TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU
Côn trùng, nấm bệnh gây hại và vai trò của thuốc bảo vệ thực vật
Theo nghiên cứu của nhà côn trùng học N N Melnikov, có hơn 68.000 loài côn trùng và nhiều chủng vi sinh vật gây hại cho con người, động vật và thực vật Côn trùng và vi sinh vật này đã gây thiệt hại lớn cho sản xuất nông nghiệp, ước tính khoảng 1/3 tổng sản lượng lương thực toàn cầu bị mất hàng năm Nếu không có sự nghiên cứu và kiểm soát hệ thống, thiệt hại có thể còn lớn hơn, với ước tính 37% sản lượng khoai tây, 22% cải bắp, 10% táo và 9% đào toàn cầu bị hư hại.
Tại Trung Quốc, có 1.648 loại tác nhân gây hại cho mùa màng, bao gồm 724 loại thực vật, 838 loại côn trùng, 64 loại cỏ dại và 22 loài gặm nhấm Nếu không sử dụng thuốc bảo vệ thực vật (BVTV), sản lượng hoa quả, rau màu và ngũ cốc sẽ giảm lần lượt 78%, 54% và 32% Việc áp dụng thuốc BVTV đã giúp Trung Quốc tăng thêm 89,44 triệu tấn ngũ cốc, 1,65 triệu tấn bông, 2,53 triệu tấn hạt lấy dầu và 78 triệu tấn rau màu.
Theo đánh giá của Viện Lúa quốc tế (IRRI), côn trùng và nấm bệnh gây thiệt hại khoảng 37% tổng sản lượng lúa thu hoạch hàng năm trên toàn cầu.
Bệnh Panama, do nấm Fusarium cubense gây ra, là một trong những bệnh nấm nổi tiếng nhất và gây thiệt hại nghiêm trọng nhất trong lịch sử trồng chuối toàn cầu Vào những năm đầu thế kỷ, bệnh này đã gần như tiêu diệt hoàn toàn ngành nông nghiệp trồng chuối tại Châu Mỹ La tinh.
20 Những căn bệnh mới do nấm gây ra tiếp tục đe dọa xóa sổ ngành công
Thuốc bảo vệ thực vật (BVTV) đóng vai trò quan trọng trong nông nghiệp, giúp tăng thêm 1/3 tổng sản lượng nông sản toàn cầu Nếu không có BVTV, sản lượng hoa quả, rau màu và ngũ cốc có thể giảm mạnh tới 78%, 54% và 32% tương ứng.
Tại Mỹ, mỗi 1 USD chi cho thuốc bảo vệ thực vật (BVTV) mang lại 4 USD giá trị thu hoạch Với chi phí trung bình hàng năm lên tới 10 tỷ USD cho BVTV, nông dân Mỹ đã thu được thêm 40 tỷ USD từ sản lượng nông sản mà nếu không có thuốc, có thể bị mất do sâu bệnh.
Việc sử dụng thuốc bảo vệ thực vật (BVTV) đã giúp các nước đang phát triển gia tăng sản lượng lương thực và nông sản, mở rộng diện tích sản xuất nông nghiệp từ khu vực Amazon đến rừng nhiệt đới Indonesia Theo báo cáo của FAO, mỗi khi sản lượng lương thực tăng thêm 1%, lượng sử dụng thuốc BVTV cũng tăng tương ứng 1,8%.
Theo Tổ chức Nông Lương Thế giới (FAO), thuốc bảo vệ thực vật (BVTV) là các hợp chất hoặc hỗn hợp được sử dụng để ngăn chặn, tiêu diệt hoặc kiểm soát các yếu tố gây hại như côn trùng, động vật và thực vật không mong muốn trong quá trình sản xuất, chế biến và bảo quản nông sản Thuốc BVTV cũng bao gồm các chất điều hòa sinh trưởng thực vật, chất gây rụng lá, cũng như các hợp chất làm chậm quá trình chín của quả.
Nó bao gồm các chất được sử dụng trước và sau khi thu hoạch nông sản nhằm ngăn ngừa sự suy giảm chất lượng sản phẩm trong quá trình bảo quản và vận chuyển.
Thuốc bảo vệ thực vật (BVTV) có thể được phân loại dựa trên vật đích tác dụng, bao gồm thuốc diệt cỏ, thuốc trừ sâu hóa học (hữu cơ, vô cơ, tổng hợp) và thuốc có nguồn gốc sinh học (biopesticide) Ngoài ra, thuốc BVTV cũng có thể được phân loại theo trạng thái vật lý như dạng rắn, lỏng, khí hóa lỏng và thuốc xông.
Thuốc diệt côn trùng hóa học được phân loại thành nhiều nhóm, trong đó có organochlorine, organophosphate và carbamate Bên cạnh đó, thuốc bảo vệ thực vật có nguồn gốc sinh học, hay còn gọi là biopesticide, đang phát triển nhanh chóng với nguyên liệu từ vi sinh vật, thực vật và khoáng tự nhiên, bao gồm các nhóm như pyrethroid, rotenoid, nicotinoid, strychnine và scilliroside.
Thuốc bảo vệ thực vật có thể được phân loại thành hai loại chính: loại dễ phân hủy bởi vi sinh vật thành các chất ít gây hại hơn và loại bền vững, khó phân hủy, có khả năng tồn tại lâu dài, tích lũy trong chuỗi thức ăn và gây độc cho hệ sinh thái.
Hiện nay, thế giới tiêu thụ khoảng 3,5 tỷ kg thuốc bảo vệ thực vật hóa học mỗi năm từ giai đoạn gieo trồng đến thu hoạch và bảo quản Trong đó, 75% tổng tiêu thụ diễn ra tại các quốc gia phát triển, trong khi nhu cầu tại các nước đang phát triển đang tăng mạnh.
Xu hướng thay thế thuốc BVTV hóa học bằng thuốc BVTV gốc sinh học7 1.3 Thuốc BVTV sinh học chiết xuất từ nguyên liệu thực vật
Việc sử dụng thuốc bảo vệ thực vật hóa học hiện nay đang gây ra nhiều vấn đề nguy hiểm, đòi hỏi thế giới phải tìm ra giải pháp hợp lý và hiệu quả hơn Cần kiểm soát chặt chẽ việc sử dụng thuốc BVTV, đồng thời khuyến khích các nhà khoa học nghiên cứu và phát triển các biện pháp canh tác mới, cũng như các thế hệ thuốc BVTV an toàn hơn để thay thế thuốc hóa học.
Trong tương lai, các thế hệ thuốc bảo vệ thực vật (BVTV) sẽ cần sở hữu những đặc tính quan trọng như: (1) hoạt tính sinh học và hiệu quả diệt trừ sâu bệnh cao hơn, đồng thời giảm thiểu tác động tiêu cực đến môi trường; (2) không có độc tính, đảm bảo an toàn cho sức khỏe; và (3) không gây ô nhiễm, thân thiện với môi trường tự nhiên.
Theo Cơ quan Bảo vệ môi trường Mỹ (US EPA), thuốc bảo vệ thực vật có nguồn gốc sinh học (Bio-pesticide) là các sản phẩm phòng trừ dịch hại được chiết xuất từ nguyên liệu tự nhiên như thực vật, động vật, vi khuẩn, vi rút, nấm và các chất chuyển hóa thứ cấp của chúng Khái niệm này cũng bao gồm các chất được tạo ra từ gene cấy vào cây trồng (cây chuyển gene - GMO) nhằm phát triển khả năng kháng lại dịch hại.
Thuốc bảo vệ thực vật sinh học (BVTVSH) sở hữu nhiều đặc tính nổi bật, cho phép chúng thay thế hiệu quả cho thuốc bảo vệ thực vật hóa học Giới khoa học toàn cầu đang tích cực nghiên cứu, phát triển và ứng dụng BVTVSH để kiểm soát và tiêu diệt các loại cỏ dại, cũng như bệnh dịch do côn trùng và nấm gây ra.
Thuốc BVTV sinh học (BVTVSH) mang lại nhiều ưu điểm vượt trội so với thuốc BVTV hóa học, bao gồm hiệu quả tiêu diệt sâu bệnh gây hại mà vẫn đảm bảo an toàn cho con người và động vật, không gây ô nhiễm môi trường và không để lại dư lượng hóa chất Ngoài ra, thuốc BVTVSH còn có tính chọn lọc cao đối với vật chủ, bảo vệ an toàn cho các loài sinh vật có lợi và thiên địch tự nhiên.
Tất cả nguyên liệu và chất hoạt hóa đều là sản phẩm tự nhiên, đảm bảo khả năng sản xuất bền vững và ổn định Công nghệ lên men và công nghệ sinh học có thể được áp dụng để cải thiện chất lượng sản phẩm Hơn nữa, hiện tượng kháng thuốc xảy ra rất hiếm.
Trên toàn cầu, hiện có hàng trăm nghìn loại thuốc bảo vệ thực vật sinh học (BVTVSH) đang được thương mại hóa và sử dụng Trong đó, Mexico, Mỹ và Canada dẫn đầu về tiêu thụ, chiếm 44% tổng lượng tiêu thụ toàn cầu Các khu vực tiếp theo lần lượt là Châu Âu (20%), Châu Á (13%), Châu Đại Dương (11%), Mỹ Latinh (9%) và Châu Phi (3%).
Từ những năm 1990, ngành công nghiệp thuốc bảo vệ thực vật sinh học tại Trung Quốc đã chứng kiến sự tăng trưởng mạnh mẽ, đạt mức trung bình từ 10% đến 20% mỗi năm Hiện nay, có hàng nghìn loại sản phẩm được đăng ký bảo hộ, sản xuất và thương mại.
Năm 2006, tổng tiêu thụ thuốc bảo vệ thực vật sinh học (BVTVSH) tại Trung Quốc đạt 145.000 tấn, trong đó thuốc Bt chiếm 2%, kháng sinh nông nghiệp 9% và thuốc trừ sâu thảo mộc 5% Dự báo trong tương lai gần, BVTVSH sẽ thay thế 20% tổng tiêu thụ thuốc bảo vệ thực vật hóa học tại Trung Quốc.
Mặc dù thuốc BVTVSH mang lại nhiều lợi ích, nhưng vẫn tồn tại một số hạn chế như thời gian phản ứng chậm, giá thành cao và nhanh bị phân hủy, điều này đã ảnh hưởng đến tiềm năng phát triển và ứng dụng của chúng Do đó, cần thiết phải tìm kiếm các giải pháp nhằm cải thiện hình thức sản phẩm và giảm giá thành sản xuất trong tương lai.
1.3 Thuốc BVTV sinh học chiết xuất từ nguyên liệu thực vật
1.3.1 Thuốc BVTV thảo mộc trừ sâu
Từ lâu, nông dân trên toàn thế giới đã sử dụng các loài thực vật có chứa chất độc để tiêu diệt côn trùng gây hại cho cây trồng và gia súc Họ thực hiện điều này bằng cách phun trực tiếp lên cây hoặc sử dụng nước chiết để tắm cho gia súc.
Trên toàn cầu, có khoảng 2000 loài cây độc, trong đó 10-12 loài được sử dụng phổ biến Tại Việt Nam, đã ghi nhận khoảng 335 loài cây độc, với gần 40 loài có khả năng trừ sâu, trong đó 10 loài có hiệu quả diệt sâu tốt.
Các hợp chất trừ sâu thảo mộc như rotenon, artemisinin, azadirachtin, và pyrethrin là những ancaloit và glucozit có trong một số loài cây Hàm lượng độc tố của chúng phụ thuộc vào loại cây, bộ phận cây, điều kiện sống và thời gian thu hái Những chất này dễ bị phân huỷ do oxy hoá, ánh sáng, độ ẩm, nhiệt độ và pH, do đó ít gây hại cho môi trường Tuy nhiên, đặc tính này cũng khiến điều kiện thu hái, bảo quản và kỹ thuật chế biến có ảnh hưởng lớn đến chất lượng sản phẩm.
Thuốc trừ sâu thảo mộc hoạt động bằng cách tiếp xúc, vị độc hoặc xông hơi để tiêu diệt côn trùng, bao gồm cả nhện hại cây Mặc dù phổ tác động không rộng, nhưng sau khi xâm nhập, thuốc nhanh chóng ảnh hưởng đến hệ thần kinh, gây tê liệt và dẫn đến cái chết của côn trùng.
Trừ nicotin, một loại thuốc độc hại gây ung thư và đã bị cấm ở nhiều quốc gia, bao gồm Việt Nam, các loại thuốc trừ sâu thảo mộc thường ít độc đối với con người, động vật máu nóng, cũng như các sinh vật có ích và động vật hoang dã Nhờ vào khả năng phân hủy nhanh chóng, thuốc trừ sâu thảo mộc không tích tụ trong cơ thể sinh vật hay môi trường, đồng thời không gây ra hiện tượng sâu kháng thuốc.
Thuốc thảo mộc rất an toàn đối với thực vật, thậm chí trong một số trường hợp chúng còn kích thích cây phát triển.
Nấm nội sinh thực vật và triển vọng tìm kiếm các hoạt chất BVTV sinh học thế hệ mới
1.4.1 Khái niệm nấm nội sinh thực vật
Nấm nội sinh thực vật (Endophytes) là vi sinh vật sống trong mô cây mà không gây hại cho cây Chúng có khả năng thúc đẩy tăng trưởng thực vật thông qua việc sản xuất phytohormone, tổng hợp siderophores, cố định đạm và hỗ trợ phytoremediation Endophytes có thể được truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác qua mô của vật chủ, hạt giống hoặc mầm thực vật Nghiên cứu đã chỉ ra rằng chúng có nhiều tác dụng như chống oxy hóa, chống tiểu đường, ức chế miễn dịch, chống huyết khối, chống viêm và hỗ trợ điều trị bệnh Alzheimer cùng nhiều bệnh khác.
Nấm nội sinh và thực vật có mối quan hệ cộng sinh, trong đó nấm nội sinh phát triển từ một số bệnh lý thực vật qua tiến hóa Sự tương tác lâu dài giữa cây chủ và vi sinh vật gây bệnh đã dẫn đến sự xuất hiện những đột biến gen, tạo ra các chủng nấm nội sinh có lợi Những nấm này đóng vai trò quan trọng trong việc cân bằng hệ vi sinh vật trên cây chủ, giúp ngăn chặn các tác nhân gây bệnh.
Nấm nội sinh đóng vai trò quan trọng trong việc tăng cường khả năng thích nghi sinh thái của thực vật chủ Nghiên cứu cho thấy, những loài cây có nấm nội sinh thường có khả năng chịu đựng khô hạn và độc tính của nhôm trong môi trường sống Ngoài việc bảo vệ cây khỏi các yếu tố bất lợi như động vật ăn cỏ và côn trùng, nấm nội sinh còn sản sinh ra nhiều hợp chất tự nhiên có khả năng ngăn chặn và tiêu diệt các mầm bệnh xâm nhập vào mô thực vật Điều này đặt ra câu hỏi liệu các hoạt chất quý giá này là do cây sản xuất hay là kết quả của mối quan hệ tương sinh giữa nấm nội sinh và cây chủ.
1.4.2 Triển vọng nghiên cứu và phát hiện các hoạt chất mới từ nấm nội sinh thực vật
Năm 1955, thế giới chỉ phát hiện 500 chất kháng sinh, nhưng đến năm 1975, con số này đã tăng lên 5.000 Hiện nay, hơn 13.000 chất kháng sinh tự nhiên đã được biết đến.
Từ những năm 1990, Taxomyces andreanae được phân lập lần đầu tiên trong quá trình phân chia tế bào, với phổ khối tương tự như paclitaxel từ cây thông đỏ (Taxus wallichiana) Nghiên cứu về khu hệ nấm nội sinh của các cây thuộc chi Thông đỏ đã phát hiện ra hoạt chất taxol, một hợp chất hiệu quả trong điều trị ung thư buồng trứng và ung thư vú, do nấm nội sinh tổng hợp Chi thông đỏ (Taxus) được xem là nguồn giàu nấm nội sinh.
Giữa năm 1995 và 1996, các nhà nghiên cứu đã phân lập hàng trăm loài nấm nội sinh từ cây thông đỏ tại Châu Âu, Châu Á và Bắc Mỹ, cho thấy cây thông đỏ là nguồn tài nguyên phong phú chứa nhiều vi sinh vật độc đáo Những nấm như Taxomyces andreanae và Pestolotiopsis microspora đã được xác định có khả năng tổng hợp taxol Thêm vào đó, các bằng chứng miễn dịch học cũng chỉ ra rằng nhiều loài nấm nội sinh khác, bao gồm các chủng của Penicillium sp., từ cây thông đỏ Taxus brevifolia cũng có khả năng tổng hợp taxol.
Năm 2000, Strobel và cộng sự đã nghiên cứu về vai trò của vi khuẩn nội sinh Streptomyces sp chủng NRRL 30562 được phân lập từ cây
Kennedia nigriscans sản xuất kháng sinh munumbicin, có khả năng kháng lại các vi khuẩn Gram dương như Bacillus anthracis và M tuberculosis đa kháng, cùng với một số vi khuẩn kháng thuốc khác Bên cạnh đó, Streptomyces sp chủng NRRL 30562, phát triển trên lá cây Grevilea pteridifolia ở Úc, sản xuất các kháng sinh kakadumicin và echinomycin, có tác dụng kháng P falciparum với LD50 từ 7-10 ng/ml.
Năm 2001, Tan và Zou đã chứng minh rằng nấm nội sinh là nguồn phong phú của chất chuyển hóa với hoạt tính sinh học đa dạng Một vật chủ có khả năng phân lập nhiều chủng nấm nội sinh khác nhau.
Năm 2003, Strobel và cộng sự đã phát hiện ra rằng chủng nấm nội sinh có khả năng sản xuất cryptocandin và cryptocin, trong đó cryptocandin có tác dụng kháng lại một số nấm gây bệnh cho người như Candida albicans và Trichophyton sp., cũng như một số nấm gây bệnh thực vật như Sclerotinia sclerotiorum và Botrytis cinerea Bên cạnh đó, cryptocin có khả năng kháng Pryriaria oryzae và một số nấm gây bệnh thực vật khác Cũng trong năm này, Taechowisan và cộng sự đã nghiên cứu các endophyte có hoạt tính kháng nấm từ rễ cây Zingiber officinale và Alpinia galanga.
Năm 2005, Raviraja đã phân lập mười tám loài nấm nội sinh từ vỏ cây, thân và lá của năm loài cây thuốc ở Tây Ghats, Ấn Độ, bao gồm các loài như Curvularia clavata, C lunata, C Pallescens và Fusarium oxysporum Nghiên cứu cho thấy nấm nội sinh xuất hiện chủ yếu trong các đoạn lá, với cây Callicarpa tomentosa chiếm ưu thế với 11 loài, trong khi cây Lobelia nicotinifolia có 5 loài.
Năm 2007, Li và cộng sự đã tìm ra nấm Acremonium (2F09P03B) từ
Huperzia serrate có khả năng sản xuất huperzine A có tác dụng là chất ức chế enzyme acetylcholinesterase, và được dùng trong điều trị bệnh Alzheimer [32].
Năm 2009, Kusari và cộng sự đã phân lập được Fusarium solani từ
Camptotheca acuminate có khả năng sản xuất camptothecin và 2 dẫn xuất (9- methoxycamptothecin và 10-hydroxycamptothecin) có khả năng chống ung thư [33].
Năm 2012, Agnes Joseph Aswathy và cộng sự đã nghiên cứu về endophyte trong cây Nghệ (Curcuma longa), phát hiện rằng các chất dinh dưỡng trong thân rễ của cây nghệ tạo ra môi trường sống phong phú cho nhiều nhóm vi khuẩn khác nhau Một số vi khuẩn nội sinh này có khả năng thúc đẩy sự tăng trưởng của cây Đặc biệt, trong rễ củ nghệ, hai chủng vi khuẩn đã được xác định có khả năng sản xuất Indole 3 acetic acid, được phân tích qua phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).
Năm 2012, Cui và cộng sự đã phát hiện nấm nội sinh Fusarium oxysporum được phân lập từ cây Ginkgo biloba, có khả năng sản xuất ginkgolid B, một hợp chất tiềm năng trong điều trị bệnh tim mạch.
Năm 2014, Lena Hammerschmidt và các đồng nghiệp từ Viện Sinh dược và Công nghệ Sinh học, Đại học Heinrich-Heine, Duesseldorf, đã phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất từ dịch chiết của nấm Acremonium strictum Gams, thu hái từ cây Đước đôi (Rhizophora apiculata Blume) tại Việt Nam Nghiên cứu đã phát hiện 5 dẫn xuất polyketide mới, bao gồm 60-hydroxypestalotiopsone C (1), acropyrone (2), bicytosporone D (3), waol acid (4), và pestalotiopene C (5), cùng với 7 hợp chất đã biết (6-12) Trong số đó, các hợp chất 6, 7 và 9 cho thấy hoạt tính gây độc tế bào trung bình đối với hai dòng tế bào ung thư biểu mô buồng trứng nhạy cảm và kháng cisplatin, trong khi chất 9 còn thể hiện hoạt tính kháng khuẩn.
Staphylococcus aureusvới giỏ trị MIC 14,3 àM [25].
Có thể liệt kê các hoạt tính sinh dược từ sản phẩm thứ cấp khi lên men nấm nội sinh:
Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng nấm nội sinh từ cây ngập mặn có khả năng tổng hợp các chất độc, tiêu diệt tế bào ung thư Cụ thể, cyclic depsipeptides bionectriamides A-C được chiết xuất từ chủng Bionectria ochroleuca, được tìm thấy ở cây Bần chua (Sonneratia caseolaris) tại Hải Nam, Trung Quốc, cho thấy tiềm năng trong việc chống lại ung thư.
Các hợp chất mới từ nấm nội sinh có khả năng tiêu diệt vi sinh vật, đặc biệt là các vi khuẩn gây bệnh kháng thuốc Nghiên cứu đã chỉ ra rằng nhiều hợp chất từ nấm nội sinh có thể tiêu diệt một loạt các loài vi khuẩn gây hại Một ví dụ điển hình là Fusarium incarnatum, được phân lập từ cây Cúc tần (Pluchea indica) tại đảo Hải Nam, Trung Quốc, có khả năng sinh ra equisetin.
Giới thiệu về loài Ngâu ta (Aglaia duperreana Pierre), Gội ổi (Aglaia
oligophylla Miq.), Trầu không ( Piper betle L.) và Nghệ vàng ( Curcuma longa L.)
Cây Ngâu ta (Aglaia duperreana Pierre):
Cây Ngâu ta là một loại cây nhỡ cao từ 4-7m, với lá kép lông chim lẻ Hoa của cây mọc thành chùm ở kẽ lá, có màu vàng nhỏ và tỏa hương thơm Quả của cây có hình dạng hạch màu đỏ, trong đó chứa hạt có áo hạt.
Cây ngâu được trồng phổ biến để làm cảnh và lấy hoa ướp chè Ngoài việc tạo hương thơm cho trà, hoa và lá của cây còn có tác dụng chữa trị sốt, vàng da và hen suyễn Lá tươi cũng được sử dụng để nấu tắm ghẻ.
Cây Gội ổi (Aglaia oligophylla Miq.):
Cây Gội ổi là một loại cây gỗ lớn, có chiều cao từ 20 đến 25 mét Lá của cây là lá kép lông chim lẻ, trong khi hoa có đường kính khoảng 2mm Quả của cây có hình dạng gần giống cầu, có màu nâu hoặc vàng, được chia thành 2 ô, mỗi ô chứa một hạt có áo hạt màu trắng hoặc nâu.
Phân bố: Loài phân bố ở Việt Nam, Thái Lan, Malaixia, Inđônêxia và
Philippin Ở Việt Nam có gặp tại Đồng Nai, An Giang và Kiên Giang.
Công dụng: Gỗ được sử dụng trong xây dựng và đóng đồ đạc thông thường.
Cây Trầu không (Piper betleL.)họ Hồ tiêu (Piperaceae):
Cây Trầu không là một loại cây nhỡ leo, có bề mặt nhẵn Lá cây có cuống và bẹ, với phiến lá hình trái xoan đặc trưng Hoa của cây mọc thành bông và không nằm ở gốc Quả của cây là loại quả mọng, lồi, tròn và có lông mềm ở đỉnh.
Cây gốc ở Malaixia được trồng phổ biến để thu hoạch lá ăn trầu Lá có thể được thu hái quanh năm, sử dụng tươi, phơi khô hoặc xay thành bột để bảo quản và sử dụng dần.
Trầu không có vị cay nồng và mùi thơm hắc, tính ấm, giúp trung hành khí, khư phong tán hàn, tiêu thũng chỉ thống, hoá đàm và chống ngứa Ngoài ra, trầu không còn được coi là thuốc làm săn da, chất kích thích, lợi nước bọt, và có tác dụng dự phòng bệnh lỵ và sốt rét.
Cây Nghệ vàng (Curcuma longa L.) là một loại cây có chiều cao khoảng 70 cm, với thân rễ hình trụ hoặc bầu dục, phân nhánh và có màu vàng tươi Lá của cây là lá đơn, mọc từ thân rễ, trong khi bẹ lá hình lòng máng, dài từ 18-28 cm, ôm sát vào nhau tạo thành một thân khí sinh giả có màu xanh.
Hình 1.5.4 Cây Nghệ vàng (nguồn internet) Phân bố: Gốc ở Ấn Độ, được trồng phổ biến tại Việt Nam, lấy thân rễ làm gia vị và làm thuốc.
Nghệ, với vị đắng, cay và mùi thơm hắc, có tác dụng hành khí, phá ứ và thông kinh chỉ thống Curcumin trong nghệ giúp tiêu mủ, thúc đẩy sự hình thành da non, tăng cường bài tiết mật từ gan và giảm cholesterol trong máu Ngoài ra, tinh dầu nghệ còn có khả năng diệt nấm ngoài da và kháng khuẩn hiệu quả.
1.5.2 Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học
1.5.2.1 Cây Ngâu ta (Aglaia duperreana Pierre)
Năm 2007, Bo-Jun Xie và cộng sự đã phân lập được 5 hợp chất: agladupol A–E (đánh số từ1–5trong hình dưới đây) [39].
Năm 2012, nghiên cứu của Heng Zhang và cộng sự chỉ ra rằng dịch chiết methanol từ cành lá Aglaia duperreana có khả năng tiêu diệt ốc bươu vàng Pomacea canaliculata với giá trị LC50 là 33.4 μg/mL Trong đó, cặn chiết ethyl acetate thể hiện hoạt tính cao nhất với LC50 53.6 μg/mL Tiến hành nghiên cứu sâu hơn về thành phần hóa học của cặn chiết, nhóm tác giả đã phân lập và xác định cấu trúc của 16 hợp chất, bao gồm (20R)-3β-hydroxy-lup-28,29-dioic acid, betulinic acid, 24(R),25-dihydroxydammar-20-en-3-one, ursolic acid, obtusilin, (24R)-cycloartane-3α,24,25-triol, cabraleone, ocotillone, shoreic acid, 3-hydroxy-4',5,7-trimethoxyflavone, và 2,3-dihydro-5-hydroxy-4',7-dimethoxyflavone.
Naringenin trimethyl ether exhibits significant activity with an LC50 value of 3.9 μg/mL, surpassing the control saponin found in green tea, which has an LC50 of 4.5 μg/mL Other compounds discussed include (2R,3R)-(+)-4',5,7-trimethoxydihydroflavonol, (+)-eudesmin, (+)-odorine, and (+)-odorinol.
1.5.2.2 Cây Gội ổi (Aglaia oligophylla)
Năm 2003, Gerhard Bringmann và cộng sự đã phân lập được 4 hợp chất: rocaglamide (số 22), 6-demethoxy-6,7-methylendioxyrocaglamide (số
(số 24) và cyclorocaglamide (số 25) Trong đó hợp chất 3 có tác dụng ức chế ấu trùng bướm đêmSpodoptera littoralisvới giá trị LC50bằng 2,5 ppm [41]
Năm 2006, Nantiya Joycharat và cộng sự đã phân lập, xác định cấu trúc của 10 hợp chất từ láAglaia oligophylla gồm dipterocarpol (số26), ocotillone
(số 27), cabraleone (số 28), ocotillol (số 29), 20(S),24(S)-dihydroxydammar-
25-en-3-one (số 30), rocaglaol (số 31), odorine (số 32), 20-epi-odorine (số
33), 20S,25-epoxy-24R-hydroxy-3-dammaranone (số 34), 20S,25-epoxy-24R- hydroxydammarane-3α-ol (số35) [42].
In 2016, Yunie Y and colleagues isolated and identified the chemical structures of four compounds from the Aglaia oligophylla species, which include two steroid compounds: stigmasterol and β-sitosterol, as well as two triterpenoid compounds: oligophyllic acid and foveolin B.
Ngoài tác dụng dược lý như thuốc trừ sâu, chống viêm và chống ung thư, dịch chiết ethyl acetate từ thân cây cho thấy khả năng giảm mạnh nhất trong xét nghiệm CUPRAC với giá trị 1543 mg đương lượng Trolox/g, trong khi dịch chiết methanol đạt giá trị 1059 mg đương lượng Trolox/g, cho thấy khả năng chống oxy hóa đáng kể.
1.5.2.3 Cây Trầu không (Piper betle L.)
Năm 2013, nghiên cứu của D Pradhan và cộng sự chỉ ra rằng cây Trầu không (Piper betle L.) có thành phần hóa học phong phú và đa dạng, với nhiều hoạt tính sinh học quan trọng Trong số đó, một số hợp chất terpenoid đã được xác định.
Key phenolic derivatives identified in betel leaves include 8-cineole, cadinene, camphene, caryophyllene, limonene, pinene, chavibetol, ally pyrocatechol, carvacrol, safrole, chavibetol acetate, eugenol, and piperitol Notably, eugenol exhibits strong antifungal activity.
Flavonoid compounds such as quercetin and luteolin, along with alkaloids like cepharadione A, aristololactame (A-II), and cepharadione, are notable for their potential health benefits Additionally, ursonic acid is another significant compound worth mentioning.
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Mẫu thực vật
Vào tháng 12 năm 2012, vỏ cây Ngâu ta được thu thập tại Vườn quốc gia Cúc Phương, Ninh Bình, và được xác định bởi chuyên gia thực vật Nguyễn Kim Đào thuộc Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Cây này có tên khoa học là Aglaia duperreana Pierre, thuộc họ Xoan (Meliaceae), với mẫu tiêu bản AD1212 được lưu giữ tại Phòng Sinh dược, Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Vào tháng 12 năm 2012, lá cây Gội ổi thu được tại Vườn quốc gia Cúc Phương (Ninh Bình) đã được chuyên gia thực vật Nguyễn Kim Đào, thuộc Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, xác định với tên khoa học là Aglaia oligophylla Miq., thuộc họ Xoan (Meliaceae) Mẫu tiêu bản AO1212 hiện đang lưu giữ tại Phòng Sinh dược, Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Vào tháng 12 năm 2012, lá cây Trầu không được thu thập tại Trạm đa dạng sinh học Mê Linh, Vĩnh Phúc Chuyên gia thực vật Nguyễn Kim Đào từ Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật đã xác định cây có tên khoa học là Piper betle L., thuộc họ Hồ tiêu (Piperaceae), với số tiêu bản PB1212 được lưu trữ tại Phòng Sinh dược, Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Vào tháng 12 năm 2012, củ rễ cây Nghệ vàng (Curcuma longa L.) thuộc họ Gừng (Zingiberaceae) đã được thu thập tại Trạm đa dạng sinh học Mê Linh, Vĩnh Phúc Việc xác định tên khoa học được thực hiện bởi chuyên gia thực vật Nguyễn Kim Đào từ Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, với mẫu tiêu bản CL1212 được lưu trữ tại Phòng Sinh dược, Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Phương pháp thu hái mẫu thực vật, lưu tiêu bản mẫu, xác định tên khoa học, lập hồ sơ lưu trữ
Để chuẩn bị cho quá trình thu thập mẫu, bạn cần một số dụng cụ thiết yếu như túi lưới, báo cũ, dây buộc, túi nilon nhỏ, eteket, bút viết kính, khung gỗ ép mẫu, dao cắt chặt mẫu, dao kéo cắt dây và cành mẫu nhỏ, rổ nhựa, cùng với máy ảnh để ghi lại hình ảnh.
Trong quá trình thu hái thực vật ngoài thực địa, cần lấy mẫu từ các bộ phận như lá, vỏ, rễ và củ với số lượng từ 0,5 đến 1 kg Các mẫu thực vật thu được cần được mô tả sơ bộ, bao gồm tên cây, màu sắc, hoa và quả Tại địa điểm thu hái, nên tiến hành thu thập sơ bộ các bộ phận khác nhau của cây để tạo thành một bộ mẫu hoàn chỉnh.
Mỗi túi lưới chứa một eteket đánh mã số loài, với mẫu thực vật được ghi mã số và chụp ảnh để lưu trữ Ảnh chụp cần thể hiện rõ các đặc điểm nhận dạng của loài như dạng thân cành, cách mọc lá, và đặc điểm hoa quả Để xác định chính xác danh tính, cần tách riêng một mẫu tiêu bản gồm một lượng nhỏ tất cả các bộ phận của loài thực vật đã thu hái Các mẫu tiêu bản này được gắn eteket đánh mã số tương ứng và cho vào cùng một túi lưới.
Sau khi thu hái, mẫu thực vật cần được xử lý cẩn thận bằng cách tách riêng hoặc gộp chung tùy thuộc vào khối lượng Cành và thân được chặt nhỏ với kích thước 5 – 10 mm và sau đó được ép bằng khung ép mẫu và giấy báo để ngăn cách các mẫu tiêu bản Các lớp báo không chỉ giúp ngăn cách mà còn hút ẩm, tránh thối hỏng mẫu Chuyên gia thực vật sẽ dựa vào mẫu tiêu bản và các đặc điểm đã ghi chép ngoài thực địa để xác định tên khoa học Sau khi băm nhỏ và làm khô sơ bộ, mẫu sẽ được cho vào rổ nhựa có ký hiệu, sắp xếp gọn gàng, sấy khô và chuyển vào kho chứa mẫu thực vật.
Phương pháp xử lý và chiết mẫu thực vật
Các mẫu thực vật đều được xử lý chung như sau: Mẫu được ngâm chiết
Trong nghiên cứu, metanol được xử lý ba lần trong thiết bị siêu âm ở nhiệt độ phòng Dịch tổng thu được được cất kiệt dung môi dưới áp suất giảm và nhiệt độ dưới 50 độ C, tạo ra cặn cô metanol Cặn này sau đó được thêm nước và chiết xuất lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexan, diclometan và etyl axetat Kết quả cuối cùng là thu được cặn tương ứng từ n-hexan, diclometan, etyl axetat và metanol.
Phương pháp chiết sinh khối nấm nội sinh thực vật
Các mẫu nấm nội sinh thực vật được xử lý bằng cách nuôi cấy nấm đã được phân lập trong môi trường gạo trong 35 ngày cho đến khi sợi nấm phát triển kín Sau đó, nấm được diệt khuẩn bằng tia UV và ngâm chiết trong dung môi hữu cơ Quá trình chắt lọc dung môi ngâm chiết diễn ra sau 12 giờ và được thực hiện ba lần, sau đó cô quay để thu được cặn chiết Cặn chiết này được chiết phân lớp bằng các dung môi có độ phân cực tăng dần, bao gồm n-hexan, diclometan, etyl axetat, methanol và nước, từ đó thu được cặn dịch tương ứng với các dung môi.
Phương pháp định danh bằng PCR giải trình tự gene vùng ITS
Tách chiết ADN tổng số: phương pháp sử dụng CTAB của J Doyle và
Phản ứng PCR được thực hiện trong thể tích 20 μl, bao gồm 2 mM MgCl2, 0,25 mM mỗi loại dNTP, 1U Taq DNA polymerase (Thermo Scientific), 0,2 μM mồi, khoảng 30 ng khuôn mẫu ADN và nước cất.
Chương trình chạy PCR bao gồm chu trình nhiệt với các bước: 94°C trong 5 phút, sau đó thực hiện 35 chu kỳ với nhiệt độ 94°C trong 1 phút, 59°C trong 45 giây, và 72°C trong 50 giây, kết thúc ở 72°C trong 5 phút Sau khi hoàn tất, sản phẩm PCR được thêm 4 μl thuốc nhuộm và tiến hành điện di.
Phương pháp thôi gel theo kit Qiagen:
- Cắt lấy đoạn ADN mong muốn từ gel agarose, cho đoạn gel vừa cắt vào ống eppendorf 2 ml Bổ sung buffer QG theo tỷ lệ 3:1.
- Ủ ở nhiệt độ 50°C trong khoảng 10 phút cho đến khi gel tan hoàn toàn.
- Cho dung dịch mẫu đã hoà tan ở trên vào cột QIAquick và ly tâm với tốc độ 13.000 vòng/phút trong 1 phút.
- Bổ sung 500 μl buffer QG vào cột QIAquick và ly tâm với tốc độ 13.000 vòng/phút trong 1 phút để loại hết agarose dư thừa.
- Bổ sung 750 μl buffer PE vào cột QIAquick, để cột thẳng đứng 5 phút sau đó ly tâm với tốc độ 13.000 vòng/phút trong 1 phút.
- Chuyển cột QIAquick sang ống microcentrifuge 1,5 ml sạch.
- Để hòa tan ADN, bổ sung 30 μl nước (pH = 7-8,5) vào giữa màng của cột QIAquick và ly tâm với tốc độ 13.000 vòng/phút trong 1 phút, thu lượng ADN tinh sạch.
Sản phẩm PCR vùng ITS sau khi được tinh sạch sẽ được giải trình tự tại Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội Kết quả giải trình tự sẽ được so sánh với các trình tự tương đồng trên NCBI Các trình tự này sẽ được tập hợp và phân tích bằng phần mềm MEGA v6.0 và CLC v8.02 để tạo ra cây phát sinh loài.
Kết quả phân tích sản phẩm khuếch đại cho thấy, sau khi thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi ITS1/ITS4, sản phẩm đạt được có kích thước khoảng 750 bp và được điện di trên gel agarose 1,5% Sau đó, chúng tôi tiến hành thôi gel bằng cách sử dụng cột.
Phương pháp phân lập các hợp chất từ mẫu nghiên cứu
Phân tích và tách các phần dịch chiết của mẫu nghiên cứu được thực hiện bằng nhiều phương pháp sắc ký khác nhau, bao gồm sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký lớp mỏng điều chế (PTLC), sắc ký cột thường (CC) sử dụng pha tĩnh là silica gel (Merck), sắc ký cột pha đảo với pha tĩnh YMC RP 18 (Merck), và sắc ký ray phân tử với pha tĩnh sephadex LH-20 (Merck).
2.2.1 Sắc ký lớp mỏng (TLC)
Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 và RP-18 F254S với độ dày 0,25 mm từ Merck Phương pháp phát hiện chất sử dụng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm Các hợp chất có thể được phát hiện qua đèn tử ngoại hoặc bằng cách phun thuốc thử anisaldehyde và nung nóng.
Công thức: Anisaldehyde/H2SO4 (DAB 10)
Các thành phần được trộn lẫn, sau đó thêm 5 ml axit sulfuric đặc Hỗn hợp được để nguội từ từ và bảo quản trong chai thủy tinh màu, lưu trữ trong tủ lạnh để sử dụng.
Sắc ký cột thường, với pha tĩnh là silica gel 60, cỡ hạt 0,040 - 0,063 mm (230 - 400 mesh) của Merck, dung môi rửa giải chủ yếu là loại phân tích, công nghiệp.
Sắc ký cột ray phân tử với pha tĩnh là sephadex LH-20.
Sắc ký cột pha đảo sử dụng loại YMC RP-18 có cỡ hạt là 30-50 μm(Fujisilica Chemical Ltd.).
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC-Preparative) sử dụng các cột điều chế có kích thước 125 x 4 mm, i.d nhồi sẵn với eurospher C-18 (Knauer, Berlin, Germany) hoặc Dynmax (250 x 21.4 mm, L.ID) Lượng mẫu cần đưa lên cột phụ thuộc vào kích thước cột; đối với cột nhỏ, 3 mg mẫu được hòa tan trong 1ml dung môi và bơm lên cột theo chương trình định trước, trong khi với cột lớn, lượng mẫu có thể lớn hơn.
Nồng độ 20 mg thường được sử dụng trong các hệ dung môi, bao gồm hỗn hợp methanol hoặc acetonitrile với nước siêu lọc (nanopure), có thể có hoặc không có đệm 0,1% TFA, với tỉ lệ dòng là 5 ml/phút Các hợp chất được phát hiện thông qua máy dò UV-VIS diode array.
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một kỹ thuật phân tích quan trọng, sử dụng bơm áp suất cao để đẩy dung môi pha động qua cột sắc ký nhằm đạt hiệu suất phân tách tối ưu Kỹ thuật này giúp nhận dạng các peak từ dịch chiết hoặc các phân đoạn, với các thành phần trong hỗn hợp được đưa qua cột với tốc độ dòng khác nhau, phụ thuộc vào sự phân bố giữa dung môi pha động và pha tĩnh Hệ dung môi thường sử dụng là gradient MeOH: Nước (nanopure), kết hợp với đệm pH=2 từ acid phosphoric, với sự gia tăng dần của MeOH lên 100% trong một khoảng thời gian nhất định.
45 phút Các hợp chất được phát hiện bằng UV-VIS diode array detector.
2.2.3 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học
Phương pháp xác định cấu trúc hóa học các hợp chất hiện nay sử dụng thiết bị hiện đại Một trong những thiết bị quan trọng là máy Kofler micro-hotstage, được sử dụng để đo điểm nóng chảy (mp) tại Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Phổ khối lượng (MS) được thực hiện thông qua phương pháp phun mù điện tử (ESI-MS) trên máy Agilent 1200 TRAP Đối với phổ khối lượng phân giải cao (HR-ESI-MS), quá trình đo được tiến hành trên máy FT-ICR-Mass spectrophotometer tại Viện Hóa học thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Phổ cộng hưởng từ nhân (NMR) được thực hiện trên máy Bruckker avance 500 MHz với chất chuẩn nội là TMS tại Viện Hoá học thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Các kỹ thuật NMR tiên tiến đã được áp dụng để phân tích và nghiên cứu.
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều: 1 H-NMR, 13 C-NMR và DEPT. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều: HSQC, HMBC, COSY và NOESY.
Các dung môi được sử dụng trong nghiên cứu bao gồm DMSO-d6, CD3OD và CDCl3 Việc lựa chọn dung môi phù hợp phụ thuộc vào đặc tính của từng mẫu, đảm bảo rằng dung môi phải hòa tan hoàn toàn mẫu đo.
Các phương pháp thử sàng lọc hoạt tính trừ sâu và nấm bệnh của dịch chiết, phân đoạn và chất sạch trong phòng thí nghiệm
2.3.1 Phương pháp thử sàng lọc hoạt tính trừ sâu của dịch chiết, phân đoạn và chất sạch trong phòng thí nghiệm[24]
Dụng cụ và vật liệu thí nghiệm bao gồm dịch chiết từ các mẫu cần thử, lá thầu dầu sâu khoang (Spodoptera litura), đĩa petri và các dụng cụ hỗ trợ khác như đũa gỗ, pipetman và bông.
Cân 10 mg dịch chiết cho vào lọ penecillin, sau đó cho vào mỗi ống
Để thực hiện thí nghiệm, sử dụng 10 ml cồn hoặc aceton và chạy siêu âm trong 10 phút để đảm bảo dịch chiết tan hoàn toàn Trước khi tiến hành thí nghiệm, kiểm tra độ tan của các chất bằng mắt thường Đối với chất sạch, cân 5 mg và hòa tan trong 5 ml cồn hoặc aceton.
Lá thầu dầu được thu hái về đem rửa sạch, lau khô, bỏ cuống gân Cắt thành hình tròn đường kính 6 cm Mỗi đĩa petri cần 2 lá.
Sâu khoang: thí nghiệm được thử bằng sâu khoang ở độ tuổi 1,5-2 tuổi, chọn mỗi đĩa 10 con sâu đồng đều lứa tuổi để đưa vào thí nghiệm.
Sử dụng pipetman để hút lượng chất đã định lượng, sau đó phun đều lên cả hai mặt lá thầu dầu Để cồn hoặc axeton bay hơi hoàn toàn, hong khô tự nhiên rồi đặt lá vào đĩa petri có giấy thấm Tiếp theo, dùng đũa gỗ để thả 10 con sâu vào mỗi đĩa thí nghiệm và cho 0,5 ml nước cất thấm vào bông và giấy thấm nhằm tạo độ ẩm cần thiết.
Sau 24h kiểm tra số sâu sống.
Sau 48h kiểm tra số sâu và thay lá mới không phun thuốc.
Sau 72h cân xác định khối lượng sâu sống sót.
Phương pháp tính toán và xử lý số liệu theo công thức Abbott:
Tỷ lệ sâu sống được tính theo công thức:
Tỷ lệ sâu chết tính theo công thức:
Tỷ lệ sâu tăng trưởng tính theo công thức:
Hoạt lực trừ sâu tính theo công thức:
Ca: Số sâu sống của mẫu đối chứng
Ta: Số sâu sống của mẫu thí nghiệm
2.3.2 Phương pháp thử sàng lọc hoạt tính trừ nấm của dịch chiết, phân đoạn chiết, chất sạch trong phòng thí nghiệm[24]
Chủng nấm Botrytis cinerea gây bệnh thối xám đã được phân lập và làm sạch trên môi trường Malt extract với thành phần bao gồm 17 g Malt extract, 17 g Agar, 0,2 g Getamicin và 1 l H2O Để tiến hành thí nghiệm, cần sử dụng dịch chiết thực vật, kháng sinh Nystatin, cùng với các dụng cụ như bình tam giác, giấy bạc, đĩa petri, box cấy, que cấy, đũa thủy tinh, đèn cồn, nồi hấp khử trùng, cồn 70% và bình xịt cồn.
Cân 10mg dịch chiết tổng, 7,5mg phân đoạn dịch chiết, hoặc 5mg chất sạch vào ống eppendorf đã khử trùng, sau đó thêm 2 ml cồn (có thể bổ sung metanol hoặc axeton để tăng khả năng hòa tan) Siêu âm mẫu trong 20 phút để đảm bảo dịch chiết hòa tan hoàn toàn vào dung môi Cuối cùng, khử trùng mẫu dịch chiết bằng tia UV trong hộp cấy.
Mẫu đối chứng dương được thay dịch chiết thực vật bằng kháng sinh Nystatin với nồng độ 200 ppm Mẫu đối chứng âm chỉ chứa môi trường thạch, trong khi mẫu đối chứng dung môi là sự kết hợp của 2 ml cồn với 10 ml thạch.
Môi trường được khử trùng và làm nguội ở nhiệt độ 50 - 60 độ C trước khi được đổ đều vào các đĩa petri Đồng thời, dịch chiết cũng được thêm vào các đĩa thạch đã được đổ Sau đó, sử dụng đĩa thủy tinh để khuấy đều dịch chiết vào môi trường thạch và để nguội Mỗi đĩa thạch chứa khoảng 10 ml, với tổng nồng độ dịch chiết là 1000 ppm, trong đó phân đoạn dịch chiết đạt 750 ppm và chất sạch là 500 ppm.
Chủng nấm Botrytis cinerea được làm sạch và sử dụng làm nguyên liệu Sau đó, sử dụng que cấy có đường kính 4mm để cấy chấm điểm vào trung tâm đĩa thạch đã đổ dịch chiết Nấm được nuôi ở nhiệt độ 25 độ C trong vòng 5 đến 6 ngày.
Khi nấm đối chứng âm đã phát triển đầy đủ trên đĩa thạch, thí nghiệm sẽ được kết thúc và chúng ta sẽ tiến hành đo đường kính tản nấm ở các mẫu thí nghiệm Đánh giá khả năng ức chế sẽ được thực hiện theo công thức đã định.
KNƯC %: Khả năng ức chế của dịch chiết với nấm T: Đường kính tản nấm ở công thức thí nghiệm C: Đường kính tản nấm ở công thức đối chứng (âm)
2.4 Phương pháp phân lập và sinh khối nấm nội sinh từ thực vật [24]
Bước 1: Chuẩn bị môi trường nuôi cấy và dụng cụ thí nghiệm
Môi trường nuôi cấy bao gồm 15 g agar, 15 g malt extract, 0,2 g chloramphenicol và 1 l nước cất Sau khi chuẩn bị, môi trường được khử trùng ở 121 ᴼC trong 20 phút Sau khi khử trùng, môi trường được lấy ra và đặt vào tủ cấy đã được lau sạch bằng cồn, sau đó bật đèn để chuẩn bị cho quá trình nuôi cấy.
UV 15 phút Môi trường nguội đến 50 ᴼC - 60 ᴼC xoay nhẹ cho nó phân tán đều, rót ra đĩa petri.
Bước 2: Chuẩn bị mẫu thực vật tươi trước khi cấy mẫu
Mẫu thực vật cần được thu thập toàn bộ thân, lá, củ và rễ, sau đó rửa sạch dưới vòi nước Nếu mẫu được lấy ở xa, nên bảo quản trong thùng đá Tiếp theo, xịt cồn lên toàn bộ mẫu và tách riêng các bộ phận: lá, thân, củ, rễ Để khử trùng, cắt mẫu thành từng phần nhỏ và ngâm trong cốc cồn 70% khoảng 2 phút Sau đó, chuyển mẫu sang cốc nước thanh trùng và để trên giấy thấm để loại bỏ dung môi và nước, cuối cùng đặt mẫu lên đĩa petri đã được thanh trùng.
Bước 3: Phân lập nấm từ mẫu thực vật và theo dõi thí nghiệm
Để kiểm tra độ sạch của mẫu thực vật dùng để phân lập nấm, cần quệt hoặc lăn mẫu đã khử trùng lên bề mặt thạch đối chứng Sử dụng panh và dao sắc để cắt nhỏ và cắt lát các mẫu nghệ, sau đó đặt các mẫu đã cắt lên bề mặt đĩa thạch, mỗi đĩa chứa khoảng 4 - 5 mẫu Các mẫu đối chứng và mẫu thí nghiệm phải được bọc kín bằng paraffin và nuôi trong điều kiện 22 độ C.
Sau 48 giờ ở nhiệt độ 25 độ C, có thể kiểm tra mẫu thí nghiệm Nếu mẫu đối chứng không có dấu hiệu nào cho thấy sự phát triển của nấm, điều này chứng tỏ quá trình khử trùng đã thành công Ngược lại, nếu mẫu đối chứng xuất hiện nấm, điều này cho thấy khử trùng chưa đạt yêu cầu và cần tiến hành lại thí nghiệm với mẫu đó.
Bước 4: Cấy chuyển – làm sạch các chủng nấm đã mọc
Khi phát hiện sợi nấm trên đĩa thạch, cần tiến hành cấy chuyển ngay để tránh sự phát triển lẫn nhau giữa các chủng nấm Sử dụng que cấy đầu tròn nhẹ nhàng gạt qua các sợi nấm và cấy sang đĩa thạch mới theo hình cửa xếp Tiến hành cấy chuyển nhiều lần cho đến khi chủng nấm được làm sạch, sau đó xác định tên họ và mức độ nguy hiểm của chúng trước khi sản xuất sinh khối lớn.
Nấm được sinh khối trong môi trường gạo Cân 200 g gạo cho vào bình
Để chuẩn bị mẫu nấm sinh khối, đầu tiên, bạn cần đun sôi 1 lít nước cất và khử trùng trong 1 giờ Sau khi khử trùng, để nước nguội trong tủ cấy và tiến hành khử trùng bằng tia UV Mẫu nấm được chọn sẽ được cắt thành từng miếng nhỏ và cho vào bình gạo đã nguội Cuối cùng, để mẫu sinh khối phát triển trong khoảng 5 - 6 tuần ở nhiệt độ thích hợp cho đến khi nấm mọc kín bình gạo.
Xử lý sơ bộ mẫu Khử trùng mẫu Tiến hành phân lập
Mẫu đối chứng Nấm mọc lên từ một mẫu thực vật
Một nấm sạch đã phân lập được
Sinh khối nấm Ngâm chiết dung môi Thu dịch chiết mẫu nấm NSTV
Hình 2.1 Các bước phân lập và sinh khối nấm nội sinh từ mẫu thực vật
Phương pháp phân lập và nuôi cấy nấm nội sinh từ thực vật
3.1.1 Phân lập nấm nội sinh cây nghệ vàng (Curcuma longa L.)
Bốn chủng nấm nội sinh gồm Fusarium solani, Fusarium sp., Trichoderma atroviride đã được phân lập từ mẫu rễ và củ nghệ vàng thông qua nghiên cứu hình thái bào tử nấm và phương pháp PCR giải trình tự vùng ITS.
Fusarium oxysporum, được ký hiệu là Ng1, Ng2, C2 và B1, là một chủng nấm nội sinh được phân loại và định danh thông qua sự hợp tác với nhóm nghiên cứu của PGS TS Dương Văn Hợp tại Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học (IMBT), thuộc Đại học Quốc gia Hà Nội.
Nguồn gốc phân lập: củ nghệ Đặc điểm sinh trưởng, phát triển: Sợi nấm khí sinh phát triển và có màu trắng Có sinh bào tử.
Khuẩn lạc: phát triển nhanh, kích thước đạt 60-80 mm sau 7 ngày trên môi trường PDA, sợi nấm không màu, khuẩn lạc màu trắng, dạng nhung Mặt trái không màu.
Hình 3.1 Khuẩn lạc và cuống sinh bào tử của chủng Fusarium solani
Cơ quan sinh sản của sinh vật này có cuống sinh bào tử đơn độc hoặc phân nhánh, với phần đỉnh tạo ra nhiều bào tử dạng thể bình Có hai loại bào tử trần: bào tử lớn hình quả chuối hoặc hình chiếc thuyền, kích thước 20-25 x 4,5-7 µm, và bào tử nhỏ hình hạt đậu hoặc hình quả thận, kích thước 3-5 x 7-10 µm Ngoài ra, còn có bào tử nghỉ dạng chlamydospore.