM KHẢO 83

PHỤ LỤC 91

Tr ường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………vii

DANH MỤC CÁC BẢNG 1 Bảng 3.1 Nguồn vật liệu ñậu tương sử dụng trong ñánh giá ña dạng di truyền……… 30

2 Bảng 3.2 Các tính trạng ñược ñánh giá……… 32

3 Bảng 3.3 10 cặp mồi SSR ñược sử dụng trong thí nghiệm……….35

4 Bảng 3.4 Thành phần các chất tham gia phản ứng PCR………35

5 Bảng 3.5 Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR ñối với ñậu tương……… … 36

6 Bảng 4.1 Thời gian sinh trưởng của các dòng, giống ñậu tương ……… 39

7 Bảng 4.2 Chiều cao cây của các dòng, giống ñậu tương………43

8 Bảng 4.3 Mức ñộ nhiễm sâu của các dòng, giống ñậu tương tham gia thí nghiệm……….45

9 Bảng 4.4 Mức ñộ nhiễm bệnh của các dòng, giống ñậu tương tham gia thí nghiệm………47

10 Bảng 4.5 Khả năng chống ñổ của các dòng, giống ñậu tương………….49

11 Bảng 4.6 Một số ñặc ñiểm thực vật học chính của các dòng, giống ñậu tương………51

12 Bảng 4.7 Các yếu tố cấu thành năng suất của ñậu tương……….54

13 Bảng 4.8.Năng suất của các dòng, giống ñậu tương tham gia thí nghiệm……….56

14 Bảng 4.9 Hệ số tương quan giữa năng suất với một số tính trạng…… 57

15 Bảng 4.10 Một số ñặc ñiểm hình thái của các dòng, giống ñậu tương tham gia thí nghiệm……… 60

16 Bảng 4.11 Một số ñặc ñiểm về hình dạng lá chét của các dòng, giống ñậu tương………63

17 Bảng 4.12 Một số ñặc ñiểm của hoa, quả , hạt ñậu tương………66

18 Bảng 4.13 Một số ñặc ñiểm thực vật học của các nhóm……… 69

20 Bảng 4.14 Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất……… 70

21 Bảng 4.15 Số băng và thông tin ña hình PIC của 10 cặp mồi SSR…… 73

Tr ường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………1

PHẦN I MỞ ðẦU 1.1 ðặt vấn đề

Cây ñậu tương Glycine max (L) Merrill là một trong những cây trồng

quan trọng ở nước ta ðậu tương là cây họ ñậu ngắn ngày, có thể trồng ñược 3

- 4 vụ trong năm trong các hệ thống luân canh tăng vụ trên 7 vùng sinh thái của nước ta

Sản phẩm cây ñậu tương không những là nguồn thực phẩm giàu protein, vitamin và các khoáng chất trong bữa ăn hàng ngày của người dân các nước ñang phát triển mà còn là nguyên liệu cho các nghành công nghiệp chế biến và là nguồn thức ăn quan trọng cho chăn nuôi

Bên cạnh ñó, cây ñậu tương cũng ñược coi là một thành phần quan trọng trong hệ thống canh tác về phương diện sinh thái Do có khả năng cố ñịnh ñạm, ñậu tương ít bị phụ thuộc vào phân ñạm hơn so với các cây trồng khác ðậu tương cũng góp phần nâng cao ñộ phì nhiêu của ñất và cung cấp nguồn ñạm cho cây trồng vụ sau Vì thế ñậu tương ñã trở thành cây trồng quan trọng trong luân canh và trồng xen ở nhiều nước trên thế giới

ðối với Việt Nam, ñậu tương là một cây luân canh, xen canh, gối vụ rất quan trọng trong cơ cấu cây trồng, góp phần nâng cao năng suất cây trồng vụ sau và nâng cao hệ số sử dụng ñất ðiều này có ý nghĩa to lớn trong phương châm chuyển ñổi cơ cấu, ña dạng hóa cây trồng ở nước ta hiện nay ðặc biệt, trong chiến lược thâm canh tăng vụ, việc ñưa vào luân canh những cây trồng

có giá trị cải tạo ñất là một vấn ñề thiết yếu, nhằm nâng cao năng suất cây trồng và sử dụng ñất bền vững Chính vì những giá trị ñó, cây ñậu tương chiếm giữa một vị trí quan trọng trong nền nông nghiệp ở nước ta

Sự phát triển nhanh và mạnh mẽ của công nghệ sinh học ñã mang lại nhiều thành tựu to lớn trong nông nghiệp Nghiên cứu và ứng dụng công nghệ

Tr ường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………2

sinh học trong chọn giống cây trồng đã được nhiều nhà khoa học quan tâm Trong các cơng cụ, chỉ thị phân tử là cơng cụ hữu ích đối với chọn tạo giống

cây trồng, đĩ là RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), RAPD

(Ramdom amplified polymorphic DNA) , SSR (Simple Sequence Repeats), STS

(Sequence Tagged Site) ðối với vật liệu chọn giống chỉ thị phân tử được sử dụng để phân tích đa dạng di truyền và xác định các mối quan hệ trong nguồn gen hay nguồn vật liệu khởi đầu Chỉ thị phân tử cịn được dùng trong thiết lập bản đồ gen hoặc xác định locus tính trạng chất lượng và số lượng nhằm cung cấp thơng tin di truyền của các tính trạng

Trong các chỉ thị phân tử, chỉ thị SSR (Simple Sequence Repeats) hay

microsatellite cĩ nhiều ưu điểm: i) đồng trội và dựa trên PCR, ii) cĩ độ tin cậy cao và chính xác, iii) đa allen và biến động mạnh Chỉ thị SSR là những đoạn lặp lại ngắn phân bố ngẫu nhiên và đồng đều trên tồn genom (Hamada và

CS, 1982) [44] Sự biến động mạnh về số lượng các đơn vị SSR làm cho chỉ thị SSR là một cơng cụ tuyệt vời để phân hĩa kiểu gen, phân tích phả hệ và đánh giá khoảng cách di tuyền giữa các cá thể hay quần thể Chỉ thị SSR đã được sử dụng thành cơng để phân tích kiểu gen của nhiều lồi cây trồng, như

cà chua (Phillips và CS, 1994) [63], cải dầu (Kresovich và CS, 1995) [53], khoai tây (Schneider và Douches, 1997) [66] và những cây trồng khác Tính

đa hình cao ở các locus SSR cũng đã được phát hiện ở đậu tương (Akkaya và

CS, 1992; Cregan và CS, 1994; Narvel và CS, 2000; Messang và CS, 2001) [33], [37], [61], [59] Chỉ thị SSR đã được sử dụng thành cơng và hiệu quả trong phân tích đa dạng di truyền, phân loại các giống cây trồng, xây dựng bản đồ liên kết, phân lập (gen), xác định quan hệ di truyền giữa các dịng giống cây trồng và chẩn đốn cặp lai cho ưu thế lai (Akash, 2003) [60]

ðậu tương là một cây trồng tự thụ phấn, cĩ sự biến động di truyền hạn chế Chỉ thị hình thái và chỉ thị RFLP cho thấy sự đa dạng di truyền thấp

Tr ường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ3

(Keim và cộng sự, 1992) [52] Những chỉ thị khác như RAPD, SSR ựã ựược kiểm chứng là những chị thị có ắch ựể phát hiện sự ựa dạng di truyền ở ựậu tương (Akkaya và CS, 1992) [33] Vì vậy, sự ựa dạng di truyền của nguồn vật liệu ựậu tương không thể chỉ dựa vào sự ựa dạng hình thái, mà cần bổ sung bằng chỉ thị phân tử nhằm cung cấp cở sở cho các nhà chọn giống ựánh giá ựể sử dụng trong cải tiến tạo các giống theo mục tiêu cho trước Tuy nhiên, ở nước ta chưa có nhiều tài liệu ựề cập ựến ựánh giá sự ựa dạng di truyền bằng chỉ thị phân tử đề tài của chúng tôi trình bày kết quả bước ựầu

về: Ộđánh giá sự ựa dạng của các dòng, giống ựậu tương dựa trên chỉ thị

Sử dụng phương pháp SSR ựể ựánh giá ựa dạng di truyền giữa 36 dòng, giống ựậu tương trên cơ sở phân tắch ADN, xác ựịnh khoảng cách di truyền,

vẽ biểu ựồ biểu hiện mối quan hệ này

Tr ường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ4

1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của ựề tài

1.3.1 Ý nghĩa khoa học của ựề tài

đề tài nghiên cứu sử dụng các chỉ thị hình thái và phân tử trên cơ sở phân tắch các tắnh trạng chất lượng và phân tắch ADN ựã xác ựịnh ựược khoảng cách di truyền của các giống thắ nghiệm đó là một biện pháp khoa học ựể xác ựịnh tắnh ựa dạng di truyền giữa các dòng, giống ựậu tương

1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn

Kết quả của ựề tài là dẫn liệu khoa học làm cơ sở cho các nhà chọn tạo giống tham khảo và sử dụng trong lựa chọn vật liệu khởi ựầu trong lai tạo giống

Tr ường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………5

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Mở ñầu

ðậu tương (Glycine max (L.) Merrill.) là một trong những cây trồng có

từ lâu ñời ðậu tương thuộc họ ñậu Fabaceae, họ phụ Faboideae, tộc

Phaseoleae, tộc phụ Glycininae, chi Glycine Willd Glycine gồm hai chi phụ

là Glycine và Soja ðậu tương ñược thuần hóa từ ñậu tương hoang dại Glycine

soja Sieb & Zucc Tên khoa học của ñậu tương Glycine max (L.) Merrill, do

Ricker và Morse ñề xuất năm 1948 rồi trở thành tên gọi chính thức

Các nghiên cứu dựa trên tài liệu về ngôn ngữ, ñịa lý, lịch sử và các bằng chứng khảo cổ học ñều chỉ ra rằng phía Bắc Trung Quốc là trung tâm khởi nguyên và ña dạng của ñậu tương trồng ngày nay (Hymowitz, 1970) [48] Sau ñó, ñậu tương ñược phát tán ñến các nước Châu Á khác như Hàn Quốc, Nhật Bản, Indonesia, Philippines, Ấn ðộ, Thái Lan, Việt Nam và Nepal ðến thế kỷ thứ 16, 17, ñậu tương ñược du nhập vào Châu Âu và Bắc

Mỹ (Singh and Hymowitz, 1999) [68]

Ba vốn gen cây trồng là vốn gen sơ cấp, thứ cấp và tam cấp dựa trên tỷ

lệ thành công khi lai giữa các loài (Harlan and de Wet, 1971) [46] Vốn gen

sơ cấp của ñậu tương gồm ñậu tương trồng (G max) tổ tiên hoang dại của nó (G soja) và dạng cỏ dại (G gracilis) Vốn gen thứ cấp ñược ñịnh nghĩa là

“Tất cả các loài có thể lai với vốn gen sơ cấp nhưng phải có ít nhất một số cá thể hữu dục ở F1”, và như vậy, ñậu tương không có vốn gen thứ cấp (Singh

and Hymowitz, 1999) [68] Vốn gen tam cấp của G max gồm có 16 loài hoang dại lâu năm trong chi phụ Glycine, chủ yếu là các loài bản ñịa của Ôxtrâylia Một số các loài khác trong chi phụ Glycine cũng ñược tìm thấy ở

các ñảo phía nam Thái Bình Dương và ñảo Miyako của Nhật Bản Riggs và

cộng sự (1988) [64] ñã chỉ ra rằng chuyển gen từ các loài hoang dại sang ñậu

Tr ường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………6

tương có thể thực hiện ñược thông qua lai giữa các chi và các dòng lưỡng bội hữu dục cải tiến

ðậu tương là một cây trồng cho hạt có giá trị kinh tế quan trọng và có giá trị sử dụng ở nhiều mặt do giàu protein (trong khoảng 30% - 48%, trung bình 40%) và dầu (trong khoảng 13 - 22%, trung bình 20%) (Singh and Hymowitz, 1999) [68] Do ñó, ñậu tương là nguồn protein, vitamin và khoáng chất quan trọng cho con người và gia súc Các thành phần khác của hạt ñậu tương cũng ñược sử dụng trong nhiều lĩnh vực công nghiệp như làm men, vec-ni, xà phòng, thực phẩm, các dược phẩm và sản phẩm nông nghiệp Các sản phẩm ñậu tương như sữa ñậu nành, ñậu phụ, tương ñã trở nên phổ biến trong bữa ăn hàng ngày của người Châu Á Các nước phương Tây sử dụng ñậu tương trong bơ thực vật, dầu nấu và dầu làm salad (Lu, 2004) [58] Hơn nữa, ñậu tương ñược xếp ñứng ñầu về sản xuất dầu trên thị trường thương mại quốc tế (48%) so với các cây trồng khác như hạt bông, lạc, hướng dương, dừa

và cọ dầu

Ngày nay, ñậu tương là một cây trồng quan trọng trên thế giới với diện tích gieo trồng khoảng 80 triệu hecta và sản lượng khoảng 197 triệu khối

(Charron và cộng sự, 2005) [35] Mỹ, Trung Quốc, Bắc Triều Tiên, Hàn

Quốc, Braxin và Achentina là những nước sản xuất ñậu tương chính, chiếm 90% sản lượng của thế giới (Lu , 2004) [58]

2.2 Tình hình nghiên cứu ñậu tương ở trên thế giới và Việt Nam

2.2.1 Tình hình nghiên cứu ñậu tương trên thế giới

Cây ñậu tương ngày nay ñã ñược trồng rộng rãi khắp các châu lục, trải dài từ 48o vĩ ñộ Bắc ñến 15o vĩ ñộ Nam Mục tiêu của các nhà chọn giống hiện nay là nâng cao năng suất ñậu tương, ngoài ra còn quan tâm ñến việc tạo ra các giống có phẩm chất cao, khả năng chống chịu sâu bệnh tốt, thích hợp với việc cơ giới hoá nông nghiệp Nhiều phương pháp khác nhau ñã ñược sử dụng

Tr ường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ7

trong chọn tạo giống ựậu tưong như lai tạo, ựa bội thể, ựột biến, ghép sinh dưỡng và chuyển gen

Vật liệu khởi ựầu ựóng vai trò quan trọng trong chọn tạo giống cây trồng Vật liệu khởi ựầu có thể là các loài hoang dại, các giống ựậu tương ựịa phương và các biến dị ựược phát hiện trong tự nhiên đặc biệt, các loài hoang dại cung cấp nguồn gen cho các tắnh trạng như tắnh chống chịu sâu bệnh và ựiều kiện ngoại cảnh bất lợi, và phản ứng ựặc biệt với quang chu kỳ (Fernie

và cộng sự, 2006) [41] Vắ dụ một số loài ựậu tương hoang dại có mang tắnh trạng mong muốn như tắnh chống chịu sâu bệnh, kháng thuốc diệt cỏ, có khả năng chịu ựược khô hạn và ắt mẫn cảm với quang chu kỳ Hiện nay nguồn gen ựậu tương ựược lưu giữ chủ yếu ở 15 nước trên thế giới: đài Loan, Úc, Trung Quốc, Pháp, Nigieria, Ấn độ, Nhật Bản, Indonesia, Nam Triều Tiên, Bắc Triều Tiên, Nam Phi, Thụy điển, Thái Lan, Mỹ và Liên Xô (Trần đình Long, 1991) [13]

Năng suất ựậu tương trên thế giới trong những năm qua tăng lên không ựáng kể Nguyên nhân là do qua nhiều năm, chọn tạo giống ựậu tương chỉ giới hạn trong lai tạo giữa các loài trong vốn gen sơ cấp và chọn lọc những giống có năng suất, thành phần protein và dầu cao, dẫn ựến nền di truyền hẹp Vắ dụ, chỉ

có 6 loài ựóng góp vào hơn một nửa nền di truyền của các giống ựậu tương

trồng ở miền Bắc nước Mỹ (Gizlice và cộng sự, 1994) [43] Nền di truyền hẹp

cũng có thể ảnh hưởng ựến phương pháp chọn tạo giống Các phương pháp chọn giống truyền thống thường ựược sử dụng trong chọn tạo các giống cho năng suất cao, kháng sâu, thời gian sinh trưởng, chịu úng, hàm lượng dầu và protein là phương pháp phả hệ, trồng dồn, hỗn hợp và phương pháp một hạt Hơn nữa, do ựậu tương phản ứng với quang chu kỳ nên việc sử dụng các nhóm sinh trưởng khác nhau trong lai tạo giống ở ựậu tương là rất hiếm

Tr ường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ8

Một số nước rất chú trọng ựến chọn tạo giống ựậu tương bao gồm Mỹ, Canada, Braxin và Trung Quốc Mỹ và Canada hiện nay có gần 10.000 Mẫu giống, ựưa vào sản xuất hơn 100 dòng có khả năng thắch ứng rộng và chống

chịu tốt với bệnh do Phytopthora, ựiển hình như các giống Amsoy71, Harkey

36, Clark36 Hướng nghiên cứu chắnh của các nhà chọn giống Mỹ là sử dụng các tổ hợp lai phức tạp và thuần hoá giống nhập nội thành giống thắch nghi với từng vùng sinh thái (Johnson và Bernard, 1967) [51]

Ở Braxin, từ năm 1976 ựến nay trung tâm nghiên cứu quốc gia Braxin

ựã chọn tạo ra ựược nhiều giống mới như Doko, Numbaira, CristalinẦvới

1500 dòng giống ựậu tương khác nhau Trong ựó, năng suất cao nhất là giống Cristalin ựạt 38 tạ/ha Thời gian tới Braxin chọn giống theo hướng có thời

gian sinh trưởng 107- 120 ngày, năng suất cao, kháng sâu bệnh rộng và chất

lượng tốt(Tsukuba, Japan, 1993) [70]

Trung Quốc là quốc gia sản xuất ựậu tương hàng ựầu châu Á Dựa trên nguồn vật liệu di truyền thu thập từ nhiều quốc gia và vùng sinh thái, Trung Quốc ựã tạo ra nhiều giống ựậu tương có năng suất cao, chất lượng tốt, chống chịu với các ựiều kiện ngoại cảnh bất thuận điển hình là các giống CN001, CN002, HTF18, YAT12, ựạt năng suất trên diện rộng là 24 - 42 tạ/ha (The Asian Soybean Network, 1994) [72] Trong số các giống có năng suất cao, giống Tạp Hoàng ựược nhập vào Việt Nam có tiềm năng năng suất 40 Ờ 45 tạ/ha (Dương đình Tường, 2006) [26]

Trong các phương pháp chọn tạo giống ở ựậu tương, lai hữu tắnh vẫn là phương pháp hiệu quả nhất Lai hữu tắnh có thể tạo ra các tổ hợp mới mang tắnh trạng mong muốn của bố mẹ và có khả năng vượt trội bố mẹ Bằng cách lai hai giống Wiliam và Rexon (1970), sau ựó tiến hành chọn lọc liên tiếp ựến

F4 ựã tạo ra giống Efl thuộc nhóm chắn III và thấp cây (55cm) hơn nhiều so với Wiliam (93cm) chống ựổ tốt năng suất cao (Johnson và Bernard, 1967)

Tr ường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ9

[51] Từ lai giữa các ựột biến phóng xạ, Liên Xô ựã thu ựược giống ựậu tương Sudo - orusi 77 có khối lượng 1000 hạt lớn (450 gam), lá lớn thân dầy, năng suất ựạt 35 tạ/ha (Trần đình Long, 1978) [12] Giống Lee thu ựược từ lai S -

100 x CNS có năng suất khá, giữ hạt, chống ựược các bệnh mụn mủ, bỏng rộp, ựốm mắt ếch và chấm ựỏ ở hạt (FAO, 1990) [31]

Tuy nhiên, một trong những khó khăn khi lai hữu tắnh ở ựậu tương là hoa bé và tỷ lệ ựậu quả thấp, ựòi hòi phải thụ phấn nhiều hoa, tốn nhiều thời gian và công sức Mặt khác, hoa ựậu tương là hoa thụ phấn ngậm (quá trình thụ phấn thụ tinh xảy ra khi hoa chưa nở) nên ựòi hỏi phải khử ựực ựúng thời ựiểm Charlen A.Srin ựã phát hiện ra cây ựậu tương bất dục ựực nhưng nhụy vẫn có khả năng thụ tinh tốt Do ựó, dòng bất dục ựực có thể sử dụng làm cây

mẹ khi lai và như vậy sẽ cho phép lai ựược nhiều hơn, giảm thời gian và công sức (Trần đình Long, 1977) [11]

Chọn giống ựột biến ở ựậu tương ựi sau rất nhiều so với các cây trồng quan trọng khác như lúa, lúa mì nhưng cũng là một trong các phương pháp hiệu quả nhờ ựem lại nhiều biến dị phong phú.Tác nhân gây ựột biến, chủ yếu

là tác nhân hóa học, ựã ựược sử dụng thành công trong cải tiến một số tắnh trạng ở ựậu tương Vắ dụ, sử dụng tác nhân hóa học (ethyl methansulfonate EMS hay ethyl nittrosourea) ựã thu ựược các dòng ựậu tương có khả năng

chống chịu thuốc diệt cỏ (Sebastian và cộng sự, 1989) [67] đặc biệt, tác nhân

hóa học ựược sử dụng rất hiệu quả trong việc tạo ra những biến ựộng về hàm lượng các acid béo trong ựậu tương như palmitic (11%), stearic (3%), oleic (22%), linoleic (56%) và linolenic acid (8%) Một dòng chứa trung bình 4,1% linolenic acid ựã ựược chọn lọc từ thế hệ M4 qua gây ựột biến bằng EMS

(Hammond and Fehr 1983) [45] Wilcox và cộng sự (1984) [75] ựã thu ựược

cá thể ựột biến ổn ựịnh di truyền và có hàm lượng linolenic acid thấp (3,4%)

Tr ường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ10

từ các thế hệ M2, cũng từ gây ựột biến bằng EMS Hai dòng ựột biến khác có chứa 8,5 axit palmitic và 17,2% axit palmetic cũng thu ựược từ sử dụng EMS

Một hướng chọn tạo giống ựậu tương nữa trong ựiều kiện khắ hậu toàn cầu có nhiều biến ựổi là chọn tạo giống ựậu tương chịu hạn Khả năng chịu hạn của các giống có liên quan ựến sự phát triển nhanh của bộ rễ, tắnh chắn sớm tương ựối cũng như với bản chất di truyền về khả năng sử dụng nước một cách tiết kiệm trong quá trình sinh trưởng phát triển của cây Hạn hán gây

ra sự ức chế cho các bộ phận của cây xảy ra theo chiều lá - thân - rễ Khi kết thúc hạn các phản ứng phục hồi xảy ra theo chiều ngược lại (rễ - thân - lá) (Nguyễn Huy Hoàng, 1992) [8] Các giống chịu hạn ựược chia thành 2 nhóm: nhóm có khả năng chống chịu sự thiếu nước ở tất cả các giai ựoạn của quá trình phát triển và nhóm có khả năng chịu hạn ở từng giai ựoạn riêng rẽ trong quá trình phát triển Các giống thuộc nhóm thứ hai thường có năng suất không

bị giảm ựáng kể khi gặp hạn vì các giai ựoạn tới hạn của sự sinh trưởng phát triển không trùng với thời kỳ hạn, còn giai ựoạn tạo quả của các giống này thì không dài

đậu tương cũng là loại cây trồng mẫn cảm với nhiều sâu bệnh Do ựó, chọn tạo giống có khả năng chống chịu sâu bệnh luôn là mối quan tâm của

các nhà chọn giống Vắ dụ, bệnh gỉ sắt ựậu tương do nấm Phakopsora

pachyrhizi có thể làm giảm năng suất từ 30 - 80% nếu thời gian bị bệnh trùng với thời gian cây ra hoa ựậu quả Bệnh gỉ sắt nay ựã xuất hiện khắp châu Á, từ Trung Quốc ựến đông Nam Á, xuôi về phắa nam ựến Úc

Năm 1971, Úc ựã nhập 3 giống ựậu tương PI.200492, Tainung 3, Tainung 4 chống bệnh gỉ sắt ựể thử nghiệm và lai tạo Từ thế hệ F3 của 4 cặp lai P.I.200492 x Ogden, Tainung 3 x Ross, Tainung 4 x Gilbent và Tainung 4

x Ross, mức ựộ chống chịu và kiểu phản ứng với bệnh gỉ sắt ựã ựược chia

thành 3 kiểu: Kiểu I - miễn dịch với bệnh, không có vết bệnh xuất hiện trên

Tr ường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………11

lá; kiểu R - có vết bệnh hoại thư, không có bào tử xuất hiện; Kiểu S - có vết

bệnh hoại thư, có bào tử nấm xuất hiện Ba giống bản ñịa (Ogden, Ross và Gilbent) phản ứng theo kiểu S, và 4 quần thể F3 thì mỗi quần thể phản ứng theo cả ba kiểu phản ứng ñó là kiểu I, R, S (ðậu Anh Quốc, Trần Văn Lài (TL dịch), 1987) [19]

Ngày nay, công nghệ gen mở ra một hướng mới cho chọn tạo giống nói chung và chọn tạo giống ñậu tương nói riêng Một số gen quý và thể hiện các tính trạng sinh lý tốt ñã ñược chuyển vào cây ñậu tương nhằm mục ñích tạo năng suất, phẩm chất tốt và tăng tính chống chịu với ñiều kiện bất lợi Hiện nay khoảng 80% lượng ñậu tương ñược trồng phục vụ trong thương mại ñều là ñậu tương chuyển gen (James và Gresshoff, 2000) [50] ðậu tương chuyển gen ñược trồng chủ yếu ở Mỹ, Achentina, Braxin, Canada, Ấn ðộ và Trung Quốc

Duzan và cộng sự (2005) [39] ñã tìm ra nhân tố Nod (một loại vi sinh vật cộng sinh) tạo ra khả năng ñề kháng bệnh phấn trắng Họ cũng phát hiện

ra rằng khi sử dụng Nod ở nồng ñộ thấp (10-6M) ñậu tương vẫn tiếp tục kháng lại bệnh, kể cả hai tuần sau khi xử lý bằng Nod

Ngoài ra, Li và cộng sự (2005) [56] ñã chuyển gen γ- zein từ ngô vào giống ñậu tương Jack ñể sản xuất ra loại protein giàu lưu huỳnh có chứa cả methionin và cystein Kỹ thuật này ñã ñem lại 3 giống ñậu tương chuyển gen trong ñó có hai giống có hàm lượng methionine và cysteine tăng ñáng kể (methionine cao hơn 18,6% và cysteine cao hơn 30% so với giống Jack ban ñầu) Các giống ñậu tương này cũng di truyền ổn ñịnh gen γ -zein cho các thế

Tr ường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………12

kháng thuốc trừ cỏ ñược gieo trồng ở 10/25 nước trồng cây công nghệ sinh học (James, 2008) [36]

Một phương pháp nữa mà các nhà chọn giống ñã áp dụng trong chọn giống ñậu tương là ứng dụng công nghệ sinh học cDNA của Dehydrin ñã ñược phân lập từ lá ñậu tương bị mất nước (Maitra và Cushman, 1994) Dehydrin là một trong những LEA (late embryogenesis abundant protein - protein ñược tổng hợp với số lượng lớn trong giai ñoạn cuối của quá trình hình thành phôi) ñược hình thành và tích lũy khi cây gặp ñiều kiện hạn cDNA của LEA cũng ñã ñược phân lập từ lá và rễ ñậu tương D95 khi bị hạn (Trần Thị Phương Liên, 1999) [10]

Một vài năm trước ñây hệ thống nuôi cấy mô ñậu tương cũng ñược phát triển Nuôi cấy mô bao gồm việc tái sinh chồi non từ lá nguyên, ñốt lá mầm hay trụ mầm (Barwale và cộng sự, 1986; Wright và cộng sự, 1986 - 1987) Christianson và cộng sự (1987) cũng ñề cập ñến phát sinh phôi non (trụ mầm hay trụ phôi) ñể sử dụng chuyển gen vào ñậu tương nhờ khuẩn AT (Fao.org.vn) [77]

Chọn tạo giống bằng chỉ thị phân tử (MAS - Marker assisted selection) cũng ñã ñược sử dụng trong chọn giống ñậu tương Concibido và cộng sự (2003) ñã thiết lập bản ñồ locut tính trạng số lượng QTL (Quantitative Trait

Loci) về năng suất của G soja PI407305 Dựa vào ñó, các QTLs từ G soja

ñược chuyển vào 6 quần thể di truyền khác thông qua hồi giao Dựa vào chỉ thị phân tử, các locut quy ñịnh năng suất ñược kiểm tra và ñánh giá Hiệu quả của QTL này ñã bị hạn chế ở 2 trong 6 quần thể di truyền, nhưng nó chứng minh khả năng chuyển gen mục tiêu từ loài hoang dại vào loài canh tác ñể cải tiến năng suất ñậu tương (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2007) [3]

Tr ường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ13

2.2.2 Tình hình nghiên cứu ựậu tương ở Việt Nam

đậu tương là cây trồng truyền thống gắn bó với nông dân Việt Nam đậu tương ựược trồng phổ biến ở cả ba miền, trên ựủ mọi loại ựịa hình và các loại ựất khác nhau

Bảng 2.1 Tình hình sản xuất ựậu tương ở Việt Nam

Năm (nghìn ha) Diện tắch Năng suất (tạ/ha) (nghìn tấn) Sản lượng

Nguồn: Faostat, Janurary 2008 [77]

Công tác thu thập vật liệu, nghiên cứu và ựánh giá tập ựoàn, công tác chọn giống trong 20 năm (1985 - 2005) ựã thu ựược những kết quả khắch lệ Trên 5000 Mẫu giống ựậu tương trong ựó có trên 300 giống ựịa phương ựã ựược thu thập và nhập nội Khoảng 4188 Mẫu Mẫu giống ựậu tương nhập chủ yếu từ Viện cây trồng liên bang Nga mang tên Vavilop (VIR), một số ựược nhập từ Trung tâm phát triển rau Châu Á (AVRDC), Úc, Nhật, Mỹ, và Viện cây trồng nhiệt ựới quốc tế (IITA) ựã ựược khảo sát và ựánh giá Bên cạnh ựó, các Mẫu giống ựột biến với các tắnh trạng như thời gian sinh trưởng ngắn, chịu rét, chịu nóng, chống bệnh gỉ sắtẦựã ựược phân lập và sử dụng trong chọn tạo giống (Trần đình Long và Nguyễn Thị Chinh, 2005) [15]

Từ nghiên cứu và ựánh giá tập ựoàn, nhiều giống ựậu tương mới ựã ựược tuyển chọn Vắ dụ, giống AK03 ựược chọn từ dòng G2261 nhập nội có

Tr ường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ14

thời gian sinh trưởng 80 - 85 ngày và năng suất trung bình 13 - 16 (tạ/ha), thắch hợp cho vụ ựông Cũng chọn từ dòng G2261, giống AK05 có thời gian sinh trưởng 90 - 95 ngày, năng suất trung bình ựạt 15 - 18 (tạ/ha), kháng bệnh

gỉ sắt và thắch hợp cho vùng ựồng bằng sông Hồng Bằng phương pháp tương

tự, một số giống khác như đT12 ựược tuyển chọn từ tập ựoàn nhập nội của Trung Quốc, có thời gian sinh trưởng cực ngắn 71 - 80 ngày, có thể trồng ựược 3 vụ nhưng thắch hợp nhất ở vụ hè, có khả năng chống ựổ tốt, chịu úng khá, năng suất trung bình 14 - 23 (tạ/ha) (Bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn, 2005) [29]

Bên cạnh ựánh giá tập ựoàn nhập nội và tuyển chọn, chọn tạo giống bằng phương pháp lai hữu tắnh cũng ựã ựược sử sử dụng và tạo ra nhiều giống mới Giống đT92 thu ựược từ lai đH4 x TH84, có thời gian sinh trưởng 95 -

105 ngày, thắch hợp cho vụ đông và vụ Xuân, năng suất trung bình 14 - 16 tạ/ha, ựặc biệt chống chịu ựược bênh gỉ sắt (Bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn, 2005) [29] Giống V74 thu ựược lai từ giống cọc chùm với V73 có năng suất cao hơn từ 10 - 15% trong vụ ựông Chọn lọc dòng từ lai hữu tắnh giữa DL02 x đH4 ựã thu ựược giống D140 Giống D140 sinh trưởng tốt ở cả ba

vụ trong năm, nhưng cao nhất là vụ xuân hè và vụ hè năng suất từ 14,8 - 27,8 tạ/ha, thời gian sinh trưởng 90 - 100 ngày D140 có tỷ lệ quả 3 hạt cao, khối lượng 1000 hạt 150 - 170 (g), hạt có hàm lượng protein ựạt 40%, không bị nứt, màu sắc hạt ựẹp Tương tự, một số dòng lai 901, 903 từ tổ hợp M103 x 801A rất

có triển vọng với năng suất lý thuyết trội hơn 801A và M103, hạt không bị nứt

vỏ như M103 (Vũ đình Chắnh và cộng sự, 1982) [4]

Các nhân tố ựột biến trong chọn tạo giống cây ựậu tương cũng ựã ựược

sử dụng Xử lý tia gramma Co60 trên 4 giống ựậu tương bao gồm Cúc lục ngạn, Xanh lơ, Vân Kiều và V70 cho thấy tác nhân ựột biến có tác dụng kìm hãm các chỉ tiêu sinh trưởng phát triển ựối với quần thể ựậu tương ở M1. Ở tất

Tr ường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ15

cả các giống nghiên cứu, ựột biến làm giảm tỷ lệ cây còn sống, làm tăng tỷ lệ hạt bất dục, tỷ lệ rụng hoa và kéo dài thời gian sinh trưởng Thế hệ M2 xuất hiện các dạng ựột biến về diệp lục, hình thái, ựột biến chắn sớm và các cơ quan sinh sản, ựột biến ở quả và hạt Chọn lọc qua 9 thế hệ ựã phân lập ựược

3 dòng có triển vọng M103, A75, A9, trong ựó M103 và A9 chắn sớm hơn ựối chứng (7 - 14 ngày), A75 có hàm lượng protein cao M103 có tiềm năng năng suất cao (20 tạ/ha), chịu nóng khá và ựã ựược công nhận giống quốc gia năm

1994 (Trần đình Long, 1978) [12]

Ngoài ra, ựã thu ựược rất nhiều giống mới với ưu ựiểm nổi trội như khối lượng hạt lớn, năng suất cao và chống chịu sâu bệnh từ xử lý ựột biến Vắ

dụ giống DT90 thu ựược từ kết hợp lai hữu tắnh giữa K.7000 x Cộc chùm với

xử lý ựột biến tia gramma - Co60/18Krad Giống DT90 có khối lượng 1000 hạt lớn (180 - 270g), kháng bệnh ựốm nâu vi khuẩn, gỉ sắt, sương mai tốt (Mai Quang Vinh và Ngô Phương Thịnh,1999) [28] Xử lý ựột biến trên dòng lai F3 -D.333 (của tổ hợp lai DT80 x đH4) ựã tạo ra giống DT84 là giống ngắn ngày có khả năng thắch ứng rộng, tiềm năng năng suất cao, chất lượng hạt tốt và chống chịu sâu bệnh khá (Mai Quang Vinh và Ngô Phương Thịnh, 1999) [28] Xử lý ựột biến giống V74 bằng Natriazit (NaN3) ựã thu ựược giống V48 Giống V48 có thể trồng ựược trong vụ Xuân và vụ Hè trên ựất thịt nhẹ, ựất bãi vùng ựồng bằng và trung du Bắc Bộ, năng suất ựạt 14 - 15 (tạ/ha) Giống V48 cứng cây, bộ lá gọn nên chống ựổ tốt, hạt ựẹp và nhiễm gỉ sắt trung bình (Trần đình Long và cộng sự, 1999) [14]

Khả năng chống chịu của ựậu tương ựối với môi trường là một yếu tố hay chỉ tiêu quan trọng trong chọn tạo giống chống chịu với ựiều kiện ngoại cảnh bất lợi như nóng, hạn, úng, và mặn Dựa trên ựặc tắnh sinh hóa và ở mức

ựộ phân tử, một số giống như Trà Lĩnh, Cúc Lục Ngạn ựược xác ựịnh có khả năng chịu hạn nhưng có hàm lượng protein và lipit thấp; các giống ựại trà

Tr ường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ16

VX92 và MV1 chịu hạn trung bình nhưng hàm lương protein và lipit cao hơn, giống M103 ựặc biệt chịu nóng có hàm lượng protein, lipit cao nhất trong các

vụ Hè (Trần Thị Phương Liên, 1999) [10]

Một số tắnh trạng sinh lý có thể liên quan ựến khả năng chịu hạn của ựậu tương và do ựó, có thể sử dụng như một trong các chỉ tiêu chọn lọc giống chịu hạn Trong ựiều kiện hạn, cường ựộ thoát hơi nước, cường ựộ quang hợp, hiệu suất sử dụng nước và năng suất của các giống DT84, D140, M103, Vàng Cao Bằng ựều bị giảm và sự suy giảm khác nhau giữa các giống Giai ựoạn ra hoa rộ và giai ựoạn quả mẩy là hai giai ựoạn mẫn cảm với sự thiếu nước, nhưng giai ựoạn quả mẩy bị ảnh hưởng nghiêm trọng nhất khi gặp ựiều kiện hạn Vàng Cao Bằng có khả năng chịu hạn tốt nhất có thể sử dụng làm vật liệu khởi ựầu trong chọn giống chống hạn (Trần Anh Tuấn, Vũ Ngọc Thắng,

Vũ đình Hòa, 2007) [25]

Bệnh gỉ sắt do Phakopsora pachyrhizi Sydow là một trong những bệnh

làm giảm nghiêm trọng năng suất ựậu tương Gỉ sắt làm giảm hàm lượng diệp lục và giảm quang hợp, do ựó ảnh hưởng tới toàn bộ quá trình trao ựổi chất của cây Một số Mẫu giống như G8587, SJ4, SJ5, và DT74 thu ựược từ tập ựoàn 500 Mẫu giống và một số Mẫu giống của chương trình thử nghiệm giống quốc tế có sức kháng khá và tốt bệnh gỉ sắt (Nguyễn Thị Bình, 1990) [1] Hơn nữa, khả năng chống bệnh gỉ sắt của cây ựậu tương với mật ựộ lông phủ ở mặt dưới lá có mối quan hệ chặt chẽ (Nguyễn Thị Bình, 1990) [1]

2.3 đa dạng di truyền và chỉ thị phân tử

2.3.1 đa dạng di truyền

đa dạng di truyền là sự thể hiện phong phú, có thể ở mức ựộ nucleotide, gen, nhiễm sắc thể (NST) hay toàn bộ genome của loài Về cơ bản, ựa dạng di truyền thể hiện ở sự khác nhau trong trình tự các nucloeotid cấu trúc nên ADN trong tế bào của một loài

Tr ường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ17

Trong quá trình sinh sản hữu tắnh, sự ựa dạng di truyền của các quần thể sẽ tăng lên do kết quả tái tổ hợp hoặc ựột biến (Nguyễn Hồng Minh, 1999) [16] Sự khác biệt về kiểu gen của các cá thể trong quần thể có thể cho phép

cá thể này thắch nghi hơn cá thể ựiều kiện của môi trường thay ựổi

Tắnh ựa dạng di truyền là cơ sở ựể tạo nên ưu thế lai Trong một chừng mực nhất ựịnh, nếu tắnh ựa dạng di truyền giữa các bố mẹ càng lớn thì ưu thế lai càng cao Ở ựây tắnh ựa dạng di truyền chủ yếu là do:

Cả hai bố mẹ có họ hàng xa như các loài hoặc loài phụ khác nhau

Cả hai bố mẹ ựều bắt nguồn từ một vùng ựịa lý xa nhau

Cả hai bố mẹ thuộc kiểu sinh thái khác nhau giống chắn sớm, chắn trung bình, chắn muộn

đa dạng di truyền có ý nghĩa rất lớn trong chọn giống đó là nhân tố giúp cho sinh vật di truyền ựược nòi giống, kháng với các loại dịch bệnh và thắch nghi với những thay ựổi của ựiều kiện ngoại cảnh (La Tuấn Nghĩa, 2004) [18]

2.3.2 Chỉ thị di truyền

Chỉ thị di truyền là bất kỳ một ựặc tắnh nào, có thể về mặt hình thái, sinh hóa hoặc phân tử và có thể di truyền theo quy luật Menden Chỉ thị di truyền ựược dùng ựể nhận biết, phân biệt sự khác biệt giữa các sinh vật hoặc cho phép phát hiện sự sai khác về mặt thông tin di truyền giữa hai hay nhiều

cá thể Theo Paterson và cộng sự (1991) [62], một ựặc ựiểm ựược coi là chỉ thị di truyền nhất thiết phải ựảm bảo hai tiêu chuẩn: (i) phải khác biệt giữa bố

và mẹ; (ii) phải ựược truyền lại chắnh xác cho thế hệ sau

Các nhà nghiên cứu di truyền và chọn giống rất quan tâm ựến chỉ thị di truyền vì tắnh hữu ắch của nó trong nghiên cứu sự di truyền các tắnh trạng và những biến ựổi di truyền xảy ra trong quần thể, ựặc biệt là những chỉ thị liên quan ựến tắnh trạng nông sinh học có lợi cho con người

Tr ường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………18

Ba loại chỉ thị di truyền là chỉ thị hình thái, chỉ thị sinh hóa và chỉ thị phân tử Chỉ thị hình thái là loại chỉ thị có thể nhìn thấy và ño ñếm ñược hay nói cách khác chính là ñặc ñiểm hay tính trạng hình thái Chỉ thị hình thái dễ dàng nhận biết ñược ở dạng trội lặn Tuy nhiên, chỉ thị hình thái chịu ảnh hưởng của quá trình tương tác gen, ñiều kiện ngoại cảnh và chỉ thể hiện ở những giai ñoạn nhất ñịnh của quá trình phát triển cá thể (Bùi Chí Bửu và cộng sự, 1995) [2] Vì thế, cần kết hợp chỉ thị hình thái, chị thị sinh hóa và các chỉ thị phân tử nhằm mang lại hiệu quả cao trong quá trình chọn giống

Chỉ thị sinh hóa là loại chỉ thị có bản chất là ña hình protein gồm isozyme và các loại protein dự trữ Những chỉ thị sinh hóa chỉ thể hiện ở những giai ñoạn nhất ñịnh của quá trình phát triển cá thể tùy vào cơ chế phức tạp của sự ñóng mở gen Cơ chế này ñược ñiều chỉnh bởi vật chất di truyền là ADN Một protein có mặt trong cơ thể sinh vật dù ở giai ñoạn nào của phát triển cá thể thì cũng chỉ là sản phẩm của gen thông qua dòng thông tin di truyền từ ADN – ARN – Protein Tuy nhiên, do có số lượng không nhiều và phụ thuộc vào các giai ñoạn phát triển của cá thể nên chỉ thị sinh hóa hạn chế

về mặt ứng dụng

Chỉ thị phân tử ADN là những chỉ thị có bản chất ña hình ADN, nó có thể là một ñoạn gen hoặc một ñoạn ADN có vị trí xác ñịnh trên nhiễm sắc thể (NST) và di truyền theo quy luật Menden Có rất nhiều loại chỉ thị phân tử như RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), AFLP (Amplified fragment length polymorphism), RAPD (ramdom amplified polymorphic DNA), SSR (simple sequence repeat) and SNP (single - nucoletide polymorphism)

Trong những năm gần ñây, các chỉ thị phân tử ñã ñược ứng dụng rất lớn trong nghiên cứu hệ gen và các tính trạng của nhiều loại cây trồng Chỉ thị phân tử có thể ñược sử dụng trong thiết lập bản ñồ liên kết gen, phát hiện các

Tr ường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………19

locus tính trạng số lượng và chất lượng nhằm cung cấp thông tin di truyền của tính trạng mong muốn như tính chịu hạn, chống ñổ, năng suất, và kháng bệnh Ngoài ra, chỉ thị phân tử còn ñược sử dụng ñể so sánh và phân tính sự giống, khác nhau trong vị trí và trình tự các gen (comparative genomic analysis) giữa các loài có quan hệ họ hàng như giữa lúa và lúa mì, cà chua và khoai tây hay ñậu tương và ñậu xanh Nhờ những ứng dụng trên, chỉ thị phân tử thực sự hữu ích trong chọn tạo giống cây trồng nhờ chọn lọc dựa vào chỉ thị phân tử ADN

- Marker Assisted Selection (MAS)

* Ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn giống cây trồng

Từ lâu, các nhà chọn giống ñã quan tâm ñến các chỉ thị hình thái liên kết với một số tính trạng nông học quan trọng và sử dụng chúng như một phương tiện hữu ích trong quy trình chọn tạo giống mới Tuy nhiên, việc ứng dụng còn gặp nhiều hạn chế Vì thế chỉ thị phân tử ra ñời ñã trở thành công cụ ñắc lực hổ trợ phương pháp truyền thống, giải phóng cho các nhà chọn giống một lượng lớn công việc khi phải tiến hành chọn lọc Các nhà khoa học ñã nghiên cứu và ñưa ra những ưu thế của chỉ thị phân tử so với chỉ thị hình thái như sau:

1 Chỉ thị phân tử có thể xác ñịnh kiểu gen của các locus tại bất kỳ giai ñoạn nào và bất cứ mức ñộ nào (tế bào, mô hay toàn bộ cơ thể)

2 Số lượng các chỉ thị AND là rất lớn, trong khi ñó số lượng các chỉ thị hình thái rất hạn chế

3 Các alen khác nhau thường không liên kết với các hiệu ứng có hại, trong khi việc ñánh giá các chỉ thị hình thái thường hay ñi kèm với những hiệu ứng kiểu hình không mong muốn

4 Các alen của các chỉ thị phần lớn là ñồng trội, vì thế cho phép phân biệt mọi kiểu gen ở bất kỳ thế hệ phân ly nào Các alen của các chỉ thị hình

Tr ường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………20

thái thường tương tác theo kiểu trội – lặn, do ñó bị hạn chế sử dụng trong nhiều tổ hợp lai

5 ðối với chỉ thị hình thái các hiệu ứng lấn át thường làm sai lệch việc ñánh giá các cá thể trong quần thể phân ly Trong khi ñó, chỉ thị phân tử hiệu ứng lấn át hoặc cộng tính rất ít gặp

Ngày nay, phương pháp chọn giống bằng chỉ thị phân tử là một phương pháp hữu hiệu trợ giúp ñắc lực cho chọn giống truyền thống nhằm khắc phục những trở ngại mà chọn giống truyền thống không hoặc rất khó giải quyết Ngoài ra, phương pháp này còn giúp ta chọn lọc những cá thể mang những tổ hợp gen cần thiết và loại bỏ các nhiễu do các tương tác trong cùng alen hay giữa các alen gây ra

Trong những năm gần ñây, các nhà khoa học ñã phân tích cặn kẽ một

số mô hinh MAS Theo ñó, chỉ cần trải qua 3 - 4 thế hệ chứ không phải 6 – 8 thế hệ (ngay cả khi quần thể chọn giống có kích thước nhỏ và các dữ liệu về chỉ thị phân tử bị hạn chế) là có thể ñạt ñược mục tiêu của mình (Frey và cs, 2004) [42]

2.3.3 Một số chỉ thị phân tử

2.3.3.1 Ch ỉ thị RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) – ða

hình ñộ dài các ñoạn cắt hạn chế

RFLP là kỹ thuật nhận dạng ADN bằng cách lai các ñoạn ADN tạo thành

từ sự phân cắt ADN bằng các enzyme giới hạn (restriction enzymes) với Mẫu dò

Enzyme cắt giới hạn sẽ tạo nên các ñoạn cắt có kích thước khác nhau và ñược phân biệt bằng ñiện di ñồ Các ñoạn cắt ñược gọi là “dấu vân tay” (finger printing) ñặc trưng cho ADN của từng loài Ở thực vật, chỉ thị này lần ñầu tiên ñược áp dụng trong nghiên cứu gen tổng hơp ARN ribosome trong vùng cấu trúc nhân của lúa mỳ Từ ñó chỉ thị này ñược ứng dụng ñể lập bản ñồ di truyền trên một số ñối tượng khác như cà chua, ngô, lúa (Leister và cộng sự, 1999) [54]

Tr ường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………21

Chỉ thị RFLP là chỉ thị ñồng trội, có khả năng biểu hiện trong tất cả các alen của cùng một locus gen Vì thế, ưu ñiểm của RFLP là có thể phân biệt các cá thể ñồng hợp tử (AA hoặc aa) với các cá thể dị hợp tử (Aa) Tuy nhiên, kỹ thuật RFLP vẫn còn nhiều hạn chế do lượng Mẫu lớn, kỹ thuật phức tạp, thời gian kéo dài và ñầu tư trang thiết bị kỹ thuật lớn

2.3.3.2 Ch ỉ thị AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) - ða hình

ñộ dài các ñoạn nhân chọn lọc

Chỉ thị AFLP là sự khuếch ñại có chọn lọc các ñoạn ADN ñược cắt bởi enzyme giới hạn AFLP phát hiện ña hình qua sự khác nhau về ñộ dài của các ñoạn ADN ñược nhân lên Kỹ thuật này linh hoạt, có thể phát hiện ñược sự có mặt của những mảnh cắt giới hạn trong bất kỳ loại ADN nào

Kỹ thuật này có nhiều ưu ñiểm như cho ñộ ña hình cao, lượng ADN tổng số tiêu tốn rất ít, dễ dàng lặp lại và có thể phân tích ADN ở bất kỳ nguồn gốc hay mức ñộ phức tạp nào Tuy nhiên chỉ thị này không có khả năng phân biệt ñược cá thể ñồng hợp tử trội với cá thể dị hợp tử,kỹ thuật phức tạp và ñòi hỏi ñầu tư trang thiết bị lớn

2.3.3.3 Ch ỉ thị RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) – ða hình các ñoạn ADN nhân bản ngẫu nhiên

Chỉ thị RAPD là kỹ thuật ñược dựa trên cơ sở PCR với các ñoạn mồi ñơn có trình tự ngẫu nhiên (10 nucleotid) ADN chỉ ñược nhân lên khi vị trí mồi ở hai ñiểm có sự ñịnh hướng ngược nhau trong khoảng tối ña 2000 base dọc theo nhiễm sắc thể Do mồi ngắn nên phản ứng RAPD sẽ tạo ra nhiều ñoạn ADN có kích thước và trình tự khác nhau

Kỹ thuật RAPD có nhiều ưu ñiểm như phát hiện ña hình ñáng tin cậy, phương pháp tiến hành ñơn giản, dễ sử dụng, thời gian ngắn, giá thành thấp, sử dụng lượng ADN khuôn ít, không cần trang thiết bị phức tạp Tuy nhiên, RAPD không phân biệt ñược thể dị hợp tử, ñộ nhạy của RAPD phụ thuộc nhiều vào

Tr ường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………22

điều kiện của phản ứng (thành phần phản ứng, nhiệt độ gắn mồi ) và khơng chắc chắn các đoạn cĩ cùng kích thước từ 2 Mẫu ADN khác nhau thực sự tạo ra

từ cùng một vị trí trên hệ gen và đơi khi khơng lặp lại được, đặc biệt là những cơ thể cĩ bộ gen lớn như lúa mỳ (Devos và cộng sự, 1992) [38]

2.3.3.4 SSR (Simple Sequence Repeats) – ða hình trình tự lặp lại đơn giản

Kỹ thuật SSR là kỹ thụât khuếch đại các đoạn lặp lại đơn giản cịn được gọi là phương pháp vi vệ tinh (microsattellite) Các đoạn lặp lại gồm từ 2 đến

6 cặp nucleotit được lặp đi lặp lại nhiều lần trong hệ gen của lồi ðoạn SSR điển hình là đoạn trình tự gồm 2 - 3 cặp nucleotit, lặp lại từ 9 - 30 lần Các đoạn trình tự bảo thủ thường dùng trong kỹ thuật SSR là ATT, AT, CTT, CT Các đoạn lặp lại cĩ kích thước dài ngắn khác nhau và số lần lặp lại khác nhau tuỳ theo từng lồi, từng giống cây trồng và vật nuơi

Ngay trong genome của lồi cũng cĩ mức độ lặp lại ở các nhiễm sắc thể khác nhau Ở các động vật cĩ vú, một đoạn trình tự lặp lại một vài lần chiếm

>50%, cịn đoạn lặp lại hàng trăm nghìn lần chỉ chiếm khoảng 20 - 25% Các đoạn SSR thường ở vùng gần tâm động hoặc đầu mút của NST và cĩ vai trị điều hồ hoạt động của gen

SSR là một loại marker chính xác và hữu hiệu trong nghiên cứu đa dạng di truyền, phân loại các giống cây trồng, vật nuơi khác nhau trong cùng một lồi động vật hay thực vật Ngày nay SSR được sử dụng trong xây dựng bản đồ liên kết gen, phân lập gen, xác định quan hệ di truyền giữa các Mẫu giống cây trồng, vật nuơi và chẩn đốn cặp lai cho ưu thế lai (Bell, 1994; Tautz, 1984) [34], [71]

* Cơ sở khoa học của chỉ thị SSR trong đánh giá đa dạng di truyền

Bộ gen của sinh vật nhân thật chứa 3 loại chuỗi ADN lặp là satellite, minisatellites và microsatellites Các chuỗi lặp nằm theo thứ tự tiếp nhau (tandem) và cĩ kích thước rất khác nhau Trong số các chuỗi lặp đơn giản

Tr ường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………23

này, microsatellite là một chỉ thị phân tử quan trọng, thường ñược sử dụng trong nghiên cứu ña dạng di truyền

Microsatellite (còn ñược gọi là các chuỗi lặp ñơn giản - simple sequence repeats (SSRs), các chuỗi lặp liền kề ngắn - short tandem repeats (STRs) hay các ñoạn ña hình chuỗi ñơn giản - simple sequence length polymorphisms (SSLPs)) là nhóm các chuỗi ADN ñơn giản lặp lại nhỏ nhất,

có thể từ 1 - 5, 1 - 6 hay 2 - 8 nucleotid Các chuỗi lặp thường ñơn giản bao gồm 2, 3, 4 nucleotid (gọi là di-, tri-, and tetranucleotide repeats) Một ví dụ phổ biến của microsatellite là dãy chuỗi lặp gồm 2 nucleotid (CA)n, trong ñó

n là tổng số chuỗi lặp nằm trong phạm vi từ 10 – 100

Microsatelite là một trong các chỉ thị phân tử ñược sử dụng rộng rãi nhất

vì nó có một ñặc ñiểm quan trọng là có tốc ñộ ñột biến cao hơn các phần khác của bộ gene Hơn nữa, các chỉ thị SSR thường tạo ra mức ña hình cao trong nội

bộ loài và giữa các loài, ñặc biệt khi số chuỗi lặp n bằng 10 hoặc lớn hơn

Ở một locus microsatellite ñồng hợp tử, số các chuỗi lặp giống nhau Ở một locus microsatellite dị hợp tử, số các chuỗi lặp khác nhau (chẳng hạn 1 microsattellite có 9 chuỗi lặp còn microsatellite có 10 chuỗi lặp) Do ñó, SSR

là chỉ thị ñồng trội, cho phép phân biệt cá thể ñồng hợp tử và dị hợp tử

2.4 Ứng dụng chỉ thị phân tử trong ñánh giá ña dạng di truyền

Trong những năm gần ñây, với sự phát triển nhanh chóng của khoa học công nghệ nói chung và công nghệ sinh học nói riêng, các chỉ thị phân tử ñã ñược nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu và ứng dụng trong việc ñánh giá mối quan hệ di truyền, ña dạng di truyền, lập bản ñồ liên kết gen và xác ñịnh locut tính trạng số lượng Trên có sở ñó, chỉ thị phân tử ñược sử dụng trong chọn tạo giống cây trồng ñể tạo ra nhiều giống mới mang các ñặc tính mong muốn phù hợp với nhu cầu của sản xuất

Tr ường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ24

Dựa trên 16 cặp mồi SSR trong phân tắch ựa dạng di truyền, 23 Mẫu lúa từ 5 nước (Braxin, Nhật, Trung Quốc, Pakitstan và Hàn Quốc) có sự tương ựồng di truyền từ thấp ựến trung trung bình (0,13 ựến 0,64) Các Mẫu ựược xếp vào hai nhóm riêng biệt: nhóm I gồm các Mẫu thuộc loài phụ Japonica từ Braxin, Nhật và Trung Quốc; nhóm II gồm các Mẫu thuộc loài phụ Indica từ Pakistan, Hàn Quốc và lúa nương của Braxin (Zhao Yong và cộng sự, 2002) [76] Khi phân tắch ựa dạng di truyền của 232 cá thể thuộc 6 quần thể lúa lúa (03 quần thể từ Jiangxi và 03 quần thể từ Hunan Ờ Trung Quốc), 23 cặp mồi SSRs ựã cho 115 alen ựa hình điều này cho thấy các Mẫu lúa thu từ hai ựịa phương rất ựa dạng (Song và cộng sự, 2003) [69] đánh giá ựa dạng di truyền của 113 Mẫu lúa vùng Yunnan (Trung Quốc) bằng 36 cặp mồi SSRs cho kết quả tương tự như khi sử dụng chỉ thị hình thái hay chỉ thị isozyme (Li và cộng sự, 2004) [55] Như vậy, SSR là một trong những chỉ thị phân tử hiệu quả trong ựánh giá ựa dạng di truyền của các giống lúa từ các ựiều kiện sinh thái, ựịa lý khác nhau và trong xác ựịnh mối quan hệ phả hệ

Ở cây ăn quả, sử dụng kết hợp chỉ thị SSR và AFLP phân tắch ựa dạng

di truyền của tập ựoàn giống bưởi chùm cho thấy gần 99,1% của 335 SSR loci, 72% của 343 AFLP loci là ựa hình và trung bình 9,85 SSR locus ựược phát hiện Giá trị ựa dạng di truyền thay ựổi từ 0,19 ựến 0,91 Tỷ lệ dị hợp tử dao ựộng từ 0,13 ựến 0,28 Tập ựoàn giống bưởi chùm ựược phân thành 8 nhóm, gồm một số nhóm chắnh như nhóm bưởi Shatain, Wendan và các giống lai (Liu và cộng sự, 2005) [57]

Ebtissam H A và cộng sự (2007) [40] ựã sử dụng chỉ thị RAPD, SSR, EST, AFLP ựồng thời kết hợp giữa các chỉ thị ựể ựánh giá 11 giống bông (Luồi và Hải ựảo) Kết quả cho thấy, mức ựộ tương ựồng di truyền tương ựối cao và dao ựộng tương ứng là 63,8 - 95,9%, 13,8 - 98,1%, 70,4 -

Tr ường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………25

98,5%, 13,7 - 99,3% và 78,2 - 98,0%; 11 giống bơng được phân thành 2 nhĩm chính (1 nhĩm cĩ 8 giống gồm cả bơng Luồi và Hải đảo, nhĩm cịn lại gồm 3 giống bơng Luồi)

Trong khi trên thế giới, cơng nghệ sinh học được phát triển từ rất sớm (từ những năm 1970) và được ứng dụng trong nơng nghiệp thì ở Việt Nam, cơng nghệ sinh học và ứng dụng của nĩ cịn khá mới mẻ, đặc biệt là việc ứng dụng chỉ thị phân tử vào cơng tác chọn tạo giống cây trồng Song song với các phương pháp chọn tạo giống truyền thống, chỉ thị phân tử được coi là một cơng cụ hữu ích làm tăng hiệu quả và gĩp phần rút ngắn thời gian chọn tạo giống Tuy nhiên, việc ứng dụng cơng nghệ sinh học nĩi chung và chỉ thị phân tử nĩi riêng trong chọn giống cây trồng ở Việt Nam cịn nhiều hạn chế, phần lớn các kết quả đạt được chỉ ở mức độ phịng thí nghiệm

Bùi Mạnh Cường và cộng sự (2003) [30] đã sử dụng 60 chỉ thị RAPD để đánh giá 29 dịng ngơ thuần Kết quả cho thấy khoảng cách di truyền biến động

từ 0,47 - 0,77 chứng tỏ giữa các vật liệu nghiên cứu cĩ sự đa hình rất lớn

12 mồi RAPD sử dụng trong phân tích đa dạng di truyền của 57 Mẫu giống đậu xanh đã cho 88/121 đoạn ADN đa hình (chiếm 73%) Các Mẫu cĩ hệ

số tương đồng di truyền cao, dao động từ 0,83 – 0,93 cho thấy sự đa dạng thấp (ðiêu Thị Mai Hoa và Lê Trần Bình, 2005) [7]

Lê Thị Muội và cộng sự, 2005 [17] đã sử dụng chỉ thị SSR đánh giá đa dạng di truyền của tập đồn 35 giống lạc cĩ phản ứng khác nhau với bệnh héo xanh vi khuẩn Kết quả cho thấy, cĩ 19/20 cặp mồi cho đa hình, hệ số sai khác

di truyền giữa các giống khá lớn, dao động từ 12 – 49% Kết quả đã ghi nhận các giống lạc cĩ cùng nguồn gốc hoặc cùng mức độ kháng bệnh đều được xếp vào một nhĩm nhỏ

Trần ðức Trung và cộng sự (2009) [23] đã tiến hành phân tích sự đa dạng di truyền của 38 Mẫu giống chè bằng 12 mồi RAPD Kết quả thu được

Tr ường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………26

184 alen và hệ số tương đồng di truyền dao động từ 0,45 - 0,89 Với hệ số tương đồng di truyền 0,72, 38 Mẫu giống chè được chia thành 6 nhĩm khác nhau cĩ quan hệ chặt chẽ về nguồn gốc và vùng địa lý

Phân tích đa dạng di truyền của 19 dịng/giống lúa bằng 15 cặp mồi SSR cho thấy mức độ đa hình lớn, dao động từ 0,06 - 1 Dựa trên cơ sở đa dạng di truyền của 19 dịng/giống lúa này, tổ hợp lúa lai TGMS-VN1 x D24

đã được lựa chọn và dự đốn cho ưu thế lai cao với khoảng cách di truyền 0,67 - 0,90 (Nguyễn Văn ðồng và cộng sự, 1999) [6]

Ngồi ra, sử dụng chỉ thị SSR nghiên cứu 10 dịng/giống lúa cĩ nguồn gốc khác nhau đã xác định được tương đồng di truyền dao động từ 0,49 - 0,96 Các Mẫu đã được phân loại thành các nhĩm cĩ khoảng cách di truyền khác nhau và sử dụng làm cơ sở để chọn bố mẹ cho chọn giống lúa lai (Võ Thị Minh Tuyền, 2007) [27]

Trong những năm gần đây, việc sử dụng chỉ thị phân tử ở nước ta tập trung chủ yếu vào các tính trạng kháng sâu bệnh, chống chịu điều kiện bất lợi của mơi trường và các tính trạng chất lượng Ví dụ, Lưu Ngọc Huyền (2005) [9]

sử dụng 50 cặp mồi SSR để xác định tính kháng rầy nâu ở một số dịng/giống lúa Kết quả đã xác định được 15 chỉ thị SSR nằm ở NST số 4 của hệ gen lúa và

sử dụng làm chỉ thị trợ giúp để chọn lọc các cá thể mang gen kháng rầy nâu Chỉ thị SSR RM234 liên kết với locut quy định hàm lượng protein (GPC) trong gạo được xác định nằm trên NST số 7 (Trương Bá Thảo và cộng sự, 2005) [20]

2.5 Ứng dụng chỉ thị phân tử trong đánh giá đa dạng di truyền của đậu tương

Rất nhiều loại chỉ thị phân tử khác nhau đã được sử dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền của đậu tương

Tr ường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………27

Trong ñánh giá 72 giống ñậu tương của Ấn ðộ, 12 mồi AFLP cho 1257/1319 ñoạn ña hình (chiếm 95%) Các Mẫu giống nhìn chung có ñộ ñang dạng cao (Satyavathi và cộng sự, 2006) [65]

ðặc biệt, 131 mẫu giống thu thập từ 14 nước trong khu vực châu Á như Trung Quốc, Nhật Bản, Việt Nam, Lào và Thái Lan, ñã ñược sử dụng ñể ñánh giá ña dạng di truyền với 20 mồi SSR Các mồi cho trung bình 11,9 allen với thông tin di truyền PIC (Polymophism Information Content ) cao (0,78) Các mẫu thu từ Nhật Bản và Trung Quốc hình thành hai nhóm khác biệt hẳn nhau Các mẫu thu từ Hàn Quốc thuộc cả nhóm Nhật Bản và Trung Quốc Các mẫu còn lại thu từ các nước khác có hệ số tương ñồng cao với các mẫu thu từ Trung Quốc (Abe và cộng sự, 2003) [32]

Tương tự, Wang và Takahata (2007) [73] sử dụng 10 mồi SSR ñánh

giá ña dạng di truyền trên 45 và 60 mẫu giống ñậu tương dại (Glycine soja) từ

Trung Quốc và Nhật Bản Số băng ñoạn ADN thu ñược nhiều (từ 16 - 25) và 99% các ñoạn thu ñược là ña hình Mẫu giống giữa hai nước rất khác biệt nhau Như vậy, Nhật Bản và Trung Quốc hai vốn gen ñậu tương chính của Châu Á

Mặc dù có rất nhiều nghiên cứu về ña dạng di truyền của ñậu tương trên thế giới, vẫn chưa có nhiều nghiên cứu và ñánh giá về ña dạng di truyền của ñâu tương Việt Nam Cho ñến nay, mới có nghiên cứu sử dụng 20 mồi RAPD ñể ñánh giá 50 mẫu giống ñậu tương Số ñoạn thu ñược từ 2 - 6 ñoạn Mặc dù 50 Mẫu giống ñược xếp vào 3 nhóm nhưng các mẫu giống có hệ số tương ñồng di truyền cao (> 0,57) chứng tỏ các mẫu giống có sự ña dạng di truyền thấp (Phạm Thị Bé Tư, 2003) [24]

Vũ Thanh Trà và Trần Thị Phương Liên (2006) [22] ñã nghiên cứu sự

ña dạng di truyền trong phản ứng với bệnh gỉ sắt của một số giống ñậu tương, nhằm bước ñầu cung cấp thông tin di truyền, góp phần lưu giữ và duy trì

Tr ường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………28

nguồn gen của một số giống ñậu tương ñịa phương vùng núi phía Bắc cũng như giống ñược trồng ñại trà ở Việt Nam Kết quả phân tích trên 12 cặp mồi SSR cho thấy có 8 cặp mồi cho ña hình và thu ñược 32 alen Các mẫu giống không có sự ñang dạng di truyền cao trong phản ứng với bệnh gỉ sắt do hệ số tương ñồng di truyền dao ñộng trong khoảng 0,58 – 0,81

Nguyễn ðức Thuận Và Nguyễn Thị Lang (2006) [21] ñã tiến hành ñánh giá sự ña dạng di truyền của 30 giống ñậu tương sưu tập tại ngân hàng gen của Viện Lúa ðồng bằng Sông Cửu Long bằng 13 bộ mồi RAPD Kết quả cho thấy có 9 bộ mồi cho ña hình 30 giống ñậu tương ñược chia thành 4 nhóm chính với mức ñộ tương ñồng di truyền nằm cao (0,80 – 0,98) chứng tỏ các mẫu có sự ña dạng di truyền thấp

Tóm lại, ña dạng di truyền có vai trò quan trọng vì nó cung cấp nguồn gen cho công tác chọn giống Chỉ thị phân tử là công cụ hữu ích trong chọn tạo giống cây trồng Trong các loại chỉ thị phân tử, chị thị SSR có nhiều ưu ñiểm hơn các chỉ thị khác như RFLP, ALFP và RAPD ðối với Việt Nam, cây ñậu tương là một loại cây công nghiệp ngắn ngày có ý nghĩa và giá trị về mặt kinh tế nên chọn tạo giống ñậu tương cũng ñã ñược chú trọng và tiến hành từ rất sớm Tuy nhiên, chọn tạo giống ñậu tương vẫn chủ yếu dựa trên phương pháp truyền thống Hơn nữa, cũng có rất ít nghiên cứu ñánh giá ña dạng di truyền của nguồn gen ñậu tương trong nước

Do vậy, mục ñích của ñề tài là ñánh giá ña dạng di truyền ở ñậu tương

sử dụng chỉ thị phân tử SSR và hình thái, từ ñó cung cấp thông tin cho công tác chọn tạo giống ñậu tương trong nước

Tr ường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ29

PHẦN 3 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Vật liệu nghiên cứu

Vật liệu nghiên cứu gồm 36 mẫu giống ựậu tương (Bảng 3.1) do Trung tâm Tài nguyên di truyền thực vật, Trung tâm Nghiên cứu Phát triển ựậu ựỗ, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam và TS Vũ đình Chắnh (Bộ môn Cây công nghiệp, Khoa Nông học, Trường đại Học Nông nghiệp Hà Nội) cung cấp Trong 36 mẫu giống này, 13 mẫu giống nhập nội, 17 mẫu giống ựịa phương, phần mẫu giống còn lại là những giống ựược chọn tạo trong nước bằng ựột biến hoặc lai

3.2 Nội dung nghiên cứu

đánh giá sự ựa dạng của các mẫu giống ựậu tương bằng chỉ thị hình thái

đánh giá sự ựa dạng của các mẫu giống ựậu tương bằng chỉ thị phân tử SSR

3.3 Gieo trồng và theo dõi các chỉ tiêu hình thái

để theo dõi các ựặc ựiểm sinh trưởng, hình thái và năng suất các mẫu giống ựược trồng ngoài ựồng trong vụ Xuân, từ tháng 2 ựến tháng 6 năm 2009 tại khu thắ nghiệm ựồng ruộng Khoa Nông học Các mẫu giống ựược gieo theo ô diện tắch 2,5 m2/mẫu giống, không lặp lại, giống DT84 ựược dùng làm ựối chứng Mỗi ô gồm 2 hàng, mật ựộ duy trì sau khi gieo là 30 cây/m2

3.3.1 đặc ựiểm sinh trưởng và hình thái

Các tắnh trạng theo dõi ựể ựánh giá ựược dựa trên phiếu mô tả và ựánh giá nguồn gen ựậu tương của Trung tâm tài nguyên di truyền thực vật Việt Nam (Bảng 3.2)

Các tắnh trạng ựược theo dõi bắt ựầu từ khi cây ựậu tương mọc (tùy theo từng tắnh trạng)

Tr ường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………30

Bảng 3.1 Nguồn vật liệu ñậu tương sử dụng trong ñánh giá ña dạng di truyền

12 D140 Tạo từ tổ hợp lai: DL02x ðH4 30 Phong Niên Giống ñịa phương

16 AK06 Chọn từ dòng 55 của giống nhập nội 34 Pogla Giống nhập nội

Tr ường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………31

Tr ường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ32

* đánh giá mức ựộ nhiễm sâu bệnh hại, khả năng chống ựổ của các dòng, giống

đánh giá mức ựộ nhiễm ựối với một số sâu, bệnh hại chắnh của ựậu tương theo tiên chuẩn ngành 10TCN 339 Ờ 2006

- Sâu ựục quả - Eitiella zinekenella (%):

Tỷ lệ quả bị hại = Số quả bị hại/tổng số quả ựiều tra

điều tra 10 cây ựại diện theo phương pháp 5 ựiểm chéo góc

- Sâu cuốn lá - Lamprosema indicata (%):

Tỷ lệ lá bị hại = Số lá bị cuốn/tổng số lá ựiều tra điều tra 10 cây ựại diện theo phương pháp 5 ựiểm chéo góc

- Bệnh gỉ sắt - Phakopsora pachyrhizi Sydow (cấp) và bệnh sương

- Tắnh chống ựổ (ựiểm): điều tra toàn bộ các cây trên ô trước thu hoạch

Không ựổ điểm 1 (Hầu hết các cây ựều ựứng thẳng)

Tr ường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………33

Bảng 3.2 Các tính trạng ñược ñánh giá Tính trạng Phương pháp ñánh giá Tính trạng Phương pháp ñánh giá

Tính trạng chất lượng

Chu kỳ sinh trưởng Sớm Trung bình Muộn

Kiểu sinh trưởng 1- Hữu hạn 2- Vô hạn 3- Bán hữu hạn

Màu thận hạ diệp 1- Xanh 2- Tím

Hình dạng lá chét 3- Hẹp 5- Trung gian 7- Rộng

Cuống lá 1- Không có 2- Có

Lông/lá 1- Không có 2- Có

Màu sắc lá 1- Xanh 2- Xanh nhạt 3- Xanh ñậm

Mật ñộ lông 3- Thưa 5- Hơi thưa 7- Trung bình 9- Dày

Màu lông 1- Xám 2- Nâu nhạt 3- Nâu

Dạng lông 1- Thẳng 2- Cong

Màu sắc cánh hoa 3- Trắng 5- Tím ñậm 7- Tím

Màu sắc quả 3- Nâu nhạt 5- Nâu 7- ðen

Màu vỏ hạt 1- Vàng sáng 2- Vàng 3-Xanh

Kiểu rốn hạt 1- Rốn nông 2- Rốn sâu

Màu rốn hạt 1- Trắng 2- Vàng 3- Nâu nhạt 4- Nâu 5-Nâu ñậm 6-ðen

ðộ bóng của hạt 3- Bóng 5- Trung bình 7- ðục

Chất lượng hạt giống 1- Kém 2- Trung bình 3- Tốt

Hình dạng hạt 1-Elip 2- Trứng 3- Tròn dẹt 4- Tròn 5- Hình thận

Tính trạng số lượng

Thời gian sinh trưởng

- Thời gian từ khi gieo ñến khi 70% số cây ra hoa (ngày)

- Thời gian từ khi gieo ñến khi ñậu quả (ngày)

ðộ dài cành cấp1: ðo cành dài nhất/10 cây/ô thí nghiệm (cm)

Số ñốt/thân chính: ðếm 10 cây/ô thí nghiệm (ñốt)

Chiều cao cây cuối cùng: Khi thu hoạch ño 10 cây/ô thí nghiệm (cm)