Nghiên cứu quy trình xác định đồng thời auramine o và rhodamine b trong một số mẫu thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng kết nối detector tử ngoại khả kiến

Sinh viên thực hiện: NGUYỄN THANH THƠI – 40201091 Nội dung đề tài:  Mục tiêu: Nghiên cứu xây dựng quy trình phân tích đồng thời Auramine O và Rhodamine B trong một số mẫu thực phẩm b

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH

KHOA HÓA HỌC

NGUYỄN THANH THƠI

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI

AURAMINE O VÀ RHODAMINE B TRONG MỘT SỐ MẪU THỰC PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG KẾT NỐI DETECTOR TỬ NGOẠI KHẢ KIẾN

CỬ NHÂN NGÀNH SƯ PHẠM HÓA HỌC

TP HỒ CHÍ MINH - THÁNG 05/2018

CỬ NHÂN NGÀNH SƯ PHẠM HÓA HỌC

GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN:

ThS HUỲNH THỊ NHÀN ThS NGUYỄN THỊ TUYẾT NHUNG

TP HỒ CHÍ MINH, NĂM 2018

SẮC KÝ LỎNG KẾT NỐI DETECTOR TỬ NGOẠI KHẢ KIẾN

Nguyễn Thanh Thơi 40.201.091 ThS Phan Thị Hoàng Yến

Đánh giá Khóa luận

1 Về cuốn báo cáo:

Số trang _ Số chương _

Số bảng số liệu _ Số hình vẽ _

Số tài liệu tham khảo _ Sản phẩm _

2 Nhận xét của chủ tịch hội đồng:

Điểm khóa luận:

Nguyễn Thanh Thơi: ……… /10

Chủ tịch Hội đồng

Sinh viên thực hiện:

NGUYỄN THANH THƠI – 40201091

Nội dung đề tài:

 Mục tiêu: Nghiên cứu xây dựng quy trình phân tích đồng thời Auramine O và

Rhodamine B trong một số mẫu thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng kết nối detector tử ngoại khả kiến Sử dụng quy trình đề xuất phân tích một số mẫu thực

tế

 Phạm vi: Phân tích trên nền một số mẫu thực phẩm (cải chua, măng, thịt gà)

 Phương pháp: Sắc ký lỏng hiệu năng cao kết nối detector tử ngoại khả kiến

 Kết quả mong đợi của đề tài: Nghiên cứu đề xuất điều kiện HPLC tối ưu để

phân tích đồng thời Auramine O và Rhodamine B, đề xuất được quy trình xử lý một số mẫu thực phẩm và phân tích trên một số nền mẫu thực tế

TP HCM, ngày 05/05/2018

Sinh viên

iv

LỜI CẢM ƠN

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất đến cô Nguyễn Thị Tuyết Nhung

và cô Huỳnh Thị Nhàn đã hướng dẫn em tận tình, hỗ trợ và giúp đỡ em từ những ngày đầu thực hiện đến khi hoàn thành đề tài:

“Nghiên cứu quy trình xác định Auramine O và Rhodamine B trong một số mẫu

thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng kết nối detector tử ngoại khả kiến”

Em xin gửi lời cảm ơn đến Trung tâm Khoa học Công nghệ Dược Sài Gòn (Sapharcen), cô Lê Thị Hồng Vân (giảng viên Bộ môn Dược liệu, Khoa Dược – Trường Đại học Y dược Thành Phố Hồ Chí Minh), thầy Huỳnh Lời, anh Lê Văn Huấn đã hỗ trợ

và hướng dẫn em sử dụng máy sắc ký lỏng hiệu năng cao kết nối detector PDA và cho

em những lời khuyên bổ ích trong quá trình thực hiện đề tài

Em xin gửi lời cảm ơn đến thầy Nguyễn Thành Lộc, thầy Trần Bửu Đăng, cô Văn

Thị Cẩm Duyên, cô Phạm Thị Thảo Uyên, thầy Võ Công Minh, thầy Nguyễn Ngọc Hưng

đã giúp đỡ em trong quá trình tiến hành thực nghiệm và các thầy cô Khoa Hóa – trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh đã truyền cho em những kiến thức quý báu trong những năm tháng em học ở trường

Cuối cùng, em gửi lời cảm ơn đến gia đình, anh chị, bạn bè và tất cả những người luôn ở bên cạnh em, động viên, ủng hộ, giúp đỡ em trong quá trình thực hiện đề tài này Đặc biệt, em muốn cảm ơn bạn Phan Thị Ngọc Trinh đã cùng em thực hiện đề tài

Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 05 tháng 05 năm 2018

Nguyễn Thanh Thơi

v

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU

AOAC (Assosiation of Official Analytical Chemists): Hiệp hội các nhà hóa phân tích chính thức

PDA (Photodiode array): Đầu dò diode quang

LC-MS (Liquid chromatography mass spectrometry): Sắc ký lỏng khối phổ

HPLC (High performance liquid chromatography): Sắc ký lỏng hiệu năng cao

ICH (International Conference on Harmonization): Hội nghị quốc tế về hài hòa hóa ISO (International Organization for Standardization): Tổ chức Quốc tế về tiêu chuẩn hóa LOD (Limit of Detection): Giới hạn phát hiện

LOQ (Limit of Quantitation): Giới hạn định lượng

S

N (Signal to noise ratio): Tỉ lệ tín hiệu trên nhiễu

TCVN: Tiêu chuẩn Việt Nam

STT: Số thứ tự

AO: Auramine O

RB: Rhodamine B

vi

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1 Phân loại sắc ký theo pha tĩnh 9

Bảng 2.1 Danh mục chất chuẩn 18

Bảng 2.2 Danh mục dung môi tinh khiết chuyên dùng cho HPLC 18

Bảng 2.3 Danh mục hóa chất tinh khiết 19

Bảng 2.4 Thông số thẩm định phương pháp không tiêu chuẩn ICH, USP, FDA 24

Bảng 2.5 Độ lặp lại tối đa chấp nhận tại các nồng độ khác nhau (theo AOAC) 28

Bảng 2.6 Lấy mẫu và thông tin mẫu 28

Bảng 3.1 Kết quả bước sóng và độ hấp thụ cực đại của các chất phân tích trong MeOH và trong ACN 32

Bảng 3.2 Kết quả khảo sát dung môi pha động 33

Bảng 3.3 Khảo sát các giá trị pH sử dụng acid acetic 33

Bảng 3.4 Khảo sát pH = 3 sử dụng acid formic 34

Bảng 3.5 Khảo sát pH = 2,3 và 2,6 sử dụng H3PO4 35

Bảng 3.6 Chương trình gradient khảo sát tốc độ dòng 37

Bảng 3.7 Khảo sát tỉ lệ dung môi ban đầu 39

Bảng 3.8 Chương trình gradient tối ưu 39

Bảng 3.9 Dữ liệu nồng độ và diện tích AO, RB thu được khi tiến hành chạy sắc ký 40

Bảng 3.10 Độ chệch các điểm nồng độ dùng xây dựng đường chuẩn 42

Bảng 3.11 Hệ số dung lượng và hệ số không đối xứng của AO 43

Bảng 3.12 Hệ số dung lượng và hệ số không đối xứng của RB 43

Bảng 3.13 Diện tích của các chất phân tích và giá trị ' i B tương ứng ở mỗi nồng độ 44

Bảng 3.14 Bảng các giá trị Ftính của các chất phân tích 44

Bảng 3.15 Khảo sát độ lặp lại của phép đo 46

Bảng 3.16 Thể tích chiết và diện tích peak sắc ký 47

Bảng 3.17 Kết quả phân tích mẫu măng 49

Bảng 3.18 Hệ số thu hồi AO, RB của mẫu măng 49

Bảng 3.19 Kết quả phân tích mẫu cải chua 52

Bảng 3.20 Hệ số thu hồi AO, RB của mẫu cải chua 52

Bảng 3.21 Kết quả phân tích mẫu thịt gà 53

vii

Bảng 3.22 Hệ số thu hồi AO và RB của mẫu thịt gà 53

viii

DANH MỤC HÌNH VẼ

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của Auramine O 3

Hình 1.2 Công thức cấu tạo của Rhodamine B 4

Hình 1.3 Minh họa a) quá trình sắc ký b) Sắc ký đồ 8

Hình 1.4 Hệ thống sắc ký khí 9

Hình 1.5 Hệ thống sắc ký lỏng 9

Hình 1.6 Hình ảnh minh họa sắc ký đồ 10

Hình 1.7 Hình ảnh minh họa peak sắc ký 10

Hình 1.8 Hình ảnh minh họa peak sắc ký theo phân bố Gauss 12

Hình 1.9 Hình ảnh minh họa cột sắc ký và các đĩa lý thuyết 13

Hình 1.10 Hình ảnh minh họa sự tách hai peak sắc ký 14

Hình 1.11 Hình ảnh minh họa sơ đồ hệ thống HPLC 15

Hình 2.1 Chương trình gradient pha động – Khảo sát chọn loại dung môi 21

Hình 2.2 Gradient pha động – Khảo sát pH 2,3 và 2,6 22

Hình 2.3 Hình ảnh minh họa xác định LOD bằng cách tính S N 26

Hình 2.4 Khảo sát thể tích dung môi chiết 29

Hình 3.1 Sắc đồ khảo sát pH = 3 sử dụng acid acetic 34

Hình 3.2 Sự phụ thuộc của hệ số không đối xứng theo pH 34

Hình 3.3 Sắc đồ khảo sát pH = 3,0 sử dụng acid formic 35

Hình 3.4 Sắc đồ khảo sát pH = 2,6 sử dụng acid phosphoric 35

Hình 3.5 Sắc đồ chạy đẳng dòng với dung môi MeOH – HCOOH (pH = 3) 36

Hình 3.6 Sắc đồ chạy đẳng dòng với dung môi ACN – HCOOH (pH = 3) 36

Hình 3.7 Sắc đồ chạy đẳng dòng với dung môi ACN – đệm acetate 37

Hình 3.8 Sắc đồ AO và RB ứng với tốc độ dòng 0,6 mL/phút 37

Hình 3.9 Sắc đồ AO và RB ứng với tốc độ dòng 0,7 mL/phút 38

Hình 3.10 Sắc đồ AO và RB ứng với tốc độ dòng 0,85 mL/phút 38

Hình 3.11 Sắc đồ AO và RB ứng với tốc độ dòng 1 mL/phút 38

Hình 3.12 Quan hệ tuyến tính giữa diện tích peak và nồng độ Auramine O 41

Hình 3.13 Quan hệ tuyến tính giữa diện tích peak và nồng độ Rhodamine B 41

ix

Hình 3.14 Sắc đồ xác định LOD của AO và RB ở nồng độ 0,02 ppm 45

Hình 3.15 Sắc đồ xác định LOQ của AO và RB ở nồng độ 0,05 ppm 46

Hình 3.16 Sự phụ thuộc của diện tích peak vào các lần chiết AO (a) và RB (b) 47

Hình 3.17 Quy trình xử lý mẫu tối ưu 48

Hình 3.18 Các sắc ký đồ phân tích mẫu măng 50

Hình 3.19 Bước sóng ứng với hấp thụ cực đại của AO 51

Hình 3.20 Bước sóng ứng với hấp thụ cực đại của RB 51

x

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN iv

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU v

DANH MỤC BẢNG BIỂU vi

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Auramine O 3

1.1.1 Cấu tạo 3

1.1.3 Ứng dụng 3

1.1.4 Độc tính 3

1.2 Rhodamine B 4

1.2.1 Cấu tạo 4

1.2.2 Tính chất 4

1.2.3 Ứng dụng 5

1.2.4 Độc tính 5

1.4 Cơ sở lý thuyết về phương pháp sắc ký 7

1.4.1 Khái niệm sắc ký 7

1.4.2 Phân loại 8

1.4.3 Lý thuyết về sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 9

1.5 Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 14

1.5.1 Bình chứa pha động 15

1.5.2 Bộ phận khử khí 15

1.5.3 Bơm cao áp 16

CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM 18

2.1 Hóa chất và dụng cụ 18

2.1.1 Hóa chất 18

2.1.1.1 Chất chuẩn 18

2.1.1.2 Dung môi 18

2.1.1.3 Các hóa chất khác 19

2.1.2 Trang thiết bị và dụng cụ phục vụ nghiên cứu 19

xi

2.1.2.1 Trang thiết bị 19

2.1.2.2 Dụng cụ 20

2.2 Nội dung nghiên cứu 20

2.2.1 Khảo sát các điều kiện tối ưu cho hệ thống HPLC 20

2.2.1.1 Khoảng bước sóng của detector PDA 20

2.2.1.2 Thăm dò thứ tự tách các chất phân tích trên cột sắc ký pha đảo C18 20

2.2.2 Tối ưu hóa pha động 21

2.2.2.1 Khảo sát dung môi pha động 21

2.2.2.2 Khảo sát pH 22

2.2.2.3 Khảo sát chương trình hóa dung môi pha động 23

2.2.2.4 Tốc độ pha động 23

2.2.3 Thẩm định phương pháp 23

2.2.3.1 Tính đặc hiệu/chọn lọc 24

2.2.3.2 Khoảng tuyến tính và đường chuẩn 25

2.2.3.3 Giới hạn phát hiện 26

2.2.3.4 Giới hạn định lượng 27

2.2.3.5 Độ đúng 27

2.2.4 Quy trình xử lý mẫu thực phẩm 28

2.2.4.1 Lấy mẫu và bảo quản mẫu 28

2.2.4.2 Quy trình xử lý mẫu thực phẩm 29

2.2.5 Phương pháp xử lý và đánh giá kết quả 29

2.2.5.1 Xử lý kết quả dựa trên đường chuẩn 29

2.2.5.2 Xử lý thống kê các số liệu thực nghiệm 30

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32

3.1 Điều kiện phân tích HPLC 32

3.1.1 Bước sóng và độ hấp thụ cực đại của các chất phân tích trong các dung môi 32

3.1.2 Tối ưu hóa pha động 32

3.1.2.1 Khảo sát dung môi pha động 32

3.1.2.2 Khảo sát pH pha động 33

3.1.2.3 Khảo sát chương trình dung môi pha động với chế độ đẳng dòng 36

xii

3.1.2.3 Khảo sát tốc độ dòng 37

3.2 Thẩm định phương pháp 40

3.2.1 Tính đặc hiệu/chọn lọc 40

3.2.2.1 Xây dựng đường chuẩn của AO và RB 40

3.2.2.2 Độ chệch các điểm nồng độ dùng xây dựng đường chuẩn 42

3.2.2.3 Hệ số dung lượng và hệ số không đối xứng 42

3.2.2.4 Kiểm tra sai số hệ thống của phương pháp 43

3.2.3 Giới hạn phát hiện 44

3.2.4 Giới hạn định lượng 45

3.2.5 Khảo sát độ lặp lại của phép đo 46

3.3 Ứng dụng quy trình phân tích mẫu thực tế 47

3.3.1 Quy trình chiết mẫu 47

3.3.2 Mẫu măng 48

3.3.2.1 Phân tích mẫu măng và xác định hệ số thu hồi 48

3.3.2.2 Tính chọn lọc AO và RB đối với phân tích mẫu măng 50

3.3.3 Mẫu cải chua 51

3.3.3.1 Phân tích cải chua và xác định hệ số thu hồi 51

3.3.3.2 Tính chọn lọc AO và RB đối với phân tích mẫu cải chua 52

3.3.4 Mẫu thịt gà 53

3.3.4.1 Phân tích mẫu gà và xác định hệ số thu hồi 53

3.3.4.2 Tính chọn lọc AO và RB đối với phân tích mẫu thịt gà 53

3.3.5 Kết quả khảo sát mẫu thực tế 54

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 55

4.1 Kết luận 55

4.2 Kiến nghị 56

TÀI LIỆU THAM KHẢO 57

PHỤ LỤC 60

MỞ ĐẦU

Ngày nay, vấn đề an toàn thực phẩm là một trong những vấn đề thời sự của xã hội và mang tính chất toàn cầu Thực phẩm trên thị trường rất đa dạng và có nhiều nguồn gốc khác nhau (thực phẩm trong nước, thực phẩm được nhập khẩu từ nhiều nước khác trên thế giới) Trong thực phẩm, ngoài các thành phần tự nhiên có sẵn thì người cung ứng thường bổ sung thêm các chất gọi là phụ gia thực phẩm để bảo quản hoặc tạo màu sắc sản phẩm

Tuy nhiên, một số cá nhân, tổ chức vì lợi nhuận kinh tế hoặc do hiểu biết còn hạn chế đã thêm những chất không được phép vào thực phẩm gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe của người tiêu dùng Trong những năm gần đây, vấn nạn thực phẩm nhiễm Auramine O và Rhodamine B được phát hiện ngày càng nhiều, không chỉ xảy

ra ở Việt Nam mà còn một số quốc gia khác trên thế giới, chẳng hạn như Trung Quốc Auramine O và Rhodamine B là các chất được sử dụng chủ yếu trong công nghiệp nhuộm Phân tử của các chất này chứa nhiều hệ liên hợp, trong đó có vòng benzene Khi ăn phải các thực phẩm nhiễm Auramine O hoặc Rhodamine B dù với hàm lượng lớn hay nhỏ đều gây ra những biến đổi không tốt đối với cơ thể và có thể

để lại những hậu quả lâu dài Vì thế, yêu cầu phân tích định tính và định lượng hai chất này trong thực phẩm đang rất được quan tâm

Trong nước, số lượng tác giả nghiên cứu phân tích đồng thời Auramine O và Rhodamine B trong thực phầm hầu như chưa có Các đề tài phân tích riêng rẽ Rhodamine B và đặc biệt là Auramine O còn rất hạn chế mặc dù các chất màu này đã được nhiều tác giả trên thế giới nghiên cứu

Qua những tài liệu, những bài báo đã công bố trên các tạp chí uy tín, chúng tôi thấy rằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là phương pháp tốt để định tính và định lượng hai thành phần này trong các mẫu thực phẩm

Vì vậy, dựa trên thực tế đó cùng với những trang thiết bị hiện đại và cơ sở vật chất vốn có của phòng thí nghiệm Bộ môn Hóa Phân Tích – trường Đại học Sư phạm Thành Phố Hồ Chí Minh và Trung tâm khoa học Công nghệ Dược Sài Gòn (Sapharcen) – trường Đại học Y dược Thành phố Hồ Chí Minh, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài:

“Nghiên cứu quy trình xác định đồng thời Auramine O và Rhodamine B

trong một số mẫu thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng kết nối detector tử ngoại khả kiến”

Đề tài này nhằm mục đích nghiên cứu xây dựng một phương pháp xác định đồng thời hai chất màu này trong thực phẩm và tiến hành phân tích trên một số mẫu thực tế

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN1.1 Auramine O

Auramine O (Vàng ô) là tên gọi thương mại của chất thuộc phân nhóm ketoimine[2]

1.1.1 Cấu tạo

Tên IUPAC: bis[4-(dimethylamin)phenyl]methanimium chloride

Tên khác: Basic yellow 2, pyocatanium auremine, pyoktanin yellow, canary yellow, pyoktanin, C.I

Công thức phân tử: C17H22N3Cl

Khối lượng mol: 303,84 gam/mol

Công thức cấu tạo:

NH.HCl

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của Auramine O

Ở điều kiện thường, Auramine O là tinh thể hình kim vàng[2] Auramine O tan tốt

trong nước, ethanol[2] và một số dung môi hữu cơ khác

Auramine O của dòng tế bào người trong ống nghiệm thì các nhà khoa học phát hiện rằng DNA bị hư hại nghiêm trọng

Auramine O dễ tan trong nước, ethanol Nó là một loại thuốc nhuộm có tính base Một số cá nhân, tổ chức vì lợi nhuận kinh tế đã thêm Auramine O vào đậu nành, thức ăn cho cá để làm thay đổi màu sắc sản phẩm[23], làm chất phụ gia trong chế biến thức ăn gia súc và làm chất tạo màu trong công nghiệp thực phẩm[2] Các dữ liệu về độc tính cho thấy rằng Auramine O kích thích nhẹ đến niêm mạc da, có thể gây ra viêm kết mạc, và gây kích ứng đường hô hấp trên Khi con người hít phải hoặc tiếp xúc với Auramine O thì có thể bị ngộ độc, gây ung thư, với hàm lượng lớn có thể phá hủy DNA, tế bào gan, thận và tủy[2]

1.2 Rhodamine B

1.2.1 Cấu tạo

O N

Công thức phân tử: C28H31N2O3Cl

Khối lượng phân tử: 479,01 (gam/mol)

1.2.2 Tính chất

Ở điều kiện thường, Rhodamine B là chất dạng bột màu đỏ Rhodamine là phân

tử chứa nhóm azo (chất có liên kết –N=N– trong cấu tạo phân tử) nên tan được trong dầu[3], trong nước (50 mg/mL tạo dung dịch màu tím đỏ) và dung môi hữu cơ như methanol (70 mg/mL), ethanol, tan nhẹ trong acetone[3] Nhiệt độ nóng chảy của Rhodamine B là 210°C – 211°C[3]

Tỉ trọng tương đối: 0,79 g/cm3

Bước sóng hấp thụ cực đại ( max): 550 nm[3]; 520 nm[23] ; bước sóng hấp thụ cực

đại trong ethanol 526 nm[3]

+ + +

o a,[R ][H ][RH ]

năng bền màu và phát quang màu tím đỏ)

Rhodamine B phát huỳnh quang nên được ứng dụng nhiều trong công nghệ sinh học như kính hiển vi huỳnh quang, đếm tế bào dòng chảy, quang phổ huỳnh quang … Tuy nhiên, nếu dùng Rhodamine B để nhuộm thực phẩm sẽ gây ảnh hưởng xấu đến sức khỏe con người

1.2.4 Độc tính

Theo Ủy ban an toàn thực phẩm của Châu Âu, nhiều thuốc nhuộm màu thuộc nhóm azo có khả năng gây ung thư Năm 2005, Ủy ban Châu Âu đã quy định rõ các chất nhuộm màu nhóm azo không được dùng trong thực phẩm và mỹ phẩm nên không

có giới hạn cho phép đối với nhóm chất nhuộm này[6]

Rhodamine B cũng đã được cảnh báo là chất có thể gây độc cấp tính và mãn tính Những nghiên cứu trong nước và trên thế giới cho thấy rằng Rhodamine B có thể gây ung thư, đột biến nếu da tiếp xúc trực tiếp với chất này Nếu Rhodamine B dính vào người, nó có thể gây dị ứng hoặc làm mẩn ngứa da mắt Nếu hít phải hơi chất này thì sẽ gây ra triệu chứng ho, ngứa cổ, khó thở đau ngực Nếu ăn phải thức ăn chứa Rhodamine B, nó gây nôn mửa, gây hại cho gan, thận, hệ sinh sản, hệ thần kinh cũng như có thể gây ung thư[4][6]

Thực nghiệm trên chuột cho thấy Rhodamine B gây ung thư với liều lượng 89,5 mg/kg qua đường ăn uống hoặc tiêm vào tĩnh mạch Rhodamine B đi vào cơ thể, nó có thể bị chuyển hóa thành amine thơm tương ứng, chất này có phần độc hại hơn Rhodamine B và đây cũng chính là nguyên nhân gây ung thư Khi Rhodamine B chuyển hóa thành các dẫn xuất và tồn tại trong cơ thể thì nó và các dẫn xuất của nó sẽ tác động mạnh mẽ đến các quá trình sinh hóa của tế bào gây ung thư gan[6] Một số thực nghiệm khác cho thấy Rhodamine B tác động phá vỡ cấu trúc DNA và nhiễm sắc thể khi đưa vào nuôi cấy tế bào Do tính độc hại của Rhodamine B rất lớn nên hầu hết các quốc gia trên thế giới đều cấm sử dụng chất này trong thực phẩm

1.3 Lịch sử nghiên cứu Auramine O và Rhodamine B trong và ngoài nước

Công trình số 27 trong danh mục tài liệu tham khảo[27] nhóm tác giả đã nghiên cứu phương pháp xác định Rhodamine B có trong ớt khô, nước ép trái cây và rượu vang đỏ Các chất phân tích có trong ớt khô, nước ép trái cây, rượu vang đỏ đã được chiết với acetonitrile Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao kết nối đầu dò huỳnh quang (HPLC – Flu) được sử dụng để xác định các chất phân tích Thành phần pha động gồm đệm phosphate có nồng độ 3 g/mol và methanol (3:7, tỉ lệ thể tích), pH được điều chỉnh để đạt giá trị 7,0 bằng acid orthophosphoric Kết quả đường chuẩn tuyến tính với khoảng nồng độ chất chuẩn từ 1-100 ppb LOD của Rhodamine B là 0,1 ppb trong ớt khô; 0,2 ppb trong cả hai loại thức uống là nước ép trái cây và rượu vang

đỏ LOQ của Rhodamine B đối với ớt khô là 0,6 ppb, nước ép trái cây 0,5 ppb và rượu vang đỏ 0,5 ppb Hệ số thu hồitrung bình của Rhodamine B là 98,2% – 110,3% trong

ớt khô, 94,6% – 102,2% trong nước ép trái cây, và 90,4% –104,6% trong rượu vang

đỏ Độ lệch chuẩn tương đối của phương pháp này là 2,3% – 9,0%

Công trình số 23[23] trong danh mục tài liệu tham khảo, các tác giả đã sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với đầu dò UV-Vis để xác định 7 loại phẩm màu không được có trong thực phẩm bao gồm Auramine O, Basic Orange, Acid Orange II, Acid Orange, Rhodamine B, Para Red và Sudan I Các mẫu thực phẩm như đậu nành, thịt được chiết bằng acetonitrile, methanol và kiềm Các mẫu gia vị được chiết bằng acid acetic và acetonitrile 70%, cột sắc ký (250mm x 4,6mm x 5µm), pha động methanol – 50 mmol/L amonium acetate (dùng H3PO4 điều chỉnh pH đến 4,5) LOD trong khoảng 0,01 – 0,1 mg/L; LOQ trong khoảng 0,175 – 1,25 mg/kg Hệ số thu hồi trung bình lớn hơn 80%; độ lệch chuẩn tương đối (RSD, n = 3) trong phạm vi 2,04% – 5,66%

Công trình “Xác định Rhodamine B trong thực phẩm bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao”[6] của nhóm các tác giả Bùi Thị Ngoan, Trần Thắng, Bùi Thị Kim Ngân (Viện dinh dưỡng quốc gia) Các tác giả đã phân tích các mẫu bột ớt, bột cà ri, bột sa

tế sử dụng phương pháp HPLC Trong đề tài này, Rhodamine B trong mẫu được hòa tan trong hỗn hợp acetonitrile/acetone, dịch chiết được lọc, ly tâm, lấy dung dịch xác định bằng máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với đầu dò UV – Vis ở bước sóng 550 nm, cột pha đảo RP C18 (150mm x 4,6mm x 5µm) LOD thu được 0,2 ppm, LOQ là 0,6 ppm Bài báo cũng chỉ ra các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình phân tích mẫu bao gồm:

+ Sử dụng thiết bị siêu âm để chiết Rhodamine B từ nền mẫu cho thấy Rhodamine B không bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ không quá 70oC

+ Thời gian chiết tách và chạy sắc ký tốt nhất được thực hiện trong ngày, sang các ngày tiếp theo nồng độ Rhodamine B có giảm nhưng không đáng kể, ngày thứ 4 thì nồng độ Rhodamine B giảm đi một nửa

Tác giả Lê Thị Hường Hoađã “Nghiên cứu xây dựng quy trình phát hiện và xác định hàm lượng một số chất bị cấm sử dụng trong mỹ phẩm”[3] – trong luận án tiến

sĩ dược học của mình Rhodamine B là một trong số các chất mà tác giả đã phân tích Đối tượng phân tích của tác giả này là mỹ phẩm Điều kiện sắc ký là cột sắc ký Hypersil ODS (C18), (5µm x 200mm x 4,6 mm) hoặc tương đương, nhiệt độ cột là

30oC, tốc độ dòng là 1 ml/phút Bước sóng phát hiện Rhodamine B là 535 nm, vùng quét phổ 275 – 760 nm, thể tích tiêm mẫu: 10 µl Thời gian sắc ký 35 phút Pha động được sử dụng là dung dịch tetrabutylammonium (TBA) 0,005 M – nước (75 : 25, theo thể tích) LOD của Rhodamine B là 0,8 ppm Tác giả không đề cập đến LOQ

1.4 Cơ sở lý thuyết về phương pháp sắc ký [4][5]

Các chất phân tích tương tác mạnh mẽ nhất với pha tĩnh sẽ mất nhiều thời gian để

đi qua hệ thống hơn so với những chất tương tác với pha tĩnh yếu hơn

Những tương tác này xảy ra trong một hệ thống sắc ký thường là các tương tác mang bản chất hóa học, nhưng trong một số trường hợp, tương tác vật lý cũng có thể được sử dụng trong sắc ký

Hình 1.3 Minh họa a) quá trình sắc ký b) Sắc ký đồ 1.4.2 Phân loại

Sắc ký có thể được phân loại dựa trên loại pha động, pha tĩnh và vật liệu nhồi

1.4.2.1 Phân loại theo hệ pha

Việc phân chia các kỹ thuật sắc ký đầu tiên dựa trên loại pha động được sử dụng trong hệ thống Theo cách phân chia này, có hai loại sắc ký là sắc ký khí (GC) với pha động là chất khí và sắc ký lỏng (LC) với pha động là chất lỏng

Việc phân chia các kỹ thuật sắc ký cũng có thể dựa trên loại pha tĩnh trong hệ thống Hai cách phân chia này có thể được tóm tắt trong bảng sau:

Bảng 1.1 Phân loại sắc ký theo pha tĩnh

1.4.2.2 Phân loại theo vật liệu nhồi

Các kỹ thuật sắc ký cũng có thể phân loại dựa trên vật liệu nhồi được sử dụng trong hệ thống Với cách phân loại này, có các kỹ thuật sắc ký cột nhồi, sắc ký mao quản, sắc ký bản mỏng

1.4.3 Lý thuyết về sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

1.4.3.1 Khái niệm sắc ký lỏng hiệu năng cao

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một dạng của sắc ký lỏng Đây là một kỹ thuật mà theo đó một mẫu hỗn hợp các chất được tách thành các thành phần để định tính, định lượng và tinh chế Trong HPLC, khả năng tách chất dựa vào sự tương tác của chất phân tích với các thành phần của pha động và pha tĩnh, trong đó tương tác giữa chất phân tích với pha động là quan trọng[5]

1.4.3.2 Các đặc trưng của sắc ký lỏng hiệu năng cao

i) Sắc ký đồ

Sắc ký đồ là một đáp ứng điển hình thu được bằng phương pháp sắc ký Sắc ký

đồ cho thấy sự phụ thuộc của nồng độ so với thời gian rửa giải

Hình 1.6 Hình ảnh minh họa sắc ký đồ

Trong đó, tR được gọi là thời gian lưu; tM (hoặc to) là thời gian chết; Wb là độ rộng đường nền trong một đơn vị thời gian lưu; Wh là độ rộng bán phổ (tức là độ rộng của peak sắc ký ở chiều cao bằng nửa chiều cao của peak sắc ký) trong một đơn vị thời gian

ii) Peak sắc ký

Chiều rộng peak và vị trí peak xác định sự phân tách các chất trong kỹ thuật sắc

ký

Hình 1.7 Hình ảnh minh họa peak sắc ký

Sự phân tách của các chất trong sắc ký phụ thuộc vào hai yếu tố là sự khác biệt trong việc giữ lại các chất phân tích (tức là sự khác biệt về thời gian lưu hoặc thể tích cần thiết cho sự rửa giải chúng) và bề rộng của mỗi peak sắc kí phải hẹp

iii) Thời gian lưu

Thời gian lưu (tR) của chất phân tích hoặc thể tích lưu (VR) trong sắc ký có liên quan trực tiếp đến độ mạnh trong sự tương tác giữa chất phân tích với các pha động và pha tĩnh

Sự lưu giữ chất phân tích trên một cột nhất định liên quan đến các chi tiết của hệ thống sắc ký đó bao gồm kích thước của cột, tốc độ dòng của pha động Trong đó, tốc

độ dòng trung bình của pha động có thể được tính thông qua biểu thức:

R

L v t

 với L là chiều dài của cột sắc ký

iv) Hệ số dung lượng k '



 Vì vậy, hệ số dung lượng '

k cũng liên quan trực tiếp đến độ mạnh của sự tương tác giữa một chất phân tích với các pha tĩnh và pha động

Hệ số dung lượng rất hữu ích trong việc so sánh kết quả thu được trên các hệ thống sắc ký khác nhau vì hệ số này không phụ thuộc vào chiều dài cột và tốc độ dòng chảy

Ngoài ra, giá trị của hệ số dung lượng cũng rất hữu ích trong việc tìm hiểu các cơ chế lưu giữ chất phân tích, vì theo như định nghĩa cơ bản của k’ là:

s.p '

m.p

mol Ak

mol A



Với mol As.p đại diện cho lượng chất phân tích có mặt trong pha tĩnh và mol Am.p

đại diện cho lượng chất phân tích có mặt trong pha động ở trạng thái cân bằng Ở vị trí tâm của peak sắc ký sẽ là nơi mà cân bằng đạt được hoặc nơi đó chính là lân cận của cân bằng

Biểu thức hệ số dung lượng chỉ ra rằng nếu '

k càng nhỏ thì tR càng nhỏ và sự tách trong trường hợp này kém Ngược lại, nếu '

k lớn thì tR lớn khi đó peak bị doãng Trong thực tế, đối với hỗn hợp ít cấu tử, '

k dao động trong đoạn từ 1 đến 5 là tối ưu Còn đối với hỗn hợp nhiều cấu tử '

k dao động trong nửa khoảng từ 1 đến 10

peak sắc ký hẹp (peak sắc ký hẹp có nghĩa là có sự khác biệt nhỏ trong tương tác tách hai chất phân tích)

Hình 1.8 Hình ảnh minh họa peak sắc ký theo phân bố Gauss

Giá trị  có thể được xác định từ độ rộng của các peak nếu chúng ta giả sử hình dạng của peak tuân theo phân bố Gauss (phân bố chuẩn) Khi đó, Wb = 4 và Wh = 2,354 Giá trị này phụ thuộc vào thời gian chất phân tích lưu giữ trong cột ( '

k hoặc

tR)

vi) Số đĩa lý thuyết

Số đĩa lý thuyết (N) dùng để so sánh hiệu năng của một hệ thống đối với các chất phân tích có thời gian lưu giữ khác nhau N được xác định từ tR và  thông qua biểu

  Ngoài ra, giá trị N cũng có thể

được tính thông qua thời gian lưu (tR), chiều cao đĩa lý thuyết (H) và diện tích peak sắc

ký (Speak) theo biểu thức: R 2

Giá trị N đối với một cột càng lớn thì khả năng tách hai chất của cột đó càng cao

N phụ thuộc vào chiều dài của cột sắc ký, không phụ thuộc vào sự lưu giữ chất phân tích

Hình 1.9 Hình ảnh minh họa cột sắc ký và các đĩa lý thuyết vii) Chiều cao đĩa lý thuyết

Chiều cao tương đương của một đĩa lý thuyết (HFTP) hay nói một cách ngắn gọn

là chiều cao đĩa (H) được sử dụng để so sánh hiệu năng tách chất của các cột có độ dài khác nhau: H L

N

 với L là chiều dài cột sắc ký và N là số đĩa lý thuyết tương ứng với cột sắc ký đó H có thể hiểu đơn giản là chiều dài của một cột sắc ký tương đương với một đĩa lý thuyết

Chiều cao đĩa mô tả mức độ phân tán đỉnh gây ra do sự pha trộn của chất phân tích với pha động Sự mở rộng peak là kết quả của 4 quá trình xảy ra trong quá trình chuyển chất phân tích đi qua cột tách Vì vậy, chiều cao của đĩa được hình thành từ 4

sự đóng góp mà tổng hợp các sự đóng góp này xác định độ phân tán peak Bốn sự đóng góp đó là Hdiff mô tả đóng góp từ sự khuếch tán theo chiều dọc; Hconv mô tả đóng góp từ hỗn hợp đối lưu; Hex, m mô tả đóng góp có nguồn gốc từ quá trình động học của

sự truyền khối từ pha động đến bề mặt phân cách giữa pha động và pha tĩnh; Hex, s mô

tả đóng góp có nguồn gốc từ quá trình động học của sự truyền khối từ pha tĩnh

Như vậy, tổng chiều cao của đĩa là sự đóng góp của 4 yếu tố trên:

viii) Hệ số chọn lọc và độ phân giải

Hệ số chọn lọc được ký hiệu bởi chữ  Đây là một tham số được sử dụng để mô

tả cách thức hai chất phân tích được tách ra bằng một hệ thống sắc ký Giá trị hệ số chọn lọc được xác định bởi biểu thức

' 2 ' 1

k k

Hình 1.10 Hình ảnh minh họa sự tách hai peak sắc ký

Độ phân giải được ký hiệu là Rs Độ phân giải giữa hai peak là một thước đo thứ hai cho thấy cách thức hai peak được tách ra như thế nào

Độ phân giải được xác định bởi biểu thức R 2 R1

Độ phân giải (Rs) được sử dụng rộng rãi hơn so với hệ số chọn lọc () vì nó giữ lại cả hai đặc trưng là thời gian lưu (tR) và hiệu năng cột (Wb) được xem xét trong việc xác định khả năng tách của các peak

Nếu hai peak là hai tam giác cân thì Rs = 1 là đủ để tách riêng hai peak sắc ký ra khỏi nhau Nếu hai peak là các phân bố Gauss thì RS > 1,5 là cần thiết để các peak tách nhau một cách hoàn toàn

Sự tách là lý thưởng khi Rs đạt giá trị độ phân giải đường nền (Rs = 1,5)

1.5 Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

HPLC là một dạng của sắc ký lỏng dùng để tách các hợp chất được hòa tan trong dung dịch Vì vậy, hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) phải bao gồm các bộ phận cơ bản như được mô tả như trong hình dưới:

Hình 1.11 Hình ảnh minh họa sơ đồ hệ thống HPLC

7: Hệ thống máy tính có phần mềm ghi nhận tín hiệu,

xử lý dữ liệu và điều khiển hệ thống 8: Hệ thống để in dữ liệu

1.5.1 Bình chứa pha động

Hệ dung môi rửa giải thường được cho vào các bình chứa được làm bằng chất liệu trơ, thường là bằng thủy tinh[5] Trong mỗi bình, có một ống dẫn dung môi từ bình vào hệ thống sắc ký

Các máy HPLC hiện nay thường có 4 đường dung môi vào đầu bơm cao áp Điều này cho phép chúng ta sử dụng 4 bình chứa dung môi cùng một lần để rửa giải theo tỉ

lệ mong muốn và tổng tỉ lệ của 4 đường là 100%

Tất cả các dung môi dùng cho HPLC đều phải là dung môi tinh khiết sử dụng cho HPLC Tất cả các hóa chất dùng để chuẩn bị mẫu và pha hệ đệm đều phải là hóa chất tinh khiết dùng cho phân tích

Việc sử dụng hóa chất tinh khiết nhằm tránh hỏng cột sắc ký hay nhiễu đường nền, tạo nên các peak tạp trong quá trình phân tích

1.5.2 Bộ phận khử khí

Mục đích sử dụng bộ khử khí nhằm loại trừ các bọt nhỏ còn sót lại trong dung môi pha động, tránh xảy ra hiện tượng tỉ lệ pha động của các đường dung môi không đúng làm cho thời gian lưu của peak thay đổi

Trong trường hợp bọt quá nhiều, bộ khử khí không thể loại trừ hết được thì bơm cao áp có thể không hút được dung môi, khi đó ảnh hưởng đến áp suất và hoạt động của cả hệ thống HPLC

Trong các trường hợp trên đều dẫn đến sai kết quả phân tích

1.5.3 Bơm cao áp

Mục đích của bơm cao áp là để bơm pha động vào cột thực hiện quá trình chia tách sắc ký Bơm phải chịu được áp suất 400 bar cho HPLC thường và đến 1300 bar cho UPLC, tốc độ dòng từ 0,01 đến 10 mL/phút Bơm cao áp được thiết kế để giảm xung khi piston vận hành

Một bơm tốt phải thỏa được các yêu cầu là chịu được nhiều loại dung môi hữu cơ; các dung dịch đệm, tốc độ dòng ổn định; ít bị ăn mòn và thể tích chết càng nhỏ càng tốt[5]

Một máy bơm có thể cung cấp một thành phần pha động không đổi (đẳng dòng) trong suốt quá trình phân tích hoặc gradient có thành phần pha động thay đổi (gradient) trong quá trình phân tích

Pha động được bơm vào cột sắc ký bằng một bơm cao áp

Trước khi pha động đi vào cột phân tích, nó phải được cho ngang qua một cột bảo vệ để lọc bỏ những tạp chất bẩn còn sót lại[5]

– Đầu dò phát huỳnh quang (RF)

– Đầu dò chỉ số khúc xạ

– Đầu dò amper kế

– Đầu dò đo độ dẫn điện

– Đầu dò quang phổ hồng ngoa ̣i (IR)

– Đầu dò khối phổ (MS)

1.5.7 Bộ phận ghi nhận tín hiệu

Bộ phận này ghi tín hiệu do đầu dò phát hiện

Đối với các hệ thống HPLC hiện đại, phần này được phần mềm trong hệ thống ghi nhận, lưu các thông số, sắc ký đồ, các thông số liên quan đến peak như tính đối xứng, hệ số phân giải, … Đồng thời tính toán, xử lý các thông số liên quan đến kết quả phân tích

1.5.8 In dữ liệu

Sau khi phân tích xong, dữ liệu sẽ được in ra qua máy in kết nối với máy tính có cài phần mềm điều khiển

CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM 2.1 Hóa chất và dụng cụ

tủ mát Các dung dịch làm việc được pha từ dung dịch chuẩn gốc bằng methanol Các

dung dịch loãng chỉ sử dụng trong ngày

2.1.1.2 Dung môi

Bảng 2.2 Danh mục dung môi tinh khiết chuyên dùng cho HPLC

STT Tên dung môi Nhà sản xuất Tiêu chuẩn

Hàm lượng nguyên trạng (%)

1 Methanol Merck KGaA Đức

2.1.1.3 Các hóa chất khác

Bảng 2.3 Danh mục hóa chất tinh khiết

STT Tên hóa chất Nhà sản xuất Tiêu chuẩn

Hàm lượng nguyên trạng (%)

1

Acid acetic

(băng) Merck KGaA - Đức Dùng cho HPLC 100%

2 Acid chlohidric Merck KGaA - Đức Dùng cho HPLC 37%

3 Acid formic Scharlau, Scharlab

acetate Merck KGaA - Đức Dùng cho HPLC 98%

7 Ethyl acetate Fisher Scientific UK Dùng cho HPLC 99,98%

8 Hexane Fisher Scientific UK Dùng cho HPLC > 99%

9 Acetone Merck KGaA - Đức Dùng cho HPLC

10 Ethanol Merck KGaA - Đức Dùng cho HPLC 96%

12 Ammonia

Guangdong Guanghua Sci-Tech Co., Ltd

+ Bình đựng dung môi 4 kênh (Pyrex 1000 L, Germany)

+ Bộ lọc dung môi dùng màng lọc 0,45 micromet

+ Máy deion (Water Pro PS, LABCONCO)

+ Cột sắc ký C18 (Zorbax Eclipse XDB – C18, 5 m 4, 6 mm 250 mm    , Agilent – USA) và tiền cột (Eclipse XDB – C18 4 – Pack, Agilent – USA)

+ Cân phân tích (Sartorius – CPA225D)

+ Máy cất nước hai lần (Hamilton Laboratory Class Limited – Sartorius)

+ Máy xay mẫu

+ Máy siêu âm (S100H Elmasonic, Elma – Germany)

+ Máy ly tâm (DNA concentrator)

+ Máy đo phổ hấp thụ phân tử UV – Vis (Lambda 25 UV/Vis Spectrometor, Perkin Elmer)

2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Khảo sát các điều kiện tối ưu cho hệ thống HPLC

2.2.1.1 Khoảng bước sóng của detector PDA

Phương pháp nghiên cứu được lựa chọn là sắc ký lỏng hiệu năng cao sử dụng

đầu dò PDA Việc đo để phát hiện các chất phân tích Auramine O và Rhodamine B vẫn dựa trên cơ sở tính chất hấp thụ quang phân tử của chất trong dung dịch tại một bước sóng nào đó Để thu được peak đủ điều kiện định lượng cần phải đo ở bước sóng ứng với cực đại hấp thụ

Các hợp chất Auramine O và Rhodamine B hấp thụ bức xạ trong vùng khả kiến, nên đầu tiên ta tiến hành khảo sát phổ hấp thụ ánh sáng trong vùng khả kiến Vis trên máy đo quang UV – Vis (Lambda 25 UV/Vis Spectrometor, Perkin Elmer) Dung dịch

đo là chuẩn đơn Auramine O, chuẩn đơn Rhodamine B và chuẩn hỗn hợp (Auramine

O và Rhodamine B) với:

Nồng độ chất phân tích 2 ppm đối với mỗi chất

Dung môi 100% MeOH; 100% ACN

Khoảng quét phổ 300 – 600 nm

2.2.1.2 Thăm dò thứ tự tách các chất phân tích trên cột sắc ký pha đảo C18

Vấn đề đầu tiên để bắt đầu khảo sát các điều kiện sắc ký là phải khảo sát thời

gian lưu Như chúng tôi đã nêu ở Chương 1, thời gian lưu được tính từ lúc nạp mẫu

vào cột tách sắc ký cho đến lúc chất phân tích được rửa giải ra khỏi cột ở điểm có nồng

độ cực đại Thời gian lưu liên hệ mật thiết với:

+ Pha tĩnh (loại, cỡ hạt, độ xốp, cấu trúc xốp, )

+ Pha động chương trình chạy sắc ký (loại dung môi, tỉ lệ dung môi, tốc độ…)

+ Chất phân tích (bản chất, cấu trúc)

+ Môi trường pha động (đệm, pH)

Khảo sát thời gian lưu để xác định chất nào ra trước, chất nào ra sau và dự đoán ảnh hưởng của độ phân cực của dung môi với khả năng tách riêng từng chất trong hỗn hợp Thời gian lưu được khảo sát bằng cách pha một dung dịch chuẩn hỗn hợp (Auramine O và Rhodamine B) với nồng độ mỗi chất là 2,0 ppm trong dung môi methanol Tiến hành phân tích sắc ký với chương trình nhiệt độ là 35oC5oC, tốc độ pha động là 1 mL/phút, detector PDA với khoảng bước sóng khảo sát từ 400 – 600 nm

2.2.2 Tối ưu hóa pha động

Với mục đích tìm kiếm điều kiện tối ưu cho pha động, chúng tôi khảo sát bằng cách thay đổi từng yếu tố, theo thứ tự:

1 Khảo sát dung môi pha động

2 Khảo sát pH của pha động

3 Khảo sát chương trình hóa dung môi (đẳng dòng, gradient)

4 Khảo sát tốc độ dòng

5 Khảo sát tỉ lệ dung môi pha động ban đầu

Sau khi khảo sát xong các mức trong cùng một yếu tố, chọn ra mức tối ưu để khảo sát các yếu tố tiếp theo

2.2.2.1 Khảo sát dung môi pha động

Dung môi được lựa chọn để khảo sát là acetonitrile và methanol

Chương trình sắc ký với pha tĩnh là RP – C18, nhiệt độ cột tách là 35oC5oC, nồng độ hai chất phân tích là 2,0 ppm, bước sóng khảo sát từ 400 – 600 nm, tốc độ dòng là 1 mL/phút Chương trình gradient pha động[23] theo đồ thị Hình 2.1:

Hình 2.1 Chương trình gradient pha động – Khảo sát chọn loại dung môi

0 20 40 60 80 100

Thực hiện phân tích sắc ký, thiết lập các mối quan hệ về hệ số dung lượng, hệ số không đối xứng, độ phân giải hai peak sắc ký để chọn dung môi pha động

2.2.2.2 Khảo sát pH

Dựa vào giá trị pKa[19] của AO và RB, để hạn chế tồn tại đồng thời nhiều dạng

AO, RB trên cột và loại bỏ sự kéo đuôi của peak AO, RB trong quá trình tách sắc ký thì pH < 7 Ngoài ra, cột pha đảo C18 chịu đựng được pH trong khoảng 2 – 9 nên chúng tôi chọn các acid và đệm cho chương trình dung môi pha động bao gồm:

Đối với các giá trị pH từ 3,0 đến 4,5 ta sử dụng chương trình gradient pha động[23] tiến hành với các tỉ lệ theo đồ thị Hình 2.1

Đối với các giá trị pH 2,3 và 2,6 ta sử dụng chương trình gradient pha động tiến

hành với các tỉ lệ theo đồ thị Hình 2.2 và tốc độ dòng là 0,7 mL/phút:

Hình 2.2 Gradient pha động – Khảo sát pH 2,3 và 2,6

Thực hiện phân tích sắc ký, thiết lập các mối quan hệ về hệ số dung lượng, hệ số không đối xứng, độ phân giải hai peak sắc ký để chọn loại acid (hoặc đệm) thích hợp cho pha động

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

Thời gian (phút)

2.2.2.3 Khảo sát chương trình hóa dung môi pha động

Tỉ lệ thành phần dung môi tạo ra pha động có ảnh hưởng đến quá trình rửa giải các chất phân tích ra khỏi cột tách Khi tỉ lệ thành phần pha động thay đổi thì lực rửa giải của pha động thay đổi, tức làm thay đổi thời gian lưu của chất phân tích ra khỏi cột và do đó làm thay đổi hệ số dung lượng của chất phân tích

 Khảo sát chương trình đẳng dòng (isocratic)

Thực hiện phương pháp phân tích sắc ký với một số chương trình đẳng dòng như sau: + Chương trình đẳng dòng sử dụng dung môi MeOH và HCOOH (pH = 3) theo tỉ

 Khảo sát chương trình gradient

Lựa chọn các đoạn gradient và đặt tỉ lệ thành phần dung môi ở đầu mỗi đoạn gradient Các mức được chọn khảo sát:

+ Mức 1: t = 0 (30% MeOH hoặc ACN)

+ Mức 2: t = 0 (43,7% MeOH hoặc ACN)

Chương trình sắc ký dùng để khảo sát sử dụng pha tĩnh là RP – C18, nhiệt độ cột tách là 35oC5oC, nồng độ hai chất phân tích là 2,0 ppm, bước sóng quét phổ của đầu

dò PDA từ 400 – 600 nm, tốc độ dòng là 1 mL/phút

2.2.2.4 Tốc độ pha động

Cùng với các yếu tố nhưthành phần pha động, tỉ lệ thành phần pha động, pH thì tốc độ pha động khi chạy sắc ký cũng có thể ảnh hưởng đến kết quả phân tách sắc ký Tốc độ pha động quá nhỏ sẽ gây ra hiện tượng doãng peak sắc ký, thời gian rửa giải các chất lâu nên sẽ tăng chi phí cho phép phân tích, không có tính kinh tế Tốc độ pha động quá lớn có thể làm cho các chất trong hỗn hợp mẫu không kịp tách ra khỏi nhau

Tiến hành khảo sát tốc độ pha động ở 4 mức 0,6; 0,7; 0,85 và 1,0 mL/phút với các điều kiện tối ưu đã tiến hành khảo sát ở trên và lựa chọn tốc độ dòng thích hợp

2.2.3 Thẩm định phương pháp

Phương pháp do chúng tôi đề xuất được tham khảo từ các bài báo công bố trên các tạp chí trong và ngoài nước đồng thời nghiên cứu khảo sát và thay đổi một số điều kiện trong quá trình thực hiện (thiết bị phân tích, nền mẫu, người tiến hành phân tích,

…) Vì vậy, phương pháp mà chúng tôi đề xuất không phải là phương pháp tiêu chuẩn

Do đó, theo yêu cầu của ISO 17025[8][11][12][16] , phương pháp phân tích này phải được thẩm định nhằm mục đích kiểm tra và cung cấp bằng chứng khách quan chứng tỏ phương pháp đề xuất đáp ứng được các yêu cầu đặt ra và kết quả phân tích thu được là

đáng tin cậy Dựa vào Bảng 2.4, chúng tôi lựa chọn ra các thông số thẩm định bao

gồm: độ đúng, độ đặc hiệu/chọn lọc, LOD, LOQ, độ tuyến tính

Bảng 2.4 Thông số thẩm định phương pháp không tiêu chuẩn ICH, USP, FDA

Trong đó, kí hiệu (+) Cần thực hiện thẩm định và (–) Không cần thực hiện thẩm định

2.2.3.1 Tính đặc hiệu/chọn lọc [14]

Đối với sắc ký lỏng sử dụng detector PDA thì tính chọn lọc trong sắc ký lỏng có thể đạt được thông qua việc việc lựa chọn cột tối ưu, điều kiện sắc ký tối ưu, nhiệt độ cột và bước sóng Ngoài việc thay đổi điều kiện sắc ký thì giai đoạn xử lý mẫu cũng phải tối ưu để đạt được tính chọn lọc cao nhất Trong sắc ký, cần xác định rằng peak sắc ký có phải là một peak đơn hay có lẫn các tạp chất khác Đối với các hệ thống sắc

ký có detector PDA có thể xác định được tính chọn lọc thông qua xác định độ tinh khiết của peak

Khảo sát tính đặc hiệu/chọn lọc trong phân tích AO, RB được thực hiện bằng cách chuẩn bị ba mẫu gồm dung dịch chuẩn, một mẫu thực tế cần phân tích không có thêm chuẩn, một mẫu thực tế cần phân tích có thêm chuẩn hỗn hợp hai chất AO và

RB Các mẫu được xử lý theo quy trình xử lý đã tối ưu hóa

Tính chọn lọc AO và RB trong phân tích các mẫu thực phẩm được đánh giá dựa vào hai tiêu chí Tiêu chí thứ nhất: sự tương đồng về thời gian lưu các peak mục tiêu (AO, RB) của mẫu thực tế có thêm chuẩn với mẫu chỉ chứa dung dịch chuẩn, sự tương

Các thông số thẩm

định

Phân tích định tính

đồng các peak tạp của mẫu thực tế không thêm chuẩn và mẫu thực tế có thêm chuẩn Tiêu chí thứ 2: độ tinh khiết của peak sắc ký

2.2.3.2 Khoảng tuyến tính và đường chuẩn [10]

Khoảng tuyến tính của một phương pháp phân tích là khoảng nồng độ ở đó có sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được (diện tích hoặc chiều cao peak sắc ký) vào nồng độ chất phân tích

Để xác định khoảng tuyến tính cần thực hiện đo các dung dịch chuẩn có nồng độ thay đổi và khảo sát sự phụ thuộc của tín hiệu vào nồng độ Sau đó, vẽ đường cong phụ thuộc giữa tín hiệu đo vào nồng độ và quan sát sự phụ thuộc cho đến khi không còn tuyến tính

Tuy nhiên, trong thực tế để tiết kiệm thời gian và hóa chất, chúng tôi không xây dựng toàn bộ đường tuyến tính mà chỉ xây dựng đường chuẩn và xác định hệ số hồi quy tương quan Dựa trên các dữ liệu từ các bài báo và dự đoán hàm lượng các chất phân tích có thể có trong mẫu thực tế mà chúng tôi sẽ tiến hành phân tích, chúng tôi xây dựng đường chuẩn trong khoảng nồng độ từ 0,05 ppm đến 2,00 ppm Chúng tôi chọn cách xây dựng đường chuẩn với chất chuẩn tinh khiết (Auramine O – tinh khiết HPLC 85% và Rhodamine B – tinh khiết HPLC  95%) được pha trong MeOH Các chuẩn này mua từ hãng Sigma đạt được các yêu cầu của ISO 17025[11]

Sau khi chuẩn bị xong các chuẩn có nồng độ đã tính trước, chúng tôi xác định các giá trị đo được Y (diện tích hoặc chiều cao peak sắc ký) theo nồng độ X Mỗi nồng độ chuẩn được tiến hành đo lặp lại 2 đến 3 lần và lấy giá trị trung bình Trong khoảng nồng độ khảo sát, nếu sự phụ thuộc giữa các đại lượng là tuyến tính, đường biểu diễn

là một phương trình bậc nhất có dạng như sau: Y = A + BX, với A là điểm cắt trục tung của đường chuẩn và B là giá trị hệ số góc (độ dốc của đường chuẩn) Các dữ liệu thu thập được trong tiến trình chạy sắc ký được xử lý thống kê bằng phần mềm Origin 8.5.1 để xác định được các giá trị A, B cũng như hệ số tương quan R

Một đường chuẩn được chấp nhận khi thỏa mãn các yêu cầu về hệ số tương quan

R và độ chệch của các điểm nồng độ dùng để xây dựng đường chuẩn

Hệ số tương quan R được xem như là chỉ tiêu đầu tiên của một đường chuẩn đạt yêu cầu Giá trị R phải nằm trong đoạn 0,995 ≤ R ≤ 1 hay 0,99 ≤ R2 ≤ 1

Độ chệch các điểm nồng độ dùng xây dựng đường chuẩn Sau khi lập đường chuẩn xong cần kiểm tra bằng phương pháp tính ngược lại nồng độ của các điểm

chuẩn sử dụng để xây dựng đường chuẩn từ đó tính các giá trị độ chệch theo công thức sau:

100 C

C C

c

c t

2.2.3.3 Giới hạn phát hiện

Theo IUPAC và ISO, LOD được xem là nồng độ nhỏ nhất của chất phân tích mà phương pháp phân tích có thể phát hiện được[10]

LOD được xác định tương đối dựa vào độ dốc của đường chuẩn và độ lệch chuẩn

của tín hiệu đo thông qua biểu thức: LOD 3 Sy

B



 Trong đó Sy là độ lệch chuẩn của tín hiệu của mẫu trắng, cũng được xác định bằng phương trình hồi quy và B là độ dốc (hệ số góc) trong phương trình hồi quy[10]

Sau khi thu được LOD bằng cách tính theo đường chuẩn, chúng tôi pha loãng dung dịch chuẩn đến nồng độ LOD vừa tính được Tiến hành phân tích sắc ký với các điều kiện đã được tối ưu và dựa vào tỉ lệ tín hiệu trên nhiễu (S

N) để xác định lại LOD LOD được chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 2–3 lần nhiễu đường nền, thông thường thường lấy S

N = 3 Theo Hình 2.3 [10], công thức tính tín

hiệu trên nhiễu là:

2 h

H N

Hình 2.3 Hình ảnh minh họa xác định LOD bằng cách tính S

N