HIỆU ỨNG ĐÁM ĐÔNG ĐẠI PHÂN TỬ ĐỐI VỚI TÍNH CHẤT CUỐN CỦA PROTEIN LUẬN VĂN THẠC SĨ VẬT LÝ

Xuất phát từ thực trạng đó, với mục đích nghiên cứu sâu hơn về quátrình cuốn protein đồng thời góp phần áp dụng hiệu quả trong việc nghiên cứucác cơ chế gây ra các bệnh tật là những vấn

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

LỜI CẢM ƠN

Với tình cảm chân thành, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới các thầygiáo, cô giáo đã tham gia giảng dạy và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tậpcũng như trong thời gian triển khai đề tài

Đặc biệt, Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành, sâu sắc nhất tới Thầy - PGS

TS Trịnh Xuân Hoàng, người đã trực tiếp hướng dẫn và giúp đỡ tôi trongsuốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn này

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới: Ban Giám đốc, Phòng đào tạo của HọcViện Khoa Học Công Nghệ - Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ ViệtNam; Ban Giám hiệu cùng toàn thể đồng nghiệp trường THPT Yên Khánh B -Ninh Bình đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành nhiệm vụ học tập

và nghiên cứu đề tài của mình

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình, đặc biệt là chồng và các con tôi

đã luôn ở bên, yêu thương, động viên, cổ vũ và tạo mọi điều kiện thuận lợi đểtôi hoàn thành khoá học này

Mặc dù đã có rất nhiều cố gắng, song do thời gian nghiên cứu có hạn,kinh nghiệm nghiên cứu chưa nhiều, nên khó tránh khỏi những thiếu sót Tácgiả kính mong nhận được những ý kiến đóng góp quý báu của Hội đồng khoahọc, các thầy giáo, cô giáo và các bạn đồng nghiệp

Hà Nội, ngày 15 tháng 6 năm 2019

Tác giả luận văn

TẠ THỊ QUYÊN

MỤC LỤC

Mở đầu .3

Chương 1: Tổng quan về cuốn protein và hiệu ứng đám đông đại phân tử 6

1.1 Các thông tin cơ bản về protein 7

1.2 Hiện tượng cuốn protein trong ống nghiệm 8

1.3 Mô hình hai trạng thái trong cuốn protein 9

1.4 Hiệu ứng đám đông đại phân tử đối với cuốn protein 10

1.5 Lý thuyết hạt tỷ lệ .12

Chương 2: Các mô hình và phương pháp mô phỏng 22

2.1 Mô hình Go cho protein 24

2.2 Mô hình đại phân tử đám đông 26

2.3 Phương pháp động lực học phân tử dựa trên phương trình Langevin .28

2.4 Phương pháp phân tích biểu đồ có trọng số .32

Chương 3: Một số kết quả nghiên cứu 33

3.1 Ảnh hưởng của đám đông đại phân tử lên nhiệt độ chuyển pha cuốn 34

3.2 Ảnh hưởng của đám đông đại phân tử lên độ ổn định của trạng thái cuốn 37

Kết luận .41

Tài liệu tham khảo .42

Mở đầu

Ngày nay, với cuộc cách mạng khoa học kỹ thuật phát triển mạnh mẽ và

sự bùng nổ thông tin trên nhiều lĩnh vực, thế giới đang bước vào thời đại củatoàn cầu hoá, con người ngày càng khẳng định vị thế trong quá trình pháttriển của nhân loại Cùng với đó, nhu cầu chăm sóc, bảo vệ sức khoẻ ngàycàng được tăng cường, y học ngày càng phát triển

Vật lý sinh học là môn khoa học liên ngành, ứng dụng lý thuyết và

phương pháp của khoa học vật lý vào các vấn đề sinh học, y học Phạm vinghiên cứu của vật lý sinh học rất rộng, trải từ phân tích trình tự ADN tới cácmạng nơ-ron thần kinh Trong vật lý sinh học, nghiên cứu về protein là mộttrong những hướng nghiên cứu quan trọng, do protein là các phân tử thực hiệnhầu hết các chức năng của cơ thể sống Các nghiên cứu về protein nói riêng vàcác phân tử sinh học nói chung trong những năm gần đây đã mang lại nhiềuhiểu biết về cơ chế phân tử của các quá trình xảy ra trong cơ thể sống, gópphần đáng kể vào các tiến bộ trong y học, trong đó có việc xác định nguyênnhân của các loại bệnh và tìm ra thuốc điều trị bệnh

Trong vật lý sinh học, một hiệu ứng hiện nay đang được các nhà khoahọc quan tâm nghiên cứu là hiệu ứng đám đông đại phân tử (macromolecularcrowding effect), nghĩa là ảnh hưởng của môi trường đậm đặc các đại phân tửbên trong tế bào lên các quá trình xảy ra trong đó Tỷ lệ thể tích lên tới 40%

bị chiếm bởi các đại phân tử trong tế bào được cho là có ảnh hưởng lớn đến

sự ổn định và chức năng của protein Đám đông đại phân tử cũng được cho làlàm tăng khả năng kết tụ của các protein, được biết là nguyên nhân của nhiềuloại bệnh liên quan tới thần kinh như Alzeihmer, Parkison Việc nghiên cứucác quá trình sinh hoá trong điều kiện thực tế với sự hiện diện của đám đôngđại phân tử là thực sự cần thiết cho hiểu biết của chúng ta về sự sống ở cấp độphân tử Tuy vậy, các hiểu biết về hiệu ứng đám đông đại phân tử vẫn còn rất

hạn chế do tính phức tạp của vấn đề nghiên cứu cũng như những khó khăn khithực hiện các thí nghiệm bên trong tế bào

Xuất phát từ thực trạng đó, với mục đích nghiên cứu sâu hơn về quátrình cuốn protein đồng thời góp phần áp dụng hiệu quả trong việc nghiên cứucác cơ chế gây ra các bệnh tật là những vấn đề có ý nghĩa to lớn đối với sức

khoẻ con người, do đó tôi chọn đề tài nghiên cứu “Hiệu ứng đám đông đại phân tử đối với tính chất cuốn của protein” Nghiên cứu hiệu ứng đám

đông đại phân tử lên tính chất cuốn của protein giúp ta hiểu rõ hơn về hành

xử của protein môi trường tế bào, tạo cơ sở cho việc tìm ra cơ chế gây bệnh

và nghiên cứu các ứng dụng trong y sinh học

Đối tượng nghiên cứu là các protein nhỏ đơn miền, được biết có khảnăng cuốn nhanh chóng trong môi trường ống nghiệm không có sự hiện diệncủa đám đông đại phân tử Các nội dung nghiên cứu bao gồm:

1 Nghiên cứu ảnh hưởng của đám đông đại phân tử lên nhiệt độ chuyểnpha cuốn

2 Nghiên cứu ảnh hưởng của đám đông đại phân tử lên độ ổn định củatrạng thái cuốn

Một số nghiên cứu trước đây đã đề cập tới các nội dung trên Điểm mớicủa nghiên cứu trong luận văn này là chúng tôi sẽ so sánh kết quả cho 2protein với cấu trúc trạng thái tự nhiên khác nhau nhằm làm rõ hơn mức độảnh hưởng của đám đông đại phân tử lên các protein có cấu trúc khác nhau.Ngoài ra, các kết quả tính toán trong luận văn cho 2 protein này cũng nhằmkiểm tra lại các kết quả của các nghiên cứu trước đây cho các protein khác Nghiên cứu trong luận văn sử dụng các mô hình đơn giản hóa, bao gồm

mô hình Go cho protein và mô hình quả cầu với thế năng đẩy cho các đạiphân tử Phương pháp động lực học phân tử với phương trình Langevin được

sử dụng để mô phỏng động lực học của hệ protein và các phân tử đám đông

Để tính toán các đại lượng cân bằng nhiệt động như nhiệt dung riêng, nănglượng tự do một cách hiệu quả, luận văn sử dụng phương pháp phân tích biểu

đồ có trọng số

Luận văn gồm 3 chương:

- Chương 1: Tổng quan về cuốn protein và hiệu ứng đám đông đại phân tử

- Chương 2: Các mô hình và phương pháp mô phỏng

- Chương 3: Một số kết quả nghiên cứu

Kèm theo các chương này là phần kết luận và tài liệu tham khảo

Chương 1: Tổng quan về cuốn protein và hiệu ứng đám đông đại phân tử

1.1 Các tính chất cơ bản của protein

1.1.1 Thành phần hóa học của protein

Protein là các đại phân tử sinh học lớn chứa một hoặc nhiều các aminoacid Protein thực hiện rất nhiều chức năng bên trong sinh vật, bao gồm cácphản ứng trao đổi chất, xúc tác, sao chép DNA, đáp ứng lại kích thích, và vậnchuyển phân tử từ một vị trí đến vị trí khác Các protein khác nhau chủ yếu ởtrình tự của các axit amin trong cấu tạo của chúng, mà trình tự này bị chi phốibởi trình tự nucleotide của các gen quy định tương ứng, và ở kết quả của giaiđoạn cuốn protein (protein folding) thành những cấu trúc 3 chiều quyết địnhchức năng của nó Protein là một chuỗi polymer đơn tuyến hợp thành bởi 20loại axit amin, còn gọi là chuỗi polypeptide Trong 20 loại amino acid này, 19loại có cấu trúc cơ bản giống nhau như Hình 1.1(a) Mỗi amino acid có mộtnguyên tử C trung tâm gọi là C liên kết với một nguyên tử H, một nhóm car-boxyl COOH, một nhóm amin NH2, và một chuỗi bên (side chain) R Loạiamino acid thứ 20 còn lại là proline có cấu trúc tương tự như các amino acidkhác, nhưng nguyên tử C thuộc chuỗi bên của nó liên kết với nguyên tử N củanhóm amin tạo thành mạch vòng (Hình 1.1 (b))

Hình 1.1 a) Cấu trúc chung của amino acid b) Cấu trúc của proline.

Các tính chất vật lý và hoá học của chuỗi bên xác định các đặc tính củaamino acid, qua đó quyết định vai trò của amino acid trong chuỗi polypeptide.Dựa trên các tính chất này, các amino acid có thể phân thành các nhóm khôngphân cực (kị nước), phân cực (ưa nước), tích điện âm (nếu chuỗi bên mangđiện tích âm), và tích điện dương (nếu chuỗi bên mang điện tích dương).

Chuỗi polypeptide được tạo thành bởi phản ứng trùng ngưng các aminoacid loại bỏ đi các phân tử nước được tạo thành từ nhóm OH của nhóm car-boxyl và H của nhóm amin Phản ứng này tạo ra các liên kết peptide (Hình1.2) là liên kết cộng hoá trị giữa nguyên tử C của nhóm carboxyl và nguyên tử

N của nhóm amin kề nhau Các nguyên tử này cùng với các nguyên tử C tạothành bộ khung cho chuỗi polypeptide gọi là mạch xương sống (backbone)của chuỗi polypeptide Toả ra từ bộ khung này là các chuỗi bên của các aminoacid Liên kết peptide tạo ra tính định hướng cho chuỗi polypeptide, cácnguyên tử N của nhóm amin đều nằm cùng một phía của nguyên tử C Phíacòn lại là các nguyên tử C của nhóm carboxyl Nhóm amin duy nhất khôngtham gia liên kết peptide tạo thành đầu N của chuỗi polypeptide Đầu còn lại

là đầu C Quá trình dịch mã trong ribosome được tiến hành từ đầu N đến đầu

C của chuỗi để tạo ra cấu trúc bậc nhất của protein

Hình 1.2 Chuỗi polypeptide hình thành bởi các liên kết peptide giữa các

Protein được sinh tổng hợp trong tế bào bởi các ribosome Kích thướccủa một protein có thể đo bằng số lượng amino acid chứa trong nó hoặc bằngtổng khối lượng phân tử, mà thông thường tính bằng đơn vị Dalton (đồngnghĩa với đơn vị khối lượng nguyên tử), hoặc đơn vị dẫn xuất kilo-Dalton(kDa) Các protein tổng hợp bởi nấm men trung bình dài 466 amino acid và

có khối lượng trung bình 53 kDa Protein lớn nhất từng được biết đến là titin,một thành phần của đơn vị cơ bản sợi cơ vân (muscle sarcomere), với khối

lượng phân tử 3.000 kDa và chứa tới 27.000 amino acid.

1.1.2 Cấu trúc của protein

Cấu trúc bậc 1: Là trình tự của các amino acid trong chuỗi polypeptide

của protein

Cấu trúc bậc 2: Là tương tác không gian giữa các gốc axit amino ở gần

nhau trong chuỗi polypeptide Cấu trúc được bền vững chủ yếu nhờ liên kếthydro hình thành giữa các liên kết peptide ở kề gần nhau, cách nhau nhữngkhoảng xác định dọc theo trình tự chuỗi Các cấu trúc bậc 2 của phân tử pro-tein bao gồm xoắn α (α-helix), phiến β (β-sheet) và các khúc ngoặt (turn) Bởi

vì cấu trúc bậc 2 mang tính cục bộ, nhiều vùng với các cấu trúc bậc 2 khácnhau có thể tồn tại trong cùng một phân tử protein

Cấu trúc bậc 3: là hình dạng 3 chiều tổng thể của một phân tử protein đơn

nhất; hay mối quan hệ không gian giữa các cấu trúc bậc 2 với nhau Nóichung cấu trúc bậc 3 được giữ ổn định bởi các tương tác phi cục bộ, phần lớnbởi sự hình thành một lõi kị nước (hydrophobic core), và ngoài ra được giữ ổnđịnh bởi các cầu muối (salt bridge), liên kết hydro, liên kết disulfide Thuậtngữ “cấu trúc bậc 3” thường được sử dụng mang nội dung đồng nghĩa vớithuật ngữ cuốn hoặc gấp protein Cấu trúc bậc 3 kiểm soát chức năng cơ bảncủa protein

Cấu trúc bậc 4: là cấu trúc hình thành bởi một số phân tử protein liên kết

với nhau (chuỗi polypeptide), mà hay gặp thuật ngữ tiểu đơn vị protein trongtrường hợp này, mà chức năng của cấu trúc bậc 4 hoạt động như một phứchợp protein

1.1.3 Các tương tác của protein

Protein là một hệ phức tạp với nhiều loại tương tác có cường độ mạnh, yếukhác nhau Để nghiên cứu protein chúng ta cần nắm rõ các loại tương tác này,vai trò và cường độ của chúng đối với từng bậc cấu trúc

Liên kết peptide: là liên kết cộng hoá trị dọc theo chuỗi polypeptide Đây

là liên kết cơ bản hình thành nên cấu trúc bậc một của protein Liên kếtpeptide có thể bị phá vỡ bởi môi trường axit trong dạ dày và các enzymeprotease trong hệ tiêu hóa

Cầu disulfide: là liên kết cộng hoá trị hình thành giữa hai nguyên tử lưu

huỳnh (−S−S−) của hai amino acid loại cysteine Liên kết này chỉ xuất hiệntrong các protein có chứa cysteine Cầu disulfide có thể bị phá hủy khi môitrường có tính khử mạnh Khi cầu disulfide bị huỷ, các hoạt tính sinh học vàtính chất hoá lý của protein bị biến đổi mạnh

Liên kết tĩnh điện: Giữa một số nguyên tử hay nhóm nguyên tử tích điện

có tương tác Coulomb Chuỗi bên của các amino acid mang điện tích trái dấu

có thể tạo thành các liên kết tĩnh điện mạnh gọi là cầu muối (salt bridge)

Liên kết hydro: Bản chất của liên kết hydro chính là tương tác tĩnh điện

giữa hai nguyên tử hay nhóm nguyên tử bị phân cực (thường xảy ra giữanguyên tử H của nhóm amin phân cực dương và nguyên tử O của nhómcarboxyl phân cực âm) Liên kết hydro thường có tính lặp lại và đóng vai tròrất lớn trong việc hình thành và giữ ổn định cấu trúc không gian bậc cao Đặcbiệt, các xoắn α và phiến  được ổn định bởi các liên kết hydro

Tương tác Van der Waals xuất hiện khi các nguyên tử ở khá gần nhau.

Khi khoảng cách giữa các nguyên tử rất nhỏ, chúng đẩy nhau Ở khoảng cáchlớn, chúng hút nhau Thế năng tương tác này cũng giúp hình thành và ổn địnhcấu trúc bậc cao, tuy nhiên độ lớn của tương tác Van der Waals yếu hơn liênkết hydro vài lần

Tương tác kỵ nước: là hệ quả của các tương tác phức tạp giữa các phân tử

nước với chuỗi bên của các amino acid và giữa các phân tử nước với nhau,trong đó có sự liên quan tới việc hình thành các cấu trúc của nước xung quanhcác phân tử chất hoà tan Kết quả của tương tác kỵ nước là sự liên kết giữacác phân tử kỵ nước nằm gần nhau Phân tử nước có mômen lưỡng cực, tươngtác mạnh với các amino acid theo hai nhóm: nhóm kỵ nước (hydrophobicgroup) và nhóm phân cực (polar group) Các chuỗi bên kỵ nước thường quayvào phía trong của protein để tránh tiếp xúc với nước, do đó, bị dồn lại gầnnhau làm xuất hiện tương tác Van der Waals giữa chúng Các chuỗi bên phâncực thường có xu hướng nằm trên bề mặt của protein Mặc dù vậy, trên bề mặtprotein vẫn tồn tại khoảng 30% các chuỗi bên kỵ nước

Cường độ của các tương tác của protein có thể chia thành hai nhóm Cácliên kết cộng hoá trị (liên kết peptide, cầu disulfide) mạnh và bền hơn nhiềucác tương tác không cộng hoá trị (liên kết hydro, tương tác Van der Waals,tương tác kỵ nước, liên kết tĩnh điện) Các liên kết thuộc nhóm thứ nhất khó

có thể bị phá vỡ bởi dao động nhiệt trong khi các liên kết thuộc nhóm thứ hai

có thể bị kích thích và bị phá vỡ ở nhiệt độ phòng Vì vậy, các tính chất độnghọc và nhiệt động của protein phụ thuộc chủ yếu vào nhóm liên kết khôngcộng hoá trị này

1.2 Quá trình cuốn protein

Để tạo ra những protein với đầy đủ chức năng, tế bào phải thực hiệnnhững quá trình cực kỳ nghiêm ngặt Trước tiên, các ribosome nối các amino

acid lại thành các chuỗi polypeptide không phân nhánh (là cấu trúc bậc mộtcủa protein) Mỗi chuỗi polypeptide này sau đó được cuộn chặt, biến đổithành cấu hình lập thể chính xác mang cấu trúc bậc 3 và có thể là bậc 4 Cấuhình này gọi là trạng thái tự nhiên (native state) của protein Với hầu hếtprotein, trạng thái tự nhiên là duy nhất và là cấu hình bền vững nhất Hoạt tínhsinh học của protein chỉ thể hiện khi nó nằm ở trạng thái tự nhiên Theo gócnhìn nhiệt động học thì trạng thái tự nhiên là trạng thái có năng lượng tự dothấp nhất

Hiện tượng cuốn protein được nghiên cứu đầu tiên bởi Anfinsen vànhững năm 1950 Các thí nghiệm của Anfinsen cho thấy protein có thể duỗi ra

và cuốn lại về trạng thái tự nhiên một cách thuận nghịch khi các điều kiệndung môi thay đổi tương ứng Điều này đưa ông kết luận rằng trình tự aminoacid trong chuỗi polypeptide là đủ để xác định cấu trúc ba chiều của trạng thái

tự nhiên của protein Mối liên hệ giữa trình tự amino acid trong protein và cấutrúc 3 chiều của nó còn được gọi là mã di truyền bậc 2

Quá trình cuốn protein là quá trình chuỗi polypeptide biến đổi động lựchọc từ trạng thái duỗi với cấu trúc bậc một tới trạng thái tự nhiên của protein.Trong những điều kiện nhất định, quá trình biến đổi động lực học từ cấu trúcbậc một có thể cho sản phẩm là một cấu hình khác với cấu hình tự nhiên củaprotein, gọi là quá trình cuốn lỗi (misfolding) Protein sẽ mất đi các chức năngsinh học vốn có khi nằm ở trạng thái cuốn lỗi

Quá trình cuốn protein có thể coi là quá trình tiến về trạng thái tự nhiên

có năng lượng cực tiểu trên một địa hình năng lượng xác định bởi năng lượngcủa tất cả các trạng thái trong không gian cấu hình Người ta cho rằng quátrình cuốn là quá trình ngẫu nhiên trên một địa hình năng lượng dạng phễu,theo đó quá trình cuốn là quá trình giảm năng lượng đồng thời với giảm en-tropy về trạng thái tự nhiên Do sự cạnh tranh và xung đột giữa các tương tác,

nên địa hình năng lượng là một bề mặt gồ ghề với các rào thế và cực tiểu địaphương Protein chỉ có thể cuốn nhanh chóng nếu nó có một địa hình nănglượng đủ trơn mượt

1.3 Mô hình hai trạng thái trong cuốn protein

Động học của quá trình cuốn của đa số các protein nhỏ, đơn miền có thểđược mô tả bởi mô hình hai trạng thái Đây là một mô hình cơ bản trong lýthuyết về tốc độ phản ứng, đã được áp dụng cho nhiều loại quá trình khácnhau như phản ứng hóa học, các quá trình khuyếch tán, ngưng tụ v.v Trong

mô hình hai trạng thái cho cuốn protein, giản đồ năng lượng tự do được đặctrưng bởi một rào thế lớn ngăn cách trạng thái cuốn (trạng thái tự nhiên) vàtrạng thái duỗi (không cuốn) như trong giản đồ mô tả trên Hình 1 Trong giản

đồ này, trạng thái cuốn (N – native) và duỗi (U – unfolded) tương ứng với cáccực tiểu của năng lượng tự do theo tiến trình phản ứng Trạng thái chuyển tiếp(TS - transition state) nằm ở đỉnh rào thế năng lượng tự do Độ chênh lệchnăng lượng tự do giữa trạng thái cuốn và trạng thái duỗi đặc trưng có mức độ

ổn định của protein được gọi là năng lượng tự do cuốn (folding free energy)

Δ F ≡ Δ F N −U=F N − F U

Hình 1.3: Giản đồ năng lượng tự do của protein trong mô hình hai trạng thái.

Độ cao bờ thế năng lượng tự do cuốn được định nghĩa bằng

Δ F N=F TS − F U Độ cao bờ thế năng lượng tự do duỗi Δ F U=F TS − F N Các bờthế này quyết định tốc độ cuốn (k f) và tốc độ duỗi (ku) theo định luật Van’tHoff – Arrhennius:

k f ,u=ν0exp(− Δ F N ,U

k B T ) , (1.1)trong đó v 0 là hằng số, T là nhiệt độ và k B là hằng số Boltzmann ∆FN,U phụthuộc vào nhiều yếu tố như nhiệt độ, áp suất, nồng độ chất làm duỗi trong cácthí nghiệm Các nghiên cứu thí nghiệm của quá trình cuốn thường thực hiệnbằng cách thay đổi nhanh chóng điều kiện dung môi để protein chuyển từtrạng thái không cuốn sang trạng thái cuốn và ngược lại Trong giới hạn chophép, có thể coi rằng ∆F N,U phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ của hoá chấtlàm duỗi protein trong dung dịch Do đó, theo phương trình (1.1), ln(kf) vàln(ku) cũng phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ chất làm duỗi

Động học của protein trong mô hình hai trạng thái tuân theo hệ phươngtrình chủ

∂P N

∂t =k f P U−k u P N , (1.2)

∂P U

∂t =k u P N−k f P U , (1.3)trong đó PN và PU lần lượt là xác suất tìm thấy hệ ở trạng thái N và U Sửdụng các điều kiện biên ta thu được nghiệm của phương trình có dạng:

P N(t)=P ∞ N+(P N0 − P N ∞)e − kt (1.4)Động học trong đó k = kf + ku , P N0 là xác suất ban đầu, P∞ N là xác suất tìm thấy

hệ ở trạng thái cuốn khi hệ ở cân bằng nhiệt động khi t → ∞. Như vậy, hai

đặc trưng chính của mô hình hai trạng thái là: logarit của tốc độ cuốn và duỗiphụ thuộc tuyến tính vào nồng độ chất làm duỗi và quá trình hồi phục tuântheo hàm mũ Trong thực nghiệm, thông thường những protein nhỏ đơn miền

có động học thoả mãn hai tính chất này Chúng được gọi là các protein haitrạng thái

1.4 Hiệu ứng đám đông đại phân tử

Môi trường trong tế bào là một môi trường không đồng nhất, tập trungđông đúc các đại phân tử Số lượng, chủng loại, nồng độ phân tử trong bàotương phụ thuộc vào loại tế bào và chu kỳ của tế bào Tổng lượng proteintrong tế bào ước tính cỡ 50 − 400 mg/ml tương ứng với cỡ từ 5 − 40% tổngthể tích (Hình 1.1) Môi trường đông đúc như vậy được biết đến với tên gọi

“đám đông đại phân tử” [1] và có ảnh hưởng lớn tới các tính chất của cácphân tử trong tế bào cũng như các quá trình xảy ra trong tế bào [2,3] Ví dụ,đám đông đại phân tử được biết làm tăng khả năng kết dính giữa DNA vàenzyme DNA polymerase trong các quá trình sao chép và nhân đôi DNA [4],đẩy mạnh sự liên kết giữa các protein [5], và cải thiện hiệu quả hoạt động củacác chaperonin [3] Người ta cũng chỉ ra rằng đám đông đại phân tử làm tăngtính ổn định và tốc độ cuốn của protein [6], nhưng đồng thời cũng làm tăngkhả năng kết tụ của protein [7]

Việc quá trình cuốn của protein xảy ra trong một không gian bị lấp đầyđáng kể bởi các đại phân tử dẫn đến các câu hỏi là: Làm thế nào để proteincuốn và thực hiện chức năng trong một môi trường đông đúc như vậy? Liệucác kết quả thực nghiệm về các tính chất của protein được thực hiện trong môitrường pha loãng có phản ánh chính xác những gì xảy ra trong cơ thể haykhông và có thể chấp nhận ở mức độ nào? Câu hỏi đầu tiên có ý nghĩa cơ bảnđối với hiểu biết của chúng ta về protein, trong khi câu hỏi thứ hai cũng rấtquan trọng bởi hầu hết các thông tin hiện có về quá trình cuốn của protein đều

nhận được từ các thí nghiệm trong đó protein nằm trong một dung dịch phaloãng trong ống nghiệm Các thí nghiệm này thường sử dụng các dung dịchloãng nhất có thể để tránh các điều kiện không lý tưởng và tập trung vào tínhchất của protein tinh khiết Trong tế bào, sự xuất hiện của các đám đông đạiphân tử đã phá vỡ các điều kiện lý tưởng như trong ống nghiệm.

Hình 1.4: Hình ảnh mô phỏng mô tả mật độ đông đúc của các đại phân tử

bên trong tế bào [14]

Hiệu ứng cơ bản của đám đông đại phân tử được cho là gây ra bởi thểtích loại trừ bị chiếm bởi các phân tử đám đông và không thể tiếp cận đượcđối với các phân tử khác Trong cuốn protein, sự thăng giáng của các khônggian trống còn lại trở nên bất lợi đối với trạng thái duỗi của protein nhiều hơn

so trạng thái cuốn, do trạng thái duỗi cần một không gian lớn hơn Đây chính

là cơ sở của một số lý thuyết về hiệu ứng đám đông dựa trên lý thuyết hạt điềuchỉnh tỷ lệ (scaled particle theory - SPT) [8, 9, 10] Những lý thuyết này chophép tính toán sự thay đổi năng lượng tự do cuốn của protein, là sự chênh lệchnăng lượng tự do ở trạng thái cuốn so với trạng thái duỗi, gây ra bởi sự có mặt

trò của thể tích loại trừ [11, 12] Ngoài ra, các ảnh hưởng của đám đông lêncuốn protein được chỉ ra là cho các kết quả tương tự như các hiệu ứng gây rabởi sự hạn chế về không gian [10, 13] Mặc dù vậy, các nghiên cứu thựcnghiệm cho đến nay vẫn đưa ra các kết quả không hoàn toàn thống nhất vềảnh hưởng của đám đông đại phân tử lên cuốn protein

Các nghiên cứu về hiệu ứng đám đông đại phân tử trong hơn 30 nămgần đây đã thu được những hiểu biết đáng kể Ngoài các tương tác phức tạpgiữa protein và các phân tử đám đông, có thể kể ra hai hiệu ứng quan trọng vàtrực tiếp mà môi trường đông đúc bên trong tế bào tác động lên protein, làhiệu ứng thể tích loại trừ (excluded volume effect) và hiệu ứng rút kiệt(depletion effect) Hiệu ứng thể tích loại trừ khiến cho protein bị thay đổikhông gian cấu hình, và bị giam cầm trong một khu vực linh động tạo ra cáckhác biệt so với quá trình cuốn trong một dung dịch pha loãng Hiệu ứng rútkiệt có bản chất liên quan đến entropy của các phân tử đám đông [15] khiếncho các protein có xu hướng co cụm lại gần nhau, giúp ổn định các phức hệprotein nhưng cũng làm tăng khả năng kết tụ Các nghiên cứu thực nghiệm và

mô phỏng gần đây đã làm rõ hơn các hiệu ứng này

Trong hầu hết các trường hợp, nghiên cứu thực nghiệm và mô phỏngcho thấy đám đông đại phân tử làm tăng sự ổn định cuốn của protein chống lạikhả năng biến tính do tác động hoá học và nhiệt độ Khả năng tăng sức đềkháng với biến tính nhiệt độ thay đổi đáng kể từ protein này đến protein khác.Pielak và các đồng nghiệp [16, 17] tìm thấy hai kết quả trái ngược nhau Haitác nhân polymer PVP và Ficoll có tác dụng ổn định cuốn cho protein CI2 phùhợp với các nghiên cứu khác [18, 19] Trong khi đó, hai tác nhân proteinlysozyme và huyết thanh bò (BSA) dẫn đến sự bất ổn nhẹ Kết luận này tráingược với những hiểu biết hiện nay về ảnh hưởng của đám đông đại phân tửlên sự ổn định cuốn của protein Gần đây, các dữ liệu thực nghiệm của phòng

thí nghiệm Pielak được Zhou tái phân tích [20], theo đó tác giả đưa ra gợi ýrằng hiệu ứng trái ngược của các tác nhân đám đông polymer và protein lên

sự ổn định cuốn của CI2 là do sự khác biệt trong nhiệt độ khảo sát và do hailoại tác nhân có tương tác hút khác nhau lên protein CI2 Tác giả cũng dựđoán rằng đối với một protein nhất định, mỗi đám đông đại phân tử có mộtgiá trị nhiệt độ chuyển giao tại đó ảnh hưởng của đám đông thay đổi từ mất ổnđịnh sang ổn định Do đó nhiệt độ thử nghiệm đóng một vai trò quan trọngtrong hiệu ứng đám đông lên sự ổn định cuốn Phù hợp với kỳ vọng này, ảnhhưởng của đám đông PVP và Ficoll làm tăng sự ổn định cuốn của CI2 được

đo ở nhiệt độ cao 37oC, trong khi đó hiệu ứng gây mất ổn định bởi lysozyme

và BSA được đo ở nhiệt độ thấp 20oC Tiên đoán là đám đông PVP và Ficoll

sẽ gây mất ổn định ở nhiệt độ thấp và ngược lại lysozyme và BSA sẽ làm tăng

sự ổn định cuốn ở nhiệt độ cao hơn Trong khi dự đoán này vẫn chưa đượckiểm tra, phòng thí nghiệm của Gruebele hiện đã công bố kết quả ảnh hưởngcủa đám đông protein (subL) làm tăng sự ổn định cuốn của protein λ6−85 [21]

và của enzim phosphoglycerate bên trong tế bào [22] đều ở nhiệt độ cao Tómlại, nhiệt độ được tiên đoán đóng vai trò quyết định ảnh hưởng thực sự củađám đông lên sự ổn định cuốn của protein trong các sinh vật chịu nhiệt

Các nghiên cứu cho thấy đám đông đại phân tử làm tăng nhẹ tốc độcuốn của protein [23, 24] Cụ thể, tốc độ cuốn lại của carbonic anhydrase tăngtrong sự có mặt của Ficoll 70 [25] Tương tự, tốc độ cuốn lại của VlsE [26],apoflavodoxin [27], và apocytochrome b562 [28] cũng tăng trong sự hiện diệncủa các đám đông như Ficoll, Dextran hoặc PEG nhưng tốc độ duỗi lại không

bị ảnh hưởng

Kết quả thu được khi nghiên cứu sự cuốn lại của carbonic anhydrasecho thấy tổng lượng protein được cuốn thành công giảm xuống khi có mặtđám đông Ficoll, nghĩa là hiệu quả cuốn giảm [25] Kết quả này thống nhất

với các nghiên cứu của Dobson [23, 24] cho rằng đám đông làm giảm khảnăng cuốn lại do kết tụ Tuy nhiên, vai trò của đám đông đại phân tử trongmôi trường nội bào lên sự cuốn hỏng của protein chưa được hiểu biết rõ ràng.Trong một nghiên cứu gần đây của nhóm Ma [29] cho thấy các hiệu ứng tráingược của đám đông đại phân tử lên sự cuốn lỗi của protein Đám đông đạiphân tử làm tăng sự hình thành các sợi kết tụ đối với protein Tau của người(protein Tau hình thành sợi kết tụ trong não gây ra bệnh Alzheimer) nhưng ứcchế sự hình thành sợi amyloid trong các protein prion của thỏ (là một trong số

ít loài đề kháng với bệnh) và lysozyme trong lòng trắng trứng gà Các tác giả

đề xuất rằng các protein dễ bị kết tụ thành sợi và có liên quan đến các bệnh dễ

bị cuốn lỗi dưới ảnh hưởng của đám đông hơn trong dung dịch pha loãng.Ngược lại, các protein không liên quan đến các bệnh ít có khả năng hìnhthành kết tụ trong các điều kiện đông đúc

1.5 Lý thuyết hạt tỷ lệ

Lý thuyết hạt tỷ lệ (scaled particle theory - SPT) được đưa ra đầu tiênbởi Reiss và các đồng nghiệp [30] để ước tính sự thay đổi thế hoá học khichèn một hạt mới vào trong một chất lỏng có chứa rất nhiều các hạt khác vớigiả thiết các hạt có kích thước đáng kể Lý thuyết hạt điều chỉnh tỷ lệ lúc đầuchỉ được xây dựng được cho hệ chất lỏng chỉ chứa một loại hạt là các quả cầucứng với cùng kích thước, sau đó được mở rộng cho dung dịch chứa nhiềuloại hạt hình cầu cứng với bán kính khác nhau Nó cũng áp dụng khá tốt chocác hệ gồm các hạt không phải hình cầu [31]

Xét một dung dịch có thể tích V chứa N đại phân tử đám đông có kíchthước giống nhau Gọi Rc là bán kính của các đại phân tử Tỷ lệ thể tích bịchiếm chỗ bởi các đại phân tử được ký hiệu là c Theo lý thuyết hạt điềuchỉnh tỷ lệ, khi chèn một quả cầu cứng với bán kính R vào dung dịch, sự thayđổi năng lượng tự do (thế hóa học) được cho bởi

tự do giữa hai mức cực tiểu này phản ánh sự ổn định của protein ở trạng thái

tự nhiên Khi cực tiểu năng lượng tự do ứng với trạng thái tự nhiên thấp hơncực tiểu năng lượng tự do ở trạng thái duỗi thì protein ổn định ở trạng tráicuốn Mức độ ổn định càng lớn khi độ chênh lệch năng lượng tự do giữa trạngthái duỗi và trạng thái cuốn càng lớn

Như vậy, để nghiên cứu tác động của hiệu ứng đám đông đại phân tử lên

sự ổn định cuốn của protein chúng ta cần xem xét đại lượng năng lượng tự docuốn, là hiệu năng lượng tự do tại các trạng thái cuốn và trạng thái duỗi, trongtrường hợp vắng mặt và có mặt các đại phân tử đám đông Sự thay đổi nănglượng tự do cuốn do sự có mặt của các đại phân tử được cho bởi:

(1.6)

Do đó, bài toán nghiên cứu tác động của đám đông đại phân tử lên sự ổnđịnh cuốn của protein được chuyển thành bài toán ước tính thay đổi thế hoáhọc của trạng thái cuốn (∆μN) và duỗi (∆μU) của protein khi đặt thêm các đạiphân tử vào hệ Có 2 cách áp dụng lý thuyết hạt điều chỉnh tỷ lệ cho việc tínhtoán sự thay đổi thế hóa học này, được đề xuất lần lượt bởi Minton và Zhou

Minton [32] là người đầu tiên áp dụng lý thuyết hạt điều chỉnh tỷ lệ vàonghiên cứu ảnh hưởng của đám đông đại phân tử lên quá trình cuốn củaprotein trong môi trường tế bào Để làm việc này, ông coi các trạng thái cuốn

và trạng thái duỗi của protein một cách gần đúng là các quả cầu cứng, trong

đó bán kính của trạng thái cuốn nhỏ hơn bán kính của trạng thái duỗi Ápdụng công thức (1.5) ta tính được sự thay đổi thế hoá ∆μN và ∆μU cho protein

ở các trạng thái cuốn và duỗi, được coi là các quả cầu cứng với bán kínhtương ứng là RN và RU được chèn vào dung dịch đông đúc các đại phân tử.Thay lại vào công thức (1.6) ta có thể xác định sự thay đổi năng lượng tự docuốn protein bởi các đại phân tử đám đông Kết quả tiên đoán của Minton chothấy sự hiện diện của các đại phân tử đám đông hình cầu được tiên đoán gây

ra sự giảm phi tuyến của năng lượng tự do cuốn vào mật độ thể tích của cácđại phân tử đám đông

Zhou [33] sử dụng cách tiếp cận tương tự với Minton nhưng dựa trên giảđịnh khác cho trạng thái không cuốn Zhou áp dụng mô hình chuỗi Gauss chotrạng thái không cuốn trong sự hiện diện của đám đông đại phân tử hình cầu,còn trạng thái cuốn vẫn được coi là các quả cầu cứng Chuỗi Gauss được xem

là một tập hợp các hạt kết nối với nhau bởi các thế năng điều hoà Gọi li là

khoảng cách từ hạt thứ i đến i + 1 Bán kính hồi chuyển (radius of gyration)

của chuỗi Gaussian được cho bởi:

Trong cách áp dụng của Zhou, sự thay đổi thế hóa của trạng thái cuốn vẫn tínhtheo công thức (1.5), trong khi sự thay đổi thế hóa của trạng thái duỗi đượccho bởi:

Lý do của kết quả này được giải thích là do các chuỗi Gauss có thể chen vàocác khoảng trống giữa các đại phân tử đám đông Sự khác biệt giữa 2 lýthuyết của Minton và Zhou được mô tả trên Hình 1.5

Hình 1.5: Sự thay đổi năng lượng tự do cuốn phụ thuộc vào tỷ lệ thể tích của đám đông đại phân tử trong lý thuyết của Minton (đường liền nét) và Zhou (đường đứt nét)