Tính c ấ p thi ế t c ủa đề tài
Chi Boerhavia gồm hơn 40 loài, trong đó Nam sâm bò (Boerhavia diffusa L.) là loài phổ biến, mọc hoang ở nhiều nơi, có thể có chủng dưới loài Cây này là thân thảo, phân bố chủ yếu ở các vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới và nơi có khí hậu ấm áp như Ấn Độ, Trung Quốc, Lào, Campuchia Tại Việt Nam, Nam sâm bò thường thấy ở các vùng đất cát như Quảng Ninh, Bình Thuận và thành phố Hồ Chí Minh Ở Ấn Độ và Brazil, Nam sâm bò được sử dụng trong Y học cổ truyền để điều trị nhiều bệnh, bao gồm tiểu đường và ung thư.
Nam sâm bò tại Việt Nam được sử dụng để điều trị nhiều bệnh lý như hen suyễn, đau dạ dày, phù thũng, thiếu máu, vàng da, gan cổ trướng, tiểu ít và táo bón Rễ của cây có tác dụng lợi tiểu, nhuận tràng, hỗ trợ trị long đờm, loét giác mạc và quáng gà Đặc biệt, lá của Nam sâm bò cũng có hiệu quả trong việc điều trị hen suyễn.
Nam sâm bò thu nhận tại Ấn Độ chứa nhiều hợp chất quý giá như flavonoid, alkaloid, steroid và triterpenoid, trong đó một số chất cho thấy hoạt tính sinh học mạnh mẽ như kháng oxy hóa và chống di căn tế bào ung thư Những hợp chất này có khả năng điều hòa miễn dịch và tạo phức với ion kim loại, từ đó ngăn chặn các phản ứng oxy hóa Nhờ vào những đặc tính này, Nam sâm bò có tiềm năng trong việc phát triển thuốc điều trị các bệnh liên quan đến gốc tự do, bảo vệ cơ thể và ngăn ngừa các vấn đề như xơ vữa động mạch, tai biến mạch máu, lão hóa và tổn thương do bức xạ.
Nghiên cứu của Đỗ Thị Mỹ Liên (2014) đã tiến hành khảo sát thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của ba loài thuộc chi Boerhavia trong họ Bông phấn.
Nghiên cứu đã phân lập thành công 55 hợp chất, trong đó có 16 hợp chất mới Kết quả sàng lọc cho thấy các hợp chất boeravinone có khả năng ức chế tế bào ung thư, thể hiện hoạt tính gây độc tế bào trên dòng tế bào ung thư vú MCF-7 và ung thư cổ tử cung HeLa.
Tuy nhiên, ở Việt Nam, các bằng chứng khoa học về loài dược liệu này còn chưa sáng tỏ
Trên toàn cầu và tại Việt Nam, sự phát triển kinh tế - xã hội đi kèm với nhiều bệnh tật tiềm ẩn từ môi trường, trong đó các gốc oxy hoạt động (ROS) là một tác nhân chính Các ROS này có thể xuất hiện từ quá trình sinh hóa tế bào hoặc do tác động của các yếu tố vật lý, hóa học, ô nhiễm và viêm Ở nồng độ cao, chúng có khả năng tấn công các đại phân tử như DNA, protein và lipid, gây hại cho tế bào qua quá trình oxy hóa màng tế bào Hậu quả là, chúng cản trở việc thải chất cặn bã và tiếp nhận dinh dưỡng, đồng thời tấn công ty thể, làm suy yếu nguồn cung cấp năng lượng Cuối cùng, các gốc tự do này làm giảm hiệu quả của hormone và enzyme, ảnh hưởng đến sự phát triển của cơ thể Một số gốc tự do phổ biến bao gồm superoxid (O2 ●), hydroxyl (OH ●), hydroperoxid (HOO ●), peroxid (ROO ●) và oxid nitric (NO ●).
Trong hóa trị liệu ung thư, các nghiên cứu đã chỉ ra mối liên hệ giữa kháng thuốc và nồng độ gốc oxy hóa trong tế bào Phát hiện này mở ra cơ hội mới trong điều trị lâm sàng, giúp hạn chế khả năng kháng thuốc và nâng cao sức đề kháng cho bệnh nhân ung thư.
Trong cơ thể, tế bào chứa các enzyme tham gia vào quá trình chuyển hóa các ROS, trong khi các hợp chất kháng oxi hóa có khả năng tương tác và vô hiệu hóa chúng Một số chất kháng oxy hóa quan trọng bao gồm vitamin E, omega-3, N-acetyl-cysteine và bardoxolone Nhu cầu bảo vệ sức khỏe và chăm sóc sắc đẹp của con người ngày càng gia tăng, dẫn đến việc bổ sung các chất kháng oxy hóa từ tự nhiên Nghiên cứu các hoạt chất từ thiên nhiên có khả năng ức chế gốc tự do hiện đang thu hút sự quan tâm của các nhà khoa học.
Nghiên cứu này tập trung vào việc khám phá các đặc điểm sinh học của Nam sâm bò tại khu vực Cần, bao gồm các đặc điểm hình thái và khả năng kháng oxi hóa in vitro.
Giờ - Tp HCM để cung cấp những dẫn liệu cho các nghiên cứu về sau và ứng dụng trong lĩnh vực y học.
M ụ c tiêu nghiên c ứ u c ủa đề tài
Nghiên cứu khả năng kháng oxy hóa in vitro của Nam sâm bò thu nhận ở huyện Cần Giờ (Tp HCM).
N ộ i dung nghiên c ứ u
- Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của các cao chiết ethanol và chloroform của Nam sâm bò
- Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của nước sắc Nam sâm bò.
Cách ti ế p c ậ n c ủa đề tài
Các gốc tự do, có nguồn gốc từ oxy và năng lượng cao, có khả năng phản ứng với các đại phân tử trong tế bào như lipid, protein, và DNA bằng cách cho điện tử, từ đó gây rối loạn các quá trình sinh hóa trong cơ thể Trong tự nhiên, có nhiều hợp chất có khả năng tương tác và vô hiệu hóa các gốc tự do này, được gọi là các chất kháng oxy hóa.
Một số phương pháp khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa bao gồm phương pháp bắt gốc tự do DPPH, đánh giá năng lực khử và thử nghiệm hoạt tính ức chế gốc tự do Những phương pháp này giúp xác định khả năng chống oxy hóa của các hợp chất và sản phẩm khác nhau.
NO, xác định hàm lượng Malonyl dialdehyde, đánh giá khả năng kết hợp với ion sắt
Phương pháp thử hoạt tính ức chế enzyme xanthine oxidase là một trong những cách để khảo sát khả năng kháng oxy hóa của hợp chất, với mỗi phương pháp tập trung vào các gốc tự do khác nhau trong tế bào Trong số đó, phương pháp bắt gốc tự do DPPH được ưa chuộng nhất nhờ vào tính hiệu quả, độ tin cậy và tốc độ cho kết quả ổn định.
Chúng tôi đã áp dụng phương pháp bắt gốc tự do DPPH để nghiên cứu khả năng kháng oxy hóa của cao chiết và nước sắc từ Nam sâm bò, trong bối cảnh giới hạn của đề tài và điều kiện phòng thí nghiệm.
DPPH (2,2-diphenyl-1-picylhydrazyl) là một gốc tự do bền vững, có màu tím và không tan trong nước nhưng tan trong dung môi hữu cơ Dung dịch DPPH hấp thu cực đại tại bước sóng 517 nm và tạo ra sản phẩm khử là 2,2-diphenyl-1-picylhydrazine.
Phương pháp này ban đầu được nêu ra bởi Blois (1958) sau đó được phát triển bởi nhiều nhà khoa học khác (Brand – Williams – 1995; Kim – 2002; Zhu – 2002)
Các chất kháng oxy hóa hoạt động bằng cách trung hòa gốc DPPH thông qua việc cung cấp hydrogen, dẫn đến sự giảm độ hấp thu tại bước sóng cực đại và làm nhạt màu dung dịch phản ứng, chuyển từ màu tím sang màu vàng nhạt.
Ph ạ m vi nghiên c ứ u
Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của nước sắc, cao chiết ethanol và cao chloroform từ thân, lá, rễ của Nam sâm bò được thực hiện bằng phương pháp bắt gốc tự do DPPH Nghiên cứu này nhằm đánh giá hiệu quả của các chiết xuất khác nhau trong việc loại bỏ các gốc tự do, từ đó xác định tiềm năng ứng dụng của Nam sâm bò trong lĩnh vực bảo vệ sức khỏe.
TỔ NG QUAN TÀI LI Ệ U
Hi ện tượ ng oxy hóa và kháng oxy hóa
1.1.1 Hi ện tượng oxy hóa trong tế bào
Oxy là yếu tố thiết yếu trong hô hấp tế bào, đóng vai trò là chất nhận điện tử cuối cùng trong chuỗi electron hô hấp tại màng ty thể Chuỗi truyền điện tử bao gồm các phản ứng oxy hóa – khử, trong đó các chất cho điện tử như NADH và FADH2 được gọi là chất khử, trong khi các chất nhận điện tử được gọi là chất oxy hóa.
Quá trình phản ứng oxy hóa – khử tạo ra các gốc oxy hoạt động (ROS), là những gốc thiếu electron ở lớp ngoài cùng và dễ dàng nhận electron từ các phân tử khác Một số gốc ROS phổ biến trong tế bào bao gồm hydroxyl (OH ●), hydroperoxyl (HOO ●), peroxyl (ROO ●), alkoxyl (RO ●), lipoperoxyde (LOO ●) và H2O2 Ở nồng độ nhất định, các gốc ROS không chỉ cung cấp năng lượng cho cơ thể mà còn kích thích tổng hợp sắc tố melamine, sản xuất prostaglandin, một chất quan trọng trong việc ngăn ngừa nhiễm trùng, tăng cường miễn dịch, và hỗ trợ truyền đạt tín hiệu thần kinh cùng co bóp cơ.
Ở nồng độ cao, các gốc ROS có thể gây hại cho tế bào và cơ thể do tính không ổn định của chúng, khiến chúng chiếm đoạt điện tử từ các cấu trúc lân cận và tạo ra nhiều gốc ROS mới Chúng có khả năng tấn công vào DNA, gây đứt gãy chuỗi đơn và chuỗi đôi, dẫn đến đột biến gen và rối loạn quá trình truyền đạt thông tin di truyền Ngoài ra, các gốc ROS cũng tấn công vào protein và oxy hóa màng tế bào, làm rối loạn quá trình vận chuyển chất và hô hấp tế bào Nếu không được kiểm soát, gốc ROS có thể gây ra lão hóa và các bệnh như xơ vữa động mạch, suy yếu hệ miễn dịch, giảm trí tuệ, tiểu đường, và ung thư.
Nồng độ các gốc tự do ROS trong cơ thể chịu ảnh hưởng từ nhiều yếu tố nội tại và ngoại tại Các gốc ROS có xu hướng gia tăng khi cơ thể đối mặt với bệnh tật, căng thẳng, hoặc tiếp xúc với môi trường ô nhiễm, tia UV và khói thuốc lá.
Tế bào sở hữu cơ chế tự điều chỉnh để cân bằng các gốc tự do ROS Các chất có khả năng chống lại những gốc này được gọi là chất kháng oxy hóa (Antioxidant).
1.1.2 Hi ện tượng kháng oxy hóa trong tế bào
Chất kháng oxy hoá được chia thành 2 loại: Các chất kháng oxy hoá có bản chất enzyme và các chất kháng oxy hoá không có bản chất enzyme (hình 1.1)
Trong tế bào, một số enzyme như superoxid dismutase, catalase và peroxidase có khả năng xúc tác các phản ứng, giúp loại bỏ các gốc tự do ROS và chuyển hóa chúng thành những sản phẩm không độc hại cho cơ thể.
Superoxid dismutase là enzyme xúc tác cho phản ứng trung hòa gốc anion dioxide (O 2 • ), theo sơ đồnhư sau:
Catalase là enzyme xúc tác cho phản ứng phân huỷ H 2 O 2 tạo thành H 2 O và O 2 theo sơ đồnhư sau: H2O 2 → H 2 O + O 2
Peroxidase là một nhóm enzyme xúc tác cho phản ứng oxy hóa – khử, chuyển phân tử H 2 O 2 thành một chất không có khảnăng oxy hóa và H2O:
AH 2 + H 2 O 2 → A + 2 H 2 O (AH 2 là cơ chất hữu cơ) Ngoài ra, tế bào còn có các enzyme khác xúc tác cho các phản ứng oxy hóa – khửnhư glutathion reductase, gluthion peroxidase.
Các chất kháng oxy hóa không phải enzyme như vitamin A, vitamin E, bioflavonoid, coenzyme Q, glutathione và N-acetyl cystein có khả năng ngăn chặn các gốc tự do ROS.
Vitamin E giúp ngăn chặn quá trình oxy hóa các acid béo chưa bão hòa trong màng tế bào bằng cách liên kết với phần hydrocarbon, từ đó dập tắt các phản ứng dây chuyền và ngăn chặn sự hình thành gốc tự do mới.
R • (ROO • ) + Vitamine E → RH(ROOH) + Vitamine E •
R • (ROO • ) + Vitamine E • →RH(ROOH) + Tocopherol quinon
(RH là các acid béo chưa bão hòa)
Vitamin E hình thành tocopherol quinon, một chất không độc hại cho tế bào, giúp loại bỏ gốc tự do trong cơ thể Nhờ đó, vitamin E duy trì độ bền và sự nguyên vẹn của màng tế bào cũng như DNA.
Flavonoid là các hợp chất được cấu tạo từ nhóm hydroxyl phenolic, nhóm carbonyl và vòng thơm benzen Chúng có khả năng chuyển đổi các gốc tự do ROS thành những chất ổn định hơn, từ đó ngăn chặn sự hình thành các gốc ROS mới trong tế bào do không tham gia vào các phản ứng oxy hóa – khử.
Vitamine C có khảnăng kháng oxy hóa theo cơ chếnhư sau:
Vitamine E-O • + Vitamine C khử → Vitamine E-OH + Vitamine C oxy hoá
Trong quá trình khử các gốc tự do, vitamine C có khảnăng phục hồi vitamine
E ở trạng thái oxy hóa thành vitamine E ở trạng thái khử
Vitamin C có khả năng loại bỏ các gốc tự do như hydrogen peroxide, superoxide và hydroxyl trong những điều kiện nhất định Nhờ đó, vitamin C giúp tăng cường sức đề kháng của cơ thể, góp phần bảo vệ chống lại nhiều bệnh nghiêm trọng như ung thư, bệnh tim mạch và viêm nhiễm.
Certain compounds such as glutathione, mercaptopropionyl glycine, and N-acetyl cysteine exhibit strong reducing properties, enabling them to neutralize free radicals like hydroxyl radicals (•OH), which subsequently generate thiyl radicals through a specific reaction.
Các gốc thiyl (RS • ) có khả năng kết hợp với nhau để hình thành phức hợp disulfur (RS-SR) hoặc có thể trung hòa một gốc oxy hóa khác thông qua phản ứng hóa học.
Nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng các chất chống oxy hóa như vitamin C và vitamin E có nhiều trong rau quả và thảo dược Để ngăn ngừa lão hóa và bệnh tật, các nhà khoa học đang tích cực khám phá và sàng lọc các chất chống oxy hóa tự nhiên.
Gi ớ i thi ệ u v ề Nam sâm bò
Họ: Bông phấn Nyctaginaceae Chi: Sâm nam Boerhavia Loài: Boerhavia diffusa L
Tên Việt Nam: Nam sâm bò, Sâm đất, Sâm quy đầu [4]
1.2.2.1 Đặc điểm hình thái Nam sâm bò
Nam sâm bò là một loại cây thân thảo, mọc lan sát mặt đất với rễ củ hình thoi Thân cây có hình trụ, phân cành tại các lóng, có màu xanh đến tím Lá cây mọc đối, dày, có hình bầu dục hoặc thon, không có lông hoặc chỉ có lông thưa, với gân lá rõ rệt và mép lượn sóng Mặt dưới lá có nhiều lông màu trắng lục, trong khi mặt trên nhẵn và có màu lục thẫm, kích thước lá dài từ 2 đến 4 cm và rộng từ 0,15 đến 0,3 cm Cuống lá dài từ 1 đến 1,5 cm và có phủ lông ngắn.
Phát hoa tận cùng và cụm hoa hình xim chứa 3 hoa không cuống, mọc ở nách lá hoặc đầu cành Các nhánh hoa có lông tròn dính, hoa lưỡng tính màu đỏ tía với 1-2 nhị Quả hình trụ dài 0,3 cm, phồng ở đầu và có 5 cạnh, đi kèm với lông dính.
1.2.2.2 Đặc điểm sinh thái Nam sâm bò
Nam sâm bò phân bốở vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới và nơi có khí hậu ấm áp
Nam sâm bò, một loại thảo dược quý, phân bố rộng rãi ở nhiều quốc gia như Ấn Độ, Trung Quốc, Lào, Campuchia và các vùng nhiệt đới khác Tại Việt Nam, cây này mọc hoang tại nhiều địa phương, đặc biệt là ở các vùng đất cát như Quảng Ninh, Bình Thuận và thành phố Hồ Chí Minh.
1.2.3 Các công trình nghiên c ứu về Nam sâm bò
Nam sâm bò, theo nghiên cứu của Đỗ Huy Bích và cộng sự, được sử dụng để điều trị nhiều bệnh như hen suyễn, đau dạ dày, phù thũng, thiếu máu, vàng da, gan cổ trướng, và các vấn đề liên quan đến tiểu tiện như tiểu ít và táo bón Rễ của cây có tác dụng lợi tiểu, nhuận tràng, giúp trị long đờm, loét giác mạc và quáng gà Đặc biệt, lá Nam sâm bò cũng có hiệu quả trong việc điều trị hen suyễn.
Năm 2014, Đỗ Thị Mỹ Liên đã khảo sát hóa học và hoạt tính sinh học của 3 loài Boerhavia, phát hiện 55 hợp chất, trong đó có 16 hợp chất mới Kết quả cho thấy các hợp chất boeravinone có khả năng ức chế tế bào ung thư, đặc biệt trên dòng tế bào MCF-7 và Hela.
Năm 2009, Manu, A G và Kuttan, G đã nghiên cứu tác động của hợp chất alkaloid từ Nam sâm bò (Ấn Độ) lên sự chết theo chương trình của tế bào ung thư ác tính B16F-10 Kết quả cho thấy hợp chất punarnavine có khả năng ức chế nhân tố phiên mã phụ thuộc nhân (NF-kB), từ đó khẳng định tiềm năng kháng ung thư của Nam sâm bò.
Năm 2010, nghiên cứu của Srivastava, R và cộng sự đã chỉ ra rằng cao ethanol chiết xuất từ rễ Nam sâm bò có khả năng ức chế sự tăng sinh của tế bào ung thư cổ tử cung Hela Cụ thể, cao chiết này tác động bằng cách ức chế tổng hợp DNA ở pha S trong chu kỳ tế bào, cho thấy tiềm năng chống ung thư của nó.
Năm 2010, Gopal, T K và cộng sự đã nghiên cứu hoạt tính kháng oxy hóa của các cao chiết từ rễ Nam sâm bò (Ấn Độ), bao gồm ethyl acetate, ethanol và chloroform, bằng phương pháp bắt gốc tự do DPPH Kết quả cho thấy cao chiết ethanol có hoạt tính kháng oxy hóa mạnh hơn so với cao chiết ethyl acetate và chloroform Cụ thể, giá trị IC 50 của cao chiết ethanol từ rễ là 134 µg/ml.
Cao chiết ethanol từ lá Nam sâm bò ở Nigeria đã cho thấy hoạt tính kháng oxy hóa đáng kể, với khả năng bắt 78,32 ± 2,41% gốc tự do DPPH ở nồng độ 1000 µg/ml Ngoài ra, kết quả từ phương pháp thử năng lực khử cho thấy giá trị mật độ quang đạt 0,65 ± 0,02 tại cùng nồng độ 1000 µg/ml (Tollulope O M và cộng sự, 2010).
Năm 2011, nghiên cứu của Guha và cộng sự đã khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của các chiết xuất từ lá Nam sâm bò (Ấn Độ) bằng phương pháp DPPH Kết quả cho thấy giá trị IC 50 của các mẫu cao chiết: cao nước (200,82 ± 0,55 àg/ml), cao methanol (327,40 ± 0,68 àg/ml), cao chloroform (409,81 ± 0,62 àg/ml), và cao hexane (2351,60 ± 0,18 àg/ml) Qua đó, cao nước và methanol thể hiện hoạt tính kháng oxy hóa mạnh hơn so với cao chloroform và hexane, cho thấy Nam sâm bò có khả năng bắt gốc tự do mạnh ở những dung môi phân cực.
Năm 2012, Apu, S A và cộng sự đã nghiên cứu khả năng kháng oxy hóa của các cao chiết methanol, hexane và ethyl acetate từ Nam sâm bò ở Bangladesh bằng phương pháp bắt gốc tự do DPPH Kết quả cho thấy cao chiết methanol có khả năng kháng oxy hóa cao nhất với IC 50 = 8,18 µg/ml, vượt trội hơn so với cao chiết hexane (IC 50 = 40,61 µg/ml) và ethyl acetate (IC 50 = 43,81 µg/ml) Nghiên cứu này khẳng định rằng các cao chiết có tính phân cực mạnh như methanol thể hiện khả năng bắt gốc tự do DPPH tốt hơn so với các dung môi có tính phân cực yếu như hexane và ethyl acetate.
Research indicates that various compounds such as flavonoids, alkaloids, steroids, triterpenoids, lipids, lignin, carbohydrates, proteins, and glycoproteins are present in Boerhavia diffusa (commonly known as punarnava) Notable compounds like punarnavine, boeravinone, hypoxanthine 9-L-arabinofuranoside, ursolic acid, and β-sitosterol exhibit significant biological activities Flavonoids, in particular, have been shown to possess antioxidant properties and can chelate metal ions, acting as catalysts to inhibit oxidative reactions Consequently, flavonoids play a protective role in the body, helping to prevent atherosclerosis, vascular accidents, aging, liver degeneration, and radiation-induced damage Additionally, specific flavonoids such as boeravinone A, B, and C have been isolated from Boerhavia diffusa in India, further highlighting their potential health benefits.
D, E, F, G,… đều thể hiện hoạt tính kháng oxy hóa Đặc biệt, boeravinone G được chứng minh có hoạt tính kháng oxy hoá mạnh, có tiềm năng trong việc điều chế các loại thuốc chữa trị các bệnh liên quan tới gốc tự do Một số hợp chất phenolic được phân lập từ Nam sâm bò là eupalitin 3-o-galactoside, quercetin và kaempferol Trong đó, quercetin được chứng minh có khảnăng kháng virus, kháng khuẩn, kháng ung thư và kháng viêm Quercetin làm gia tăng sự chết của các tế bào, ức chế sự tổng hợp DNA, ức chế sựtăng trưởng tế bào và biến đổi con đường truyền tín hiệu ở các tế bào bị đột biến Từ đó cho thấy, quercetin có tiềm năng kháng ung thư Các hợp chất alkaloid (punarnavine, hypoxanthine 9-L-arabinofuranoside,…) trong Nam sâm bò cũng có nhiều hoạt tính sinh học quan trọng Một trong những hợp chất alkaloid được chiết xuất từ Nam sâm bò là punarnavine (C 17 H 22 N 2 O) được chứng minh có khả năng chống lại sự di căn của các tế bào ung thư, điều hòa miễn dịch, chống viêm, giảm đau, Rễ Nam sâm bò có chứa 0,04% hợp chất này [8, 12, 17, 18,
Năm 2014, nghiên cứu của Sharma và các cộng sự đã chỉ ra rằng cao chiết methanol từ cây Nam sâm bò có khả năng kháng oxy hóa đáng kể, với hoạt tính cao nhất được ghi nhận ở lá (137,67 ± 2,516 Mm/L.g) và thấp nhất ở rễ (74,33 ± 2,081 Mm/L.g).
Năm 2014, Bhardwaj và cộng sự đã khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của cao chiết methanol từ các bộ phận khác nhau của Nam sâm bò ở Ấn Độ bằng phương pháp DPPH Kết quả cho thấy giá trị IC50 của các mẫu cao chiết là 195,25 ± 4,487 µg/ml (lỏ), 90,8 ± 2,275 µg/ml (thõn) và 398,03 ± 4,351 µg/ml (rễ), trong đó cao chiết từ thõn có hoạt tính kháng oxy hóa mạnh nhất.
Đặc điể m t ự nhiên c ủ a th ị tr ấ n C ầ n Th ạ nh, huy ệ n C ầ n Gi ờ
Thị trấn Cần Thạnh nằm cách trung tâm thành phố Hồ Chí Minh 57 km và chỉ 15 km từ Đặc khu Vũng Tàu - Côn Đảo theo đường biển Khu vực này có phần đất liền tiếp giáp với biển Đông.
- Phía Bắc giáp xã Thạnh An – huyện Cần Giờ
- Phía Nam và phía Đông giáp Biển Đông.
- Phía Tây giáp xã Long Hòa – huyện Cần Giờ.
Phương pháp chiế t xu ấ t h ợ p ch ấ t sinh h ọ c t ừ th ự c v ậ t
Đất ở thị trấn Cần Thạnh chủ yếu gồm hai loại: đất cát và đất phèn mặn, với độ cao trung bình khoảng 1 m, thấp nhất là 0,5 m so với mực nước biển Địa hình nơi đây bao gồm giồng cát và đồng trũng, bờ biển thoải và bằng phẳng, giàu phù sa Đất phèn mặn là loại đất chiếm diện tích lớn nhất, được chia thành hai loại: đất phèn mặn theo mùa và đất phèn mặn thường xuyên Trong mùa mưa, nước mặn bị pha loãng trong khoảng 4 đến 5 tháng, tạo điều kiện cho các loài cây ngập mặn phát triển mạnh mẽ, góp phần giữ bờ, lấn biển và bảo vệ môi trường Sự phát triển của hệ thực vật này không chỉ bảo vệ cảnh quan mà còn hỗ trợ cho du lịch sinh thái và duy trì hệ sinh thái phong phú ở vùng ven biển Đông – Nam thành phố.
Thị trấn Cần Thạnh có khí hậu nhiệt đới gió mùa cận xích đạo, với nhiệt độ cao ổn định quanh năm Khu vực này trải qua hai mùa rõ rệt: mùa mưa từ tháng 4 đến tháng 10 và mùa khô từ tháng 11 đến tháng 3 năm sau.
1.4 Các phương pháp chiết xuất hợp chất sinh học từ thực vật
1.4.1 Phương pháp chiết lỏng – lỏng
Phương pháp chiết lỏng – lỏng được sử dụng để phân tách cao ethanol thô hoặc dịch chiết ban đầu thành các phân đoạn có tính phân cực khác nhau Nguyên tắc của phương pháp này là dung môi không phân cực hòa tan hiệu quả các hợp chất không phân cực, trong khi dung môi phân cực trung bình và phân cực mạnh tương ứng hòa tan tốt các chất có tính phân cực trung bình và mạnh.
Hình 1.1 Phương pháp chiết lỏng – lỏng
Phương pháp chiết lỏng – lỏng sử dụng bình lóng, trong đó cao ethanol thô được hòa tan vào pha nước Các dung môi hữu cơ không hòa tan với nước được sử dụng để chiết các hợp chất phân cực khác nhau từ pha nước Vị trí của pha hữu cơ sẽ phụ thuộc vào tỉ trọng giữa các dung môi và nước, có thể nằm ở lớp trên hoặc dưới so với pha nước.
Quá trình chiết xuất bắt đầu bằng việc sử dụng dung môi kém phân cực như ete dầu hỏa hoặc hexane, sau đó chuyển sang các dung môi phân cực mạnh hơn như chloroform, ethyl acetate và buthanol Mỗi loại dung môi được sử dụng nhiều lần với lượng nhỏ, cho đến khi không còn chất hòa tan, sau đó chuyển sang dung môi có tính phân cực cao hơn Các dung dịch thu được từ các lần chiết được gom lại và loại bỏ nước bằng các chất như Na2SO4, MgSO4 hoặc CaSO4, cuối cùng thu được cao chiết.
1.4 2 Phương pháp chiết rắn – lỏng
Phương pháp chiết rắn – lỏng bao gồm 2 phương pháp là: chiết ngấm kiệt và ngâm dầm
1.4.2.1 Phương pháp chiết ngấm kiệt
Phương pháp này sử dụng bình ngấm kiệt bằng thủy tinh hình trụ đứng, có van khóa ở đáy để điều chỉnh tốc độ chảy của dung dịch Dung dịch chiết được hứng ở bình chứa bên dưới, trong khi phía trên cùng là bình lóng chứa dung môi tinh khiết.
Dung môi trong bình lóng chảy từ từ qua lớp bột cây, giúp các chất tự nhiên trong bột hòa tan vào dung môi Quá trình này cho phép các hợp chất hòa tan theo dung môi và chảy xuống bình chứa bên dưới.
Hình 1.2 Phương pháp chiết ngấm kiệt
1.4.2.2 Phương pháp chiết ngâm dầm
Phương pháp chiết ngâm dầm tương tự như chiết ngấm kiệt nhưng không cần thiết bị phức tạp, giúp dễ dàng thao tác với số lượng lớn mẫu cây.
Bột cây nên được ngâm trong bình thủy tinh có nắp đậy, tránh sử dụng bình nhựa để ngăn chặn sự hòa tan của nhựa vào dung môi hữu cơ Dung môi tinh khiết được thêm vào bình và giữ ở nhiệt độ phòng, cho phép dung môi thẩm thấu vào cấu trúc tế bào thực vật và hòa tan các hợp chất tự nhiên Sau đó, dịch chiết được lọc qua giấy lọc và dung môi được cô quay đuổi để thu được cao chiết Quá trình này tiếp tục cho đến khi mẫu cây được chiết kiệt hoàn toàn.
Thời gian ngâm bột cây trong dung môi cần khoảng 48 giờ để đạt được mức hòa tan tối đa, vì lượng dung môi trong bình là cố định và mẫu chất chỉ hòa tan đến mức bão hòa.
Hình 1.3 Phương pháp chiết ngâm dầm
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã áp dụng phương pháp chiết ngâm dầm trong điều kiện phòng thí nghiệm để thu nhận cao chiết ethanol và cao chloroform từ Nam sâm bò.
VẬ T LI ỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨ U
V ậ t li ệ u nghiên c ứ u
Nam sâm bò (thân, lá, rễ) được thu nhận tại thị trấn Cần Thạnh, huyện Cần
Giờ, thành phố Hồ Chí Minh Thời gian thu mẫu vào tháng 9 năm 2014 Nam sâm bò được định danh theo “Cây cỏ Việt Nam” (Phạm Hoàng Hộ, 1999) [4]
Mẫu được bảo quản tại phòng thí nghiệm Di truyền – Thực vật, trường Đại học
Sư phạm thành phố Hồ Chí Minh.
Hóa ch ấ t
Hóa chất sử dụng trong phương pháp thu nhận cao chiết:
- Ethanol tuyệt đối (xuất xứ Trung Quốc)
- Chloroform tuyệt đối (xuất xứ Trung Quốc)
Hóa chất sử dụng trong phương pháp thử hoạt tính bắt gốc tự do DPPH:
Nồng độ 15 μg/ml của acid ascorbic (Sigma) được xác định là giá trị IC 50 trong điều kiện phòng thí nghiệm, cho thấy đây là nồng độ mà tại đó acid ascorbic có khả năng ức chế 50% gốc DPPH.
Để pha dung dịch acid ascorbic, đầu tiên cân 0,001 g acid ascorbic và bổ sung 1 ml nước cất hai lần để tạo ra dung dịch gốc có nồng độ 1000 μg/ml Tiếp theo, pha loãng dung dịch này với nước cất hai lần để đạt nồng độ 15 μg/ml theo công thức đã hướng dẫn.
C 1 x V 1 = C 2 x V 2 Trong đó: C1: nồng độ dung dịch ban đầu (1000 μg/ml)
C 2 : nồng độ dung dịch sau (15 μg/ml)
V 1 : thể tích dung dịch tại nồng độ 1000 μg/ml cần để pha loãng
V 2 : thể tích dung dịch tại nồng độ 15 μg/ml cần cho nghiệm thức nghiên cứu trong đề tài
Dung dịch gốc cần được bảo quản trong điều kiện không có ánh sáng và ở nhiệt độ 4 độ C Trước khi tiến hành thí nghiệm, các dung dịch có nồng độ khảo sát sẽ được pha loãng.
Dung dịch DPPH (80 μM, Sigma) được tạo thành bằng cách hòa tan 3,3 mg DPPH trong 100 ml methanol tuyệt đối, đạt nồng độ 80 μM Để bảo quản, dung dịch này cần được giữ ở nhiệt độ 4°C và tránh ánh sáng Trước khi tiến hành thí nghiệm, dung dịch DPPH sẽ được pha loãng.
Phương pháp nghiên cứ u
2.3.1 Phương pháp lấy mẫu và xử lý mẫu đất
Phương pháp lấy mẫu đất và xửlý được thực hiện theo tác giảĐoàn Văn Cung và cộng sự, 1998 [2]
Mẫu đất được thu tại hai tầng 0-30 cm và 30-60 cm để xác định các chỉ tiêu pH, độ ẩm và hệ số khô kiệt Quá trình thu mẫu diễn ra tại 5 điểm khác nhau, sau đó trộn thành hỗn hợp chung nặng 2 kg Đất được để khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng và loại bỏ rác thải Cuối cùng, mẫu đất được nghiền nhỏ để xác định các chỉ tiêu pH, độ ẩm và hệ số khô kiệt.
2.3.2 Phương pháp khảo sát một số điều kiện tự nhiên
2.3.2.1 Phương pháp xác định độ pH đất
Phương pháp xác định pH đất, độ ẩm đất, độ khô kiệt được thực hiện theo tác giảĐoàn Văn Cung và cộng sự, 1998
Lấy 20 g mẫu đất cho vào bình có dung tích 100 ml Bổ sung thêm 50 ml nước cất vào bình Huyền phù đất 4 – 5 lần và tiếp tục huyền phù trên máy lắc 30 phút
(150 vòng/phút) Sau khi huyền phù, để lắng khoảng 2 giờ Huyền phù lại bằng tay
Để đo pH đất, sử dụng pH kế điện cực thủy tinh và thực hiện từ 2 đến 3 lần Đặt bầu điện cực ở trung tâm và tại điểm giữa độ sâu của dung dịch trong huyền phù Đọc chỉ số pH sau khi kim chỉ ổn định trong 30 giây.
2.3.2.2 Phương pháp xác định hệ số khô kiệt và độ ẩm đất
Lấy 5 g mẫu đất cho vào đĩa Petri và sấy ở nhiệt độ 100 – 105 o C trong 4 giờ Để nguội trong bình hút ẩm cho đến khi nhiệt độ mẫu đất bằng nhiệt độ phòng Cân khối lượng lần thứ nhất Tiếp tục sấy ở 100 – 105 0 C trong 2 giờ Để nguội trong bình hút ẩm cho đến khi nhiệt độ mẫu đất bằng với nhiệt độ phòng Cân khối lượng lần thứ 2 Tiếp tục lặp lại các bước như trên cho đến khi khối lượng lần cân sau không thay đổi hoặc thay đổi không quá 0,001 g so với lần trước thì dừng lại [2]
- Độẩm đất được tính theo công thức như sau:
𝑃𝑃 2 − 𝑃𝑃 3 × 100 Trong đó: P1: Khối lượng đĩa Petri có đất trước khi sấy (g)
P 2 : Khối lượng đĩa Petri có đất sau khi sấy (g)
P 3 : Khối lượng đĩa Petri không có đất (g)
- Hệ số khô kiệt được tính theo công thức như sau:
2.3.2.3 Phương pháp xác định nhiệt độ, độ ẩm và cường độ ánh sáng
Tại vị trí thu mẫu, chúng tôi đo nhiệt độ và độ ẩm không khí bằng ẩm kế Extech (Mỹ), cường độ ánh sáng bằng lux kế Tenmars (Đài Loan), và định vị bằng thiết bị Garmin (Thụy Sỹ).
2.3.3 Phương pháp thu mẫu, chế biến và bảo quản mẫu
Nam sâm bò (thân, lá, rễ) được thu cả cây tại huyện Cần Giờ, thành phố Hồ
Chí Minh Thời gian thu mẫu vào tháng 9 năm 2014.
Nam sâm bò được rửa sạch, phân loại các bộ phận và thân cắt nhỏ Sau đó, mẫu đem sấy khô ở 50 0 C cho đến khi trọng lượng không đổi
Sau đó, mẫu sẽđược xay thành bột mịn giữở nơi thoáng mát để làm cao chiết
Mẫu thu nhận nước sắc giữ nguyên, bảo quản trong điều kiện thoáng mát tại phòng thí nghiệm Di truyền - Thực vật
2.3.4 Phương pháp thu nhận nước sắc
Nước sắc được thu nhận theo phương pháp của Hồ Huỳnh Thùy Dương
(2003) Quy trình thu nhận nước sắc như sau: 10 g mẫu khô được bổ sung khoảng
Để thực hiện quy trình, sử dụng 500 ml nước cất hai lần và nấu ở nhiệt độ 70 - 80 độ C trong ba giờ Sau khi hoàn thành, nước sắc thu được sẽ được cô trên bể ổn nhiệt ở nhiệt độ 50 - 60 độ C cho đến khi thể tích đạt tỷ lệ 1:1 (w/v; g/l) so với khối lượng ban đầu.
3.5 Phương pháp thu nhận cao chiết
Cao chiết (ethanol, chloroform) được thu nhận bằng phương pháp chiết ngâm dầm theo nghiên cứu của Nguyễn Kim Phi Phụng (2007), như được thể hiện trong sơ đồ thu nhận cao chiết ở hình 2.1.
Hình 2.1 Sơ đồ quy trình thu nhận cao chiết Nam sâm bò
Mẫu bột Nam sâm bò (thân, lá rễ)
Ngâm trong dung môi ethanol tuyệt đối theo tỉ lệ 1 : 10 (w/v; g/l)
Ngâm trong dung môi chloroform tuyệt đối theo tỉ lệ 1 : 10 (w/v; g/l)
Thu nhận dịch chiết qua lọc Thu nhận dịch chiết qua lọc
Cô quay đuổi dung môi Cô quay đuổi dung môi
2.3.6 Phương pháp thử hoạt tính bắt gốc tự do DPPH
Hoạt tính kháng oxy hóa của các cao chiết và nước sắc Nam sâm bò được khảo sát theo phương pháp bắt gốc tự do DPPH của Brand Williams, 1995
Vào năm 1922, Goldschmidt và Renn phát hiện gốc tự do DPPH (2,2-diphenyl-1-picylhydrazyl) có màu tím đậm, bền và không phản ứng với oxy, không tan trong nước nhưng tan trong dung môi hữu cơ Dung dịch DPPH đạt độ hấp thu cực đại tại bước sóng 517 nm, và khi tham gia phản ứng oxy hóa – khử, nó tạo ra sản phẩm 2,2-diphenyl-1-picylhydrazine (DPPH-H) có màu vàng cam.
Ngày nay, phương pháp DPPH được sử dụng rộng rãi để khảo sát khả năng bắt gốc tự do Phương pháp này nổi bật nhờ tính đơn giản, nhanh chóng và độ tin cậy cao.
Các chất kháng oxy hóa có khả năng trung hòa gốc DPPH bằng cách cung cấp ion H+, dẫn đến việc giảm độ hấp thu tại bước sóng cực đại và làm màu của dung dịch phản ứng chuyển từ tím sang vàng nhạt.
Trong đó: AH – Chất kháng oxy hóa
Hình 2.2 Phản ứng bắt gốc tự do DPPH [10]
Giá trị mật độ quang OD thấp cho thấy khả năng bắt gốc tự do DPPH cao, từ đó xác định được tỷ lệ phần trăm hoạt tính kháng oxy hóa Điều này tạo cơ sở để so sánh khả năng kháng oxy hóa giữa các mẫu.
IC 50 được xác định Hợp chất nào có giá trị IC 50 càng thấp, hoạt tính kháng oxy hóa càng cao
Quy trình bắt gốc tựdo DPPH được thực hiện theo hình 2.3
Hình 2.3 Sơ đồ quy trình khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa trong phương pháp bắt gốc tự do DPPH
Theo hình 2.4, hoạt tính kháng oxy hóa từng nồng độ mẫu thửđược tính theo công thức:
𝐻𝐻𝑂𝑂 𝑐𝑐 × 100 Trong đó: ODm: giá trị mật độ quang OD của mẫu thử
OD c : giá trị mật độ quang OD của chứng âm
Các nghiệm thức khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa được bốtrí như sau:
Bảng 2.1 Bố trí nghiệm thức khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa
Chứng âm Chứng dương Mẫu Nam sâm bò
Nước cất hai lần Acid ascorbic 15 μg/ml
Cao ethanol, cao chloroform được pha loãng tạo thành dãy nồng độ 100 -
1000 μg/ml Nước sắc được pha loãng từ nồng độ 100% xuống 0%
1 ml cao chiết ở các nồng độ khảo sát
Bổ sung 5 ml DPPH pha trong methanol Đo độ hấp thụở bước sóng 517 nm Ủ 30 phút Tránh sáng
Giá trị mật độ quang OD
Phương trình hồi quy Giá trị IC 50
2.3.7 Phương pháp xử lý thống kê
Các giá trị trung bình và độ lệch chuẩn giữa các lần lặp lại trong thí nghiệm được xử lý bằng phần mềm Microsoft office excel 2010
Kết quả thí nghiệm sẽ được phân tích bằng phương pháp ANOVA để so sánh sự khác biệt giữa các nghiệm thức Phương trình hồi quy giữa nồng độ và tỷ lệ %HTKO sẽ được xây dựng thông qua phần mềm SPSS 16.0.
Theo đó, một sốphương trình phổ biến như:
Trong đó: Y: tỉ lệ % HTKO (hoạt tính bắt gốc tự do DPPH)
X: nồng độ cao chiết; b 0 : hằng số; b 1 , b 2 , b 3 : các hệ số hồi quy Phương trình hội quy được chọn là phương trình có hệ sốtương quan và tương quan hiệu chỉnh cao (phản ánh sự biến thiên của tỉ lệ % hoạt tính bắt gốc tự do DPPH được giải thích bởi nồng độ cao chiết); với độ tin cậy 95% thì P- value - giá trị Sig của phương trình và các tham sốthường ≤ 0,05 là có ý nghĩa.
Quy trình thí nghi ệ m
Hình 2.4 Sơ đồ quy trình thí nghiệm
Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa
Khảo sát điều kiện sinh thái, mô tả hình thái
Thu mẫu, xử lỹ mẫu Nam sâm bò
Thu nhận nước sắc Thu nhận cao chiết Điều kiện sinh thái
Hoạt tính bắt gốc tự do DPPH
Giá trị IC 50 Xử lý số liệu
KẾ T QU Ả VÀ TH Ả O LU Ậ N
K ế t qu ả nghiên c ứ u
3.1.1 Mô t ả một số đặc điểm về môi trường sinh thái của Nam sâm bò
Nam sâm bò được thu nhận vào tháng 09/2014 tại vùng đất cát ven biển Cần
Giờ (thị trấn Cần Thạnh, huyện Cần Giờ) Tọa độ: 10°23'14.2"B 106°55'21.7"Đ.
3.1.1.1 Một số chỉ tiêu về đất
Kết quả một số chỉ tiêu vềpH đất, độẩm, hệ số khô kiệt ở địa điểm thu mẫu Nam sâm bò được thể hiện qua bảng 3.1
Bảng 3.1 Một số chỉ tiêu vềđất
Chỉ tiêu Tầng 0 – 30 cm Tầng 30 – 60 cm pH 7,467 ± 0,295 7,727 ± 0,243 Độẩm (%) 1,273 ± 0,034 1,088 ± 0,057
Như vậy, tại vị trí thu mẫu, đất có độ kiềm yếu, độ ẩm thấp, khả năng giữ nước kém
3.1.1.2 Một số chỉ tiêu về khí hậu
Các chỉ tiêu độ ẩm không khí, nhiệt độ, cường độ ánh sáng được đo vào lúc 15h50 ngày 03/09/2014
- Cường độ ánh sáng: 31070 lux
Tại thời điểm thu mẫu, cường độ ánh sáng, nhiệt độ và độ ẩm không khí đều cao, điều này phản ánh đúng điều kiện khí hậu của thị trấn Cần Thạnh, huyện Cần Giờ.
3.1.2 Mô t ả hình thái Nam sâm bò thu nhận tại huyện Cần Giờ
Chúng tôi ghi nhận được các đặc điểm hình thái của Nam sâm bò thu tại huyện
Nam sâm bò là loại cây thảo có thân mọc lan sát mặt đất, thích nghi tốt với nền đất cát, giúp cây đứng vững trước gió biển Thân cây có hình trụ, màu sắc xanh hoặc tím.
Hình 3.1 Nam sâm bò ngoài tự nhiên
Lá của nam sâm bò có hình dạng đơn, mọc đối và bầu dục, với mặt dưới màu trắng lục có nhiều lông ngắn, trong khi mặt trên có màu lục thẫm Gân lá dạng lông chim và mép lá lượn sóng tạo nên đặc điểm nhận diện nổi bật.
Hình 3.2 Lá Nam sâm bò
Rễ: Rễ Nam sâm bò thuộc loại rễ củ, nhiều tinh bột, có mùi thơm Rễ có màu nâu, có nhiều rễ phụ mọc từ rễ chính (hình 3.3)
Hình 3.3 Rễ Nam sâm bò
Cụm hoa của cây Hoa có hình xim với 3 – 4 bông hoa lưỡng tính, có màu hồng đậm và cuống ngắn, thường mọc ở nách lá Hoa có cấu trúc mẫu 5, với các cánh hoa dính lại tạo thành bao hoa dạng ống.
Hợp bầu dưới, đính noãn đáy Nhánh hoa có nhiều lông tròn, dính (hình 3.4)
Hình 3.4 Hoa Nam sâm bò
Quả có hình trụ với đầu hơi tròn và phần gần cuống nhọn, có 5 cạnh và bề mặt phủ lông dính đa bào giúp phát tán xa Kích thước quả dài khoảng 4 mm.
A Quả B Quả (cắt ngang) C Quả (cắt dọc)
Hình 3.5 Quả Nam sâm bò
Kết quả nghiên cứu cho thấy một số đặc điểm hình thái của Nam sâm bò tại khu vực thu mẫu tương đồng với mô tả của Phạm Hoàng Hộ trong tác phẩm "Cây cỏ Việt Nam" năm 1999.
3.1.3 Ho ạt tính bắt gốc tự do DPPH của các cao chiết ethanol Nam sâm bò
Dựa trên các công trình nghiên cứu ngoài nước, đặc biệt là công trình của
Nghiên cứu của Gopal, T K và cộng sự (2010) cũng như Guha, G và cộng sự (2011) chỉ ra rằng khả năng kháng oxy hóa của các cao chiết nước và methanol từ Nam sâm bò ở Ấn Độ mạnh hơn so với cao chiết hexane và chloroform Điều này cho thấy sự ưu việt của các hợp chất kháng oxy hóa có trong Nam sâm bò.
Nam sâm bò là một chất có tính phân cực, vì vậy nghiên cứu khả năng kháng oxy hóa của Nam sâm bò tại huyện Cần Giờ, Tp HCM đã sử dụng ethanol làm dung môi để chiết xuất cao từ thân, lá và rễ Điều này là do ethanol và methanol có tính phân cực tương tự nhau.
3.1.3.1 Hoạt tính bắt gốc tự do DPPH của cao ethanol lá Để xác định khả năng bắt gốc tự do DPPH, cao ethanol lá được pha loãng thành dóy nồng độ từ 1000 àg/ml xuống 100 àg/ml Thụng thường, trong chiến lược sàng lọc các hợp chất có hoạt tính sinh học từ tự nhiên (theo viện ung thư Hoa Kỳ
NCI - Viện Ung thư Quốc gia đã nghiên cứu các cao chiết với nồng độ dưới 1000 µg/ml Từ đó, những cao chiết có hoạt tính sinh học mạnh sẽ được nghiên cứu sâu hơn nhằm cung cấp bằng chứng khoa học cụ thể cho các ứng dụng thực tiễn.
Nghiên cứu sử dụng acid ascorbic với nồng độ 15 µg/ml, nồng độ tại đó 50% gốc DPPH bị bắt, được thực hiện trong phòng thí nghiệm Di truyền - Thực vật Acid ascorbic, một chất có hoạt tính kháng oxy hóa mạnh, được chọn làm chứng dương cho quy trình thử nghiệm, trong khi nước cất hai lần đóng vai trò là chứng âm Mỗi nghiệm thức trong nghiên cứu được lặp lại ba lần để đảm bảo độ tin cậy của kết quả.
Tỷ lệ % bắt gốc tự do DPPH (%HTKO) được xác định thông qua việc xây dựng phương trình hồi quy bằng phần mềm SPSS 16.0, từ đó tính toán giá trị IC 50 của các cao chiết Điều này tạo nền tảng cho việc so sánh hoạt tính kháng oxy hóa giữa các cao chiết khác nhau.
Kết quả vể khảnăng bắt gốc tự do DPPH của cao chiết ethanol lá Nam sâm bò được thể hiện qua bảng 3.2
Bảng 3.2 Tỷ lệ % HTKO của cao chiết ethanol lá
Nồng đụ (àg/ml) %HTKO Độ lệch chuẩn
Ghi chú: a, b, c, d, e, f: sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các nồng độ
Theo sự tăng dần nồng độ từ 100 àg/ml đến 1000 àg/ml, tỷ lệ % hoạt tính bắt gốc tự do DPPH của cao ethanol lỏ cũng tăng theo, đạt cao nhất ở nồng độ 1000 àg/ml với 88,915% Sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê giữa các nồng độ khảo sát.
Kết quả nghiên cứu cho thấy nồng độ acid ascorbic 15 µg/ml đạt tỷ lệ %HTKO là 45,959 ± 3,276, chứng tỏ tính ổn định và độ tin cậy cao Từ các giá trị %HTKO, các phương trình hồi quy giữa nồng độ chiết ethanol lá và tỷ lệ %HTKO đã được xây dựng, với các phương trình có hệ số tương quan và tương quan hiệu chỉnh (R > 0,9) cùng P-value của phương trình và từng tham số đều ≤ 0,05, đảm bảo tính chính xác của kết quả (Phụ lục 13).
Kết quả ghi nhận được phương trình mũ (Power): y = 0,100x 0,990 (R = 0,995,
R 2 sau hiệu chỉnh = 0,987; độ tin cậy của phương trình P-value = 0,000; P-value của hệ số hồi quy = 0,000; P-value của hằng số = 0,030)
Theo phương trình trên, giá trị IC 50 của hoạt tính bắt gốc tự do DPPH của cao ethanol lỏ Nam sõm bũ được xỏc định là: 528,196 ± 24,172 àg/ml
3.1.3.2 Hoạt tính bắt gốc tự do DPPH của cao ethanol thân
Cao chiết ethanol từ thân Nam sâm bò được nghiên cứu về khả năng kháng oxy hóa thông qua phương pháp DPPH Kết quả cho thấy, khi nồng độ tăng từ 100 àg/ml lên 1000 àg/ml, hoạt tính bắt gốc tự do DPPH cũng tăng theo, với tỷ lệ phần trăm HTKO đạt 75,877% tại nồng độ 1000 àg/ml Sự khác biệt về giá trị %HTKO giữa các nồng độ thử nghiệm là có ý nghĩa thống kê với P-value ≤ 0,05 Kết quả khảo sát cho thấy %HTKO của acid ascorbic (15 àg/ml) là 49,506 ± 1,475, chứng tỏ các giá trị trong bảng 3.3 có độ tin cậy cao.
Bảng 3.3 Tỷ lệ % HTKO của cao chiết ethanol thân
Nồng đụ (àg/ml) %HTKO Độ lệch chuẩn
Ghi chú: a, b, c, d, e, f: sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các nồng độ
Th ả o lu ậ n
Cùng với các công trình ngoài nước, đặc biệt là các nghiên cứu của Guha, G
R (2014), đề tài đã xác định các bộ phận của Nam sâm bò thu tại huyện Cần Giờ,
Tp HCM cho thấy khả năng kháng oxy hóa bằng cách bắt gốc tự do DPPH, điều này cung cấp cơ sở khoa học vững chắc cho việc ứng dụng trong y học cổ truyền nhằm điều trị các bệnh về da, viêm, khối u, tiểu đường và điều hòa miễn dịch.
Một trong những nguyên nhân chính gây ra các bệnh lý là sự hình thành và tấn công của các gốc oxy hoạt động (ROS) Những gốc tự do này có khả năng tấn công các đại phân tử trong tế bào, dẫn đến tổn thương như đứt gãy chuỗi DNA, thay đổi cấu trúc và chức năng protein, phá hủy màng tế bào và bào quan, ảnh hưởng đến tín hiệu tế bào và thậm chí gây chết tế bào.
Nam sâm bò đã được sử dụng trong Y học cổ truyền ở Ấn Độ, Brazil và Việt Nam từ lâu, với nhiều nghiên cứu chứng minh hoạt tính sinh học của nó như kháng tiểu đường, kháng vi sinh, giảm stress, điều hòa miễn dịch và kháng viêm Các hợp chất được phân lập từ Nam sâm bò bao gồm β-sitosterol, acid urosilic, boeravinone A - H và punarvine, trong đó punarvine có khả năng kháng viêm và gây chết theo chương trình trên dòng tế bào ung thư B16F-10 Boeravione G có khả năng giảm nồng độ các gốc ROS và thể hiện hoạt tính kháng oxy hóa mạnh mẽ, hoạt hóa enzyme superoxide dismutase và nhân tố phiên mã NF-kB p65, bảo vệ DNA khỏi sự tấn công của các gốc tự do Nghiên cứu của Đỗ Thị Mỹ Liên (2014) cũng đã thu nhận được các hợp chất boeravinone từ Nam sâm bò tại Việt Nam.
Trong môi trường phòng thí nghiệm, các phương pháp chiết xuất bằng ethanol, chloroform và nước từ cây Nam sâm bò ở các bộ phận như thân, lá và rễ cho thấy hoạt tính kháng oxy hóa khác nhau.
Trong nghiên cứu về khả năng kháng oxy hóa của Nam sâm bò, cao chiết ethanol từ lá cho thấy hiệu quả mạnh mẽ nhất, tiếp theo là thân và rễ, theo phương pháp DPPH Các nghiên cứu của Bhardwaj và Sharma chỉ ra rằng thành phần phenolic, flavonoid và acid ascorbic trong lá cao hơn so với thân và rễ, với lá có hàm lượng cao nhất và rễ thấp nhất Các hợp chất này đã được chứng minh là có khả năng kháng oxy hóa mạnh mẽ, nhờ vào cấu trúc phân tử với gốc hydroxyl- gốc cho H+ Ngoài ra, cao chiết methanol từ lá cũng cho thấy hoạt tính bắt gốc tự do ABTS cao nhất So với methanol, ethanol là dung môi có tính phân cực tương tự, cho phép chiết xuất các hợp chất tương đồng Nghiên cứu của Tolulope và cộng sự cũng xác nhận rằng cao chiết ethanol từ lá Nam sâm bò tại Nigeria chứa các thành phần như vitamin E.
C, phenol, flavonoid và thể hiện khả năng bắt gốc tựdo DPPH, năng lực khử Fe 3+
Nghiên cứu cho thấy cao ethanol từ lá Nam sâm bò có hoạt tính kháng oxy hóa mạnh nhất, trong khi rễ có hoạt tính thấp nhất Hoạt tính bắt gốc tự do DPPH ở thân và lá Nam sâm bò cao hơn so với cao chloroform, do chloroform có tính phân cực yếu hơn ethanol Điều này chỉ ra rằng các hợp chất kháng oxy hóa trong lá và thân Nam sâm bò chủ yếu là những hợp chất có tính phân cực.
Sử dụng dung môi phân cực có khả năng chiết xuất hợp chất chống oxy hóa hiệu quả hơn so với dung môi có tính phân cực yếu.
Theo nghiên cứu của Guha và cộng sự (2009), khả năng kháng oxy hóa của các cao chiết từ Nam sâm bò tại Ấn Độ đã được khảo sát Kết quả cho thấy giá trị IC 50 của cao nước là 200,82 ± 0,55 µg/ml, cao methanol là 327,40 ± 0,68 µg/ml, thấp hơn so với cao chloroform (409,81 ± 0,62 µg/ml) và cao hexane.
Kết quả nghiên cứu cho thấy hoạt tính kháng oxy hóa của các cao chiết có tính phân cực mạnh hơn so với các cao chiết có tính phân cực yếu hoặc không phân cực, với nồng độ đạt 2351,60 ± 0,18 àg/ml Công trình của Apurka Sarker về các bộ phận của Nam sâm bò trên mặt đất (ngoại trừ rễ) cũng chỉ ra rằng cao methanol chứa nhiều hợp chất như flavonoid, terpenoid, và anthraquinone hơn so với cao hexane và ethyl acetate Hơn nữa, tỷ lệ phần trăm bắt gốc tự do DPPH và NO của cao methanol cũng cao hơn so với hai loại cao chiết còn lại.
Mặc dù chưa có nghiên cứu nào so sánh hoạt tính của các cao chiết ethanol từ các bộ phận khác nhau, nhưng các kết quả hiện có đã phần nào làm rõ cơ sở khoa học cho giá trị của đề tài này.
Nghiên cứu cho thấy nước sắc Nam sâm bò có khả năng kháng gốc tự do DPPH, đặc biệt là ở bộ phận lá, nhờ vào tính phân cực cao của nước Mặc dù không thể so sánh trực tiếp với cao ethanol do điều kiện thí nghiệm khác nhau, nhưng mục tiêu của đề tài là cung cấp dữ liệu khoa học cho ứng dụng trong y dược, đặc biệt là y học cổ truyền Phương pháp sắc thuốc và sử dụng dịch chiết tươi là phổ biến trong dân gian Kết quả về giá trị IC 50 của các bộ phận thân, lá, rễ cho thấy nước sắc Nam sâm bò có hoạt tính chống gốc oxy hoạt động mạnh, chứng minh tính hợp lý của việc sử dụng Nam sâm bò trong điều trị các bệnh viêm, tiểu đường và hỗ trợ miễn dịch.
Kết quả nghiên cứu cho thấy hoạt tính kháng oxy hóa của cao chloroform không tương đồng với cao ethanol và nước sắc Cụ thể, cao rễ có hoạt tính kháng oxy hóa cao nhất với giá trị IC 50 thấp nhất, trong khi lá và thân có hoạt tính thấp hơn nhưng không có sự khác biệt thống kê đáng kể (P-value ≤ 0,05) Đặc biệt, giá trị IC 50 của cao chloroform từ rễ thấp hơn so với cao ethanol Điều này trái ngược với nghiên cứu của Gopal, T K (2010), trong đó cho thấy hoạt tính kháng oxy hóa của cao ethanol cao hơn so với cao chloroform và ethyl acetate khi khảo sát hoạt tính bắt gốc tự do DPPH và NO từ rễ Nam sâm bò.
Tuy nhiên, theo công trình của Sharma, P và cộng sự (2014), năng lực khử
Hoạt tính kháng oxy hóa của các cao chiết từ rễ, thân và lá của Nam sâm bò khác nhau tùy thuộc vào loại dung môi sử dụng, với cao methanol cho thấy năng lực khử mạnh nhất, trong khi cao hexane và ethyl acetate thể hiện hoạt tính cao hơn các bộ phận khác Mối tương quan nghịch giữa khả năng bắt gốc tự do ABTS, khả năng peroxid hóa lipid và hoạt tính enzyme peroxidase cùng hàm lượng flavonoid ở rễ cho thấy rằng các hợp chất flavonoid và phenolic, vốn được biết đến với khả năng kháng oxy hóa mạnh, có mặt chủ yếu trong các dung môi phân cực như methanol và nước Đặc biệt, cao chloroform từ rễ thể hiện hoạt tính kháng oxy hóa vượt trội so với thân và lá, đồng thời có khả năng bắt gốc tự do DPPH mạnh hơn so với cao ethanol trong cùng điều kiện thử nghiệm.
Nghiên cứu của Srivastava và cộng sự (2010) chỉ ra rằng phân đoạn cao rễ Nam sâm bò (chloroform : methanol = 9:1) có khả năng ức chế sự tăng sinh tế bào ung thư cổ tử cung Hela và kích thích quá trình chết tế bào apoptosis Tương tự, Mishra và cộng sự (2014) đã xác định rằng các hợp chất từ rễ Nam sâm bò, như punarnavine và boeravinone A-J, đặc biệt là boeravinone G và punarnavine, có tiềm năng gây chết tế bào ung thư.
Để ứng dụng hiệu quả trong lĩnh vực y dược, cần nghiên cứu khả năng gây độc tế bào ung thư của các bộ phận và hợp chất, đặc biệt là rễ Nam sâm bò Đồng thời, việc nghiên cứu mối tương quan giữa hàm lượng các chất từ các cao chiết khác nhau và hoạt tính kháng oxy hóa là cần thiết để phân lập hợp chất tiềm năng phục vụ cho thực tiễn.