Nghiên cứu đặc điểm cận lâm sàng và đột biến gene jak2 v617f trên bệnh nhân tăng tiểu cầu tiên phát tại bệnh viện trung ương thái nguyên

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC LÊ HẠNH HUYÊN NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM CẬN LÂM SÀNG VÀ ĐỘT BIẾN GENE JAK2 V617F TRÊN BỆNH NHÂN TĂNG TIỂU CẦU TIÊN PHÁT TẠI BỆNH VIỆN TRUNG ƯƠNG

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

LÊ HẠNH HUYÊN

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM CẬN LÂM SÀNG VÀ ĐỘT BIẾN GENE JAK2 V617F TRÊN BỆNH NHÂN TĂNG TIỂU CẦU TIÊN PHÁT TẠI BỆNH VIỆN

TRUNG ƯƠNG THÁI NGUYÊN

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

THÁI NGUYÊN - 2019

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

LÊ HẠNH HUYÊN

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM CẬN LÂM SÀNG VÀ ĐỘT BIẾN GENE JAK2 V617F TRÊN BỆNH NHÂN TĂNG TIỂU CẦU TIÊN PHÁT TẠI BỆNH VIỆN

TRUNG ƯƠNG THÁI NGUYÊN

Ngành: Công nghệ Sinh học

Mã số: 84 20 201

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

Hướng dẫn khoa học: 1 Ts Nguyễn Thế Tùng

2 Ts Nguyễn Thị Hải Yến

THÁI NGUYÊN - 2019

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào Mọi kết quả thu được không chỉnh sửa, sao hoặc chép từ các nghiên cứu khác Mọi trích dẫn trong luận văn đều ghi rõ nguồn gốc

Tác giả

Lê Hạnh Huyên

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành bản luận văn này tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới: Ban Giám hiệu, phòng Đào tạo, trường Đại học Khoa học - Đại học Thái

Nguyên Các thầy cô và cán bộ Khoa Công nghệ Sinh học đã tận tình dạy dỗ,

truyền dạy kiến thức và kinh nghiệm nghiên cứu khoa học cho tôi trong những năm qua

Tôi xin chân thành cảm ơn thầy giáo Ts Nguyễn Thế Tùng và cô giáo

Ts Nguyễn Thị Hải Yến, người thầy đã định hướng nghiên cứu và tận tình hướng dẫn, chỉ bảo cho tôi trong suốt thời gian tôi thực hiện và hoàn thành luận văn này

Trong suốt quá trình thực hiện đề tài, tôi đã nhận được rất nhiều sự quan tâm giúp đỡ từ khoa Miễn dịch-Di truyền phân tử Bệnh viện Trung ƯơngThái Nguyên, gia đình, bạn bè, đồng nghiệp, những người luôn động viên, khích lệ, tạo cho tôi động lực và niềm say mê trong nghiên cứu khoa học Tôi vô cùng biết ơn tất cả những tình cảm tốt đẹp mà mọi người đã dành cho tôi

Thái Nguyên, tháng 11 năm 2019

Tác giả

Lê Hạnh Huyên

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT v

DANH MỤC BẢNG vi

DANH MỤC HÌNH vii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU 3

1.1 Tổng quan về bệnh tăng tiểu cầu tiên phát 3

1.1.1 Giới thiệu về bệnh tăng tiểu cầu tiên phát 3

1.1.2 Cơ chế bệnh tăng tiểu cầu tiên phát 5

1.1.3 Triệu chứng lâm sàng, cận lâm sàng bệnh tăng tiểu cầu tiên phát 8

1.1.4 Chẩn đoán tăng tiểu cầu tiên phát 10

1.2 Tổng quan nghiên cứu về gene JAK2 V617F 12

1.2.1 Gene JAK2 12

1.2.2 Đột biến gene JAK2 13

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 Vật liệu, hóa chất và thiết bị nghiên cứu 16

2.1.1 Vật liệu 16

2.1.2 Hóa chất và thiết bị nghiên cứu 16

2.2 Thời gian địa điểm nghiên cứu 17

2.3 Phương pháp xử lý số liệu 17

2.4 Phương pháp nghiên cứu 17

2.4.1 Thu thập mẫu nghiên cứu 17

2.4.2 Phân tích các đặc điểm cận lâm sàng 18

2.4.3 Xét nghiệm phát hiện đột biến gene JAK2 V617F 18

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22

3.1 Đặc điểm chung của các đối tượng nghiên cứu 223.2 Các chỉ số huyết học của đối tượng nghiên cứu 233.4 Kết quả nghiên cứu về tỉ lệ đột biến JAK2 V617F và đặc điểm huyết

học của 2 nhóm có và không có đột biến JAK2 V617F 273.4.1 Kết quả tách chiết DNA tổng số và Thực hiện phản ứng AS-PCR

kiểm tra đột biến JAK2 V617F từ mẫu máu các bệnh nhân 273.4.2 Tỉ lệ đột biến JAK2 V617F và đặc điểm huyết học của 2 nhóm có và

không có đột biến JAK2 V617F 28

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 34 PHỤ LỤC 42

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Từ viết tắt

Giải nghĩa tiếng Anh Giải nghĩa tiếng Việt

AS - PCR Alen Specific – Polymerase chain

Reaction CEL Chronic eosinophilic leukemia Bạch cầu mạn dòng acid CML Chronic megakaryocytic leukemia Bạch cầu mạn dòng tủy CNL Chronic neutrophilic leukemia Bạch cầu mạn dòng trung tính DNA Deoxyribonucleic Acid

ECC Endogenous erythroid colony Cụm sinh hồng cầu

ET Essential Thrombocythemia Tăng tiểu cầu nguyên phát

JKA2 Janus kinase 2

LDH lactate dehydrogenase

MCV Mean corpuscular volume Thể tích trung bình hồng

cầu MPN myeloproliferative neoplasm Hội chứng tăng sinh tủy MPV Mean Platelet Volume Thể tích trung bình tiểu

cầu

PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi

Polymerase

WHO World Health Organization Tổ chức Y tế thế giới

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 Phân bố giới tính và độ tuổi của của đối tượng nghiên cứu 22Bảng 3.2 Các chỉ số dòng tiểu cầu của các nhóm đối tượng nghiên cứu

theo giới (X ± SD) 23Bảng 3.3 Tần xuất đối tượng nghiên cứu theo mức số lượng tiểu cầu 23Bảng 3.4 Chỉ số dòng hồng cầu của các nhóm đối tượng nghiên cứu theo

giới (X ± SD) 24Bảng 3.5 Một số chỉ số hồng cầu lưới ở máu ngoại vi của các nhóm đối

tượng nghiên cứu theo giới (X ± SD) 24Bảng 3.6 Tần xuất đối tượng nghiên cứu theo mức chỉ số hồng cầu lưới ở

máu ngoại vi 25Bảng 3.7 Số lượng và tỉ lệ các loại bạch cầu của đối tượng nghiên cứu theo

giới (X ± SD) 25Bảng 3.8 Một số chỉ số hóa sinh của các nhóm đối tượng nghiên cứu theo

giới (X ± SD) 26Bảng 3.9 Các chỉ số dòng tiểu cầu của các nhóm đối tượng nghiên cứu

theo nhóm có đột biến và nhóm không có đột biến (X ± SD) 29Bảng 3.10 Tần xuất 2 nhóm nghiên cứu nhóm có đột biến và không có đột

biến theo mức số lượng tiểu cầu 29Bảng 3.11 Các chỉ số dòng hồng cầu của các nhóm đối tượng nghiên cứu

theo nhóm có đột biến và không có đột biến (X ± SD) 30Bảng 3.12 Một số chỉ số hồng cầu lưới ở máu ngoại vi của các đối tượng

nghiên cứu theo nhóm có đột biến và không có đột biến (X ± SD) 31Bảng 3.13 Tần xuất đối tượng nghiên cứu ở nhóm có đột biến và không có

đột biến theo mức chỉ số hồng cầu lưới ở máu ngoại vi 31Bảng 3.14 Số lượng và tỉ lệ các loại bạch cầu của đối tượng nghiên cứu

theo nhóm có đột biến và không có đột biến (X ± SD) 32

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Tiểu cầu trong máu ngoại vi 3

Hình 1.2 Hình ảnh đột biến gene JAK2 V617F gây bệnh tăng sinh tủy 6

Hình 1.3 Tiêu bản máu dàn của bệnh nhân tăng tiểu cầu nguyên phát 9

Hình 1.4 Vị trí của nhiễm sắc thể chứa gene JAK2 13

Hình 1.5 Đột biến gene liên quan đến bệnh tiểu cầu 14

Hình 3.1 Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm AS-PCR xác định đột biến gene JAK2 V617F từ các mẫu máu bệnh nhân 28

MỞ ĐẦU

Hội chứng tăng sinh tủy (Myeloproliferative neoplasm - MPN) là một nhóm bệnh của tủy xương do phát triển riêng một dòng hoặc tất cả các dòng tế bào tạo ra tại tủy Theo Tổ chức Y tế thế giới (WHO) nhóm này bao gồm 7 bệnh: Bạch cầu mạn dòng tủy (CML), Bạch cầu mạn dòng Neutrophil (CNL), Bạch cầu mạn dòng Eosinophil (CEL), Đa hồng cầu nguyên phát (PV), Tăng tiểu cầu nguyên phát (ET), Xơ tủy vô căn và tăng sinh tế bào Mast Tất cả đều có nguyên nhân từ tế bào máu gốc vạn năng sản sinh quá mức một hoặc nhiều dòng

tế bào, một số bệnh thuộc nhóm này chuyển thành bạch cầu cấp Các bệnh đa hồng cầu nguyên phát, Tăng tiểu cầu tiên phát và xơ tủy vô căn có thể chuyển dạng lẫn nhau [4], [5]

Bệnh nhân mắc bệnh tăng tiểu cầu tiên phát, số lượng tiểu cầu thường tăng từ 500 đến 1000 G/l Số lượng tiểu cầu tăng cao trong bệnh tăng tiểu cầu nguyên phát thường kèm theo tăng thêm một hoặc một vài yếu tố nguy cơ biến chứng Trên thực tế, số lượng tiểu cầu cao không nhất thiết có bất kỳ dấu hiệu lâm sàng nào và hầu như những trường hợp mắc bệnh thường được phát hiện qua việc xét nghiệm công thức máu Tuy nhiên, cần khai thác rõ tiền sử để loại trừ khả năng mắc bệnh tăng tiểu cầu thứ phát

Ngày nay nhờ sự tiến bộ về sinh học phân tử và di truyền tế bào, bệnh tăng tiểu cầu tiên phát được biết đến có liên quan đến đột biến gene JAK2 tại vị trí 617, Guanine (G) được thay bằng Thymine (T) và kết quả là Valine (V) được thay bằng Phenylalanine (P) Đột biến này làm xáo trộn dẫn truyền qua trục gene JAKSTAT, làm sản sinh quá mức các tế bào máu không kiểm soát được Nhóm bệnh này có tiên lượng khá tốt, các phương pháp điều trị kinh điển gồm các thuốc Hydroxyurea, Busulfan, Interferon, Bipobroman có thể kiểm soát được bệnh và kéo dài thời gian sống 10 -

20 năm Tuy nhiên, một số trường hợp chuyển sang bệnh lý ác tính như rối loạn sinh tủy và tử vong, bệnh nhân cũng có thể tử vong do các biến chứng huyết khối hoặc xuất huyết [12]

Tại Khoa miễn dịch - Di truyền phân tử Bệnh viện trung ương Thái Nguyên đã xác định được đột biến gene JAK2 V617F, nguyên nhân gây bệnh tăng tiểu cầu tiên phát Tuy nhiên, chưa có thống kê cụ thể về số lượng bệnh nhân và tỷ lệ đột biến gene JAK2 V617F phát hiện được trên nhóm bệnh này

Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu đặc điểm cận lâm sàng và đột biến gene JAK2 V617F trên bệnh nhân tăng tiểu cầu tiên phát tại bệnh viện Trung Ương Thái Nguyên” nhằm khảo sát các

đặc điểm về huyết học và tỷ lệ đột biến gene JAK2 V617F trên bệnh nhân tăng tiểu cầu nguyên phát tại Bệnh viện Trung Ương Thái Nguyên

Mục tiêu

Khảo sát các đặc điểm về cận lâm sàng và tỷ lệ đột biến gene JAK2 V617F

trên bệnh nhân tăng tiểu cầu tiên phát tại Bệnh viện Trung Ương Thái Nguyên

Nội dung nghiên cứu

1 Phân tích đặc điểm chung của các đối tượng nghiên cứu

2 Phân tích các chỉ số huyết học của đối tượng nghiên cứu bao gồm chỉ

số về PLT trung bình, MPV của nam và nữ; Các chỉ số RBC, Hgb, MCV; WBC của nam và nữ ở nhóm đối tượng nghiên cứu

3 Phân tích các chỉ số hóa sinh như hàm lượng Albumin, Protein của nam và nữ ở nhóm đối tượng nghiên cứu

4 Phân tích đột biến gene JAK2 V617F của các bệnh nhân bằng phản ứng AS-PCR

5 Phân tích đặc điểm huyết học của 2 nhóm có và không có đột biến gene JAK2 V617F bao gồm các chỉ số PLT, các chỉ số về dòng HC , tỉ lệ phần trăm

HC lưới ngoại vi, WBC của nhóm đối tượng có đột biến và không có đột biến

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU

1.1 Tổng quan về bệnh tăng tiểu cầu tiên phát

1.1.1 Giới thiệu về bệnh tăng tiểu cầu tiên phát

Tăng tiểu cầu tiên phát (Essential Thrombocythemia - ET) là một bệnh nằm trong nhóm Hội chứng tăng sinh tủy được đặc trưng bởi sự tăng sinh tủy tiên phát nghiêng về dòng mẫu tiểu cầu và có tăng số lượng tiểu cầu ở máu ngoại vi [1]

Đây là một bệnh lý tủy xương

không rõ nguyên nhân bao gồm các

rối loạn về máu, đặc biệt là tình trạng

huyết khối và chảy náu Rối loạn này

cũng có thể chuyển thành bệnh u

nguyên bào tủy, đặc biệt là suy tủy

Hội chứng tăng sinh tủy đã được chứng minh là có liên quan đến một

số gene như bcr-abl và JAK2 V617F Trong đó, bcr-abl là nguyên nhân gây

ra bệnh bạch cầu mạn dòng tủy, JAK2 V617F gây bệnh đa hồng cầu, tăng tiểu cầu tiên phát và xơ tủy tiên phát Việc xác định các đột biến soma của gene

JAK2 V617F được tìm thấy ở khoảng 90% bệnh nhân đã cải thiện đáng kể

phương pháp chẩn đoán cho rối loạn này Cho đến nay, việc ngăn ngừa các biến cố về mạch máu là mục tiêu chính của điều trị và quản lý bệnh nhân mắc bệnh ET Ngoài ra, một số phương pháp điều trị tế bào học chủ yếu được dùng cho những bệnh nhân có nguy cơ cao bị biến chứng mạch máu Các loại thuốc kích thích tế bào hiện đang được sử dụng bao gồm hydroxyurea, chủ yếu được sử dụng ở bệnh nhân lớn tuổi và interferon α được dùng chủ yếu ở bệnh nhân trẻ tuổi [1]

Hình 1.1 Tiểu cầu trong máu ngoại vi

Về mặt lâm sàng, ở bệnh nhân mắc bệnh tăng tiểu cầu nguyên phát,

số lượng tiểu cầu thường tăng từ 500 đến 1000 G/l Trên thực tế, số lượng tiểu cầu cao không nhất thiết có bất kỳ dấu hiệu lâm sàng nào và hầu như những trường hợp mắc bệnh thường được phát hiện qua việc xét nghiệm công thức máu Tuy nhiên, cần khai thác rõ tiền sử để loại trừ khả năng mắc bệnh tăng tiểu cầu thứ phát Số lượng tiểu cầu tăng cao trong bệnh tăng tiểu cầu nguyên phát thường kèm theo tăng thêm một hoặc một vài yếu tố nguy cơ biến chứng Một phần nhỏ số lượng bệnh nhân có xuất hiện triệu chứng đau đỏ đầu chi Đây là một loại biểu hiện của da, xuất hiện như một biến chứng ở bệnh nhân ET Bệnh nhân có cảm giác bỏng rát, đau và

đỏ ở các đầu ngón tay, ngón chân Khi kiểm tra tủy xương, có thể thấy xuất hiện các cụm mẫu tiểu cầu dày đặc, trong khi dòng tủy và dòng hồng cầu đều ở mức bình thường, không có sự gia tăng các tế bào Blast hoặc loạn sản Theo tiêu chuẩn của Hội nghiên cứu đa hồng cầu nguyên phát thì số lượng tiểu cầu phải trên 600 G/l là tiêu chí bắt buộc để chẩn đoán xác định bệnh tăng tiểu cầu nguyên phát Từ năm 2001, Tổ chức Y tế thế giới (WHO) đã đưa thêm vào tiêu chuẩn chẩn đoán bao gồm sự tăng số lượng các mẫu tiểu cầu lớn, trưởng thành, đồng thời đưa ra các tiêu chuẩn chẩn đoán loại trừ với các bệnh khác trong hội chứng tăng sinh tủy và lơ xê mi kinh dòng hạt Các nguyên nhân gẫy tăng tiểu cầu phản ứng như : thiếu sắt, cắt lách, phẫu thuật, nhiễm khuẩn, viêm, bệnh tự miễn, ung thư di căn, các bệnh tăng sinh lympho cũng được loại trừ Tiêu chuẩn về biến đổi gene

cũng được coi là một yếu tố quan trọng trong chẩn đoán [Error! Reference source not found.], [Error! Reference source not found.], [Error! Reference source not found.]

Một vấn đề được đặt ra đó là tuổi thọ trung bình của bệnh nhân có trường hợp nào có thể sống thọ như một người bình thường hay không, thì việc phát hiện ra những bệnh nhân thuộc nhóm nguy cơ thấp của bệnh và có tiên lượng tốt sẽ có thời gian sống thêm gần với người bình thường cùng lứa

tuổi Ngoài ra, có một số trường hợp vẫn có tuổi thọ thấp chủ yếu là do tắc mạch, hoặc bị chuyển hoá thành lơ xê mi cấp

1.1.2 Cơ chế bệnh tăng tiểu cầu tiên phát

Các bệnh tăng sinh tủy được coi là rối loạn về dòng tế bào Rối loạn về dòng tế bào xảy ra khi DNA của một tế bào gốc trong tủy xương có nhiều thay đổi Các tế bào gốc tạo máu là loại tế bào máu non có khả năng phát triển thành một trong ba dòng tế bào máu chính: hồng cầu, bạch cầu hay tiểu cầu Các thay đổi ở tế bào gốc (tế bào tạo máu) khiến cho tế bào này sinh sản liên tục, tạo ra các tế bào bất thường , từ đó chúng phát triển thành một hay nhiều loại tế bào máu Bệnh tăng sinh tủy thường tiến triển nặng hơn qua thời gian

do số lượng tế bào máu dư thừa tích lũy ở tủy xương và máu ngoại vi

Trong hầu hết trường hợp, nguyên nhân khiến cho tế bào gốc bị biến đổi không được tìm ra Tuy nhiên, một số nghiên cứu trên thế giới đã chứng minh được mối liên quan giữa các bất thường về gene và bệnh tăng sinh tủy Các đột biến có thể xảy ra do các yếu tố môi trường hoặc phát sinh trong quá trình phân chia tế bào

Theo số liệu báo cáo của Hội Leukiamia và Lymphoma Society, tỉ lệ mắc bệnh tăng tiểu cầu nguyên phát ở Hoa Kỳ trung bình từ 0.38 đến 1.7 người trên 100.000 người mỗi năm Phụ nữ có nguy cơ mắc cao hơn nam giới Bệnh có thể gặp ở nhiều lứa tuổi, bao gồm phụ nữ ở độ tuổi sinh sản cho tới trung niên

Hầu hết các trường hợp tăng tiểu cầu tiên phát có liên quan đến một hoặc nhiều đột biến gene mắc phải ở tế bào gốc tạo máu dẫn đến tình trạng sản xuất quá nhiều tế bào nhân khổng lồ, là tế bào tiền thân của tiểu cầu trong tủy xương Phần lớn các đột biến này không do di truyền mà phát sinh trong đời sống của bệnh nhân Có những trường hợp ít gặp hơn là do di truyền trong gia đình Khi được di truyền, bệnh này được gọi là “tăng tiểu cầu tiên phát có tính gia đình”

Đa số bệnh nhân tăng tiểu cầu tiên phát có đột biến gene JAK2, MPL

hay CALR Theo ước tính, tần suất xảy ra đột biến gene JKA2 là 60%,

khoảng 10% bệnh nhân không có các đột biến gene trên Với những trường

hợp như vậy cần được thực hiện thêm các xét nghiệm khác để xác định gene

đột biến

Nhìn chung cơ chế bệnh sinh của tặng tiểu cầu tiên phát cũng liên quan với

các bệnh khác trong hội chứng tăng sinh tủy Trên thực tế, rất nhiều bệnh

nhân có thể chuyển từ dạng này sang

dạng khác trong hội chứng tăng sinh

tủy trong thời gian điều trị Từ năm

2005, trên thế giới đã biết đến vai

trò của gene JAK2 (Janus-

associated Ip; kinase 2) với điểm đột

biến V617F trong cơ chế bệnh sinh

của hội chứng tăng sinh tủy

Đột biến gene JAK2 V617F

gặp hầu hết ở bệnh đa hồng cầu thực,

khoảng 50% ở tăng tiểu cầu tiên phát và xơ tủy Bình thường gene JAK2 có vai

trò trong sự phát triển dòng tủy bình thường do truyền các tín hiệu từ các

receptor của các Cytokin và các yếu tố phát triển như Interleukin 3 (IL- 3), các

yếu tố tạo máu như Erythropoietin, yếu tố kích thích tạo cụm đồng hạt và mô

nô (GM- CSF, G- CS.F) và Thrombopoetin (yếu tố kích thích tạo dòng mẫu

tiểu cầu) [Error! Reference source not found.], [Error! Reference source

not found.] Đột biến gene JAK2 V617F làm mất vai trò tự điều hòa của JAK2

gây tăng sinh không kiểm soát các tế bào máu Tuy nhiên tại sao từ một đột

biến có thể gây các bệnh tăng sinh tủy các dòng khác nhau thì vẫn chưa rõ

ràng

Hình 1.2 Hình ảnh đột biến gene JAK2 V617F

gây bệnh tăng sinh tủy

Hiện nay, có rất nhiều báo cáo đã được công bố góp phần chẩn đoán bệnh di truyền hoặc định hướng chữa bệnh trong lâm sàng, Từ những phát hiện về cấu trúc và chức năng sinh học của các thành phần cấu tạo nên DNA, nhân loại đã từng bước khám phá được nhiều vấn đề khác nhau, đặt nền tảng cho nhiều nghiên cứu khác Các acid deoxyribonucleic tạo nên gene, giúp duy trì các chức năng của tế bào dưới mức độ phân tử, cũng như quy định cấu trúc di truyền sinh học của tế bào Cần phân biệt thường biến

và biến dị di truyền, thường biến là các biến dị biểu hiện ra ở kiểu hình do tác động của điều kiện môi trường, nó thể hiện mức phản ứng của kiểu gene đối với điều kiện môi trường, thường biến không di truyền Biến dị di truyền

là các biến đổi trong kiểu gene có thể được biểu hiện hoặc không ra kiểu hình, nguyên nhân có thể do ngẫu nhiên hoặc do cơ chế tái tổ hợp trong hệ gene hoặc do tác nhân đột biến lên ADN hay Nhiễm sắc thể như tác nhân hoá học, vật lý, sinh học Đột biến gene là những biến đổi trong cấu trúc của gene, những biến đổi này có thể xảy ra trong quá trình giảm phân tạo giao tử

ở tế bào sinh dục hoặc đột biến trong quá trình phát triển của tế bào sinh dưỡng, hay còn gọi là đột biến soma

Đột biến soma gây nên các biến đổi kiểu hình thể hiện ở mức độ mô hoặc cơ quan trong thế hệ một cá thể chứ không di truyền cho thế hệ sau qua giao tử, thông thường những đột biến gene ít khi tạo ưu thế tiến hoá vì khả năng phá vỡ tính ổn định của bộ gene sinh vật, thay vào đó đột biến thường trung tính hoặc có hại, đối với động vật và con người các đột biến soma thường gây nên các hư hỏng ở mức độ tế bào, mô hoặc cơ quan nào đó ví dụ như ung thư Qua giao tử đột biến soma được ứng dụng nhiều nhất trong ghép cành, chiết cành ở thực vật, đặc biệt là những cây ăn quả, để đạt giống tốt, chống chịu sâu bệnh và các điều kiện khắc nghiệt khác Nếu đột biến gene trội

và được biểu hiện ra ngoài cơ thể thì được gọi là thể khảm

1.1.3 Triệu chứng lâm sàng, cận lâm sàng bệnh tăng tiểu cầu tiên phát

1.1.3.1 Triệu chứng lâm sàng

Bệnh thường gặp ở người lớn tuổi, thường là trên 50 tuổi Tuy nhiên cũng có trường hợp đặc biệt Triện chứng lâm sàng nổi bật của bệnh là tắc mạch hoặc xuất huyết Đối khi bệnh chỉ được phát hiện tình cờ qua kiểm tra

xét nghiệm tế bào máu ngoại vi [Error! Reference source not found.]

Tắc mạch có thể gặp ở hệ thống tĩnh mạch hoặc động mạch Bệnh nhân cũng có thể có các biểu hiện của tắc vi mạch như đau buốt, dị cảm, hoại tử đầu chi, loét cẳng chân, Một số bệnh nhân có thể có biến chứng tắc mạch ở não, võng mạc mắt, cơ tim, tĩnh mạch chi, tĩnh mạch lách Bệnh nhân có thể có các biểu hiện dị cảm kiểu rát buốt ở tay, chân và giảm dần nếu sử dụng aspirin

Biểu hiện xuất huyết có thể xuất hiện khi có bất thường về chức năng tiểu cầu, có thể có chảy máu cấp hoặc mạn tính Các tiểu cầu là những tế bào nhỏ lưu chuyển trong máu Chúng liên quan tới quá trình đông máu và sửa chữa những mạch máu bị tổn thương Khi cơ thể bị tổn thương, các tiểu cầu bị phá hủy và lan ra khắp bề mặt vết thương làm máu ngừng chảy, các chất hóa học được giải phóng từ các bao nhỏ, các chất hoá học góp phần tập trung thêm số lượng các tiểu cầu và các protein khác nếu vết thương quá rộng

Rối loạn chức năng tiểu cầu là sự bất thường trong hoạt động của tiểu cầu hình thành các nút tiểu cầu không chính xác, gây nên xu hướng chảy máu hoặc thâm tím Khi các nút tiểu cầu không được hình thành một cách chính xác, chảy máu sẽ vẫn tiếp tục và kéo dài lâu hơn thông thường

Khoảng 40% bệnh nhân có lách to, số khác có thể teo lách do nhồi máu lách Lách to thường đi theo một số triệu chứng như: đau hay đầy bụng trên bên trái có thể lan lên vai trái, có cảm giác đầy bụng cả khi không ăn hoặc sau khi ăn chỉ một lượng nhỏ, điều này có thể xảy ra khi lá lách to ép vào dạ dày Thiếu máu, dễ nhiễm trùng, chảy máu và thường hay mệt mỏi

Bệnh có thể tiến triển, chuyển thành xơ tủy hoặc Leukemia cấp Khi mắc phải Leukemia cấp, bệnh nhân có thể có những triệu chứng như thiếu máu, xuất huyết thường do giảm số lượng tiểu cầu, hay gặp ở da - niêm mạc, nặng hơn có thể gặp xuất huyết nội tạng Dễ nhiễm trùng, thâm nhiễm Có thể gặp triệu chứng tắc mạch do tăng bạch cầu Người bệnh có sức khoẻ suy giảm, dễ mệt mỏi, suy sụp

1.1.3.2 Triệu chứng cận lâm sàng

Đối với triệu chứng máu ngoại

vi bao gồm: Đôi khi có giảm hồng

cầu, bạch cầu có thể tăng vừa, chủ

yếu tăng bạch cầu hạt Số lượng tiểu

cầu tăng, thường tăng rất cao, có thể

trên 1000 G/l Có thể thấy các tiểu

cầu khổng lồ trên tiêu bản máu ngoại

vi Khi xét nghiệm tủy đồ thấy tủy đồ

giàu tế bào, tăng sinh dòng mẫu tiểu

cầu với hình thái rối loạn

Sinh thiết tủy xương thấy tăng sinh, rối loạn hình thái dòng mẫu tiểu cầu Mẫu tiểu cầu đứng tập trung thành đám, có mẫu tiểu cầu lớn, bào tương rộng và nhím nhiều thùy Có tăng sinh xơ

Về di truyền: Nhiễm sắc thể Phl âm tính Đa số các bệnh nhân không có bất thường về nhiễm sắc thể Một số bệnh nhân có del (13) (q12ql4) có thể chuyển thành xơ tủy hoặc Leukemia cấp Khi thực hiện AS-PCR kết quả thường khoảng 50% bệnh nhân có đột biến gene JAK2 V617F

Hình 1.3 Tiêu bản máu dàn của bệnh nhân tăng tiểu cầu nguyên phát

Xét nghiệm đông cầm máu: Có thể có thời gian máu chảy kéo dài tuy

nhiên ít gặp các trường hợp này, hoặc giảm ngưng tập tiểu cầu [Error! Reference source not found.]

1.1.4 Chẩn đoán tăng tiểu cầu tiên phát

* Chẩn đoán xác định được tiến hành theo tiêu chuẩn của WHO (2008):

Số lượng tiểu cầu máu ngoại vi: PLT ≥ 450 G/l; Sinh thiết tủy xương có tăng sinh mẫu tiểu cầu trưởng thành lớn, không có bằng chứng tăng tuổi đầu dòng của dòng hạt và hồng cầu; Loại trừ được các bệnh đa hồng cầu, xơ tủy, Leukemia kinh dòng hạt, rối loạn sinh tủy hoặc các bệnh tân sinh tủy khốc theo tiêu chuẩn của WHO; Có đột biến gene JAK2 V617F hoặc không có bằng chứng về tăng tiểu cầu do phản ứng Chẩn đoán xác định khi có đủ cả 4 tiêu chuẩn trên

* Chẩn đoán phân biệt với bệnh đa hồng cầu nguyên phát:

+ Tiêu chuẩn chính: HGB trên 185 g/1 đối với nam giới hoặc trên 165 g/1 đối với nữ, hoặc tăng thể tích khối hồng cầu toàn thể trên 25% trị số bình thường Có đột biến JAK2 V617F

+ Tiêu chuẩn phụ: Tăng sinh 3 dòng tế bào tủy; Nồng độ erythropoietin huyết thanh giảm; Tạo cụm sinh hồng cầu EEC (endogenous erythroid colony); Chẩn đoán xác định đa hồng cầu khi có cả 2 tiêu chuẩn chính và 1 tiêu chuẩn phụ hoặc tiêu chuẩn chính số l và 2 tiêu chuẩn phụ

* Chẩn đoán phân biệt với bệnh Xơ tủy vô căn

+ Tiêu chuẩn chính: Tăng sinh dòng mẫu tiểu cầu có bất thường hình thái đi kèm với xơ tủy sợi reticulin và/hoặc collagen; hoặc nếu không có xơ tủy với các sợi reticulin thì có bất thường mẫu tiểu cầu đi kèm với tăng mật

độ tế bào tủy, tăng sinh dòng bạch cầu hạt và thường giảm dòng hồng cầu (giai đoạn tiền xơ tủy của xơ tủy vô căn) Không đáp ứng tiêu chuẩn chẩn đoán của WHO đối với Leukemia kinh dòng hạt, đa hồng cầu nguyên phát,

tăng tiểu cầu tiên phát, rối loạn sinh tủy và các bệnh lý tân sinh tủy khác

[Error! Reference source not found.], [Error! Reference source not found.], [Error! Reference source not found.] Có đột biến JAK2 V617F

hoặc không có bằng chứng về xơ tủy phản ứng

+ Tiêu chuẩn phụ: Tăng hồng cầu, bạch cầu; Tăng nồng độ LDH huyết thanh; Thiếu máu, lách to Chẩn đoán xác định khi có cả 3 tiêu chuẩn chính và

2 tiêu chuẩn phụ,

* Chẩn đoán phân biệt với bệnh Leukemia kinh dòng hạt: Các triệu chứng lâm sàng (triệu chứng lách to điển hình, thiếu máu, gan to, biểu hiện tắc mạch v.v ); Xét nghiệm công thức máu ngoại vi có số lượng hạch cầu tăng cao và gặp đủ các lứa tuổi của dòng bạch cầu hạt; Xét nghiệm tuỷ đồ cho thấy có sự tăng sinh dòng bạch cầu hạt biệt hoá; Xét nghiệm nhiễm sắc thể Ph1 và/hoặc biến đổi gene abl/bcr dương tính

* Chẩn đoán phân biệt với bệnh tăng tiểu cầu phản ứng

Các nguyên nhân như thiếu sắt, cắt lách, phẫu thuật , nhiễm khuẩn, viêm bệnh tự miễn, ung thư di căn, các bệnh tăng sinh lymphocyte, có thể gây tăng sinh tiểu cầu do phản ứng

1.1.5 Điều trị tăng tiểu cầu tiên phát

Nguyên tắc điều trị: Giảm số lượng tiểu cầu bằng các hóa chất diệt tế bào

và gạn tách tiểu cầu (nếu số lượng quá cao); Chống và dự phòng tắc mạch [27]

Điều trị đặc hiệu: Chống và dự phòng tắc mạch: sử dụng aspirin liều

thấp, hoặc các thuốc chống ngưng tập tiểu cầu khác như dipyridamol, ticlopidin, clopidogrl; Diệt tế bào: bằng hydroxyurea, pipobroman, anagrelid, interferon; Gạn tiểu cầu bằng máy tách tế bào: trong trường hợp

số lượng tiểu cầu trên 1000 G/1, có nguy cơ tắc mạch cao [29]

Điều trị hỗ trợ: bao gồm Nâng cao thể trạng; Tăng thải acid uric; Bồi

phụ nước và điện giải (nếu cần)

1.2 Tổng quan nghiên cứu về gene JAK2 V617F

1.2.1 Gene JAK2

Gene JAK2 nằm trên cánh ngắn nhiễm sắc thể số 9 mang thông tin di

truyền tổng hợp protein nội bào JAK2 (Janus-associated tyrosine kinase) JAK2 là một tyrosine kinase tham gia truyền tin từ màng tế bào vào nhân cho các yếu tố tăng sinh gồm erythropoetin, GMCS-F, thrombopoetin Protein JAK2 có 2 phần (domain), một domain hoạt tính “âm” có tính điều hòa làm cho hiệu ứng kích thích dừng lại, không tiếp tục Sau khi erythropoetin tác động vào EPO-R (vị trí tiếp nhận erythropoetin trên màng

tế bào) thì lập tức domain “dương” của JAK2 sẽ phosphoryl hóa và qua STAT truyền tin vào nhân tế bào để kích hoạt hệ thống gene hoạt động giúp tế bào gốc tăng sinh, biệt hóa tạo ra hồng cầu, đồng thời phosphoryl hóa cả phần điều hòa của JAK2 để làm dừng kích thích

Một ví dụ về vai trò của tyrosine kinase JAK2 trong việc truyền tín hiệu bằng hormone tăng trưởng liên quan đến bệnh suy thận mãn tính ở trẻ em dẫn đến suy giảm tăng trưởng, suy thận không chỉ làm cho trẻ em kém phát triển

mà còn làm giảm sức khoẻ, chức năng của hệ bài tiết, gây ra suy giảm sức khoẻ trầm trọng ở đa số trẻ em Tuy nhiên, cơ chế mà suy thận mãn tính gây

ra vẫn chưa được hiểu rõ Liệu pháp hormone tăng trưởng (GH) làm tăng chiều cao cơ thể ở trẻ sơ sinh, cho thấy GH thúc đẩy tăng trưởng cơ thể có thể giúp hiểu rõ hơn về sự tăng trưởng của cơ thể khi mắc chứng suy thận mạn tính và do đó các liệu pháp có hiệu quả hơn Qua các nghiên cứu, các kết luận

đã được đưa ra về những gì hiện được biết về cách GH hoạt động ở cấp độ tế bào GH liên kết với một thụ thể gắn màng và kích hoạt một tyrosine kinase tế bào chất gọi là Janus kinase (JAK2) JAK2 được kích hoạt lần lượt phosphorylates tyrosine trong chính nó và thụ thể GH liên kết, tạo thành các

vị trí gắn kết ái lực cao cho một loạt các phân tử tín hiệu

Hình 1.4 Vị trí của nhiễm sắc thể chứa gene JAK2

1.2.2 Đột biến gene JAK2

Khi JAK2 bị đột biến ở phần mang thông tin cho domain điều hòa tại exon 14, đó là đột biến thay thế base nitơ thứ 1849 từ guanin (G) thành thymin (T) gọi là JAK2G1849T, sẽ làm thay đổi acid amin thứ 617 của domain điều hòa từ valin thành phenylalanin, gọi là đột biến V617F Đột biến

đó làm cho domain này không dừng kích thích được, vì vậy, ADN nhân tế bào bị hoạt hóa liên tục do đó quá trình tăng sinh hồng cầu không dừng lại, hậu quả là quá dư thừa hồng cầu trong máu Người ta thấy, khoảng 95% bệnh nhân đa hồng cầu đột biến JAK2 V617F Vì vậy, xác định đột biến JAK2 có ý nghĩa trong chẩn đoán đa hồng cầu thật Đây là một trong các bệnh thuộc hội chứng tăng sinh tủy, là bệnh ác tính Xét nghiệm JAK2 giúp phân biệt với đa hồng cầu di truyền do đột biến gene mang thông tin tổng hợp Epor-R Người

ta thấy trong đa hồng cầu thật, nhiều trường hợp đột biến dạng đồng hợp tử và theo Hoffbrand; Pettit thì bệnh càng tiến triển tỉ lệ đồng hợp tử JAK2 V617F càng tăng

Hình 1.5 Đột biến gene liên quan đến bệnh tiểu cầu

Đột biến gene JAK2 ở exon 12: Mặc dù hầu hết đột biến JAK2 là ở V617F, nhưng cũng có những trường hợp đột biến JAK2 ở exon 12, tại các codon từ 537 đến 544 Người ta cũng đã xác định hàng chục đột biến liên quan tới thay thế nucleotide, mất nucleotide ở đoạn DNA này Đột biến gene JAK2 ở exon 12 cũng có thể gây bệnh đa hồng cầu hay bệnh khác thuộc hội chứng tăng sinh tủy mạn tính, ác tính Do vậy, khi nghi ngờ chẩn đoán đa hồng cầu mà xét nghiệm âm tính với JAK2 V617F cũng cần xét nghiệm tìm đột biến tại exon 12 của gene này

Đột biến JAK2 V617F cũng được phát hiện ở bệnh nhân tăng tiểu cầu tiên phát, xơ tủy tiên phát; đồng thời có những bệnh nhân đa hồng cầu điển hình nhưng không có đột biến JAK2, vì vậy người ta cho rằng đột biến gene JAK2 một mình chưa đủ gây bệnh và như vậy phát hiện JAK2 V617F có ý nghĩa lớn trong chẩn đoán bệnh đa hồng cầu nhưng cũng cần phân biệt với các bệnh khác thuộc hội chứng tăng sinh tủy

Hạch tủy (MPNs) là khối u ác tính, vô tính được đặc trưng bởi sự sản xuất quá mức của một hoặc nhiều dòng tủy khác nhau Năm 1951, Dameshek đã nhận ra mối quan hệ giữa bệnh bạch cầu tủy xương mãn tính, bệnh đa hồng cầu (PV), tăng tiểu cầu nguyên phát (ET) và bệnh tủy nguyên phát (PMF) Cơ sở phân tử cho MPNs phổ biến nhất vẫn chưa được biết đến cho đến năm 2005, khi 4 nhóm nghiên cứu sử dụng các phương thức khác

nhau đều xác định được một đột biến soma duy nhất, V617F, trong miền pseudokinase của Janus kinase-2 (JAK2) , một tyrosine kinase tế bào chất JAK2 V617F đã được tìm thấy là nguyên nhân dẫn đến MPNs trong một số thí nghiệm ở chuột

Việc xác định đột biến JAK2 V617F (exon 14) đã kích thích các nỗ lực nghiên cứu về JAK trong các bệnh về huyết học và đã dẫn đến một bức tranh khá hoàn chỉnh về sự thay đổi di truyền ở MPNs Những đột biến bổ sung này điều khiển tiến trình bệnh và cũng có thể xảy ra như đột biến chính, nhưng giờ đây đã có những chứng minh rằng MPN có thể được bắt đầu từ một tế bào gốc tạo máu JAK2 V617F Vai trò quan trọng của Janus kinase-2 (JAK2) trong điều hòa tủy đã được công nhận cách đây hai thập kỷ Những phát hiện này đã cách mạng hóa việc chẩn đoán MPNs và dẫn đến sự phát triển của phương pháp trị liệu JAK2 mới cho nền y học

Đột biến JAK cũng đã xuất hiện trong các bệnh về huyết học khác và phần lớn các đột biến gây bệnh ở JAK2 (cũng trong JAK1 và JAK3) Tuy nhiên, các cơ chế phân tử mà các đột biến khác nhau trong miền pseudokinase dẫn đến hoạt động tyrosine kinase cấu thành và bệnh ở người vẫn còn khó nắm bắt

Hiện nay, người ta đã sản xuất được một số thuốc ức chế enzym tyrosine kinase, tuy nhiên, đang ở giai đoạn thử nghiệm

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu, hóa chất và thiết bị nghiên cứu

2.1.1 Vật liệu

Lấy 19 mẫu máu và dịch tủy xương của 19 bệnh nhân được chẩn đoán tăng tiểu cầu tiên phát (theo tiêu chuẩn của WHO năm 2008) đến khám và điều trị tại Bệnh viện Trung Ương Thái Nguyên từ tháng 04 năm 2018 đến tháng 10 năm 2018

* Tiêu chuẩn lựa chọn: Bệnh nhân có số lượng : PLT > 450 x 109/L kéo dài; Tủy đồ cho thấy sự tăng sinh chủ yếu dòng nguyên mẫu tiểu cầu (MTC-megakaryoblast) với tăng số lượng MTC kích thước lớn, trưởng thành Không có sự tăng đáng kể hay chuyển trái của dòng bạch cầu hạt hoặc dòng hồng cầu

2.1.2 Hóa chất và thiết bị nghiên cứu

* Hóa chất:

STT Tên hóa chất Hãng sản xuất Nơi sản xuất Đóng gói

1 Kit tách chiết DNA

điện di, hệ thống đèn cực tím soi gel, hệ thống máy chụp ảnh Bio-Rad, Mỹ;

Tủ an toàn sinh học ESCO Class II BSC, Singapore; Máy ly tâm tốc độ cao (hãng SMART LABASSIST, nước sản xuất: Đài Loan; Máy vortex Model DLAB MX-S, nước sản xuất: Trung Quốc; Các loại pipet 10 µl, 20 µl, 100 µl,

200 µl, 1000 µl hãng Eppendoff, nước sản xuất: Phần Lan; Đầu côn có màng lọc; Ống Eppendorf các loại vô trùng

2.2 Thời gian địa điểm nghiên cứu

Thời gian nghiên cứu: từ tháng 04 năm 2018 đến tháng 10 năm 2018 Địa điểm nghiên cứu: Các khoa lâm sàng hệ nội, Khoa Huyết học lâm

sàng, Trung tâm Huyết học truyền máu, Khoa Miễn dịch - Di truyền phân tử Bệnh viện Trung ương Thái Nguyên

2.3 Phương pháp xử lý số liệu

- Sử dụng các phương pháp thống kê y học sử dụng phần mềm SPSS 20.0

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Thu thập mẫu nghiên cứu

(1) Thu thập các thông tin bệnh nhân: đặc điểm lâm sàng và các thông tin liên quan của đối tượng nghiên cứu thông qua bệnh án nghiên cứu: Tuổi, giới, dân tộc; Các chỉ tiêu cận lâm sàng gồm kết quả xét nghiệm Tổng phân tích tế bào máu ngoại vi, Huyết đồ, Tủy đồ, các xét nghiệm đông máu, sinh hóa máu: Bilirubin TP, Bilirubin tự do, AST, ALT…

(2) Lấy mẫu:

+ Mẫu máu: 4 ml máu tĩnh mạch vào 02 ống nghiệm có chống đông bằng EDTA để làm xét nghiệm tổng phân tích tế bào máu ngoại vi, xét nghiệm huyết đồ và dùng phân tích đặc điểm gene JAK2 V617F

+ Mẫu dịch tủy xương: 2 ml dịch tủy xương vào ống nghiệm có chống đông bằng EDTA để làm xét nghiệm tủy đồ

2.4.2 Phân tích các đặc điểm cận lâm sàng

Phân tích các chỉ số huyết học, so sánh với các chỉ số bình thường; Phân tích đặc điểm các dòng tế bào máu ngoại vi trên huyết đồ Đánh giá một

số yếu tố liên quan; Phân tích các thông tin tủy đồ So sánh, đánh giá với

một số yếu tố liên quan

Các kỹ thuật tổng phân tích tế bào máu, xét nghiệm huyết đồ, xét nghiệm tủy đồ được thực hiện theo quy trình xét nghiệm đang thực hiện tại Trung tâm Huyết học - Truyền máu Bệnh Viện Trung Ương Thái Nguyên

2.4.3 Xét nghiệm phát hiện đột biến gene JAK2 V617F

Phát hiện đột biến JAK2 V617F bằng kỹ thuật Allen-specific PCR PCR) Nguyên lý của AS-PCR là sử dụng một đoạn primer có trình tự sai khác so với trình tự đặc hiệu một nucleotide ở đầu 3’ để ngăn cản quá trình kéo dài chuỗi DNA của enzym Taq-polymerase trong phản ứng PCR Trong phương pháp này, hai ống phản ứng PCR được thực hiện song song: ống phản thứ nhất sử dụng cặp primer đặc hiệu cho allen bình thường, ống phản ứng thứ hai sử dụng cặp primer để nhân bản allen đột biến Phản ứng AS-PCR luôn có ít nhất một sản phẩm: nếu người bệnh dị hợp tử thì trong hai ống phản ứng PCR đều có một băng sản phẩm đặc hiệu, nếu người bệnh đồng hợp tử mang gene bệnh thì chỉ có ống phản ứng 2 có băng đặc hiệu, còn người bệnh đồng hợp tử bình thường thì chỉ ống phản ứng 1 có băng sản phẩm đặc hiệu

(AS-Bước 1: Tách chiết DNA từ máu bệnh nhân:

1- Chuẩn bị ống 1,5 ml ghi mã bệnh nhân lên nắp và thành ống; Hút vào mỗi ống 200µl máu tổng số, bổ sung thêm 50µl ELUTION BUFFER (Nếu lấy 250µl máu không phải bổ sung thêm ELUTION BUFFER)

2- Thêm 25µl OB PROTEASE SOLUTION và 250µl BL BUFFER Vortex mạnh trong 10 giây; Ủ 65°C, lắc 300rpm trong 10 phút