NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ PHÂN TỬ MỘT SỐ TAXON THUỘC CHI SÂM (PANAX L.) Ở VÙNG TÂY NGHỆ AN LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Hơn nữa, các loài Sâm đều sinh trưởng tốt tại vườn ươm này, vì vậy đây có thể là mô hình bảo tồn chuyển vị cho các loài thuộc chi Sâm ở Tây Nghệ An Nhằm cung cấp những dẫn liệu và cơ sở

VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-

Học viên: Nguyễn Thị Hiên

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ PHÂN TỬ

MỘT SỐ TAXON THUỘC CHI SÂM (PANAX L.)

Ở VÙNG TÂY NGHỆ AN

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Hà Nội, 2020

VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-

Học viên: Nguyễn Thị Hiên

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ PHÂN TỬ

MỘT SỐ TAXON THUỘC CHI SÂM (PANAX L.) Ở

Hà Nội 2020

Tôi xin cam đoan các số liệu và kết quả trong luận văn này là trung thực và chƣa đƣợc tác giả khác công bố trong bất kỳ công trình nào Tất cả các nguồn thông tin trích dẫn trong luận văn đã đƣợc liệt kê trong tài liệu tham khảo Nếu có gì sai sót tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm./

Hà Nội, ngày tháng năm 2020

Tác giả

Nguyễn Thị Hiên

Khoa Sinh thái và Tài nguyên sinh vật đã giảng dạy và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu

Đặc biệt, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến thầy hướng dẫn số 1 - PGS.TS Phan Kế Long – người trực tiếp hướng dẫn khoa học, cùng cô giáo hướng dẫn số 2 – TS Nguyễn Thị Thanh Hương đã luôn dành nhiều thời gian, công sức, tâm huyết và lòng nhiệt tình hướng dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện nghiên cứu và hoàn thành luận văn

Tôi xin trân trọng cảm ơn Quỹ học bổng Nagao tại Việt Nam, Nhiệm

vụ Điều tra cơ bản mã số UQĐTCB.01/18-19 và Đề tài TN 17-/C04, thuộc Chương trình Tây Nguyên 2016-2020 đã hỗ trợ về kinh phí giúp tôi hoàn thiện đề tài khoa học của mình

Tôi xin trân trọng cám ơn Ban giám hiệu trường THPT Ngô Sĩ Liên –thành phố Bắc Giang, tỉnh Bắc Giang, các thầy cô giáo trong tổ bộ môn Hóa – Sinh cùng toàn thể các thầy cô giáo công tác trong trường đã tạo điều kiện hết mức về thời gian cũng như công việc ở trường giúp tôi thoàn thành quá trình học tập và nghiên cứu của mình

Cuối cùng tôi xin trân trọng cảm ơn gia đình, bạn bè luôn là điểm tựa vững chắc về vật chất, tinh thần, luôn cổ vũ động viên tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Một lần nữa tôi xin chân thành cám ơn!

Hà nội, ngày tháng năm 2020

Tác giả

Nguyễn Thị Hiên

CR : Cực kì nguy cấp

DNA : Deoxyribonucleic acid

EW : Tuyệt chủng ngoài tự nhiên

ITS : Internal transcribed spacer

IUCN : International Union for Conservation of Nature and Natural Resources

PCR : Polymerase Chain Reaction

RAMS : Random amplified microsatellite

RAPD : Randomly Amplified Polymosphic DNA

rbcL : Ribulose bisphosphate carboxylase large chain

RFLP : Restriction Fragment Length Polymorphism

SCN : Sau công nguyên

SSR : Simple Sequence Repeats

TCN : Trước công nguyên

UPGMA : Unweighted pair group method with arithmetic mean

Bảng 2.1 Trình tự cặp mồi nhân bản vùng ITS-rDNA bằng kỹ thuật PCR với

cặp mồi theo Phan Kế Long và cs (2014) 16 Bảng 2.2 Các thành phần phản ứng PCR 20 Bảng 2.3 Danh sách trình tự sử dụng trong nghiên cứu thu thập trên Genbank

23

Bảng 3.1 So sánh đặc điểm hình thái giữa Tam thất hoang (P stipuleanatus)

và Sâm vũ diệp (P bipinnatifidus) (Nguyễn Tập, 2007) 38

Bảng 3.2 Thành phần nucleotide (%) của các mẫu nghiên cứu 46 Bảng 3.3 Khoảng cách di truyền (%) giữa các mẫu nghiên cứu (bên trên) và

số lượng nucleotide sai khác (bên dưới) giữa các mẫu nghiên cứu 50

Hình 2.2 Máy đo NanoDrop one 19

Hình 2.3 Chu trình phản ứng PCR 20

Hình 2.4 Sơ đồ phản ứng QIAquick 21

Hình 3.1 Panax notoginseng - Tam thất (lá mẫu TH1) 26

Hình 3.2 Panax notoginseng - Tam thất (củ mẫu TH1) 27

Hình 3.3 Mẫu Panax thu ở khu vực Phu Xai Lai Leng 29

Hình 3.4 Panax stipuleanatus - Tam thất hoang (mẫu TB1: lá chét nguyên) 31 Hình 3.5 Panax stipuleanatus - Tam thất hoang (mẫu TB2: lá chét xẻ thùy sâu) 31

Hình 3.6 Panax stipuleanatus - Tam thất hoang (mẫu TB3: lá chét xẻ thùy sâu) 32

Hình 3.7 Panax stipuleanatus - Tam thất hoang (mẫu TB4: lá chét xẻ thùy nông) 33

Hình 3.8 Panax stipuleanatus -Tam thất hoang (mẫu lá ML1) 34

Hình 3.9 Panax stipuleanatus-Tam thất hoang (mẫu củ ML1) 35

Hình 3.10 Mẫu (K.M.Feng 13694) isotype (P stipuleanatus) hiện đang lưu trữ tại phòng tiêu bản Viện Thực vật Bắc Kinh (PE0025805) 36

Hình 3.11 So sánh trình tự vùng gen ITS-rDNA của các mẫu Panax TB1-TB4 và ML1 với trình tự vùng gen của loài P stipuleanatus 37

Hình 3.12 Lá loài Panax zingiberensis -Tam thất gừng (mẫu lá ML2) 40

Hình 3.13 Củ của loài Panax zingiberensis -Tam thất gừng (mẫu củ ML2) 41

Hình 3.14 So sánh trình tự vùng gen ITS-rDNA của mẫu ML2 với các loài trong cùng nhóm: P zingiberensis và P Wangianus 43

Hình 3.15 Sắc ký đồ trình tự vùng gen ITS-rDNA của mẫu Panax TB1 46

Hình 3.16 Trình tự vùng gen ITS-rDNA của các mẫu nghiên cứu 49

rDNA theo phương pháp Maximum Likelihood (ML) Mô hình tối

ưu GTR+G+I Eleutherococcus senticosus là loài ngoài nhóm Giá

trị ở gốc là giá trị bootstrap >50% 51

LỜI CẢM ƠN

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 GIỚI THIỆU VỀ CHI SÂM PANAX L 4

1.2 TỔNG QUAN CÁC NGHIÊN CỨU VỀ CHI PANAX L TRÊN THẾ GIỚI 4

1.3 TỔNG QUAN CÁC NGHIÊN CỨU VỀ CHI PANAX L Ở VIỆT NAM 8

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

2.1 VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ NGHIÊN CỨU 14

2.1.1 Vật liệu 14

2.1.2 Địa điểm nghiên cứu 14

2.1.3 Các hóa chất dùng trong nghiên cứu 14

2.1.4 Thi t ị và dụng cụ nghiên cứu 15

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu 17

2.2.2 Phương pháp thu thập mẫu 17

2.2.3 Phương pháp định loại hình thái 18

2.2.4 Phương pháp nghiên cứu sinh học phân tử 18

2.2.4.1 Phương pháp tách chiết DNA tổng số 18

2.2.4.2 Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) 19

2.2.4.3 Tinh sạch sản phẩm PC R 21

2.2.4.4 Phương pháp phân tích số liệu 22

3.1.1 Đặc điểm nhận bi t chi Panax 25

3.1.2 Panax notoginseng (Burkill) F.H.Chen ex C.H Chow - Tam thất 25

3.1.3 Panax stipuleanatus Tsai et Feng- Tam thất hoang 28

3.1.4 Panax zingiberensis C.Y Wu & K.M Feng-Tam thất gừng 39

3.1.5 Đặc điểm hình thái chung của chi Panax ở vùng Tây Nghệ An 43

3.1.6 Mối quan hệ họ hàng của các mẫu nghiên cứu 45

3.2 THẢO LUẬN 52

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 54

1 KẾT LUẬN 54

2 KIẾN NGHỊ 54

TÀI LIỆU THAM KHẢO 55 PHỤ LỤC

MỞ ĐẦU

1 LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI

Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa nóng và ẩm nên

có nguồn tài nguyên thực vật phong phú và đa dạng Thêm vào đó, cộng đồng các dân tộc Việt Nam từ lâu đời cũng đã có nhiều kinh nghiệm sử dụng các loại cây cỏ làm thuốc trong đó có Sâm

Nhân sâm được dùng trong y học phương Đông hàng ngàn năm nay Người Trung Quốc đã sử dụng nhân sâm từ rất lâu đời như một thứ dược liệu vô cùng trân quý, chỉ có các vua chúa và các quan lớn mới có loại thảo dược này Tác dụng của nhân sâm được đề cập trong các trước tác của Shi You (khoảng những năm 48-33 TCN) hay Shanghan Lun (khoảng những năm 200 SCN)

Chi Nhân sâm (Panax L.) là một chi nhỏ trong họ Ngũ gia bì

(Araliaceae) gồm 15 loài, tất cả đều có giá trị làm thuốc, một số loài thuộc chi

Panax L (Araliaceae) được sử dụng có giá trị cao như Nhân sâm (P ginseng), Tam thất (P notoginseng) Ở Việt Nam, có một số loài thuộc chi này như Sâm vũ diệp (P bipinnatifidus), Tam thất hoang (P stipuleanatus)

và Sâm ngọc linh (P vietnamensis) [1,2,3]

Do có giá trị sử dụng và giá trị kinh tế cao, các loài nhân sâm này đã

bị tìm kiếm, khai thác đến mức kiệt quệ trong tự nhiên Sâm vũ diệp và Tam thất hoang đã được xếp hạng cực kỳ nguy cấp (CR), còn Sâm ngọc linh ngày nay đã được coi là tuyệt chủng ngoài tự nhiên (EW) Cả ba loài này đã được đưa vào Sách Đỏ Việt Nam (2007), Phụ lục IA - các loài nghiêm cấm khai thác và sử dụng vì mục đích thương mại của Nghị định 06/2019/NĐ-CP ngày 22/01/2019, Nghị định 32/2006/NĐ-CP ngày 30/03/2006 về quản lý thực vật rừng, động vật rừng nguy cấp, quý hiếm Và đây cũng là ba trong số

17 loài thực vật thuộc Danh mục loài nguy cấp qúy hiếm được ưu tiên bảo

vệ theo Nghị định số 160/2013/NĐ-CP ngày 12/11/2013 của Thủ tướng

Chính phủ [4]

Vùng Tây Nghệ An có diện tích rất lớn với 1,3 triệu ha với 09 đỉnh núi thuộc Bắc Trường Sơn cao trên 1000m so với mặt biển như Pù Hon 1447m,

Pù Mát 1814m, Phu Xai Lai Leng 2711m, Pù Hút 2452m, Pù Lon 1561m, Pu Đen Đin 1540m, Rào Cỏ 2286m, Pù Huống 1200m và Chốp Cháp 1705m có khả năng phù hợp với điều kiện sinh trưởng và phát triển của các loài cây

thuốc thuộc chi Sâm (Panax L.) Trên cơ sở nghiên cứu bước đầu và thông tin

từ người dân địa phương cho biết đã gặp một số cây sâm ở các khe núi Ca Nọi, Na Khang và Phú Khả thuộc khu vực núi Phu Xai Lai Leng có độ cao 2711m thuộc xã Na Ngoi, huyện Kỳ Sơn, tỉnh Nghệ An nên nhóm nghiên

cứu đã lựa chọn điều tra đại diện các loài cây thuộc chi Sâm (Panax L.) cho

vùng Tây Nghệ An tại khu vực đỉnh núi Phu Xai Lai Leng

Thêm vào đó, hiện nay Công ty TNHH TH true MILK đã đầu tư vườn dược liệu tại các xã Na Ngoi và Mường Lống, Kỳ Sơn, Nghệ An trong đó có khoảng hơn 1000m2

trồng Sâm Theo thông tin ghi nhận được, các loài Sâm trồng ở đây được thu thập từ khu vực Tây Nghệ An và nhập từ địa phương khác về trong đó có cả Sâm ngọc linh được mang về từ Nam Trà My vì vậy việc khảo sát, định loại các loài thuộc chi Sâm tại đây có thể mang lại thêm thông tin về đa dạng loài Sâm tại vùng Tây Nghệ An Hơn nữa, các loài Sâm đều sinh trưởng tốt tại vườn ươm này, vì vậy đây có thể là mô hình bảo tồn chuyển vị cho các loài thuộc chi Sâm ở Tây Nghệ An

Nhằm cung cấp những dẫn liệu và cơ sở khoa học phục vụ công tác bảo tồn, phát triển cũng như công tác định danh, phân biệt một số loài Sâm ở Tây

Nghệ An, luận văn đã lựa chọn đề tài “Nghiên cứu đặc điểm hình thái và

phân tử một số taxon thuộc chi Sâm (Panax L.) ở vùng Tây Nghệ An”

2 MỤC TIÊU ĐỀ TÀI

- Mô tả đặc điểm hình thái và sinh học phân tử các loài thuộc chi Sâm

(Panax L.) thu thập ở khu vực Phu Xai Lai Leng, Kỳ Sơn, Nghệ An

- Nghiên cứu một số đặc điểm hình thái và sinh học phân tử của một số

loài thuộc chi Sâm (Panax L.) được trồng tại Công ty TNHH TH true MILK

Na Ngoi và Mường Lống, Kỳ Sơn, Nghệ An

3 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU

- Đối tượng nghiên cứu: Các loài cây thuộc chi Sâm (Panax L.) thu

thập ở vùng Tây Nghệ An gồm các mẫu thu ở khu vực Phu Xai Lai Leng và vườn giống của Công ty TNHH Thtrue MILK ở xã Na Ngoi và Mường Lống,

Kỳ Sơn, Nghệ An

- Phạm vi nghiên cứu: Vùng Tây Nghệ An

4 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU

* Ý nghĩa khoa học

- Góp phần bổ sung hoàn chỉnh vốn kiến thức về hình thái và phân loại

chi Sâm (Panax L.) ở Việt Nam

* Ý nghĩa thực tiễn

- Kết quả của nghiên cứu là cơ sở khoa học để nhận biết bảo tồn các

loài thuộc chi Sâm (Panax L.) tại vùng Tây Nghệ An

- Thông tin về thành phần loài, phân bố và hiện trạng các loài thuộc chi

Sâm (Panax L.) ở vùng Tây Nghệ An có ý nghĩa lớn đối với việc phát triển

kinh tế vùng, mang lại lợi ích cho người dân địa phương

- Kết quả của đề tài là cơ sở khoa học phục vụ cho các ngành ứng dụng

và sản xuất như Nông - Lâm nghiệp, Dược học, Tài nguyên thực vật, Đa dạng sinh học và trong công tác đào tạo

5 ĐIỂM MỚI CỦA LUẬN VĂN

- Mô tả chi tiết đặc điểm hình thái 3 loài thuộc chi Panax L thu được ở

vùng Tây Nghệ An

- Sử dụng phương pháp sinh học phân tử hỗ trợ định danh chuẩn các

loài thuộc chi Panax thu được ở vùng Tây Nghệ An

- Đã phân tích, xác định Tam thất hoang và Sâm vũ diệp ở Việt Nam là

cùng một loài P stipuleanatus H.T Tsai et K.M Feng

- Xây dựng bộ tư liệu ảnh minh họa đặc điểm hình thái, sinh học phân

tử của các taxon thuộc chi Panax ở vùng Tây Nghệ An: 14 ảnh chụp từ các

mẫu thu trực tiếp trên thực địa, ảnh tham khảo và ảnh chụp từ mẫu trong phòng tiêu bản

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 GIỚI THIỆU VỀ CHI SÂM PANAX L

Chi Nhân sâm (Panax L.) là một chi nhỏ trong họ Ngũ gia bì

(Araliaceae) Chi này trên thế giới có 8 loài phân bố ở vùng Đông Á,

Hymalaia, Inđôchina, Bắc Châu Mỹ [5] Sự phân bố của chi Panax L trên thế

giới cho thấy chúng chỉ xuất hiện ở Bắc bán cầu, kéo dài từ vùng rừng núi giáp bờ biển phía Đông của Bắc Mỹ bao gồm Bắc Hoa Kỳ và Tây-Nam

Canada (có 2 loài P quinquefolius và P trifoliatus) [6, 7, 8] Vùng Đông Bắc

Á (gồm Viễn Đông Nga, Đông Bắc Trung Quốc, bán đảo Triều Tiên và Nhật

Bản) có 2 loài là P ginseng và P japonica Trung tâm phân bố của chi Panax

L có thể từ vùng Tây - Nam của Trung Quốc xuống phía Bắc Việt Nam Thực chất khu vực này gồm 2 tỉnh biên giới kề nhau là Vân Nam (Trung Quốc) và Lào Cai (Việt Nam), ở đây đang có tới 7 loài và thứ mọc hoàn toàn tự nhiên, 2 loài

trồng là P notoginseng (nhập từ Bắc Mỹ) và P pseudoginseng Đây có thể coi là trung tâm phân bố của chi Sâm (Panax L.) trên thế giới Ở Bắc Mỹ hiện có 3 loài (P notoginseng; P quinquefolius và P trifoliatus) Giới hạn cuối cùng về phía Nam của chi Panax L là loài Sâm Việt Nam (P vietnamensis) ở Miền Trung

của Việt Nam, tại 140

15’ vĩ độ Bắc

1.2 TỔNG QUAN CÁC NGHIÊN CỨU VỀ CHI PANAX L TRÊN THẾ GIỚI

Chi Panax L được Carl Linnaeus mô tả lần đầu tiên từ năm 1753 với loài chuẩn là P quinquefolius phân bố ở Bắc Mỹ [8] Sang thế kỷ 19, một số loài khác được công bố như Giả nhân sâm - P pseudoginseng Wall, ở Nepal; Nhân sâm - P ginseng Meyer ở Bắc Triều Tiên, Đông Bắc Trung Quốc và Viễn Đông Nga; Sâm Nhật P japonicus Meyer ở Nhật Bản và Trung Quốc; Sâm vũ diệp - P bipinnatifidus Seem, ở Đông Bắc Ắn Độ, Nepal và Trung Quốc (Wen J., 2000) [9] Như vậy, đến cuối thế kỷ 19, chi Panax L có 6 loài Năm 1975, Trung Quốc đã bổ sung thêm một loài mới là P stipuleanatus H

T Tsai & K M Feng, đồng thời nâng cấp các taxon thứ của P pseudoginseng Wall, của các tác giả trước đó thành bậc loài hoàn chỉnh

(Nocerino E et al., 2000) [10] Năm 1985[11], một loài mới khác được tìm

thấy ở Việt Nam là Sâm ngọc linh - P vietnamensis Ha et Grushv đã nâng tổng số loài thuộc chi Panax trên thế giới lên 12 loài và 1 thứ Trong đó Bắc

Mỹ có 2 loài (P quinquefolius và P trifolius) Các loài còn lại phân bố ở

châu Á, bao gồm 6 loài ở Trung Quốc, 3 loài có ở Nhật Bản và có 5 loài có ở Việt Nam (kể cả 2 loài cây trồng nhập nội)

Theo Linnaeus (1753) [8] điểm khác biệt của chi Panax L so với các

chi khác trong họ Araliaceae là bầu 2 ô, hoa mẫu 5, xếp van hay xếp lợp Trong giai đoạn này, số lƣợng loài đã biết còn ít, nên tác giả chỉ giới hạn ở các đặc điểm của hoa: hoa vừa xếp lợp vừa xếp van Đây là đặc điểm chính của chi để phân biệt với các chi khác trong họ Araliaceae Tuy nhiên, với cách

sắp xếp này thì đặc điểm của chi Panax bao gồm một số chi khác thuộc họ Araliaceae, đặc biệt là chi Nothopanax

Theo quan điểm trên, De Candolle (1830) [12] đã chuyển một số loài

thuộc chi Nothopanax vào chi Panax Kể từ đây, vị trí phân loại và mối quan

hệ phát sinh của chi Panax không có sự đồng nhất về quan điểm giữa các tác

giả Decaisne và Planchon (1854) [13] cho rằng đặc điểm chính của chi

Panax là đài xếp van, nên chuyển 2 loài P quinquefolius và P trifolius sang chi Aralia, đồng thời hợp nhất hoá các chi Polyscias, Clerodendron, Pseudopanax và Maralia vào chi Panax Nhƣ vậy, với cách sắp xếp nhƣ trên, các tác giả đã cho rằng đặc điểm hình thái của chi Panax bên cạnh đài xếp

van còn có đặc điểm thân gỗ và thân thảo Đồng ý với quan điểm trên, các tác giả Bentham và Hooker (1867) [14], Clarke (1879) [15] tiếp tục sát nhập chi

Nothopanax vào chi Panax, đồng thời chuyển chi Panax vào tông (tribe) Panaceae Đến thời điểm này, số lƣợng loài thuộc chi Panax lên đến 25 loài,

phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới châu Á, châu Phi, Newzeland và Australia

Năm 1868, Seemann [16] đã xem xét lại vị trí phân loại chi Panax và

cho rằng những mô tả của Linnaeus về đặc điểm hình thái đặc trƣng của chi

Panax là không rõ ràng Theo tác giả, đặc điểm chính để phân biệt chi Panax

so với các chi khác trong họ Araliaceae là đài 5, xếp lợp, bầu 2 ô Với đặc

điểm này thì 2 loài P quinquefolius và P trifolius thuộc về chi Panax và có mối quan hệ gần với chi Aralia Đối chiếu với đặc điểm của các chi khác

thuộc họ Araliaceae, tác giả ghi nhận có một đặc điểm chỉ ra sự khác biệt giữa

chi Panax so với chi khác là thân dạng củ Qua đó, tác giả chuyển các loài có thân dạng củ trước đây ở các chi khác vào chi Panax, đồng thời chuyển một

số loài không có thân dạng củ ra khỏi chi Panax Như vậy, chi Panax có 3 đặc điểm quan trọng làm cơ sở để phân biệt với các chi khác trong họ Araliaceae

là: thân dạng củ, đài 5, xếp lợp, bầu 2 ô Với quan điểm trên, tác giả đã

chuyển 61 loài ra khỏi chi Panax, và chi này chỉ còn lại các loài: P trifolius L., P quinquefolius L., P ginseng Mey., P pseudoginseng Wall., P japonicus Mey và P bipinnatifidus Seem Với loài P fructicosus có đặc điểm là đài xếp van, Seemann xếp vào chi Nothopanax và đồng thời lấy loài này là type cho chi Nothopanax Có lẽ đây là quan điểm được nhiều nhà nghiên cứu về chi Panax cho là phù hợp hơn cả Để khẳng định lại quan điểm

của Seeman (1868) [16], Harm (1897) [17] đã nghiên cứu tất cả các đặc điểm của các loài Sâm phân bố trên thể giới như: cơ quan sinh sản, cơ quan sinh

dưỡng và cho rằng chi Panax có nguồn gốc từ chi Aralia, điểm khác biệt ở

đây là thân dạng củ Britton và Brown (1913) [18] tiếp tục xem xét vị trí phân

loại chi Panax và đồng tình với quan điểm của Seeman (1868) và Harm (1897) [17], chỉ ra loài P quinquefolius có đặc điểm đại diện cho chi: thân

dạng củ, hoa mẫu 5 xếp lợp, bầu 2 ô, và loài được mô tả lần đầu tiên, nên lấy

loài này làm type danh pháp cho chi Panax

Hoo (1961) [19] khi nghiên cứu về hệ thống học, mối quan hệ phát sinh

và phân bố của taxon trong họ Araliaceae đã cho rằng chi Panax có nguồn gốc phát sinh từ Acanthopanax Vì chi này có đặc điểm hoa mẫu 5, lá có lông

cứng mọc trên gân lá, thân thảo hay thân dạng cây bụi nhỏ Tác giả cho rằng đặc điểm thân thảo là đặc điểm tương đồng quan trọng nhất, các loài trong chi

Aralia hầu như không có đặc điểm này Quan điểm này của Hoo hầu như không nhận được sự đồng tình của các nhà nghiên cứu về chi Panax

Năm 1970, Hara [20] xem xét đặc điểm của chi Panax dựa trên mẫu vật của các loài thuộc chi Panax ở châu Á thu được ngoài tự nhiên cũng như dựa

trên mẫu lưu giữ ở các Bảo tàng thực vật Qua đó, tác giả thống nhất với các

quan điểm nghiên cứu trước đó về đặc điểm của chi Panax: thân dạng củ, hoa mẫu 5 xếp van hay xếp lợp, bầu 2 ô và có mối quan hệ gần với chi Aralia

Tuy nhiên, theo tác giả các loài trong chi Panax có đặc điểm hình thái biến đổi rất lớn so với các bậc phân loại khác trong họ Araliaceae Do đó, việc định loại các loài trong chi Panax là việc rất khó khăn nếu chỉ dựa vào một

đặc điểm hình thái nào đó Theo tác giả, để phân biệt các loài thuộc chi

Panax, trước tiên xếp loài vào 1 trong 3 chuẩn hình thái của thân rễ (rhizome

type): thân rễ có dạng thân củ (carot type); thân rễ có đốt kéo dài; và thân rễ

có đốt ngắn như đốt trúc Tiếp theo đó là các đặc điểm hình thái lá, đài, tràng,

số lượng chỉ nhụy, quả Cách phân loại dựa vào hình thái thân rễ trước rồi mới đến các đặc điểm cơ quan sinh dưỡng và sinh sản đã được Xiang và Lowry

(2007) [5] áp dụng để xây dựng khóa phân loại chi Panax ở Trung Quốc

Wen và Zimmer (1996) [21] dựa vào đặc điểm hình thái, hình thái giải

phẫu, hạt phấn và sinh học phân tử cho rằng chi Panax có mối quan hệ gần gũi với chi Aralia Đến thời điểm hiện nay, các hệ thống quan điểm dựa vào hình thái, giải phẫu và sinh học phân tử đều thống nhất và cho rằng chi Panax

có mối quan hệ gần với chi Aralia, điểm khác khác biệt chủ yếu dễ dàng nhận thấy so với chi Aralia là thân dạng củ, lá kép hình chân vịt, noãn 2-3

Sau năm 1970, vị trí phân loại và hệ thống phát sinh của chi Panax hầu

như không thay đổi Tuy nhiên do đặc điểm hình thái có biến đổi rất lớn, ngay trong một loài ở các vùng phân bố khác nhau thì có đặc điểm hình thái cũng khác nhau (Hara,1970) [20], đồng thời ngày càng có nhiều phát hiện mới nên từ

đó đến nay, việc ghi nhận số lượng loài trong chi Panax có sự thay đổi theo thời

gian và tùy vào quan điểm của các nhà nghiên cứu Ở nửa đầu của thập niên

1970, quan niệm về thành phần loài Sâm châu Á của các nhà nghiên cứu cũng rất khác nhau và có sự bổ sung nhiều taxon mới Gần đây, quan hệ phát sinh

giữa các taxon thuộc chi Panax được xây dựng không chỉ dựa vào đặc điểm hình

thái mà còn sử dụng trình tự các DNA mã vạch - hoặc gọi là chỉ thị DNA), tuy vậy vẫn chưa có sự thống nhất giữa các nhóm tác giả Có thể nhận thấy sự khác nhau giữa các quan điểm phân loại về số lượng loài, sự sắp xếp và phân chia các

loài và dưới loài trong chi Panax qua các thời kỳ có thể do các nguyên nhân sau: tính đa dạng về hình thái trong chi Panax, quan điểm về hệ thống phát sinh dựa

vào đặc điểm hình thái rất đa dạng; việc sử dụng các DNA barcode khác nhau để

hỗ trợ cho nghiên cứu phân loại; các phát hiện mới về taxon

Các taxon thuộc chi Panax đã biết đều là các đối tượng có giá trị sử

dụng cao và được xem là “thần dược cuộc sống” (Florence, 1992) [22], do vậy đã có hàng loạt các công trình nghiên cứu trên thế giới và cũng như ở Việt Nam được tiến hành nhằm thúc đẩy sản xuất, khai thác, sử dụng hiệu quả Nhiều nhất là các nghiên cứu về thành phần hóa dược và dược lý, tiếp đến là nghiên cứu về nhân giống, canh tác, chế biến, hệ thống học thực vật, đa dạng di truyền, bảo tồn đa dạng nguồn gen Do đó có khá nhiều công trình nghiên cứu được công bố trên các tạp chí, sách chuyên khảo và các thông tin trên các phương tiện đại chúng liên quan đến Sâm Nói cách khác, các loài Sâm là đối tượng thực vật có một sự cuốn hút lớn đối với những người làm công tác nghiên cứu trong nhiều lĩnh vực trên toàn thế giới Những công trình nghiên cứu về sâm vẫn đang được triển khai cho dù những phát hiện đột phá

về mặt thành phần loài gần đây không nhiều

1.3 TỔNG QUAN CÁC NGHIÊN CỨU VỀ CHI PANAX L Ở VIỆT NAM

Mặc dù là những loài cây thuốc có giá trị nhưng các công trình nghiên cứu về thực vật ở Việt Nam và Đông Dương từ thời Pháp thuộc vẫn chưa ghi

nhận phân bố của các loài thuộc chi Panax ở Việt Nam Đến năm 1964, Viện

Dược liệu đã thu được một số mẫu của loài cây thuốc có tên là “Phan xiết” do đồng bào người Dao và Mông ở Sa Pa giới thiệu Tháng 7 năm 1964 nhà thực vật học người Trung Quốc Ngô Chính Dật đã giám định các tiêu bản thuộc

chi Panax L lưu giữ tại Viện Dược liệu, trong đó mẫu số 911 và 348 thu ở xã

Tả Phin huyện Sa Pa tỉnh Lào Cai ngày 14/6/1964 được xác định có tên khoa

học là P bipinnatifidus Seem Đến năm 1969, loài này mới được Grushvitzky

và cộng sự [23] công bố trong một loạt các công trình nghiên cứu về họ Araliaceae ở miền Bắc Việt Nam [24,25,26] Từ đó, Sâm vũ diệp đã được ghi nhận trong tất cả các tài liệu về cây thuốc và hệ thực vật ở Việt Nam

Viguier (1908 – 1923) là công trình nghiên cứu đầu tiên ở Việt Nam

chỉ mô tả đặc điểm và phân bố của chi Panax Nhưng không trích dẫn tài liệu

tham khảo, dẫn đến gây khó khăn cho người nghiên cứu tiếp theo và chưa xác định được các loài có phân bố ở Việt Nam [27]

Phạm Hoàng Hộ (1970) [28] là người đầu tiên ghi nhận thứ Sâm nhật

(P schinseng Nees var japonicum Mak.) có ở rừng dày ẩm, núi Langbian

(Lâm Đồng) trong bộ “Cây cỏ Việt Nam” Ông mô tả ngắn gọn về đặc điểm hình thái, sinh thái, phân bố và hình vẽ của thứ này

Năm 1973, Võ Văn Chi & cs trong cuốn “Cây cỏ thường thấy ở Việt

Nam” mô tả Panax pseudoginseng Nees – Tam thất kim bất [29]

Năm 1993, Phạm Hoàng Hộ [30] đã mô tả 3 loài thuộc chi Panax L có

ở Việt Nam là Sâm hai lần chẻ - P bipinnatifidus Seem, có ở Hoàng Liên Sơn, Sâm nhật - P japonica (Nees) Meyer có ở Langbian, Kon Tum và Giả nhân sâm - P pseudoginseng Wall, có ở Sa Pa Trong lần tái bản vào năm

2000, ngoài hai loài Sâm hai lần chẻ và Giả nhân sâm, Phạm Hoàng Hộ còn

bổ sung thêm một loài Sâm ngọc linh - P vietnamensis Ha et Grushv có ở

Gia Lai - Kon Tum Còn loài Sâm nhật ông ghi có ở Langbian và cả ở Kon Tum Như vậy theo Phạm Hoàng Hộ, trên địa bản tỉnh Kon Tum hoặc Gia Lai

- Kon Tum cũ, có cả hai loài Sâm nhật và Sâm việt nam Còn đối với Sâm nhật ở Kon Tum, ông không ghi rõ nguồn mẫu xác định và nơi phân bố cụ thể, điều này gây trở ngại cho việc các định loài Sâm nhật kể trên có thực sự phân bố tự nhiên ở Việt Nam hay không Trong khi đó, loài Sâm nhật do Phạm Hoàng Hộ đã từng ghi nhận ở Langbian cũng chính là Sâm việt nam hay Sâm ngọc linh được Hà Thị Dụng và Grushvitzky [31] (1996) công bố là

loài mới cho khoa học và đặt tên là P vietnamensis Ha et Grushv

Năm 1993, Trần Đình Lý trong cuốn “1900 loài cây có ích ở Việt

Nam”, mô tả rất ngắn gọn về phân bố và tác dụng của P vietnamensis Ha et Grushv., P bipinnatifidus Seem và P Pseudoginseng Wall [32]

Năm 1995, Đỗ Tất Lợi trong cuốn “Những cây thuốc và vị thuốc Việt nam” đã mô tả rất chi tiết về lịch sử ra đời, hình thái, thành phần hóa học, tác

dụng dược lý, công dụng và liều dùng của hai loài là P vietnamensis Ha et Grushv và P pseudoginseng Wall.[33]

Năm 1997, Võ Văn Chi [34] trong cuốn “ Từ điển cây thuốc Việt Nam”

mô tả về P pseudoginseng Wall Loài của Nam Trung quốc và Bắc Việt

Nam Ở nước ta cây mọc hoang và được trồng nhiều ở Hà Giang, Lào Cai,

Cao Bằng tại các vùng núi cao lạnh 1200 – 1500 m; Tam thất hoang P bipinnatifidus Seem – Vũ diệp tam thất Loài của Nam Trung Quốc và Bắc

Việt Nam, ở độ cao 1900 – 2400 m trong rừng ẩm, cây mọc hoang ở vùng núi cao lạnh của tỉnh Lào Cai Cũng được trồng và mọc tốt như Tam thất; Sâm

ngọc linh P vietnamensis Ha et Grushv là loài đặc hữu của Việt Nam mọc tập

trung trong 13 xã thuộc 3 huyện miền núi Ngọc linh, thuộc hai tỉnh Kon tum

và Quảng Nam Cả ba loài này tác giả đều mô tả đầy đủ về hình thái, bộ phận

sử dụng, nơi sống và thu hái, thành phần hóa học cũng như công dụng

Năm 1997, Lê Trần Đức trong cuốn “Cây thuốc Việt Nam trồng hái chế biến trị bệnh ban đầu” đã mô tả rất chi tiết về đặc điểm hình thái, điều kiện sống, kĩ thuật trồng và chăm sóc, trị sâu bệnh, cách thu hái và chế

biến, công dụng của P pseudoginseng Wall Phần cuối mô tả tác giả có ghi phụ chú cho biết P vietnamensis Ha et Grushv và củ Tam thất mọc hoang – P bipinnatifidus Seem cũng được dùng với hiệu quả gần như P pseudoginseng Wall [35]

Năm 2000, Phạm Hoàng Hộ [36] trong cuốn “Cây cỏ Việt Nam” đã

chỉnh sửa thành P bipinnatifidus Seem Sâm hai lần kép được tìm thấy ở núi

Hoàng Liên Sơn Điểm khác biệt là trong quyển 2 xuất bản năm 2000 Phạm Hoàng Hộ bổ sung thêm đặc điểm hình thái, sinh thái, phân bố và vẽ hình của

loài P vietnamensis Dung & Grushv Sâm việt tìm thấy ở Gia Lai, Kon Tum

Nhìn chung các công trình của Phạm Hoàng Hộ còn mang tính chất thông kê đặc điểm hình thái, sinh thái, phân bố và vẽ hình chưa mô tả đặc điểm chi, chưa chỉ ra mẫu nghiên cứu và mẫu chuẩn cũng như bảo tàng lưu giữ mẫu

Tuy nhiên đây được coi là tài liệu phân loại thực vật về chi Panax ở Việt Nam

có giá trị nhất tới thời điểm này

Năm 2003, Lê Trọng Cúc & cs [37] trong “Danh lục các loài thực vật

Việt Nam”, tập II mô tả về 3 loài: P bipinnatifidum Seem 1868 ( CCVN, 2: 640), - Aralia bipinnatifida C B Clarke, 1879, - P pseudoginseng var bipinnatifidus (Seem) H L Li, 1942 (FLPF, 54:187), - Vũ diệp tam thất, sâm

vũ diệp, Trúc tiết nhân Sâm, tam thất lá xẻ, Tam thất hoang, Sâm hai lần xẻ, Hoàng liên thất, phân bố ở Lai Châu (Tà Phỉn), Lào Cai (Sa Pa), còn có ở Ấn

Độ, Trung Quốc; P pseudoginseng Wall 1829 (CCVN, 2: 641) đƣợc trồng ở

Lào Cai (Sa Pa), Hà Giang (Phố Bằng, So Phin), Cao Bằng (Tắc Tẻ, Thông

Nông), Vĩnh Phúc ( Tam Đảo), còn có ở Nêpal, Trung Quốc; P stipuleanatus,

Tsai & Feng, 1975 – Tam thất hoang, Tam thất rừng, Bình biên tam thất, Sâm tam thất, Phan xiết ( H’Mông) phân bố ở Lào Cai (Sa Pa: Núi Hàm Rồng, xã

Tà Phỉn, xã Bản Khoang, còn có ở Trung Quốc (Vân Nam); P vietnamensis

Ha & Grushv 1985 (“vietnamensis”) – Sâm ngọc linh phân bố ở Quảng Nam

(Trà My, Trà Linh, Trà Cang), Kon Tum (Đac Glây, Đác Choong, Ngọc Linh, Đác Tô), Gia Lai (Long Hi), Lâm Đồng (Lang Bian) Tác giả mô tả ngắn ngọn về hình thái, phân bố, sinh thái và công dụng

Năm 2005, Nguyễn Tập [6] sau khi nghiên cứu và hệ thống lại các loài

thuộc chi Panax đã kết luận chi Panax ở Việt Nam có 5 loài, trong đó 3 loài mọc tự nhiên là Sâm vũ diệp - P bipinnatifidus Seem., Tam thất hoang - P stipuleanatus H.T Tsai et K.M Feng và Sâm việt nam - P vietnamensis Ha

et Grushv Cùng với hai loài nhập trồng là Nhân sâm - P ginseng và Tam thất

P notoginseng Đồng thời cũng chính thức mô tả loài Tam thất hoang - P stipuleanatus H.T Tsai et K.M Feng Từ đó đến nay, các tài liệu nhƣ: “Các

loài cây thuốc cần bảo tồn”, “Danh lục đỏ cây thuốc Việt Nam”, “Danh lục

thực vật Việt Nam” v.v đều đề cập đến loài Tam thất hoang - P stipuleanatus H.T Tsai et KM Feng kể trên Tác giả mô tả đầy đủ chi tiết về

các loài Sâm này

Năm 2007 “Sách đỏ Việt Nam” [38] mô tả về 3 loài thuộc chi Panax gồm: P bipinnatifidus (Seem) 1868 – Sâm vũ diệp (tên khác: Ngật đáp thất,

Tam thất hoang, Tam thất lá xẻ, Trúc tiết nhân sâm, Vũ diệp tam thất) phân

bố ở Lai Châu (Tả Phìn), Lào Cai (Sa Pa, Bát Xát, Than Uyên, núi Hoàng

Liên Sơn), còn có ở Ấn Độ, Nepal, Trung Quốc; P stipuleanatus H.T Tsai et

K.M Feng 1975 phân bố ở Lào Cai (Sa Pa, Bát Xát, núi Hoàng Liên Sơn),

ngoài ra còn có ở Trung Quốc (Vân Nam); P vietnamensis Ha & Grushv

1985 phân bố ở Quảng Nam (Trà My), Kon Tum (Đăk Tô, Đắk Glei, núi Ngọc Linh, Gia Lai, Lâm Đồng, còn có ở Trung Quốc Cả ba loài này Sách đỏ đều ghi lại đặc điểm nhận dạng, sinh học và sinh thái, phân bố, giá trị, tình

trạng, phân hạng, biện pháp bảo vệ kèm ảnh minh họa

Năm 2013, Phan Kế Long & cs [39] đã ghi nhận bổ sung cho khu hệ

thực vật Việt Nam thứ P vietnamensis var fuscidiscus K Komatsu, S Zhu &

S.Q Cai vốn được phát hiện trước đó ở Vân Nam, Trung Quốc Nhóm nghiên cứu đã phát hiện một số điểm phân bố của thứ loài này tại Mường Tè, Tam Đường và Sìn Hồ tỉnh Lai Châu nên được đặt tên là Sâm lai châu Tác giả mô

tả đầy đủ chi tiết về đặc điểm hình thái, phân bố, công dụng

Năm 2014, Phan Kế Long & cs [40] tiếp tục nghiên cứu đặc điểm hình

thái và DNA của 7 mẫu cây không có cơ quan sinh sản thuộc chi Panax thu

thập được ở núi Phu Xai Lai Leng (Kỳ Sơn, Nghệ An) Kết quả cho thấy các

mẫu nghiên cứu có mối quan hệ gần gũi với loài Tam thất hoang - P stipuleanatus H.T Tsai et K.M Feng (dựa trên trình tự vùng gen ITS-rDNA)

Các mẫu có đặc điểm chung là lá từ không xẻ thùy đến xẻ thùy 1 lần (thùy nông hoặc sâu); cuống lá có lá kèm

Đến năm 2016, Trần Ngọc Lân và cộng sự [41] đã nghiên cứu đặc điểm hình thái, thành phần hóa học và chỉ thị DNA của các mẫu được gọi là "Sâm puxailaileng" cũng thu thập ở địa điểm trên Nghiên cứu đã cho thấy các mẫu

này có mối quan hệ gần gũi với Sâm việt nam (P vietnamensis), khác xa với Tam thất hoang (P stipuleanatus) và Sâm vũ diệp (P bipinnatifidus) và kết luận "Sâm phu xai lai leng" thuộc loài P vietnamensis Ha et Grushv Các

mẫu này được tác giả cho rằng có đặc điểm đặc trưng phân biệt với "Tam thất hoang" ở "thân rễ mang các đốt mọc cùng 1 hướng, khi sấy khô thường dẻo

và chuyển màu đen" trong khi loài "Tam thất hoang" có "thân rễ có các đốt thường mọc so le, khi sấy khô thường cứng và chuyển màu trắng" Tuy nhiên, những đặc điểm quan trọng khác lại chưa được mô tả chi tiết như: có hay không có lá kèm, hình dạng và màu sắc đĩa tuyến mật, hình dạng và màu sắc quả chín Ngoài ra, các tác giả đã không đề cập tới nơi lưu giữ các tiêu bản nghiên cứu Sự không thống nhất của các kết quả nghiên cứu về đặc điểm

hình thái và trình tự vùng ITS-rDNA trên các cá thể thuộc chi Panax cùng thu

thập ở vùng núi Phu Xai Lai Leng ở trên có thể do tại đây có sự tồn tại của

nhiều hơn 1 loài Panax Cả hai nhóm nghiên cứu đều cho rằng cần có những

nghiên cứu sâu hơn về đặc điểm hình thái và chỉ thị phân tử của các loài để có đƣợc những kết quả chính xác hơn

Nông Văn Duy & cs (2016) [42] khi nghiên cứu đặc điểm hình thái và

chỉ thị phân tử vùng gen ITS1-5.8S-ITS2, 18S rRNA và matK của quần thể

"Sâm langbiang" phân bố ở Cao nguyên Lâm Viên (núi Lang Biang, Lâm

Đồng) đã công bố đây là thứ mới của loài Sâm việt nam và đặt tên là P vietnamensis var langbianensis N.V Duy V.T Tran & L.N Trieu

Từ những nghiên cứu trên cho thấy chi Nhân sâm (Panax L.) ở Việt

Nam gồm 03 loài và 02 thứ ở Việt Nam mọc hoang dã bao gồm Sâm vũ diệp

(P bipinnatifidus), Tam thất hoang (P stipuleanatus), Sâm việt nam hay còn đƣợc gọi là Sâm ngọc linh (P vietnamensis var vietnamensis), Sâm lai châu (P vietnamensis var fuscidiscus) và Sâm langbian (P vietnamensis var langbianensis)

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ NGHIÊN CỨU

2.1.1 Vật liệu

Mẫu vật nghiên cứu bao gồm:

- 04 mẫu Sâm tự nhiên ở khu vực núi Phu Xai Lai Leng (Ký hiệu

Panax TB1 đến Panax TB4) trong đó có 02 mẫu có hoa non, lá, thân, rễ củ (Panax TB1 và Panax TB2)

- 03 mẫu Sâm tại vườn ươm: 01 mẫu Sâm (Ký hiệu Panax TH1)

gồm lá và củ được thu tại vườn ươm ở xã Na Ngoi, Kỳ Sơn, Nghệ An; 02

mẫu sâm gồm lá và củ (Ký hiệu Panax ML1 và Panax ML2) được thu tại

vườn ươm ở xã Mường Lống, Kỳ Sơn, Nghệ An thuộc sở hữu của Công ty TNHH TH true MILK

2.1.2 Địa điểm nghiên cứu

Phòng Thực vật học, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật và phòng Phân loại học thực nghiệm và Đa dạng nguồn gen, Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam

2.1.3 Các hóa chất dùng trong nghiên cứu

* Các hóa chất dùng trong nghiên cứu bao gồm:

- Taq PCR mastermix 2x (QIAgen, Mỹ)

- BigDye terminator v3.1 (Applied Biosystems, Mỹ)

- Dung dịch TBE 10x (10mM Tris, 0.9 mM axir boric, 0.01 mM EDTA) của hãng Invitrogen, Mỹ

- Thuốc nhuộm an toàn (Malaysia)

- Kít tách chiết DNA (Trung Quốc)

- Kít tinh sạch sản phẩm PCR: QIAgen Quick Gel Extraction Kit (QIAgen, Mỹ)

- Agarose (Invitrogen, Mỹ)

- Sephadex G50 (Sigma, Mỹ)

- Các hóa chất tách chiết và tinh sạch DNA (NaCl, CTAB, EDTA, HCl, β-Mercaptoethanol, Isopropanol, Sodium acetate 3M, ethanol 100%, 70%, Rnase (10mg/ml)

Tris Hóa chất điện di agarose (agarose, đệm TAE, dye )

+ Taq DNA polymerase

2.1.4 Thi t ị và dụng cụ nghiên cứu

* Các thiết bị chính sử dụng trong thao tác thực hiện thí nghiệm:

- Tủ lạnh thường và tủ lạnh sâu

- Bể ổn nhiệt và lò vi sóng

- Tủ khử trùng, máy sấy chân không

- Máy khuấy từ, máy trộn

- Máy soi cực tím

- Máy khử trùng Mac - 250Nex (Sanyo, Nhật Bản)

- Máy định lượng DNA NanoDrop One (Thermo scientific – Mỹ)

- Cân phân tích (Precisa, Thụy Sĩ)

- Máy ổn nhiệt (Memmert, Đức)

- Máy trộn rung (Vortex - Fluka, Mỹ)

- Máy ly tâm 5415D (Eppendorf, Đức)

- Máy ly tâm lạnh (Hitachi, Nhật)

- Máy PCR Mastercycler (Eppendorf, Đức)

- Máy điện di agarose gel (BioRad, Mỹ)

- Máy soi gel (UVP, Mỹ)

- Pipette, đầu côn, ống eppendorf

* Các cặp mồi dùng trong nghiên cứu:

Bảng 2.1 Trình tự cặp mồi nhân bản vùng ITS-rDNA bằng kỹ thuật PCR với

cặp mồi theo Phan Kế Long và cs (2014)

Ký hiệu

cặp mồi

Trình tự nucleotide (5’– 3’) Kích thước

Lý thuy t (bp)

Nhiệt độ bắt cặp (Tm) C

PaITS-F 5’- CAC TGA ACC TTA TCA TTT

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu

Hình 2.1 Sơ đồ các bước thí nghiệm 2.2.2 Phương pháp thu thập mẫu

Thu thập mẫu cây trưởng thành trong các chuyến thực địa ở khu vực núi Phu Xai Lai Leng với cơ quan sinh sản để làm tiêu bản, chụp ảnh, ghi chép, gắn etiket cho mẫu, mô tả …

Đối với cây non và cây trong vườn ươm chỉ thu mẫu lá và ghi nhận đặc điểm hình thái lá, củ; thu 01 lá chét và bảo quản trong túi nylon có chứa silicagel Giữ mẫu ở nhiệt độ phòng hoặc -20oC cho đến khi phân tích

Thiết kế mồi Tách chiết

PCR

Đọc kết quả trình tự

gen

Cặp mồi DNA Tổng số

Phân tích số liệu, so sánh với

các loài thuộc chi Panax và loài ngoài nhóm

Vùng gen rDNA

ITS-Cặp mồi

Khai thác trình tự trong NCBI Mẫu lá sâm

Giải trình tự

2.2.3 Phương pháp định loại hình thái

Chụp ảnh, mô tả mẫu vật thu thập được

Phân loại mẫu vật sử dụng phương pháp so sánh hình thái dựa vào các tài liệu có liên quan, đặc biệt là các tài liệu định loại ở Việt Nam, các nước lân cận Việt Nam và tài liệu mô tả gốc của các chi

2.2.4 Phương pháp nghiên cứu sinh học phân tử

2.2.4.1 Phương pháp tách chi t DNA tổng số

DNA tổng số của các mẫu sâm được tách chiết bằng Dneasy Plant Mini Kit theo qui trình sau:

- Lấy mẫu lá bảo quản lạnh sâu (-20◦C) đem nghiền trong nitrogen lỏng (-196◦C) thành dạng bột mịn Lấy 100mg bột cho vào ống eppendorf 1,5ml

- Thêm 400μl đệm AP1 và 4ul Rnase A Trộn đều bằng vortex và ủ ở 65◦C trong 10 phút Đảo trộn 2 – 3 lần trong quá trình ủ

- Thêm 130μl đệm AP2 Trộn đều và ủ trong đá 5 phút

- Hút dịch ly giải vào cột QIAshredder Mini Ly tâm tốc độ 14000rpm trong 2 phút

- Chuyển dịch qua cột vào ống eppendorf 1,5ml mới nhưng không xáo trộn Thêm 1,5 lần thể tích đệm AP3/E và trộn đều bằng pipet

- Chuyển 650μl hỗn dịch vào cột Dneasy Mini Ly tâm tốc độ 8000rpm trong 1 phút Loại bỏ dịch qua cột Lặp lại bước này với phần hỗn dịch còn lại

- Đặt cột vào ống thu mới Thêm 500μl đệm AW và ly tâm 8000rpm trong 1 phút Loại bỏ dịch qua cột

- Thêm 500μl đệm AW Ly tâm 14000rpm trong 2 phút Loại bỏ dịch qua cột

- Chuyển cột sang ống eppendorf 1,5ml có ghi nhãn Thêm 100μl đệm

AE để hoà tan Ủ ở nhiệt độ phòng 5 phút Ly tâm 6000rpm trong 1 phút Lặp lại bước này, thu được dịch chiết chứa DNA tổng số, bảo quản ở -20◦C

- Kiểm tra nồng độ DNA tổng số bằng máy định lƣợng DNA NanoDrop One (Thermo scientific – Mỹ) (Hình 2.2)

Hình 2.2 Máy đo NanoDrop one

2.2.4.2 Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)

 Ti n hành:

- Sau khi đo nồng độ DNA khuôn, tính và tạo các nồng độ DNA của các mẫu nhƣ nhau để khi đƣa vào mỗi ống phản ứng thể tích DNA khuôn đƣợc giống nhau, và đạt nồng độ 10ng trong tổng thể tích là 25 l/ 1 phản ứng

- Tính lƣợng thể tích các thành phần khác trong phản ứng, trộn đều các thành phần rồi chia vào các ống đã có khuôn DNA

- Đặt các ống vào máy PCR, khởi động, cài đặt chu trình và cho máy chạy Phản ứng PCR đƣợc tiến hành với các thành phần nhƣ Bảng 2.2

50oC

25 giây

Bước 2: Cắt đoạn gel chứa băng DNA của từng mẫu, cho vào

eppendorf 1,5 ml

Bước 3: Cân đoạn gel từng mẫu đã cắt Bổ sung 3 lần thể tích dung dịch

QG theo trọng lượng từng mẫu (1g gel tương đương 1000 μ dung dịch QG)

gel tốt lắc đều eppendorf vài lần trong quá trình ủ, mỗi lần cách nhau 2 - 3 phút

Bước 5: Khi gel đã tan hoàn toàn, kiểm tra màu của dung dịch mẫu

Màu của dung dịch tốt là màu vàng của QG ban đầu

Bước 6: Hút toàn bộ dung dịch cho vào cột MinElute đặt trong ống thu

dịch ly tâm của Kit và ly tâm 13.000 rpm trong 1 phút

Bước 7: Chuyển cột sang ống thu dịch ly tâm khác, cho 700 μl dung

dịch PE vào cột, để mẫu ở nhiệt độ phòng khoảng 5 phút, ly tâm 13.000 rpm trong 1 phút

Bước 8: Chuyển cột sang ống thu dịch ly tâm khác và ly tâm với

13.000 rpm trong 1 phút

Bước 9: Chuyển cột sang eppendorf 1,5 ml đã ghi kí hiệu mẫu, cho 10

μl EB vào cột và ly tâm 13.000 rpm trong 1 phút

C

Bước 11: Sản phẩm PCR sau khi tinh sạch được gửi đi giải trình tự ở

Công ty Macrogen (Hàn Quốc)

2.2.4.4 Phương pháp phân tích số liệu

- Sử dụng chương trình BLAST để tìm kiếm các trình tự tương đồng đã được các tác giả khác công bố trên ngân hàng DNA (Genbank)

- Các trình tự DNA được so sánh, phân tích với các loài thuộc chi

Panax và loài Eleutherococcus senticosus là loài ngoài nhóm (Bảng 2.3) sử

dụng các phần mềm ClustalW [46], GeneDoc 2.5 [47], phần mềm MEGA X [48] được dùng để phân tích tiến hóa phân tử và xây dựng cây phát sinh chủng loại theo phương pháp Maximum Likelihood (ML) với giá trị

bootstrap dùng để đánh giá độ tin cậy của cây phát sinh chủng loại được tính với 1.000 lần lấy mẫu thử (resampling) [45, 46]

Bảng 2.3 Danh sách trình tự sử dụng trong nghiên cứu thu thập trên Genbank

1 P ginseng

U41680 U41681

2 P quinquefolius

U41688 U41689

3 P japonicus Nhật Bản (JP)

U41702 AF263373

5 P japonicus var bipinnatifidus U41679

6 P japonicus var angustifolius AY271915

7 P japonicus var bipinnatifidus HQ112421

10

P vietnamensis var vietnamensis

11

P vietnamensis var langbianensis

12

P vietnamensis var fuscidiscus

Mường Tè, Lai Châu, Việt Nam (MT)

KJ418191

TT Loài/thứ ITS

13

P vietnamensis var fuscidiscus

Tam Đường, Lai Châu, Việt Nam (TĐ) KJ418187

14

P vietnamensis var fuscidiscus

Sìn Hồ, Lai Châu, Việt Nam (SH) KJ418184

15 P pseudoginseng

U41693 U41694

22 P stipuleanatus

HQ112444 HQ112441 AY271921 AY271922

23

P stipuleanatus

Tam Đường, Lai Châu, Việt Nam (TĐ) KJ418196

24 Eleutherococcus senticosus AB570259

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1.1 Đặc điểm nhận bi t chi Panax

Trên cơ sở kết hợp giữa phân loại về hình thái và đặc điểm trình tự

vùng gen ITS-rDNA, đề tài đã xác định được 03 loài thuộc chi Panax ở khu

vực Tây Nghệ An

Khóa định loại các loài thuộc chi Panax ở vùng Tây Nghệ An

1a Gốc cuống lá có phần phụ dạng gai.………… 1 Panax notoginseng

1b Gốc cuống lá không có phần phụ

2a Lá chét có cuống dài 0,5-0,8 cm………… 2 Panax stipuleanatus 2b Lá chét không cuống hay gần như không cuống…3 Panax zingiberensis 3.1.2 Panax notoginseng (Burkill) F.H.Chen ex C.H Chow -

Tam thất

F.H.Chen ex C.H Chow, 1975 Acta Phytotax Sin 13(2):41; Xiang

Q et al 2007 Fl China, 13: 490

- Aralia quinquefolius var notoginseng Burk 1920

Cây thân thảo, cao 20-60 cm Thân rễ nạc, rễ củ 1 hoặc nhiều hơn, màu trắng đục, hình con quay, chiều dài từ 5-12cm, đường kính khoảng 1-5cm Lá 3-6, mọc vòng ở đỉnh thân, kép chân vịt, gốc cuống không có gai hay có phần phụ dạng gai Lá chét 3-7 hình trứng ngược, trứng ngược-thuôn, cỡ 3,5-13 x 1,5-7 cm, dạng màng, hai mặt có lông thưa trên gân, gốc xiên, mép có răng nhỏ, đỉnh nhọn Chưa thấy được hoa (Hình 3.1, Hình 3.2) Theo tài liệu nghiên cứu, loài này có hoa màu lục vàng nhạt với 5 lá đài, cánh hoa 5, nhị 5

và bầu dưới, 2 ô Quả mọng hình cầu dẹt, khi chín có mầu đỏ, hạt hình cầu mầu trắng [34]

Hình 3.1 Panax notoginseng (Burkill) F.H.Chen ex C.H Chow - Tam thất

(lá mẫu TH1) Ảnh: Vũ Đình Duy

Hình 3.2 Panax notoginseng (Burkill) F.H.Chen ex C.H Chow - Tam thất

(củ mẫu TH1) Ảnh: Vũ Đình Duy

Loc class.: China: Yunnan: mountains near Mengzi, forests, 5000 ft Typus: A Henry 11407 (K)

Sinh học và sinh thái: Mùa hoa tháng 7-8, mùa quả tháng 9-10 Cây

mọc trong rừng ở độ cao 1200-1800m

Phân bố: Việt Nam Còn có ở Trung Quốc

Mẫu nghiên cứu: TH1

Địa điểm thu mẫu: Vườn ươm Công ty TNHH TH true MILK, Na

Ngoi, Kỳ Sơn, Nghệ An

Nơi lưu trữ mẫu: Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam

Giá trị sử dụng: Cây làm thuốc

Đặc điểm sinh học phân tử:

Mẫu Panax TH1 có trình tự vùng gen ITS-rDNA dài 588bp và tương đồng với P notoginseng U41685 (Phụ lục 1)

Kết hợp giữa kết quả nghiên cứu hình thái và sinh học phân tử, đề tài

có thể khẳng định mẫu TH1 thuộc loài P notoginseng Seem

3.1.3 Panax stipuleanatus Tsai et Feng- Tam thất hoang

Tsai & Feng, 1975 Acta Phytotax Sin 13(2): 44, pl 7, f 4, 6; N T Bân, 2003 Checkl Pl Spec Vietn 2: 1076; Xiang Q et al 2007 Fl China, 13: 490

Cây thân thảo, sống nhiều năm, cao khoảng 50-70 cm, với thân rễ mập giống như rễ tre, dài khoảng 7-12 cm, đường kính 1-2,8 cm (Hình 3.3B, Hình 3.3) Thân khí sinh, mọc thẳng, nhẵn, đặc, cao 35-56, đường kính 0,3-0,5 cm

Lá mọc vòng ở đỉnh thân, xòe ra Lá kép chân vịt, có 5 (-7) lá chét, dạng màng, gân mặt trên lá có lông dạng móc; đôi lá chét dưới cùng thường nhỏ nhất, hình thuôn rộng với cuống nhỏ dài khoảng 0,5-0,8 cm, gốc gần tròn, chóp tròn, mép có răng cưa hoặc nguyên Chưa thấy được hoa, quả và hạt nên

việc xác định tên các mẫu Sâm Panax thu ở khu vực Phu Xai Lai Leng là P stipuleanatus Tsai & Feng chưa đủ tin cậy (Hình 3.3) Theo tài liệu nghiên

cứu, loài này có hoa màu vàng xanh Cụm hoa tán mọc đơn độc ở đỉnh thân giữa các lá, dài khoảng 12-16 cm với 5 lá đài nhỏ, cánh hoa 5, nhị 5 và bầu 2

ô Quả mọng, gần hình cầu dẹt, đường kính 0,6-1,2 cm, khi chín có màu đỏ Hạt 1 hoặc 2, màu xám trắng [38]

Ghi chú: Trong số các mẫu vật nghiên cứu thu được ở khu vực Phu Xai Lai Leng có hai dạng khác nhau về lá: dạng có lá chét nguyên Hình 3.1C, Hình 3.1) và dạng có lá chét xẻ (Hình 3.3C, Hình 3.3)

Hình 3.3 Mẫu Panax thu ở khu vực Phu Xai Lai Leng A Cây đủ rễ và lá; B

Rễ củ; C Lá; D Hạt phấn; E Cuống hoa; G Hoa Ảnh: Phạm Văn Thế

Loc class.: China: Yunnan: Maguan, forests in valleys, 1100-1700 m,

7 Dec 1947 Typus: K M Feng 1364 (KUN)

Sinh học và sinh thái: Mùa hoa tháng 4-5, quả tháng 5-9 (10) Nhân giống tự nhiên chủ yếu bằng hạt Quả chín thường bị chim ăn, hạt rơi xuống đất lại bị loại sóc nhỏ ăn nhân hạt Cá biệt trong tự nhiên, quả chín tồn tại đến tháng 9 hoặc tháng 10 Cây có thể tái sinh tự nhiên bằng hạt, quả chín rụng ngay xuống đất, xung quanh gốc cây mẹ, nếu không bị tác động, hạt sẽ nảy mầm vào tháng 3 năm sau [33] Phần thân mang lá lụi hàng năm vào mùa đông, chồi mới mọc lên từ đầu thân rễ, vào đầu mùa xuân năm sau Khi thân rễ bị gãy, phần đầu mầm còn lại có khả năng tiếp tục tái sinh Cây đặc biệt ưa ẩm và ưa bóng, mọc rải rác trên đất có nhiều mùn, dưới tán 10 rừng kín thường xanh ẩm, hoặc rừng có xen lẫn với sặt gai, ở độ cao từ 1600- 2300m [47].

An và Hà Giang Trên thế giới Tam thất hoang được tìm thấy ở tỉnh Vân Nam

- Trung Quốc

Mẫu nghiên cứu: TB1-TB4 và ML1 ở Tây Nghệ An

Địa điểm thu mẫu: Khu vực Phu Xai Lai Leng (TB1-TB4) và tại Vườn

ươm Công ty TNHH TH True Milk, Mường Lống, Kỳ Sơn, Nghệ An

Nơi lưu mẫu: Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam

Giá trị sử dụng: Cây làm thuốc [33]