đánh giá khả năng kháng bệnh bạc lá của tập đoàn các giống lúa nếp ở địa phương

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI --- NGUYỄN THỊ THANH TUYẾT ðÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG BỆNH BẠC LÁ CỦA TẬP ðOÀN CÁC GIỐNG LÚA NẾP ðỊA PHƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

-

NGUYỄN THỊ THANH TUYẾT

ðÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG BỆNH BẠC LÁ CỦA TẬP ðOÀN CÁC GIỐNG LÚA NẾP ðỊA PHƯƠNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP

Chuyên ngành: TRỒNG TRỌT

Mã số: 60.62.01

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS PHAN HỮU TÔN

HÀ NỘI - 2009

LỜI CAM ðOAN

- Tôi xin cam ñoan rằng, số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa ñược sử dụng ñể bảo vệ một học vị nào

- Tôi xin cam ñoan rằng, mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện luận văn

ñã ñược cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñược chỉ rõ nguồn gốc

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Thanh Tuyết

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy, cô trong Viện Sau ñại học, khoa Nông học, khoa Công nghệ sinh học, bộ môn công nghệ sinh học ứng dụng trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội ñã tạo mọi ñiều kiện thuận lợi giúp ñỡ tôi trong suốt quá trình thực tập

Cuối cùng xin cảm ơn gia ñình, ban bè và ñồng nghiệp ñã giúp ñỡ, ñộng viên tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp

Hà Nội, ngày 10 tháng 9 năm 2009

Tác giả

Nguyễn Thị Thanh Tuyết

MỤC LỤC

Lời cam ñoan……….i

Lời cám ơn……… ii

Mục lục……….iii

Danh mục các chữ viết tắt………….……… vi

Danh mục các bảng……… vii

Danh mục các hình……….viii

1 MỞ ðẦU 1

1.1 ðặt vấn ñề 1 1.2 Mục ñích 3 1.3 Yêu cầu 3 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

2.1 Những nghiên cứu cơ bản về cây lúa 4 2.1.1 Nguồn gốc cây lúa 4

2.1.3 Nghiên cứu nguồn gen di truyền cây lúa……… 6

2.1.4 Các ñường hướng lai chọn tạo giống lúa 10

2.2 Nghiên cứu về bệnh bạc lá lúa………13

2.2.1 Nguồn gốc, phân bố của bệnh bạc lá lúa 13

2.2.2 Tác hại của bệnh bạc lá lúa 14

2.2.3 Nguyên nhân gây bệnh bạc lá lúa 16

2.2.4 Triệu chứng bệnh bạc lá lúa 17

2.2.5 Quy luật phát sinh, phát triển của bệnh bạc lá lúa ở Việt Nam 19

2.2.6 Các yếu tố ảnh hưởng ñến sự phát sinh phát triển bệnh bạc lá lúa ….19 2.2.7 Các biện pháp phòng trừ bệnh bạc lá lúa 20

2.2.8 Cơ sở khoa học của chọn giống chống bệnh bạc lá 22

2.2.9 Nghiên cứu chỉ thị phân tử chọn tạo giống kháng bệnh bạc lá 27

2.2.10 Tình hình nghiên cứu bệnh bạc lá lúa 29

3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35

3.1 Vật liệu nghiên cứu 35 3.3 Phương pháp nghiên cứu 36 3.3.1 Phương pháp khảo sát tập ựoàn các giống lúa nếp ựịa phương 36

3.3.2 Phương pháp lây nhiễm và ựánh giá khả năng kháng bệnh bạc lá nhân tạoẦẦẦ 44

3.3.3 Phương pháp sử dụng chỉ thị phân tử PCR tìm gen kháng bệnh bạc lá Xa4, xa5, Xa7 46

3.3.4 Phương pháp xử lý số liệuẦẦẦ 52

4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 53

4.1 Kết quả khảo sát một số ựặc ựiểm nông sinh học của tập ựoàn các giống lúa nếp ựịa phươngẦẦẦ 53

4.1.1 Tình hình sinh trưởng phát triển giai ựoạn mạ 53

4.1.2 Thời gian qua các giai ựoạn sinh trưởng 55

4.1.3 Kết quả nghiên cứu ựặc ựiểm hình thái của các giống lúa thắ nghiệm 62 4.1.5 Kết quả nghiên cứu một số ựặc ựiểm của thân và bông 68

4.1.6 Kết quả ựánh giá khả năng kháng nhiễm sâu bệnh trên ựồng ruộngẦ.71 4.1.7 Kết quả nghiên cứu ựặc ựiểm nông sinh họcẦẦẦ.74

4.1.8 Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất 77

4.1.9 Một số chỉ tiêu ựánh giá chất lượng hạt gạoẦẦẦ 82

4.1.10 Kết quả ựánh giá mùi thơm trên lá và trên gạoẦẦẦ 84

1.1.11 Kết quả ựánh giá chất lượng nấu nướng và ăn uốngẦẦẦ 85

4.2 đánh giá khả năng kháng bệnh bạc lá bằng lây nhiễm bệnh nhân tạo 88 4.3 Kết quả ứng dụng kỹ thuật PCR xác ựịnh gen kháng bệnh bạc lá Xa4, xa5, Xa7ẦẦẦ 97

4.3.1 Kiểm tra ựộ tinh sạch của DNA 97

4.3.2 Ứng dụng kỹ thuật PCR ựể xác ựịnh các Xa Ờ gens 98

4.4 Giới thiệu một số giống triển vọng 103

5 KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 106

5.1 Kết luận……….106

5.2 ðề nghị……… 107

TÀI LIỆU THAM KHẢO 108

PHỤ LỤC……….114

- PCR: Polymerase Chain Retriction

- RFLP: Retriction Fragment Length Polymorphirm

- Số bông hữu hiệu/khóm: Số bông hữu hiệu trên khóm

- Số hạt chắc/bông: Số hạt chắc trên bông

- Số hạt/bông: Số hạt trên bông

- STT : Số thứ tự

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 Danh mục các giống tham gia thắ nghiệm 35

Bảng 3.2 Danh sách các chủng vi khuẩn sử dụng trong lây nhiễm 44

Bảng 4.1 Tình hình sinh trưởng của cây mạ 54

Bảng 4.2 Thời gian sinh trưởng của các giống thắ nghiệm 57

Bảng 4.3 đặc ựiểm hình thái của các giống lúa thắ nghiệm 62

Bảng 4.4 đặc ựiểm hình thái lá ựòng của các giống lúa thắ nghiệm 66

Bảng 4.5 Một số ựặc ựiểm của thân và bông 68

Bảng 4.6 Tình hình nhiễm sâu bệnh của các giống tham gia thắ nghiệm 72

Bảng 4.7 đặc ựiểm nông sinh học của các giống thắ nghiệmẦẦẦ.75

Bảng 4.8 Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất 78

Bảng 4.9 đặc ựiểm hình thái hạt gạoẦẦẦ.83

Bảng 4.10 Kết quả ựánh giá mùi thơm trên lá và trên gạoẦẦẦ.84

Bảng 4.11 Hàm lượng amylose của các giống tham gia thắ nghiệmẦẦẦ 85

Bảng 4.12 Nhiệt ựộ hoá hồ của các giống thắ nghiệmẦẦẦ87

Bảng 4.13 Kết quả vết bệnh lây nhiễm nhân tạo 89

Bảng 4.14 đánh giá khả năng kháng bệnh bạc lá 90

Bảng 4.15 Mối quan hệ giữa các ựặc ựiểm hình thái với khả năng kháng nhiễm bệnh bạc láẦ ẦẦẦ 95

Bảng 4.16 Kết quả chạy PCR tìm gen kháng bệnh bạc lá 10196

Bảng 4.17 Giới thiệu một số giống có tiềm năng năng suất cao 104

Bảng 4.18 Giới thiệu một số giống có khả năng kháng bệnh tốt khi lây nhiễm nhân tạo và chứa gen kháng bệnh bạc lá 105

DANH MỤC HÌNH

Hình 4.1: Lá bị bệnh của giống 10618 91

Hình 4.2 Lá có khả năng kháng bệnh của giống 10668 91

Hình 4.3 Biểu ñồ thể hiện ñộc tính của các chủng vi khuẩn……… 93

Hình 4.4 Kiểm tra ñộ tinh sạch của DNA nguyên bản……… 97

Hình 4.5 Kết quả ñiện di xác ñịnh gen Xa4……… 98

Hình 4.6 Kết quả ñiện di sản phẩm PCR cho gen xa5 trước khi cắt enzyme……… 99

Hình 4.7 Kết quả ñiện di xác ñịnh gen xa5 sau khi cắt emzyme………… 99

Hình 4.8 Kết quả ñiện di xác ñịnh gen Xa7 100

1 MỞ ðẦU

1.1 ðặt vấn ñề

Cây lúa (Oryza sativa L ) là một trong ba cây lương thực chủ yếu trên thế giới (lúa mì, lúa, ngô) Ngoài ñược sử dụng làm lương thực thì sản phẩm phụ của lúa gạo còn có vai trò quan trọng trong ngành chế biến cũng như cho ngành chăn nuôi

Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt ñới gió mùa nên rất thích hợp cho cây lúa phát triển Từ lâu, cây lúa ñã trở thành cây lương thực chủ yếu và có ý nghĩa quan trọng trong nền kinh tế quốc dân Bên cạnh tầm quan trọng của lúa

tẻ thì lúa nếp cũng có ý nghĩa to lớn trong ñời sống văn hoá của người dân Việt Nam Nó ñược sử dụng vào nhiều mục ñích khác nhau như dùng làm ñồ thờ cúng ông bà tổ tiên, trong các bữa tiệc, lễ hội bao giờ cũng có mặt những món

ăn từ lúa nếp Chính lúa nếp ñã góp phần làm nên hương vị hấp dẫn, ñộc ñáo giàu tính nhân văn của văn hoá ẩm thực Việt Nam

ðể từ một nước nông nghiệp lạc hậu trở thành nước xuất khẩu gạo thứ hai thế giới thì ngoài những ñiều kiện tự nhiên thuận lợi cùng kinh nghiệm sản xuất lúa nước từ lâu ñời của người dân cần phải kể ñến sự phát triển vượt bậc về khoa học nông nghiệp trong ñó, công tác giống và bảo vệ thực vật chiếm một

giảm sút rõ rệt Các biện pháp phòng trừ như biện pháp canh tác, chế ựộ bón phân hợp lý, biện pháp hoá họcẦ ựều cho hiệu quả không cao Biện pháp phòng chống hữu hiệu nhất là chọn giống kháng bệnh

Muốn chọn tạo giống chống bệnh bạc lá lúa thành công và bền vững thì trước hết phải có nguồn gen kháng phong phú Tập ựoàn các giống lúa ựịa phương thường mang nhiều ựặc tắnh quý về các khả năng chống chịu với ựiều kiện bất thuận và sâu bệnh hại (trong ựó có khả năng kháng bệnh bạc lá lúa) - đây chắnh là nguồn cung cấp gen kháng bệnh phong phú và rất có ý nghĩa cho công tác chọn tạo giống kháng bệnh để khai thác và sử dụng nguồn gen này thì việc xác ựịnh khả năng kháng của từng giống lúa là việc làm rất cần thiết Tuy nhiên, việc xác ựịnh chắnh xác các giống lúa có chứa gen kháng bệnh hay không lại là một việc làm rất khó khăn Phương pháp truyền thống là tiến hành lây nhiễm nhân tạo ựồng thời với các dòng ựẳng gen rồi so sánh phổ kháng nhiễm, kết luận khả năng chứa gen của giống Phương pháp này cũng thành công song còn phụ thuộc vào ựiều kiện môi trường nên ựộ chắnh xác chưa cao để khẳng ựịnh chắnh xác khả năng mang gen kháng của các giống lúa nghiên cứu thì sử dụng phương pháp PCR là một hướng ựược nhiều nhà khoa học quan tâm Phương pháp PCR chỉ cần sử dụng hai ựoạn mồi ựặc hiệu cho gen cần xác ựịnh rồi nhân PCR, sản phẩm nhân PCR ựược chạy ựiện di ựể xác ựịnh sự ựa hình Hiện nay có rất nhiều chỉ thị liên kết với

gen kháng bệnh như gen Xa4 liên kết với chỉ thị Npb181 và Npb78 trên NST

số 11 (Yoshida et al.1992) Với khoảng cách liên kết ựều là 1.7cM Gen lặn

xa5 liên kết với chỉ thị RG556 trên nhiễm sắc thể số 5 với khoảng cách là

0-1cM (Mc Cough at.1991) Gen Xa7 liên kết chặt với chỉ thị P3 trên nhiễm sắc thể số 6 với khoảng cách 2,5cM Còn gen Xa21 thì liên kết với chỉ thị

pTA818 và pTA248 với khoảng cách 0-1cM (Ronald et al.1992) [26]

Trên cơ sở ựó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ựề tài: Ộđánh giá khả năng kháng bệnh bạc lá của tập ựoàn các giống lúa nếp ựịa phươngỢ

* Sử dụng chỉ thị phân tử PCR tìm gen kháng bệnh bạc lá Xa4, xa5, Xa7

ở tập đồn các giống lúa nếp địa phương

2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Những nghiên cứu cơ bản về cây lúa

2.1.1 Nguồn gốc cây lúa

Lúa là một trong những loài cây trồng có lịch sử trồng trọt lâu ựời nhất Căn cứ vào các tài liệu khảo cổ ở Trung Quốc, Ấn độ, Việt NamẦcây lúa có mặt từ 3000 Ờ 2000 năm trước công nguyên, ở Trung Quốc vùng Triết Giang

ựã xuất hiện cây lúa 5000 năm, ở hạ lưu sông Dương Tử - 4000 năm Tuy nhiên vẫn còn thiếu những tài liệu ựể xác ựịnh một cách chắnh xác thời gian

cây lúa ựược ựưa vào trồng trọt [3]

Ở Việt Nam cây lúa ựược coi là cây trồng Ộbản ựịaỢ, nó không phải là loại cây từ nơi khác ựưa vào (Bùi Huy đáp, 1985 ) Với ựiều kiện khắ hậu nhiệt ựới, Việt Nam cũng có thể là cái nôi hình thành cây lúa nước Từ lâu, cây lúa ựã trở thành cây lương thực chủ yếu có ý nghĩa quan trọng trong nền kinh tế và xã hội của nước ta [23] Lúa trồng hiện nay có nguồn gốc từ lúa

dại Việc xác ựịnh trực tiếp tổ tiên của cây lúa trồng ở Châu Á (Oryza sativa )

vẫn còn nhiều ý kiến khác nhau Một số tác giả như Sampath và Rao ( 1951),

Sampath và Govidaswami (1958) cho rằng: Oryza sativa có nguồn gốc từ lúa

dại lâu năm Rufipogon Tác giả Chtterjce và cộng sự ( 1958), Oka ( 1998),

Mirishima và cộng sự (1992) cho rằng: kiểu trung gian giữa O rufipogon và O

nivara giống với tổ tiên lúa trồng hiện nay hơn cả [34] Theo tác giả ở ựại học

Triết Giang (Trung Quốc) thì lúa trồng bắt nguồn từ lúa dại Oryza sativa

L.F.spontaneae

Một số tác giả như đinh Dĩnh, Bùi Huy đáp, đinh Văn LữẦcho rằng:

Oryza fatua là loài lúa dại gần nhất và ựược coi là tổ tiên của lúa trồng hiện nay

2.1.2 Phân loại lúa trồng

Về phân loại lúa trồng Oryza sativa cũng còn có nhiều quan ựiểm khác

nhau Tuy nhiên trên cơ sở kết quả nghiên cứu trước ựây, các nhà khoa học Viện nghiên cứu lúa quốc tế (IRRI) ựã thống nhất xếp lúa trồng ở Châu Á

(Oryza sativa) thuộc họ hoà thảo (Graminae) tộc oryzae, có bộ NST 2n=24

[4] Theo ựiều kiện sinh thái, Kato (1993) chia lúa trồng thành 2 nhóm lớn là

Japonica (lúa cánh) và Indica (lúa tiên) Lúa tiên thường phân bố ở vĩ ựộ thấp

như: Trung Quốc, Ấn độ, Việt Nam, InựonexiaẦlà loại hình cây cao, lá nhỏ xanh nhạt, bông xoè, hạt dài, vỏ trấu mỏng, cơm khô, nở nhiều, chịu phân kém, dễ lốp ựổ nên năng suất thường thấp Lúa cánh thường phân bố ở vùng

vĩ ựộ cao như: Nhật Bản, Triều Tiên, Bắc Trung Quốc, Châu ÂuẦlà loại hình cây lá to, xanh ựậm, bông chụm, hạt ngắn, vỏ trấu dày, cơm thường dẻo, ắt nở,

thắch nghi với ựiều kiện thâm canh, chịu phân tốt thường cho năng suất cao [23]

Căn cứ vào thời gian sinh trưởng khác nhau, Trung Quốc ựã chia ra lúa sớm và lúa muộn hoặc lúa Xuân và lúa Mùa Ở Việt Nam ựã từ lâu hình thành

2 vụ lúa là vụ lúa Xuân và vụ lúa Mùa, do lúa Xuân sinh trưởng trong vụ đông Xuân có nền nhiệt ựộ thấp nên thực tế thời gian sinh trưởng của lúa Xuân lại dài hơn lúa mùa [10] Hiện nay hầu hết các giống lúa trong sản xuất ựều phản ứng với nhiệt ựộ nên cấy ựược ở cả 2 vụ trong năm

Do ruộng lúa ựược phân bố trong các ựiều kiện ựịa hình khác nhau, chế

ựộ tưới và mức tưới ngập khác nhau ựã hình thành lúa cạn (lúa ựồi, lúa

nương) và lúa nước, lúa chịu nước sâu (deep water) với mức tưới ngập trên 1m hay lúa nổi (Floating rice) có thể chịu ngập ựến 3 Ờ 4m

Theo chất lượng và hình dạng hạt, người ta phân ra: lúa tẻ và lúa nếp, lúa hạt tròn và lúa hạt dài

Theo quan ựiểm canh tác học, cây lúa ựược phân thành 4 nhóm chắnh sau ựây [4]

- Lúa cạn (Upland rice): ựược trồng trên ựất cao, không giữ nước, cây

lúa hoàn toàn sống nhờ vào nước trời

- Lúa có tưới (Irrigated or Floaded rice): ñược trồng trên những cánh

ñồng có công trình thuỷ lợi, chủ ñộng về nước tưới trong suốt chu kỳ sống của cây

- Lúa nước sâu (Rainfed foaland rice): ñược canh tác trên những cánh

ñồng thấp, không có khả năng rút nước khi gặp mưa lớn hoặc lũ Tuy nhiên, thời gian ngập nước không quá 10 ngày và mức nước không quá 50 cm

- Lúa nổi (Deep water or Floating rice): là loại lúa ñược gieo trồng

trong mùa mưa, khi mưa lớn lúa ñã ñẻ nhánh, nước dâng cao lúa vươn nhánh ( khoảng 10cm/ngày) ñể ngoi theo, vươn lên mặt nước

Ở Việt Nam tồn tại cả 4 nhóm giống lúa trên, nhưng chủ yếu là nhóm lúa có tưới, còn nhóm lúa cạn, lúa nước sâu và lúa nổi ngày một giảm ñi Nhóm lúa cạn tồn tại nhiều ở vùng núi và trung du Bắc Bộ, Tây Nguyên Lúa

có tưới ñược canh tác chủ yếu ở vùng ñồng bằng Sông Hồng, ñồng bằng ven biển miền Trung và ñồng bằng sông Cửu Long Lúa nước sâu ñược gieo trồng chủ yếu tại các vùng úng ngập, trũng thuộc ñồng bằng Bắc Bộ, các thung lũng khó thoát nước thuộc vùng Trung du miền núi phía Bắc Lúa nổi chỉ tồn tại rất

ít ở vùng ðồng Tháp Mười thuộc ñồng bằng sông Cửu Long

Ngoài 4 nhóm trên ở Việt Nam còn có một số nhóm giống lúa thích nghi với các tiểu vùng sinh thái chuyên biệt khác nhau như: giống lúa chịu mặn, các giống lúa này ñược trồng chủ yếu ở các vùng duyên hải Bắc, Nam, Trung Bộ Các vùng ñó thường xuyên bị nước biển xâm nhập nhưng cũng ñược nguồn nước ngọt thau rửa nên vẫn có thể canh tác lúa

2.1.3 Nghiên cứu nguồn gen di truyền cây lúa

* Nguồn gen ñịa phương cây lúa và vấn ñề bảo tồn

Việt nam nổi tiếng về sự phong phú, ña dạng sinh học Theo thống kê nước ta có tới hơn 1810 giống ngô, 75 giống khoai lang, 33 giống ñay, 114

giống lạc, 224 giống ñậu ñỗ, 48 giống dâu…[38]

Các nhà khoa học cho rằng Việt Nam là một trong những cái nôi của nền văn minh nông nghiệp lúa nước Cả nước có khoảng 2.000 giống lúa cổ truyền trong ñó có 206 giống lúa nếp, hiện vẫn còn những loài lúa hoang dại

trong tự nhiên [38] Với hệ gen phong phú Indica 45000 - 56000 gen,

Japonica 32000 - 50000 gen (2003) [38], ñây là nguồn vật liệu khởi ñầu quan trọng ñể các nhà chọn giống tiến hành lai tạo giống mới

Các giống lúa ñịa phương ñược hình thành do quá trình chọn lọc tự nhiên

và nhân tạo lâu dài trong ñiều kiện ñịa phương do vậy, chúng cho năng suất

ổn ñịnh do thích nghi cao với ñiều kiện ñịa phương và có tính chống chịu tốt với một số sâu bệnh hại nguy hiểm và ñiều kiện bất thuận của tự nhiên Do tập quán, ñiều kiện canh tác, khả năng tiếp cận khoa học kỹ thuật của ñồng bào các dân tộc miền núi chưa cao, nên nhiều nơi còn duy trì và trồng một số giống lúa ñịa phương bản ñịa Thành phần của các giống lúa này rất ña dạng

và phong phú Dần dần, do sự phát triển kinh tế trong ñó có nông nghiệp thì

họ sẽ bỏ dần giống cũ và thay thế các giống lúa lai mới nhập nội có năng suất cao hơn nhưng khả năng kháng bệnh lại rất kém ñã tiềm ẩn nguy cơ sâu bệnh bùng phát trên diện rộng Do ñó, công tác chọn tạo các giống lúa có khả năng kháng bệnh là việc làm rất cấp thiết nhằm ñảm bảo an ninh lương thực Tuy nhiên, ñể chọn tạo giống kháng sâu bệnh thành công thì nguồn gen các giống lúa ñịa phương bản ñịa có ý nghĩa rất to lớn Vấn ñề ñặt ra là phải thường xuyên tiến hành ñánh giá, thu thập và bảo quản nguồn gen, dùng các biện pháp kỹ thuật thích hợp ñể lai tạo giống mới dựa trên những tính trạng tốt của các giống lúa ñịa phương

Từ năm 1975, Viện nghiên cứu lúa quốc tế IRRI ñã hợp tác chính thức với Việt Nam trong chương trình thử nghiệm giống lúa quốc tế (IRTP) trước ñây và nay là chương trình ñánh giá nguồn gen cây lúa (INGER) Trong quá

trình hợp tác, Việt nam ựã nhận ựược 279 tập ựoàn lúa gồm hàng nghìn mẫu giống mang nhiều ựặc ựiểm nông sinh học tốt, năng suất cao, chất lương tốt, chống chịu sâu bệnh và ựiều kiện ngoại cảnh bất thuận [4]

Việt Nam ựã tiến hành công tác bảo tồn nguồn gen từ những năm 1987, kết quả ựạt ựược là ựã bảo tồn và lưu giữ ựược trên 13.500 giống thực vật tại trung tâm tài nguyên thực vật (Lưu Ngọc Trình, 2000), trên 450 giống lúa có khả năng chịu hạn, chịu úng ngập và chống chịu sâu bệnh tốt (Trần Duy Quý, 2000) [4]

Ngân hàng gen cây trồng Quốc gia ựã nghiên cứu bình tuyển, phục tráng, chọn lọc và thử nghiệm một số dòng, giống lúa tốt ựể phát triển trong sản xuất: giống lúa nếp Quýt ựặc sản, lúa thơm ngắn ngày LT-3, lúa nếp thơm ngắn ngày NT-96, [38]

* Nguồn gen di truyền lúa nếp

Nguồn gen di truyền lúa nếp ở Việt Nam lần ựầu tiên ựược Lê Quý đôn thế kỷ 18 (Theo Bùi Huy đáp, 1980) mô tả trong cuốn Ộ Vân ựài loại ngữỢ với 70 giống lúa cổ truyền, trong ựó có 29 giống lúa nếp [24] Lúa nếp ựã ựược người nông dân Việt Nam cải tiến và sử dụng ựa dạng nguồn gen Ngân hàng gen quốc gia tại Viện Khoa học kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam ựã bảo quản 1200 mẫu giống lúa nếp bản ựịa ựược thu thập trên toàn quốc, trong số này có gần 200 mẫu giống ựược thu thập trước những năm 1990, là những giống có nguồn gốc chủ yếu ở khu vực ựồng bằng, còn hơn 1000 mẫu giống ựược thu thập sau năm 1990, chủ yếu là lúa nương ở khu vực miền núi [24]

Năm 1995, Lương Ngọc Trình và các cộng sự dựa trên các mẫu isozyme

ựể phân loại 643 giống lúa cổ truyền ựại diện cho các hệ sinh thái của Việt

Nam, phát hiện dòng lúa Indica chiếm 91,9% nguồn gen lúa Việt Nam, lúa

japonica chiếm 6,8% và 1,3% là không phân loại ñược Kết quả này ñã giới thiệu một cấu trúc di truyền chung của nguồn gen lúa Việt Nam [35]

Qua quá trình canh tác hàng nghìn năm, Việt Nam ñã lưu giữ, chọn tạo ñược nhiều giống lúa nếp quý như giống nếp hương, nếp cái hoa vàng, nếp rồng Nghệ An, nếp chân voi, nếp cà cuống, nếp dâu, nếp cánh sẻ, nếp bầu

Do quá trình chọn lọc, trồng cấy hàng nghìn ñời nên chúng có khả năng thích nghi và chống chịu tốt với ñiều kiện môi trường ðây là quỹ gen phong phú,

ña dạng – một nguồn gen hết sức quý giá

* Các hướng sử dụng nguồn gen ñịa phương

Hiện nay với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, bằng nhiều phương pháp khác nhau và tuỳ vào từng ñiều kiện cụ thể, người ta có nhiều cách ñể sử dụng nguồn gen ñịa phương làm sao ñể ñạt kết quả tốt nhất

- Dùng phương pháp chọn lọc trực tiếp: Từ quần thể ñịa phương, các nhà khoa học tiến hành chọn tạo trực tiếp bằng cách chọn những cá thể tốt nhất với kiểu sinh thái ñịa lý và gây thành giống mới Ví dụ: Giống lúa Mộc Tuyền ñược chọn ra từ giống Mộc Khâm [4]

- Dùng trong các tổ hợp lai: Các nhà khoa học sử dụng các giống lúa ñịa phương có một số ñặc tính tốt như có khả năng chống chịu tốt với sâu bệnh và ñiều kiện ngoại cảnh bất thuận, mang gen mùi thơm… ñể lai với các giống khác có tính trạng bổ sung như thời gian sinh trưởng ngắn, năng suất cao, … nhằm kết hợp các tính trạng tốt vào giống mới

- Dùng phương pháp gây ñột biến: Các giống ñịa phương mang tính trạng quý nhưng còn có nhược ñiểm ñược sử dụng làm vật liệu gây ñột biến nhằm cải tiến tính trạng mong muốn Ví dụ: ñã gây ñột biến tạo dòng nếp cái hoa vàng vừa mang gen mùi thơm vừa cấy ñược cả hai vụ, khắc phục ñược nhược ñiểm phản ứng với ánh sáng ngày ngắn, dễ ñổ…[4]

2.1.4 Các ñường hướng lai chọn tạo giống lúa

2.1.4.1 Nuôi cấy phôi, nuôi cấy noãn và thụ phấn in vitro

Nuôi cấy phôi là kỹ thuật khắc phục hiện tượng bất hợp khi lai xa Trong một số trường hợp phôi lai từ các tổ hợp lai giữa các loài có quan hệ xa nhau thường yếu và không có khả năng sống do sự cung cấp dinh dưỡng từ nội nhũ không ñầy ñủ Những phôi như vậy thường bị chết trong một thời gian ngắn sau khi hình thành hợp tử và không thể phát triển thành hạt có khả năng sống Vì vậy nuôi cấy phôi hay cứu phôi là phương pháp ñể khắc phục hàng rào bất hợp, ñảm bảo ñể phôi non sinh trưởng, nảy mầm và phát triển thành con Thông qua sử dụng phương pháp này ñã tạo ra nhiều con lai khác loài ở nhiều cây trồng, ñặc biệt là khi lai giữa lúa hoang dại và lúa trồng

Noãn ñã thụ tinh ñôi khi ñược nuôi cấy ñể cứu phôi từ các tổ hợp lai xa

mà không cần tách phôi ra khỏi noãn Noãn chứa phôi lai non ñược tách ngay sau khi thụ tinh trong ñiều kiện vô trùng rồi nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng Bằng con ñường nuôi cấy noãn phôi có thể nuôi cấy ở giai ñoạn sớm hơn so với nuôi cấy phôi tách rời Hơn nữa, phôi phát triển trong noãn có môi trường hoá học và lí học thuận lợi hơn nuôi cấy bên ngoài noãn

Thụ phấn và thụ tinh in vitro gồm việc thu thập noãn chưa thụ tinh, cấy

noãn trên môi trường dinh dưỡng trong ñiều kiện vô trùng và thụ phấn cho noãn với các hạt phấn tươi Ống phấn xuyên qua thành noãn và túi phôi sẽ thụ tinh cho tế bào trứng

2.1.4.2 Nuôi cấy bao phấn và sản xuất cây ñơn bội

Nuôi cấy bao phấn là nuôi cấy in vitro các bao phấn chứa tiểu bào tử hay

hạt phấn chưa thành thục trên môi trường dinh dưỡng ñể tạo ra cây ñơn bội

Số nhiễm sắc thể của cây ñơn bội ñược nhân ñôi ñể tạo ra cây lưỡng bội ñồng hợp tử hoàn toàn, gọi là thể ñơn bội kép (có thể sử dụng ñược ngay làm các

dòng thuần ở cả cây tự thụ phấn và cây giao phấn) Thời gian cần thiết ñể tạo

ra một giống hay một dòng bằng phương pháp ñơn bội kép ñược rút ngắn nhiều thế hệ so với phương pháp truyền thống ñể ñạt ñộ ñồng hợp tử bằng tự thụ phấp Các dòng ñơn bội kép tạo ra cơ hội duy nhất ñể cải tiến hiệu quả chọn lọc ñối với nhiều tính trạng vì trong quần thể không có phương sai trội, ñồng thời gen lặn cũng biểu hiện ra kiểu hình Tuy nhiên hạn chế trong việc

áp dụng rộng rãi phương pháp này là khả năng nuôi cấy khó và tính ñặc thù cao của kiểu gen

2.1.4.3 Khai thác bất dục ñực tế bào chất

Kỹ thuật này dùng ñể tạo ra các giống lúa lai F1, ñã và ñang áp dụng khá thành công ở Trung Quốc với ưu thế về năng suất vượt 20 – 30% so với các giống lúa ñang trồng có năng suất cao nhất [1]

Hệ thống lúa lai 3 dòng: Dòng A (bất dục ñực), dòng B (duy trì tính bất dục), dòng R (phục hồi hữu dục), ñã ñược áp dụng khá thành công với khoảng

22 dòng CMS có nguồn gốc từ IRRI và Trung Quốc (Jachuk, 1986) Lúa lai 3 dòng tạo ưu thế lai với những ưu ñiểm như: có khả năng cho năng suất cao, khả năng tích luỹ chất khô cao, khả năng thích nghi rộng, cây con phát triển mạnh, có tính kháng sâu bệnh Tuy nhiên nhược ñiểm của ưu thế lai là phải chọn tạo ñược bố có khả năng phối hợp cao và phải nghiên cứu công nghệ sản xuất hạt lai F1 ñể hạ giá thành hạt lai

Hệ thống lúa lai 2 dòng ra ñời ñã phần nào khắc phục ñược những nhược ñiểm trên Hệ thống lúa lai hai dòng bao gồm: dòng PGMS (bất dục ñực mẫn cảm với cảm quang chu kỳ) và TGMS (bất dục ñực mẫn cảm với nhiệt ñộ)

Ưu ñiểm của hệ thống này là có thể dùng bất kỳ nguồn gen phục hồi nào ñó cũng ñược và giảm bớt ñược một công ñoạn sản xuất hạt lai như ở hệ thống lúa lai 3 dòng

2.1.4.4 Dung hợp tế bào trần

Dung hợp tế bào trần là sự hợp nhất của các tế bào xôma không có thành

tế bào của các cá thể hoặc các loài khác nhau và sau ñó tái sinh cây lai từ các

tế bào ñã dung hợp Ngoài khả năng dung hợp nhân, dung hợp tế bào trần còn

có khả năng xảy ra hỗn hợp tế bào chất, hình thành tổ hợp di truyền hoàn toàn mới Ti thể và lạp thể của hai tế bào khác nhau có thể hợp nhất hoặc là tái tổ hợp tạo ra một tế bào dị tế bào chất, gọi là cybrid Như vậy, bằng con ñường lai xôma người ta có thể thu ñược tổ hợp mới của nạp thể hay ti thể và tương tác mới giữa nhân và tế bào chất

Phương pháp này ñã ñược áp dụng ñể tái sinh cây lúa từ tế bào trần ở cả

hai loại hình Indica và Japonica (Lee et al, 1989) Người ta cũng có thể sản

xuất con lai somatic giữa các loài có khoảng cách di truyền rất xa Tuy nhiên, lợi ích của những con lai này vẫn chưa ñược biết rõ

2.1.4.5 Kỹ thuật chuyển gen

ðây là kỹ thuật ñược tạo ra nhờ những tiến bộ trong nuôi cấy mô và sinh học phân tử Có hai cách ñể chuyển một gen lạ vào cây trồng:

- Chuyển qua Ti – plasmid của vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens gồm các bước: phân lập gen có ích từ thể cho (AND lạ ) và nhân gen; loại bỏ T – AND khỏi Ti – plasmid của các dòng vi khuẩn ñã chọn lọc; chuyển AND lạ vào Ti – plasmid cùng với gen khởi ñộng và một gen chỉ thị có khả năng chọn lọc dễ dàng; ñưa plasmid ñã biến ñổi vào tế bào thực vật; chọn tế bào ñược

chuyển gen; tái sinh tế bào ñược chuyển gen; chọn cây biểu hiện gen ñược chuyển (cây chuyển gen)

- Truyền trực tiếp ADN bằng các phương pháp: phương pháp vi tiêm (tiêm trực tiếp dung dịch ADN vào các tế bào trần dưới áp lực cao); biến nạp bằng xung ñiện (trong ñiện trường xoay ñều với tần số cao, các tế bào trần liên kết lai với nhau, sau ñó dùng xung ñiện một chiều ñể dung hợp chúng lại); phương pháp mở lỗ ñiện (các tế bào trần và ADN cần biến nạp cùng nằm trong một dung dịch sinh lý thích hợp, người ta cho xung ñiện chạy qua dung dịch, tạo nên các lỗ hổng trên màng sinh chất, nhờ vậy các phân tử ADN có

thể chui vào bên trong); dùng súng bắn gen,

Nhờ phương pháp này các nhà chọn giống ñã tạo ra một số giống lúa

kháng bệnh bạc lá: VL902 (gen Xa 21 ñược chuyển vào loài phụ Indicca) [1]

2.1.4.6 Ứng dụng marker phân tử

Giám ñịnh chính xác các giống, dòng và nguồn vật liệu khởi ñầu cho chọn giống vô cùng quan trọng ñối với việc chọn lọc bố mẹ ñể tạo ra nguồn biến dị di truyền Do ñó, việc ứng dụng marker phân tử ñể ñánh dấu các gen

có tầm quan trọng kinh tế là rất cần thiết

Những ứng dụng của phương pháp này là:

- Xác ñịnh mức ñộ ña dạng di truyền

- Xác ñịnh chính xác con lai F1

- Ước ñịnh mức ñộ lẫn tạp và phát hiện sự du nhập của gen hoang dại

2.2 Nghiên cứu về bệnh bạc lá lúa

2.2.1 Nguồn gốc, phân bố của bệnh bạc lá lúa

Bệnh bạc lá lúa ñược phát hiện ñầu tiên ở Fukuoka - Nhật Bản, vào năm

1884, và trở nên phổ biến ở tất cả các nước trồng lúa trên thế giới trong khoảng từ cuối thập kỷ 60 ñến ñầu thập kỷ 80, ñặc biệt là các nước trồng lúa châu Á như Ấn ðộ (1940), Indonexia (1950), Philippin (1957), Trung Quốc (1957), Pakistan (1976) Ngoài ra, người ta còn quan sát ñược bệnh này ở châu Phi (1975) và châu Mỹ la tinh (1979) [17]

Tuy nhiên, bệnh bạc lá phổ biến và gây hại nặng nhất ở các nước trong vùng nhiệt ñới châu Á như: Ấn ðộ, Philippin và Việt Nam ðặc biệt, bệnh gây hại nặng hơn khi mở rộng diện tích trồng 1 số giống lúa nửa lùn cho năng suất cao kết hợp với các hình thức thâm canh trong cuộc cách mạng xanh [59] Vì vậy, ñây là vấn ñề rất quan trọng ñối với các nước trồng lúa nói chung và các nước trồng lúa ở Nam Á nói riêng

Ở Việt Nam, bệnh bạc lá lúa ñược phát hiện từ sau hoà bình lập lại (1954) trên các giống lúa ñịa phương cao cây nhưng mức ñộ gây hại không nghiêm trọng [12] Khi phong trào thâm canh lúa phát triển, mở ñầu bằng việc gieo trồng các giống lúa cải tiến, chịu phân, cho năng suất cao, kết hợp với việc sử dụng nhiều phân bón, ñặc biệt là phân ñạm thì bệnh bạc lá thực sự trở nên nghiêm trọng và thường xuyên gây hại trong vụ mùa Bệnh ñã phát triển thành dịch lớn ở một số tỉnh ðồng bằng sông Hồng trong vòng từ năm 1968-

1975 [39]

Trong những năm gần ñây, bệnh bạc lá có xu hướng tăng lên và gây hại

ở cả vụ xuân ðiều này do nhiều nguyên nhân gây nên, trong ñó phải kể ñến việc gieo trồng và sử dụng rộng rãi các giống lúa nhập nội từ Trung Quốc, chưa qua khâu ñánh giá tính chống bệnh Phần lớn các giống này có phản ứng nhiễm vừa ñến nhiễm nặng ñối với các chủng vi khuẩn gây bệnh bạc lá ở Việt Nam Theo cục Bảo vệ thực vật, trong năm 1994, diện tích bị bệnh bạc lá hại

ñã lên tới 120.000 ha ở các tỉnh ðồng Bằng Sông Hồng [39] Theo Hà Minh Trung (1996), bạc lá lúa là một trong ba loại bệnh nặng và phổ biến trên cả nước [36]

Xuất phát từ yêu cầu thực tiễn của ngành trồng lúa, nhiều công trình nghiên cứu về bệnh bạc lá lúa ñã ñược tiến hành và tập trung vào các mặt như dịch tễ học, ñặc ñiểm sinh lý sinh hoá của vi khuẩn, giống chống bệnh Những thành công trong các công trình nghiên cứu này ñã góp phần không nhỏ vào việc làm giảm tác hại của bệnh bạc lá, làm tăng chất lượng và sản lượng lúa hàng năm

2.2.2 Tác hại của bệnh bạc lá lúa

Tác hại chủ yếu của bệnh bạc lá lúa là làm cho lá ñòng và các lá công năng cháy, sớm tàn, nhanh chóng trở nên khô, chết; làm bộ lá xơ xác, ảnh hưởng tới khả năng quang hợp của cây; làm tăng tỉ lệ hạt lép, dẫn tới giảm

năng suất rõ rệt [8], [40] Tuy nhiên, mức ñộ thiệt hại nặng hay nhẹ còn phụ thuộc khả năng kháng của từng giống và tác nhân gây bệnh là các chủng vi khuẩn khác nhau

Ấn ðộ hàng năm có tới hàng triệu ha bị bệnh nặng, năng suất giảm từ 6 – 60% (Theo Srivastava,1972) [59]

Ở Nhật Bản trong những năm gần ñây hàng năm có từ 300.000 – 400.000 ha lúa bị bệnh nặng, với năng suất giảm từ 20 – 30%, có nơi tới 50% Còn ở Việt Nam, theo thí nghiệm của Viện Khoa học kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam tại Văn ðiển cho thấy giống lúa Trân Châu Lùn bị bệnh 100%, vụ mùa năm 1969 ñạt năng suất 177 tạ/ha và vụ mùa năm 1970 chỉ ñạt

15 tạ/ha Năng suất lúa bị bệnh giảm so với ruộng bình thường không bị nhiễm bệnh là 40 – 60% (Mai Văn Quyền, 1969 – 1970) [17], [20] Còn trong những năm 1970 – 1975 bệnh gây thiệt hại nghiêm trọng cho một số giống lúa mới, ñặc biệt là giống lúa NN8 cấy trong vụ mùa

Bệnh gây hại nặng ở các tỉnh ñồng bằng ven biển như Hà Nam Ninh (cũ), Thái Bình với 18% diện tích giống NN8 bị bệnh, năng suất giảm từ 30 – 60% (Theo ðường Hồng Dật, 1998) [2]

Năm 1996 diện tích bị nhiễm ở các tỉnh miền Bắc, miền Trung là 304.700

ha (gấp 2,5 lần so với vụ mùa năm 1995), các giống bị nhiễm gồm: các giống lúa lai, lúa thuần Trung Quốc, CR203 Tỷ lệ bị bệnh trên nhiều giống lên tới 90 – 100% với cấp bệnh từ cấp 7 – cấp 9 và gây cháy lá (theo Viện Bảo vệ thực vật, 1998) [42] Còn năm 1997 phát sinh mạnh trong cuối vụ ñông xuân, sau vụ mưa giông diện tích bị bệnh tăng tới 29 lần, tỷ lệ bệnh trung bình là 20%, nơi cao 70% - 90%, chủ yếu trên các giống lúa lai, lúa thuần Trung Quốc, CR203 Theo Tạ Minh Sơn [18] thì cứ 1% chỉ số bệnh làm giảm 0,94 tạ/ha

Năm 1999 diện tích lúa bị nhiễm bệnh bạc lá là 112.000 ha (Cục BVTV – 1999) Năm 2000 chỉ tính riêng các tỉnh phía Bắc diện tích lúa bị bệnh bạc

lá là: 76.000 ha (TT BVTV phía Bắc – 2000) Vụ mùa 2005, riêng tỉnh Nghệ

An diện tích lúa bị bệnh là 15.000 ha, bệnh hại chủ yếu trên các giống lúa lai

Trung Quốc như Nhị ưu 838, D.ưu 52… [22]

2.2.3 Nguyên nhân gây bệnh bạc lá lúa

Lúc ñầu các nhà khoa học cho rằng ñây là một bệnh sinh lý, sau ñó

Takaishi (1908), Bokura (1911) ñã phân lập ñược vi khuẩn ký sinh trên lá bệnh và kết luận ñây là bệnh vi khuẩn, không phải bệnh sinh lý [58]

Vi khuẩn gây bệnh bạc lá lúa ñược gọi tên là Xathomonas oryzae pv

oryzae Ngoài ra trước ñây, vi khuẩn này còn ñược gọi bằng rất nhiều tên

khác như: Bacillus oryzae Hori et Boruka (Boruka, 1911), Pseudomonas

oryzae Ueda et Ishiyama (Ishiyama, 1922), Xathomonas oryzae (Uyeda et Ishiyama) Dowson (Dowson,1948) [4]

Năm 1922, Ishitama ñã chỉ ra rằng vi khuẩn gây bệnh bạc lá có hình gậy ngắn, hai ñầu hơi tròn, kích thước từ 1 – 2 x 0,5 – 0,9µm, có một tiêm mao dài 6 – 8µm Vi khuẩn nhuộm gram âm, không hình thành bào tử, các tế bào

vi khuẩn có màng nhầy bao bọc và ñược nối với nhau thành một khối vững chắc

Vi khuẩn gây bệnh chủ yếu bằng hình thức xâm nhập vào hệ thống mạch dẫn của lá và ăn dọc theo hệ thống mạch dẫn nhờ thẩm thấu các chất dinh dưỡng trong dung dịch qua vách tế bào Những chất dinh dưỡng ở dạng phức tạp sẽ ñược chuyển thành dạng ñơn giản, nhờ hệ thống men của vi khuẩn trước khi ñược hấp thụ [8]

Con ñường xâm nhập chủ yếu của vi khuẩn Xathomonas oryzae pv

oryzae là qua các vết thương, vết xây xát ở trên lá do mưa bão gây ra Ngoài

ra vi khuẩn còn có thể xâm nhập qua lỗ thuỷ khổng ở mép lá, ñầu mút lá [8], [10] Khi tiếp xúc với bề mặt lá lúa có màng nước ướt vi khuẩn dễ dàng xâm nhập vào các lỗ thuỷ khổng phân bố ở ñầu mút lá và 2 bên mép lá Sau khi xâm nhập vào lỗ thuỷ khổng, vi khuẩn nhân nhanh trong biểu mô, là nơi thông với hệ thống mạch dẫn lá Khi ñó, một số vi khuẩn xâm nhập vào hệ

thống này, còn một số khác thoát ra ngoài lỗ thuỷ khổng (Taoei và Muko,1960) [12]

Ở một số nước nhiệt ñới, do thói quen xén ñầu lá mạ trước khi cấy vô tình ñã tạo ñiều kiện thuận lợi cho vi khuẩn xâm nhập vào bên trong và gây hại [20] Ngoài con ñường xâm nhập qua lá, vi khuẩn còn có thể xâm nhập vào hệ thống mạch nhựa ở rễ qua phần rễ bị ñứt trong quá trình nhổ mạ cấy Khi vi khuẩn xâm nhập qua rễ, cây lúa thường biểu hiện triệu chứng Kresek, làm lá và toàn bộ cây bị héo rũ [7]

Sự sinh sản ñộc tố của vi khuẩn Xathomonas oryzae pv oryzae:

Theo Egawa và cộng tác viên, năm 1996 lần ñầu tiên ñã tách chiết ñược Phenylacetic axit thô trên môi trường Wakimoto nuôi cấy vi khuẩn sau ñó sử dụng dịch chiết ñể xử lí mạ Kết quả cho thấy Phenylacetic axit có khả năng gây héo mạ non, ức chế sự phát triển của cây mạ sau 3 ngày xử lí

Puruthosaman và Prasad, 1972 ñã tách chiết ñược phenolic trong môi

trường nuôi cấy vi khuẩn Xathomonas oryzae pv oryzae sau ñó xử lí lá lúa

non và cho kết quả lá bị héo rất nhanh chỉ sau 12 giờ, trong khi ñó, ñối chứng

xử lí bằng nước cât vô trùng sau 4 ngày lá lúa mới bắt ñầu vàng úa nhưng

không có hiện tượng héo như khi xử lí dịch chiết vi khuẩn Xathomonas

của vi khuẩn bạc lá sinh sản ra (Dẫn theo Mew, 1978) [52]

Theo S.H.O.U mô tả triệu chứng bạc lá như sau: bệnh thường xuất hiện

từ giai ñoạn ñẻ nhánh ñến trỗ, trường hợp nghiêm trọng bệnh có thể xuất hiện

bị bệnh Các vết bệnh có thể bắt ñầu từ một hoặc hai bên rìa lá Trên những giống dễ bị nhiễm bệnh lá thường bị héo tàn ñi như ñổ nước sôi, lá bạc trắng rồi chết Trên mô bệnh còn tươi quan sát thấy những giọt dịch màu trắng sữa

do vi khuẩn tiết ra Giọt dịch này chuyển sang màu vàng rơm ñọng lại thành hình cầu nhỏ li ti trên lá và rơi xuống nước

- Trên hạt: Hạt bệnh quan sát thấy những vết bệnh không màu, xung quanh có viền nước, các vết bệnh còn thấy rõ khi hạt thóc còn non và xanh Khi hạt chín vết bệnh chuyển sang màu vàng xám hoặc vàng nhạt

Còn ở Việt Nam, theo Lê Lương Tề bệnh bạc lá gây nên chủ yếu là triệu chứng bạc lá Các triệu chứng Kresek hoặc vàng nhạt không ñược nhắc ñến

có lẽ do triệu chứng này ít xuất hiện và không gây hại nghiêm trọng [7]

Theo kết quả nghiên cứu của bộ môn Bệnh cây - trường ðại học Nông nghiệp I cho biết có 2 triệu chứng bạc lá lúa là bạc lá gợn vàng và bạc lá gợn xanh, trong ñó bạc lá gợn xanh nguy hiểm hơn bạc lá gợn vàng Bạc lá gợn vàng phổ biến hầu hết trên các giống lúa và các mùa vụ còn bạc lá gợn xanh chủ yếu xuất hiện trên các giống lúa ngắn ngày, chịu phân, phiến lá to (NN

27, I1 ) Thông thường ranh giới giữa mô bệnh và mô khoẻ ñược phân biệt

rõ ràng bằng ñường gợn sóng màu vàng hoặc không vàng hoặc ñường viền màu nâu liên tục hoặc ñứt quãng [8]

Các triệu chứng ñó là do vi khuẩn xâm nhập vào mô lá ñã sản sinh ra ñộc

tố Xanthomonin ðộc tố Xanthomonin là các axit hữu cơ (Trans – 3 –

Methylthio – Acryli axit, Tiglic axit, Succinic axit, Fumaric axit, ) và các polysaccharide (Glucose, Mannose, Glucoronic axit, .) gây ra triệu chứng héo cho tất cả các giống lúa nhiễm bệnh bạc lá ở tất cả các giai ñoạn sinh trưởng của cây lúa kể cả giai ñoạn mạ, ñẻ nhánh, làm ñòng - trỗ bông [22]

2.2.5 Quy luật phát sinh, phát triển của bệnh bạc lá lúa ở Việt Nam

Ở miền Bắc nước ta, bệnh bạc lá có thể phát sinh và phát triển trong tất cả các mùa vụ Vào vụ chiêm xuân, bệnh thường phát sinh trong tháng 3, tháng 4

và phát triển mạnh vào tháng 5, tháng 6 Tuy nhiên, mức ñộ bệnh nhẹ và ít hại hơn trong vụ mùa Ở vụ mùa, bệnh có thể phát sinh vào tháng 8, ñặc biệt là khi lúa bước vào giai ñoạn làm ñòng ñến trỗ và chín sữa ðối với trà cấy muộn, lúa trỗ vào khoảng tháng 10, thì thiệt hại của bệnh thường nhẹ hơn [8]

2.2.6 Các yếu tố ảnh hưởng tới sự phát sinh , phát triển của bệnh bạc lá lúa

* Nguồn bệnh ban ñầu

Trên thế giới, có một số ý kiến khác nhau về nguồn bệnh ban ñầu của bệnh bạc lá lúa Tuy nhiên, các ý kiến này ñều công nhận rằng nguồn bệnh ban ñầu quan trọng của bệnh bạc lá là tàn dư cây bệnh trên ñồng ruộng và trên

cỏ dại ðây cũng chính là nguồn bệnh có ý nghĩa quan trọng trong việc lan truyền bệnh cho vụ sau [5]

Theo Lê Lương Tề, nguồn bệnh ban ñầu ở nước ta là hạt giống, tàn dư cây bệnh, các viên keo vi khuẩn tồn tại ở cuối vụ ñều có thể là nguồn bệnh ban ñầu [11]

* ðiều kiện ngoại cảnh

Hầu hết các kết quả nghiên cứu ñều cho rằng bệnh phát triển thuận lợi trong ñiều kiện nhiệt ñộ từ 26 - 30oC, ẩm ñộ cao (> 90%), bệnh phát sinh

thành dịch trong khoảng nhiệt ñộ 22 – 31oC, tối thích là 27 – 30oC [18] Ẩm

ñộ cũng ảnh hưởng lớn ñến sự phát sinh phát triển của bệnh ẩm ñộ từ 79,3% - 92,8% làm tăng sự phát triển của bệnh, còn ẩm ñộ từ 60,3% - 77% hạn chế sự phát triển của bệnh [44] ðặc biệt là khi trời có mưa bão không những gây nên những vết thương trên lá mà còn tạo ñiều kiện thuận lợi cho vi khuẩn xâm nhập vào mạch dẫn lá Bệnh cũng phát triển mạnh hơn ở những vùng ñất ẩm thấp, khó thoát nước và hay bị ngập [18] Nhiệt ñộ dưới 18oC và trên 37,2oC ñều hạn chế sự phát triển của bệnh (Devadath, 1985) [45] ðối với lúa cấy, ở vùng ñất màu mỡ thì thường bị hại nặng hơn ở vùng ñất xấu [11]

Bên cạnh ñó, có ý kiến cho rằng thời gian chiếu sáng cũng ảnh hưởng tới

sự phát triển của bệnh bạc lá Trong ñiều kiện ñủ ánh sáng thì bệnh phát triển mạnh hơn trong ñiều kiện thiếu ánh sáng, do ánh sáng có tác dụng kích thích

sự phân chia và nhân lên của vi khuẩn [18]

* Kỹ thuật canh tác

Trước tiên phải kể tới sự ảnh của phân bón ñối với sự phát triển của bệnh bạc lá lúa, ñặc biệt là phân ñạm Mức ñộ ảnh hưởng của phân ñạm phụ thuộc vào lượng bón và thời kỳ bón Nếu bón quá nhiều phân ñạm, bón lai rai, bón muộn sẽ làm cho cây lúa xanh tốt, thân lá mềm yếu nên vi khuẩn dễ xâm nhập vào mạch dẫn hơn Nếu bón thúc sớm, tập trung sẽ có tác dụng kích thích ñẻ nhánh tập trung và làm giảm nhẹ tác hại của bệnh hơn Theo Modal và Miah (1985), khi bón kali tăng sẽ làm giảm mức ñộ nhiễm bệnh bạc lá lúa [53] Bên cạnh ñó, ở ruộng lúa có mực nước từ 10 - 15 cm thường bị bệnh nặng hơn ở ruộng có mực nước từ 5-7 cm, ñồng thời bệnh cũng phát triển mạnh hơn ở ruộng lúa cấy dầy [19]

2.2.7 Các biện pháp phòng trừ bệnh bạc lá lúa

Có rất nhiều biện pháp phòng trừ bệnh bạc lá lúa như: Biện pháp canh tác, biện pháp hoá học, biện pháp chọn giống chống bệnh, và biện pháp phòng

trừ sinh học Mỗi biện pháp ñều có ưu, nhược ñiểm riêng nhưng biện pháp chọn giống chống bệnh và biện pháp phòng trừ sinh học ñược các nhà khoa học quan tâm hơn cả

2.2.7.1 Biện pháp canh tác

Bao gồm việc dọn vệ sinh ñồng ruộng, bón phân và tưới nước hợp lý ðây là biện pháp ñơn giản, dễ thực hiện, ít tốn kém nhưng hiệu quả phòng trừ không cao, không có khả năng dập dịch

2.2.7.2 Biện pháp hoá học

Biện pháp hoá học có hiệu quả phòng trừ cao nhưng lại gây ñộc hại tới môi xung quanh, tới nông sản, thậm chí ảnh hưởng tới cả con người và tiêu tốn về kinh tế Những nghiên cứu ở Nhật Bản ñã chỉ ra rằng: dùng thuốc boócño và các hợp chất chứa ñồng ñể phun ñã phần nào hạn chế ñược tác hại của bệnh, nhưng ñồng thời gây ñộc cho lúa (Dẫn theo Devadath, 1985) [45]

2.2.7.3 Biện pháp phòng trừ sinh học

Hiện nay, trên thế giới ñã có một vài công trình nghiên cứu về biện pháp phòng trừ sinh học Islam-N và Bora-LC (1998) ñã ñưa ra biện pháp phòng

trừ bệnh bạc lá bằng việc sử dụng hai chủng vi khuẩn Rhizobacterial vào việc

khử trùng hạt giống Kết quả cho thấy vi khuẩn này không chỉ có tác dụng làm giảm ảnh hưởng của bệnh bạc lá lúa mà còn có tác dụng làm tăng năng suất lúa ñối với những cây ñược xử lý khử trùng [21], [48]

Còn tác giả Nivedita và cộng sự ñã (2002) xác ñịnh tác dụng phòng trừ

của vi khuẩn Bdellovibrio bacteriovorus bằng cách lây nhiễm nhân tạo dung dịch có chứa vi khuẩn này và vi khuẩn Xanthompnas oryzae pv oryzae theo

những tỉ lệ tương ứng khác nhau (1:1, 9:1 và 99:1) Kết quả cho thấy: cả chiều

dài vết bệnh và triệu chứng bệnh ñều giảm tương ứng với tỉ lệ vi khuẩn B

Bacteriovorus tăng lên trong dung dịch lây nhiễm [54]

2.2.7.4 Biện pháp chọn tạo giống chống bệnh

Biện pháp chọn tạo giống chống bệnh là biện pháp có hiệu quả cao,

khơng gây ơ nhiễm mơi trường và được coi là biện pháp chiến lược trong bất

kỳ chương trình phịng chống bệnh nào ðể cĩ thể chọn tạo ra giống vừa cĩ khả năng chống bệnh tốt vừa cho năng suất cao, trước tiên, ta phải cĩ nguồn vật liệu khởi đầu, là những giống cĩ khả năng chống bệnh Trên cơ sở đĩ, chúng ta tiến hành chọn tạo giống chống bệnh cĩ đặc điểm nơng sinh học tốt bằng nhiều con đường khác nhau

Trên thế giới, cĩ rất nhiều giống cĩ khả năng chống bệnh bạc lá Ở Ấn

ðộ, trong 522 dịng lúa đem khảo sát, cĩ 16 dịng chống hồn tồn, 70 dịng chống trung bình, cịn lại là nhiễm vừa và nhiễm nặng [10] Các nhà khoa học Trung Quốc đã đánh giá khả năng chống chủng Jiang Ling 691 của 4091 dịng địa phương cho kết quả như sau: 6% chống hồn tồn, 10% chống trung bình, 84% nhiễm [12]

Ở nước ta, Viện khoa học kỹ thuật nơng nghiệp đã tiến hành lây nhiễm nhân tạo đối với 1164 giống trong tập đồn các giống lúa địa phương Kết quả

đã phát hiện cĩ: 597 giống chống bệnh cao, 299 giống chống trung bình, cịn lại là nhiễm [8], [27]

2.2.8 Cơ sở khoa học của chọn giống chống bệnh bạc lá

2.2.8.1 Cơ sở khoa học của chọn giống chống bệnh bạc lá

Tính kháng bệnh là một tiến trình năng động được xác định bởi kiểu gen

của 2 phía: ký sinh và ký chủ [1] Năm 1971 thuyết “gen đối gen” của Flor đã

chỉ ra rằng: ''ðối với mỗi gen kiểm sốt tính chống bệnh ở ký chủ thì cĩ một gen đặc thù kiểm sốt tính gây bệnh trong ký sinh'' Nghiên cứu di truyền

phân tử đã khẳng định lại giả thuyết “gen đối gen” với quy mơ phân tử AND

Sự kích thích phản ứng tự vệ của thực vật được bắt nguồn từ sự ghi nhận tín

hiệu phân tử đặc biệt, người ta dùng thuật ngữ “elicitor” Những “elicitor”

này đã được mã hố một các trực tiếp hoặc gián tiếp bởi các gen khơng độc

Người ta cho rằng những gen kháng sẽ mã hố các “elicitor” đối với từng

“elicitor” riêng biệt (Staskawicz và ctv, 1995) [32]

Vào những năm 80, Viện nghiên cứu lúa quốc tế (IRRI) ñã xác ñịnh bản chất di truyền tính kháng bệnh bạc lá lúa là do gen quy ñịnh

Cơ chế chống bệnh bạc lá là cơ chế kháng chủ ñộng

Theo thuyết ''gen ñối gen'' (Flor, 1956): Nếu vi khuẩn gây bệnh xâm nhập vào bên trong ký chủ mang gen alen gây bệnh thì gen kháng bệnh của ký chủ mới hoạt ñộng [4] Khi ñó ký chủ có thể tiết ra các Phytoalanin ñể hạn chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh, hoặc có thể làm tăng tính hoạt hoá của một số Enzyme trong cây

Vi khuẩn gây bệnh bạc lá khi xâm nhập vào tế bào cây chủ, trong cây chủ sẽ xuất hiện phản ứng tự vệ Phản ứng tự vệ ñó ñược ñịnh tính như sau:

do sự gia tăng hoạt ñộng peroxydase; hiện tượng dự trữ lignin trong thành tế

bào; sự chết của tế bào cây chủ ñể bao bọc pathogen lại, còn gọi là phản ứng ñốm nâu (browning); sự hạn chế vi khuẩn gia tăng quần thể (Reimers và ctv,

1992) Hai gen peroxydase POX8.1 và POX22.3 thể hiện xuyên suốt trong

quá trình kháng bệnh xâm nhập (Chitoor và ctv, 1997) Phân tích trên bản ñồ

di truyền, người ta nghi nhận POX22.3 và một peroxydase khác POX5.1

(nhạy cảm khi có vết thương) ñịnh vị trên nhiễm sắc thể số 7 (Chitoor và ctv,

1998) ðể xác ñịnh nhiệm vụ của peroxydase trong cơ chế tự bảo vệ ñối với

pathogen gây bệnh bạc lá, người ta nghiên cứu công thức gen chuyển nạp trên

dây mạng mã gốc (sense) và dây ñối mã (antisense) những peroxydase cảm

ứng với pathogen (Wang và Leung.1999) [32]

Những nghiên cứu có tính chất hệ thống về gen kháng bệnh bạc lá ñược thực hiện tại Nhật Bản và Viện nghiên cứu lúa quốc tế (IRRI) từ năm 1960 ñến nay (Mew, 1987) Theo Shauaguchi, các nhà khoa học trên thế giới ñã

xác ñịnh ñược 22 gen ñiều khiển tính chống bệnh bạc lá lúa là: Xa1, Xa2,

Xa3, Xa4, xa5, Xa7, xa8, Xa10, Xa11, Xa12, xa13, Xa14, xa15, Xa16, Xa17, Xa18, xa19, xa20, Xa21, Xa22, Xa23 và Xa24 [32], [60] Mới ñây tác giả Lee

K.S (2003) còn xác ñịnh thêm 3 gen kiểm tra tính chống bệnh bạc lá là:

xa26(t), Xa27(t), xa28(t) [51]

Một vài gen phổ biến ñã ñược sử dụng trong các chương trình cải tiến

giống lúa, bên cạnh ñó chúng ta ñã ñồng hoá ñược 5 gen, ñó là: Xa1, xa5,

Xa21, Xa26, Xa27 [32] Cùng với việc xác ñịnh các gen kiểm tra tính chống thì việc xác ñịnh nhiễm sắc thể và vị trí sắp xếp của các gen ñó trên nhiễm sắc thể (NST) cũng phục vụ ñắc lực cho công tác chọn tạo giống chống bệnh Gen

Xa1, Xa2, Xa12 nằm trên nhiễm sắc thể số 4, gen xa5 nằm trên nhiễm sắc thể

số 5, Xa7 nằm trên nhiễm sắc thể số 6, xa13 nằm trên nhiễm sắc thể số 8,

xa19 nằm trên nhiễm sắc thể số 10, các gen Xa3, Xa4, Xa10, Xa21, Xa23 nằm

trên nhiễm sắc thể số 11… Tính chống bệnh của một cá thể ñược kiểm tra bởi

một gen ñơn trội (Xa4, Xa7, Xa21…) hay một gen ñơn lặn (xa5, xa8, xa13) hoặc hai gen liên kết (Xa1\Xa4, Xa4\Xa7, Xa1\Xa10…) Cũng có khi cùng nằm trên một nhiễm sắc thể: Xa1 và Xa2 cùng nằm trên nhiễm sắc thể số 4, gen Xa3 và Xa4 cùng nằm trên nhiễm sắc thể số 11 [50] Tuy nhiên khả năng

kháng bệnh bạc lá còn phụ thuộc vào ñộ ñộc của từng chủng và ñiều kiện sinh thái của mỗi vùng Mà mỗi vùng ñịa lý khác nhau thì tồn tại những nòi sinh lý khác nhau, nên 1 gen có khả năng kháng nòi này nhưng không kháng ñược nòi khác Khi xác ñịnh ñược nòi sinh lý, khu vực phân bố và khả năng chống của các gen ñối với nòi ñó thì sẽ có phương hướng chọn tạo giống chống bệnh phù hợp với từng vùng sinh thái khác nhau

Các nhà khoa học trên thế giới ñã xác ñịnh ở Ấn ðộ có 9 chủng vi khuẩn

gây bệnh bạc lá lúa Trong ñó, những giống chứa gen xa5, kháng hầu hết các

chủng có ở Ấn ðộ Ở Philippin ñược xác ñịnh có 6 chủng và khả năng kháng

cao nhất là những giống chứa gen xa5 và Xa21 Cụ thể gen xa 5 có thể kháng chủng I, II, III, V, kháng vừa với chủng IV và nhiễm chủng VI Trong khi ñó

gen Xa21 có khả năng kháng tất cả các chủng vi khuẩn X Oryzae có tại

philippin [27] Tại Thái Lan (1972 – 1977) có 3 nhóm chủng vi khuẩn là I, II,

III (Dẫn theo Eamchit và Mew 1982) [46]

Theo Zhang Qi và cộng sự (1998) các giống lúa ở Trung Quốc chứa các

gen kháng chủ yếu là Xa2, Xa7 và Xa14 [63]

Theo Phan Hữu Tôn và Bùi Trọng Thuỷ, ở Trung Quốc, các giống chứa

gen Xa2, Xa7, Xa14 kháng ñược hầu hết các chủng, tuy nhiên khi nhập nội các giống này vào Việt Nam và ñánh giá mức ñộ chống bệnh của gen Xa14 ñã

kết luận gen này không có khả năng chống ñược các chủng gây bệnh ở Việt

Nam Trong khi ñó, các gen xa5, Xa7, Xa21 lại kháng ñược hầu hết các chủng

vi khuẩn gây bệnh ở Việt Nam [28]

Tuy nhiên, các nhà khoa học cho rằng ngoài gen kiểm tra tính chống bệnh trong nhân có thể có gen phụ và một số yếu tố khác cùng kiểm tra tính chống bệnh của giống ñó [61] Vậy ñể xác ñịnh ñược các nòi sinh lí và khả năng chống bệnh của từng gen, Viện nghiên cứu lúa quốc tế (IRRI) ñã tạo ra các dòng ñẳng gen chứa các gen chống bệnh bạc lá khác nhau trên thế giới Các dòng này ñược tạo ra bằng phương pháp lai lại giữa giống IR24 và các giống chứa gen chống bệnh bạc lá khác nhau Vì thế, chúng ñều có nền gen chung của IR24, chỉ khác nhau ở một gen chống bệnh bạc lá ðiều này có nghĩa rằng, những gen phụ và các yếu tố cùng kiểm tra tính chống bệnh với gen chính giữa các dòng này là như nhau Do vậy, có thể phân biệt ñược các nòi sinh lí dựa vào phản ứng của các nòi này với các gen chống khác nhau ðồng thời, cũng có thể xác ñịnh ñược khả năng chống của từng gen ñối với các chủng khác nhau

2.2.8.2 Di truyền tính kháng bệnh

Cũng như các loài vi sinh vật gây bệnh khác, vi khuẩn Xathomnas oryzae

cũng tồn tại nhiều nòi sinh lý khác nhau ở một vùng sinh thái Trong số các chủng vi khuẩn gây bệnh ở mỗi vùng thì có chủng gây bệnh phổ biến, có chủng gây bệnh ít phổ biến Nếu giống ñưa ra sản xuất chỉ chứa gen chống

chủng vi khuẩn phổ biến (ñơn gen) mà không chống ñược các vi khuẩn ít phổ biến thì các chủng ít phổ biến sẽ có cơ hội sinh sôi và trở nên phổ biến ðiều này cho chúng ta thấy một giống chứa ña gen sẽ kháng bệnh bền vững hơn giống chứa ñơn gen Do vậy người ta chú trọng tới việc chọn giống chứa ña gen kháng, giống có tính kháng ngang hơn là giống có tính kháng dọc Người

ta có thể chia tính kháng sâu bệnh thành hai nhóm:

* Tính kháng ngang, kháng dọc

- Tính kháng dọc (vertical resistance) còn ñược gọi là tính kháng chuyên biệt ñối với nòi, tính kháng không ñồng nhất, tính kháng chất lượng, tính kháng không bền vững

- Tính kháng ngang (horizontance resistance) còn ñược gọi là tính kháng toàn phần, tính kháng ñồng nhất, tính kháng ña gen…

Sự khác nhau giữa tính kháng ngang và tính kháng dọc:

- Sự chuyên tính của nòi cho phản ứng

kháng hoặc nhiễm của cây chủ ñối với

một nòi nào ñó của ký sinh

- ðược kiểm soát bởi một gen

- Ít chịu ảnh hưởng của môi trường

- Rất hiệu quả ñối với một ít nòi nhưng

không hiệu quả ñối với nhiều nòi khác

- Tạo nên bệnh chỉ cần một vài tác ñộng

lây nhiễm ban ñầu

- Sự không chuyên tính của nòi cho phản ứng kháng cới nhiều nòi không nhất thiết có cùng mức ñộ như nhau

- ðược kiểm soát bởi ña gen

- Chịu ảnh hưởng tương tác với môi trường

- Có hiệu quả mức ñộ ñối với nhiều nòi cho dù không cùng mức ñộ như nhau

- Có suy giảm ảnh hưởng nhất ñịnh sau khi hình thành quần thể ký sinh ñủ mạnh trên cây chủ

Do bản chất di truyền khác nhau nên khả năng kháng ngang, kháng dọc không giống nhau Kháng dọc có tác dụng làm giảm nguồn bệnh ban ñầu và trì

hoãn sự bùng nổ của dịch bệnh Thời gian tồn tại của khả năng kháng dọc phụ thuộc vào sự ña dạng di truyền trong quần thể ký sinh Kháng ngang không làm giảm bớt nguồn bệnh ban ñầu nhưng lại làm giảm tốc ñộ phát triển của dịch bệnh Do ñó, kháng ngang có tính kháng bệnh bền vững hơn kháng dọc [1]

* Tính kháng bệnh bền vững

Tính kháng bệnh bền vững là khả năng duy trì tính kháng trong khoảng thời gian dài trong môi trường sống thuận lợi cho ký sinh gây bệnh (Johnson,1984) Khả năng kháng bệnh bền vững có thể có ñược ở những giống chứa hai hay nhiều gen kháng ñặc thù với từng nòi sinh lý Chỉ khi các nòi này ñồng thời tạo nên nhiều ñột biến ñộc lập mới có thể phá vỡ hàng dào kháng bệnh của giống ñó [1] Với kỹ thuật PCR, người ta có thể tìm kiếm những gen kháng chính, những gen như vậy có thể nhanh chóng ñược phân lập và ñánh dấu phân tử Nhờ vậy, sự phối hợp lại các gen kháng sẽ giúp cho tính kháng trở nên ổn ñịnh hơn

2.2.9 Nghiên cứu chỉ thị phân tử chọn tạo giống kháng bệnh bạc lá

Cây lúa ñươc xem như là cây trồng ñầu tiên trên thế giới ñược công bố hoàn thành ñọc chuỗi ký tự DNA [32] Với khoảng 50.000 gen, bộ genom cây lúa có 12 nhiễm sắc thể bao gồm 430 triệu cặp base của phân tử DNA, trung bình mỗi gen có khoảng 3000bp Nguồn gen phong phú này chủ yếu tồn tại

trong các giống ñịa phương Với hệ gen phong phú Indica: 45.000 – 56.000 gen, Japonica: 32.000 – 50.000 gen (2003), ñây là nguồn vật liệu khởi ñầu

quan trọng ñể các nhà chọn giống lai tạo giống mới

Qua hơn nửa thế kỷ phát triển kể từ ngày Watson và Crick (1953) phát minh ra cấu trúc xoắn kép của DNA, nền công nghệ sinh học thế giới ñã có bước tiến vượt bậc và khẳng ñịnh vai trò to lớn của nó trong nhiều lĩnh vực [10] Hiện nay, các nhà khoa học thường ứng dụng công nghệ sinh học vào chương trình chọn tạo giống chống bệnh thông qua việc dùng chỉ thị phân tử

ADN ñể xác ñịnh trình tự có mặt của các gen kiểm tra tính kháng bệnh Nhờ

áp dụng chỉ thị phân tử AND (RFLP) có thể xác ñịnh ñược vị trí từng gen trên nhiễm sắc thể thông qua ñoạn AND dò ñặc hiệu liên kết với gen ñó với khoảng cách gen nhất ñịnh, từ ñó xây dựng bản ñồ di truyền cho các gen

kháng Một số gen ñã ñược xác ñịnh bằng chỉ thị phân tử như: gen Xa4 liên

kết với RFLP ở locus Npb181 và Npb 78 trên NST số 11 (Yoshidaet al.1992)

Với khoảng cách liên kết ñều là 1.7cM Gen lặn xa5 liên kết với chỉ thị

RG556 trên nhiễm sắc thể số 5 với khoảng cách là 0-1cM (MC Cough

et.1991) Gen Xa7 liên kết chặt với chỉ thị P3 trên nhiễm sắc thể số 6 với khoảng cách 2,5 cM Còn gen Xa21 thì liên kết với chỉ thị pTA818 và

pTA248 với khoảng cách 0 - 1cM (Ronald et al.1992) [27] Tuy nhiên, áp dụng phương pháp RFLP thường mất nhiều thời gian, lượng AND cần tinh khiết, nhiều khi phải dùng ñến phóng xạ, nên khó áp dụng rộng rãi ðể khắc phục nhược ñiểm này người ta ñề xuất chuyển sang phương pháp chọn lọc gián tiếp trên cơ sở nhân AND bằng phương pháp PCR, sau ñó chạy ñiện di rồi xác ñịnh sự ña hình giữa kiểu gen kháng và nhiễm

Năm 1993, Tiến sỹ hoá học Karry Mullis người Mỹ ñã nhận ñược giải thưởng Nobel hoá học nhờ phát minh ra phương pháp PCR ðây là một trong những thành tựu nổi bật nhất thập kỷ qua Phản ứng này ñã mang lại những ứng dụng vô cùng to lớn trong y học, sinh học, khoa học hình sự và khảo cổ học [27]

Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) dùng ñể nhân bất kỳ một ñoạn gen nào trong cơ thể sinh vật, chỉ cần sử dụng hai ñoạn Nucleotit mồi ở ñầu

5’ và ñầu 3’ của ñoạn ñó nếu gen ñó ñã biết trước ñược trình tự sắp xếp các Nucleotit của nó Sau ñó phân tách bằng ñiện di trên gen agarose, nhuộm bằng Ethillium bromide và quan sát kết quả sau khi chiếu bằng tia UV[33]

Sử dụng phương pháp PCR có nhiều ưu ñiểm như:

+ Có thể sử dụng trực tiếp DNA vừa chiết xuất, không cần tinh chế

+ ðoạn DNA làm khuôn không cần tách chính xác, tính ñặc hiệu của phản ứng do các oligonucleotid làm mồi quyết ñịnh

+ Lượng DNA dùng làm khuôn ít

+ Tốc ñộ nhân dòng cao

Tiến hành lây nhiễm bệnh bạc lá nhân tạo, kết hợp với kỹ thuật PCR ñể phát hiện gen kháng bệnh bạc lá ñã ñem lại kết quả rất tốt, phục vụ ñắc lực cho công tác chọn tạo giống chống bệnh bền vững

2.2.10 Tình hình nghiên cứu bệnh bạc lá lúa

Ngay từ khi bệnh bạc lá lúa phát sinh và gây hại ñầu tiên ở Fukuoka (Nhật Bản) vào năm 1988 sau ñó xuất hiện ở nhiều nước trên thế giới thì việc nghiên cứu bệnh bạc lá lúa ñã trở thành nhiệm vụ quan trọng của ngành khoa học nông nghiệp toàn thế giới Sau khi Takashi phân lập ñược vi khuẩn gây bệnh và lây lại cho lúa thành công năm 1908 thì việc nghiên cứu một cách có

hệ thống bệnh bạc lá lúa ñã ñược tiến hành ở nhiều nước trên thế giới

Năm 1926, ở Nhật Bản giống lúa chống chịu bệnh ñầu tiên trên thế giới Kono 35 ñã ñược xác ñịnh (Kush, 1997) ñược chọn lọc từ giống nhiễm bệnh Shikiniki Sau ñó, IRRI ñã tạo ra nhiều dòng, giống lúa kháng bệnh và ñược

trồng rộng rãi ở nhiều nước Châu Á như giống Chandina, IR532 – 1 – 176,

IR579 – 48 ở Ấn ðộ, IR272 – 4 – 1 ở Bangladesh, IR36 và IR38 ở Philippine

và IR1561 – 1 – 2, IR1561 – 228, IR22 ở Việt Nam (Kush,1997) [49]

Tại Nhật Bản, nghiên cứu thành phần nòi vi khuẩn gây bệnh bạc lá ñã ñược tiến hành từ năm 1957 khi phát hiện thấy giống Aisacse chống bệnh trở lên nhiễm bệnh, họ ñã xác ñịnh ở Nhật Bản có 5 nòi vi khuẩn [6]

Năm 1972 Murty và Khush ñã nghiên cứu tính kháng trội của các giống lúa khác nhau khi lây bệnh nhân tạo vi khuẩn gây bệnh bạc lá, phát hiện giống

DZ192 và BJ1 có khả năng kháng bệnh bạc lá và có chứa gen kháng bệnh [21]

Năm 1973, Murty và ctv ñã khảo sát khả năng kháng bệnh bạc lá của các

giống lúa Sigadis, TKM6, BJ1, Wase Aikoku 3, PI 215936, Zenith và B589 A4

– 18 – 1 ñã chỉ ra rằng các giống lúa này có ít nhất 3 gen kháng các nhóm nòi

vi khuẩn [21]

Năm 1977, Petpisit và ctv trình diễn thí nghiệm khảo sát khả năng kháng

bệnh bạc lá lúa của các giống IR20, IR22, IR1529 – 680 – 3 ñã xác ñịnh ñược một gen kháng trội và ñặt tên là Xa4 Các giống lúa IR 1330 – 3 – 2 và Pelita

1/1 có tính kháng bạc lá mạnh quyết ñịnh bởi gen trội Xa4, ngược lại giống lúa Chinsurah Boro II ñược quyết ñịnh bởi gen lặn xa5 Gen trội Xa4 còn

ñược tìm thấy ở các giống lúa khác như IR994 – 102 và IR1698 – 241 [21]

Librojo và ctv ñã tìm thấy gen Xa4 ở giống Semora Mangga chỉ thể hiện

tính kháng trội ở giai ñoạn ñòng – trỗ, ngược lại các giống Hom thong, IR22

thể hiện tính kháng trội của Xa4 ở cả các giai ñoạn mạ, ñẻ nhánh Năm 1974, Sur

và Khush ñã xác ñịnh ñược gen trội Xa4 ñịnh vị trên nhiễm sắc thể số 11 [21]

Ở Indonexia, theo tác giả Tentara và Hartinio (1977) Viện nghiên cứu nông nghiệp Borog ñã dùng 10 giống lúa chỉ thị của Nhật Bản và IRRI ñể xác ñịnh các nhóm chủng dựa trên hệ thống nhóm Kozaka, kết quả ñã xác ñịnh có

4 nhóm chủng Xanthomonas oryrae pv oryzae (Vũ Công Khoái, 2000) [6]

Năm 1978, Sidhu và Khush phát hiện các gen ñơn kháng bệnh bạc lá của

5 giống lúa có hiện tượng “kháng trội ñảo chiều” (Dominance reversal), là các giống lúa: Dayaggot Qan Binuggon, Qan Qipugo và Zenith, gen này ñược ñặt

tên là gen trội Xa6 [21]

Năm 1978, Sidhu và ctv ñã phân tích gen của 74 giống lúa cho kết quả

như sau: Gen Xa4: 18 giống lúa, gen Xa4b: 20 giống lúa, gen xa5: 32 giống

lúa Theo Sudhi, khả năng kháng bệnh bạc lá của các giống lúa DV85, DV86

và DZ 78 ñược quy ñịnh bởi 2 Xa – gens liên kết: xa5 và Xa7 Trong thời kỳ

lúa ñẻ nhánh nếu cây lúa ñược chăm sóc cẩn thận thì tính kháng của gen lặn

xa5 có thể ñược thể hiện vào giai ñoạn làm ñòng ñến trỗ bông [21]

Năm 1983, Sidhu và ctv ñã thiết kế thành công và ñịnh tên cho hầu hết

các Xa – gen kháng: Xa1, Xa2, Xa3, Xa4, xa5, Xa6, Xa7, Xa8 Những năm cuối thế kỷ 20, lần lượt thiết kế và ñịnh tên cho các Xa – gens còn lại [21]

ðến năm 1998 Viện nghiên cứu lúa quốc tế (IRRI) và Nhật Bản ñã xác ñịnh ñược 23 gen ñơn kháng các nhóm nòi (race) vi khuẩn X Oryzae gây bệnh bạc lá lúa và ñược chia thành 2 nhóm:

- Nhóm Xa - gen trội bao gồm: Xa1, Xa2, Xa3, Xa4, Xa7, Xa10, Xa11,

Xa12, Xa14, Xa15, Xa16, Xa17, Xa18, Xa19, Xa21, Xa22 và Xa23

- Nhóm Xa – gen lặn bao gồm: xa5, xa8, xa13, và xa20 [20]

Năm 2000, A.C.Sanchez và cộng sự kết luận: Gen Xa21 kháng tất cả các chủng có ở Philippin, gen Xa7 kháng chủng 1,2,3 và 5, kháng vừa với chủng

4 và nhiễm với chủng 6 [43]

Mới ñây tác giả Lee K.S (2003) còn xác ñịnh thêm 3 gen kiểm tra tính

chống bệnh bạc lá là: xa 26 (t), Xa 27 (t), xa 28 (t) [51]

Năm 1999, Noda, phạm Văn Dư và ctv ñã xác ñịnh ở Việt Nam có ít nhất

6 chủng là Race A (Phú Yên), Race B ( Lào Cai), Race C (Quảng Nam), Race

D (An Giang), Race E (Nam Hà), Race F (Bến Tre) [25]

Năm 2003, Yoshimuara, Bùi Trọng Thuỷ và cs ñã xác ñịnh ñược ở miền

Bắc Việt Nam tồn tại ít nhất 10 chủng vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv

oryzae ñó là Y1, Y2, Y3, Y4, Y5, Y6, Y7, Y8, Y9 và Y10 trong ñó Y5 và Y6

có tính phổ biến hơn cả [25]

Trong 3 năm 2001 – 2003, nhóm nghiên cứu bệnh bạc lá trường ðại

học Nông nghiệp I Hà Nội ñã phân lập và bảo quản ñược 154 isolate vi khuẩn

Xoo ở 11 tỉnh phía Bắc Việt Nam trên 27 giống lúa ðồng thời xác ñịnh ñược

các gen kháng hữu hiệu bệnh bạc lá ở các tỉnh phía bắc ñó là gen Xa4, xa5,

Xa7, Xa21. Qua ñó thấy ñược số lượng gen kháng của các dòng, giống Khả

năng kháng của gen xa 5 tương ñương với cá giống chứa gen xa5/Xa10,

xa5/Xa7, vì vậy thay bằng việc chuyển ñồng thời hai gen kháng, ta chỉ cần tìm

cách chuyển một gen kháng xa5 cũng ñủ khă năng kháng [33], [56], [55], [58]