Chương 6 CẤY TRUYỀN PHÔI Cấy truyền phôi là một kỹ thuật lấy phôi từ đường sinh dục của một bò cái con cho phôi và cấy vào đường sinh dục của bò cái khác con nhận phôi để ở đó quá trình
Trang 1Chương 6
CẤY TRUYỀN PHÔI
Cấy truyền phôi là một kỹ thuật lấy phôi từ đường sinh dục của một bò cái (con cho phôi) và cấy vào đường sinh dục của bò cái khác (con nhận phôi) để ở đó quá trình phát triển của thai được hoàn thành Dé khai thác tiềm năng di truyền vượt trội của những con bò cái tốt cần phải thu được càng nhiều phôi càng tốt từ những con cái đó để sau đó bằng việc sử dụng kỹ thuật cấy truyền phôi cho những con bò cái khác (có tiềm năng di truyền thấp hơn) nhằm nhân nhanh những cá thể có giá trị di truyền cao Do đó công nghệ cấy chuyền phôi thường đi kèm với kỹ thuật gây siêu bài noãn (gây rụng nhiều trứng)
I LỢI ÍCH CỦA GÂY SIÊU BÀI NOÃN VÀ CẤY TRUYỀN PHÔI
Khi kết hợp với gây siêu bài noãn của con cho phôi thì công nghệ cấy truyền phôi
có những ứng dụng như sau:
e Tăng số đời con của những bò cái có tiềm năng di truyền vượt trội
e Tăng tốc độ kiểm tra đời sau
e Giảm khoảng cách thế hệ bằng cách gây rụng nhiều trứng của những bò cái hậu bị trước lúc thành thục về tính và cấy phôi cho những con nhận đã trưởng thành Điều này có thể làm tăng tốc độ tiến bộ di truyền
e Vận chuyển phôi từ nước này sang nước khác do đó có thể khắc phục được các vấn đề lây truyền bệnh tật và giảm thời gian kiểm dịch Điều này cũng loại bỏ stress và giá vận chuyển gia súc sống
® Tạo bê sinh đôi
e Có thể thu phôi từ những bò cái có tiềm năng di truyền cao nhưng không có khả năng duy trì quá trình có chửa bình thường
® Cấy truyền phôi là một công cụ nghiên cứu trong một số ngành khoa học như sinh lý, phôi thai học, miễn dịch sinh sản, di truyền học, thú y, v.v
II CÔNG NGHỆ PHÔI VÀ CẤY TRUYỀN PHÔI
Công nghệ cấy truyền phôi bao gồm những công đoạn sau đây:
1 Chọn bò cho và bò nhận phôi
a Chon bo cho phoi
Vì công nghệ cấy truyền phôi là để khai thác tối đa tiềm năng di truyền của những con cái có tiểm năng di truyền cao, cho nên việc chọn bò cho phôi rất quan trọng Bò cái
Trang 2cho phôi phải được chọn từ đàn hạt nhân, có nguồn gốc và lý lịch rõ ràng, có khả năng sinh sản tốt Các chỉ tiêu sinh sản chính được quan tâm là số lượng, chất lượng phôi cũng như cường độ khai thác phôi từ con bò đó
b Chọn bò nhận phôi
Bò nhận phôi là những con “mang thai hộ”, cho nên khi chọn làm con nhận phôi không cần căn cứ vào phẩm giống hay năng suất của bản thân con bò đó Bò nhận phôi chỉ ảnh hưởng đến việc tiếp nhận phôi, mang thai mà không đóng góp vào kiểu di truyền của đời con Vì vậy chỉ cần chọn những con đạt các yêu cầu sau đây:
e Đẻ ít nhất 2 tháng trước đó (bò cái đã sinh sản) hay bò tơ
e Đủ trưởng thành và cơ thể đủ lớn Do đó cần phải biết giống và loại phôi sẽ được cấy để nó có khả năng mang thai đến lúc đẻ và đẻ bình thường
se Không có bệnh tật
e Sinh trưởng, phát triển và sinh lý sinh sản bình thường
Trước khi đưa vào sử dụng, bò cho phôi và bò nhận phôi phải được nuôi dưỡng và chăm sóc tốt, phải theo dõi ít nhất hai chu kỳ động dục
2 Sản xuất phôi
a Gay siéu bai nodn
Sản xuất phôi tức là tạo ra số lượng phôi lớn nhất có thể được từ một con bò cái trong một kỳ khai thác, trong một năm hay trong một đời của nó Muốn vậy, ta phải gây cho nó rụng nhiều trứng thông qua việc sử dụng một số hocmôn như FSH hay PMSG sử dụng riêng biệt hay kết hợp với PGF2œ hoặc HCG
Điều quan trọng là phải sờ khám buồng trứng của bò cho phôi một ngày trước khi bát đầu tiến hành gây rụng nhiều trứng để đảm bảo chắc chắn sự có mặt của thể vàng vì một số gia súc, mặc dầu có biểu hiện động dục, nhưng không rụng trứng Hiện tượng này phé bién 6 bd Bos indicus hon so với ở bò Bos faurus Gây rụng nhiều trứng ở những gia súc kém như thế sẽ dẫn đến không rụng trứng, tỷ lệ thu phôi kém và chất lượng phôi kém Thông thường người ta tiêm dưới da hoặc tiêm bắp PMSG hay FSH để tăng cường
sự phát triển của nhiều noãn bao Sau đó vài ngày lại tiêm LH hoặc HCG để làm cho những noãn bao này rụng trứng Tuy nhiên LH hay HCG có thể không cần thiết đối với
bò trưởng thành Các phương pháp gây siêu bài noãn có thể tóm tắt như ở bảng 6-1
Phản ứng khác nhau của bò đối với gây rụng nhiều trứng bằng FSH phụ thuộc vào các yếu tố di truyền và môi trường, đặc biệt là chế độ dinh dưỡng Lịch tiêm FSH để gây rụng nhiều trứng đã được thống nhất là 8 lần tiêm với liều giảm dần trong thời gian 4 ngày Các lần tiêm cách nhau 12 giờ vào thời gian 6-8 giờ sáng và 6-8 giờ chiều đều có kết quả như nhau
Trang 3Bảng 6-1: Liều lượng gonadotropin để gây siêu bài noãn
Kích thích Kích thích
giasúc chukỲ pDMỊSG hay FSH HCG hay LH
Bò 15-16 1500- 20-50 1500- 75-100
3000 2000
Bê - 1000- 20-50 1000- 50-75
2000 1500
Gần đây phương pháp gây siêu bài noãn có sử dụng thêm prostaglandin da cho kết qua tốt, bởi vì nó cho phép xử lý gây siêu bài noãn vào bất kỳ lúc nào giữa ngày 6 đến lức thể vàng tự nhiên thoái hoá; trong khi đó thời gian thích hợp để xử lý siêu bài noãn là từ ngày 8-
12 của chu kỳ ở bò Prostapglandin không những cho phép aps dụng thời gian gây siêu bài noãn cơ động hơn mà con làm tăng số lượng phôi bình thường Hầu hết gia súc được xử lý xuất hiện động dục 2-3 ngày sau khi tiêm prostaglandin
b Phối giống
Khi bò đã được gây siêu bài noãn và động dục, người ta tiến hành thụ tính nhân tạo cho nó (sử dụng tinh của những đực giống tốt) Nên phối lặp lại 2-3 lần, mỗi lần cách nhau từ 8 dén 10 giờ, vì sau khi tiêm hócmôn gây siêu bài noãn số lượng trứng sẽ rụng nhiều và kéo dài sau mỗi lần động dục
Kết quả gây siêu bài noãn phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: giống của bò cái, loại và liều lượng hocmôn sử dụng, mùa vụ gây siêu bài noãn, chế độ chăm sóc, nuôi dưỡng Mỗi lần xử lý siêu bài noãn có thể tạo ra 10-15 phôi và mỗi năm có thể xử lý 5-6 lần Như vậy, từ một con bò cái cao sản, thay vì mỗi năm chỉ thu được một con bê, nhờ áp dụng công nghệ này ta có thể thu được 30-40 con/năm
Sau khi gây siêu bài noãn và thu phôi, số phôi sản xuất có thể tăng hơn nhiều lần nếu ta áp dụng công nghệ cắt phôi, tức là tách phôi thành 2 hay 4 phần riêng biệt để từ mỗi phần này sẽ tái tạo thành một phôi mới Như vậy, từ một phôi ban đầu ta có thể tạo ra
2 hoặc 4 phôi giống hệt nhau
c Thu phôi
Có hai phương pháp thu phôi: phương pháp phẫu thuật và phương pháp không phẫu thuật
- Phương pháp phẫu thuật có ưu điểm là tỷ lệ thu phôi cao, nhưng khó áp dụng trong thực tế do tính phúc tạp của nó Sau mỗi lần xử lý đòi hỏi phải chăm sóc, hộ lý gia súc hết sức cẩn thận; bò cái chậm hồi phục cơ thể hơn và ảnh hưởng đến cường độ khai thác phôi
- Phương pháp thu phôi không phẫu thuật đơn giản, tiện lợi, cho tỷ lệ thu phôi cao không thua kém phương pháp phẫu thuật
Việc thu hoạch phôi được tiến hành vào ngày thứ 6, 7 hoặc 8 sau khi phối tinh với việc sử dụng một dụng cụ chuyên dùng (ống thông hai chiều) và dung dịch rửa tử cung (đồng thời cũng là dung dịch nuôi phôi ngoài cơ thể mẹ) Dung dịch thường dùng là dung dịch PBS (Phosphate Buffered Saline)
Trang 44
1 Cổ tử cung
2 Cổ ống thông
3 Pít tông ống thông
4 Lỗ bơm hơi vào cổ ống thông
5 Lỗ bơm dịch rửa vào sừng tử cung
6 Cổ ống thông trong tử cung đã bơm day khí
Hình 6-1: Sơ đồ thu phôi không phẩu thuật
Tử cung có thể được dội rửa bằng cách đặt ống thông vào thân tử cung và dội rửa thân tử cung và cả hai sừng tử cung cùng một lúc (Hình 6-1) Cũng có thể đặt ống thông vào một sừng tử cung, dội rửa một sừng tử cung đó, sau đó lấy ống thông ra và đặt vào sừng tử cung khác và lặp lại kỹ thuật Cần khoảng 500ml dung dịch dội rửa cho mỗi con cho và xoa bóp dung dịch trong tử cung để tách phôi khỏi thành tử cung vào dung dịch và sau đó dung dịch dội rửa được hút ngược trở lại vào phễu lọc Albumin huyết thanh bò có thể được bổ sung để giảm nguy cơ phôi bị dính vào các dụng cụ thu phôi
Sau khi bơm dung dịch dội rửa, tiến hành xoa bóp nhẹ lên sừng tử cung và hút dung dịch ra Lặp lại như vậy khoảng 8-10 lần Phôi được tách ra khỏi dung dịch rửa bằng việc
sử dụng các phin lọc phôi
Con cho phôi thường được phong bế thần kinh tủy sống để tránh sự co bóp của trực tràng trong lúc thu phôi
d Kiểm tra và phân loại phôi
Dung dịch hút ra nên để lắng trong vòng 30 phút, trước khi kiểm tra và phân loại phôi Việc phân loại phôi dựa vào những chỉ tiêu sau đây :
- Kích thước và hình thái của phôi
- Mầu sắc của phôi
- Sự phân bố, sắp xếp các tế bào phôi
Tiêu chuẩn đánh giá chất lượng phôi bò sữa và bò thịt ở Việt Nam đã được Bộ NN
và PTNT ban hành tháng 6/2002 (xem Phụ lục 3)
3 Bảo quản phôi
Nếu phôi không dùng để cấy chuyền ngay sau khi thu thì có thể đem bảo quản đông lạnh để sử dụng về sau Phôi được đóng vào cọng rạ trước khi đem cấy hoặc bảo quản lạnh
Với trường hợp bảo quản đông lạnh, nhiệt độ được hạ từ từ trong thiết bị tự động cho tới -30°C Sau đó phôi được bảo quản trực tiếp trong nito long (-196°C) trong nhiều năm
Glycerol 10% (1,4M) và Ethylene Glycol (EG) 1,5M thường được dùng làm chất bảo vệ lạnh Cả hai loại chất bảo vệ lạnh này đều được đóng trong lọ thuỷ tỉnh có nút cao
xu trong EMCARE (môi trường không đệm phốtphát) hay môi trường nuôi cấy trứng OCM (môi trường đệm phốtphát) Cả hai loại môi trường đều được bổ sung 0,4% BSA và khang sinh (Kanamycin)
(i) Déng lanh trong Glycerol
Tổng thời gian phôi cần phải ở trong glycerol 10% trước khi đưa vào đông lạnh ở - 5,5-6,5°C là 15-30 phút ở nhiệt độ 20-25C
Trang 5Cài đặt máy đông lạnh và cọng rạ được dán nhãn trước khi hút phôi từ môi trường giữ phôi vào môi trường đông lạnh
Đưa phôi vào glycerol 10%, và bắt đầu đặt đồng hồ (hay chú ý đến thời gian) Đưa phôi vào cọng rạ làm sao cho phôi ở vị trí ít nhất là 1/3 cọng rạ kể từ phía dưới (khi cọng
rạ được để đứng trong máy đông lạnh), do đó phôi không chìm xuống phía dưới và không
bị đông lạnh ở trong phần bóng khí Phôi phải ở phần giữa cột môi trường do đó không được tạo đá trực tiếp lên phôi Sau một thời gian tối thiểu là 15 phút và tối đa là 20-30 phút (phụ thuộc vào nhiệt độ), đặt cọng ra vào máy đông lạnh ở -5,5 đến -6,5°C Tạo đá sau l phút (thời gian không quan trọng, nhưng thời gian cần thiết phải đủ để đủ lạnh để tạo đá)
Tạo đá phía trên cột có phôi bởi vì đá không tạo bóng khí Một số cọng rạ có thể tự tạo đá trong một số máy đông lạnh, nhưng thường xuyên phải kiểm tra bằng tay nếu nghi ngờ Rất dễ nhìn thấy sự hình thành đá (môi trường biến thành màu trắng)
Giữ trong 10 phút Khi sử dụng glycerol làm chất bảo vệ lạnh, tốc độ làm lạnh từ - 0,3”C/phút đến -0,5°C/phút đến -34”C và -35°C sẽ cho kết quả tương tự
Tốc độ làm lạnh -0,5°C/phút đến -30”C cho kết quả tốt trong glycerol
Nhúng vào ni tơ lỏng ở nhiệt độ -30°C đến -35°C
(1H) Đông lạnh trong Ethylene Glycol
Ethylene Glycol (EG) có phân tử nhỏ hơn glycerol, do đó nó di chuyển vào trong tế bào phôi nhanh hơn Chính vì thế mà nó được coi là độc hơn Do vậy, chỉ nên giữ phôi trong EG tối đa là 10 phút trước khi đưa vào máy đông lạnh ở nhiệt độ —5,5 đến -6,5°C Giữ 5-10 phút sau khi tạo đá sau đó đông lạnh với tốc độ -0,5°C-0,6°C/phút đến — 30°C dén —32°C sau đó nhúng vào ni tơ lỏng
Lưu ý: một khi phôi đã được đặt vào máy đông lạnh ở khoảng -6,0°C va đã tạo đá, độc tính của chất bảo vệ lạnh bị giảm xuống rất nhiều
4 Giải đông phôi
(i) Giải đông phôi đông lanh trong glycerol
Giải đông cũng phải được thực hiện ở nhiệt độ 20-30°C Tuy nhiên, khi không thể giải đông được ở nhiệt độ đó thì nhớ rằng pha loãng chất bảo vệ lạnh càng nhanh khi nhiệt độ càng cao
- Giải đông phôi
Lấy cọng rạ ra khỏi ni tơ lỏng, giữ 10 giây và sau đó ở 30°C trong 15-20 giây Cần thận lau sạch nước khỏi cọng rạ
Khi giải đông, nếu cọng rạ được gắn bằng bột PVC, phải bảo đảm rằng không có bột hay dung dịch tiếp xúc với bột được tiếp xúc với phôi Bột PVC rất độc đối với phôi Đẩy dung dịch trong cọng rạ vào một đĩa sạch 35mm (Hình 6-2), định vị phôi và đặt vào lỗ A trong 6 phút 30 giây, sau đó vào lỗ B trong 6 phút 30 giây (ở nhiệt độ 20-25°C)
và sau đó đưa vào đĩa rửa (Hình 6-3)
Trang 6® @®
Hình 6-2: Đfa giải đông
Lỗ A: glycerol 5%, Sucroza 0,5M *
6 phút 30 giây (ở nhhiệt độ 20-25°C)
Lỗ B: glycerol 0%, Sucroza 0,5M **
6 phút 30 giây (ở nhhiệt d6 20-25°C) Ghi chú: * Trén nua no nua kia (Vi du 2ml va 2ml) Sucroza 1M va Glycerol 10%
**% '[rộn nửa nọ nửa kia (Ví dụ 2ml] và 2ml) Sucroza IM và môi trường giữ phôi
- Rửa phôi
Cho khoảng 2ml môi trường giữ phôi trong mỗi lỗ của đĩa rửa phôi (Hình 6-2) Rửa khoảng 15 giây trong mỗi lỗ, sau đó giữ trong lỗ 4 và đưa vào cọng rạ
Vp wp"
4ΠWe
Hình 6-3: Đĩa rửa phôi
Thay thế cọng rạ và dung dịch rửa sau khi mỗi đĩa đã sử lý khoảng 8 phôi
- Đưa phôi vào cọng rạ để cấy sau khi giải đông
Rửa mỗi cọng rạ 2 lần với môi trường giữ phôi và kiểm tra đầu cuối của cọng rạ (vì phôi có thể bị mắc kẹt ở đó)
Bọt khí Phôi Bọt kh
7 0 ® 0ˆ
Cat 2-4mm nế ~5cm ~3cm ~2cm
cần thiết
Hình 6-4: VỊ trí của phôi trong cọng rạ Hút khoảng 5cm môi trường, sau đó khoảng 3-4mm bóng khí, sau đó phôi ở trong cột khoảng 3cm, 3-4mm bóng khí khác, và sau đó hút đầy môi trường vào cọng rạ (Hình 6- 4) Cát khoảng 3-4mm phần cuối của cọng rạ nếu thấy cần (một số súng đòi hỏi cọng rạ ngắn hơn).
Trang 7Kiểm tra vị trí của phôi trong cọng rạ và đưa vào súng cấy phôi có cả vỏ súng và vỏ nilon để giữ vệ sinh
Giữ súng nằm ngang (do đó phôi không bị rơi vào bóng khí) trong gang tay dan tinh sạch và tránh ánh sáng chiếu trực tiếp vào phôi
(ii) Giải đông phôi trong EG để cấy truyền trực tiếp
Vì cần phải đưa phôi vào trong cơ thể bò cái càng sớm càng tốt sau khi giải đông cong ra nén phải bảo đảm rằng có sẵn bò cái có thể vàng tốt trước khi giải đông cọng Tạ Giải đông 10 giây trong không khí và khoảng 15 giây trong nước 30C Lau sạch nước bám trên cọng ra
Cắt đầu gắn cọng rạ (đối diện với đầu nút chặn của nhà sản xuất) bằng kéo sạch đã được lau qua bằng cồn
Đưa phôi vào súng cấy phôi có vỏ sing va vo nylon vệ sinh và cấy truyền
ii) Giải đông phôi đông lạnh trong EG và cấy gián tiếp
Có một số phương pháp khác nhau để pha loãng EG của phôi đông lạnh một khi chúng được lấy ra khỏi cọng rạ đông lạnh như sau:
a) Giải đông thông qua ethylen glycol va sucroza
Đây là một phương pháp do Pacifivet khuyến cáo để cấy trực tiếp phôi đông lạnh trong EG
- Chuẩn bị đĩa giải đông (Hình 6-2):
Lỗ A: EG0,75M và sucroza 0,5M *
L6B: EG0O% và sucroza 0,5M **
Ghi chú: *Trộn nửa nọ nửa kia (ví dụ 2ml và 2ml) sucroza 1M và ethylen glycol
** Tron nua no nua kia (vi du 2ml va 2ml) sucroza [M và môi trường giữ
- Cach giai dong:
Tuong tu nhu khi dung glycerol
- Rua phoi:
Tuong tu nhu khi dung glycerol
- Đưa phôi vào cọng rạ để cấy sau khi giải đông
Tương tự như khi dùng glycerol
b) Giải đông thông qua sucroza 0,5M
Khi đã được đẩy ra khỏi cọng ra, đưa phôi vào sucroza 0,5M trong 5-10 phút, sau đó vào môi trường giữ phôi (rửa 4 lần), và cuối cùng đưa vào cọng rạ và đưa đi cấy
c) Giải đông thông qua môi trường giữ phôi
Khi đã đẩy phôi ra khỏi cọng rạ, đưa phôi trực tiếp vào môi trường giữ phôi (rửa 4 lần), sau đó đưa vào cọng rạ và cấy
Trang 85 Cay truyền phôi
- Gây động dục đồng pha
Phôi cần được cấy cho con nhận có thời gian động dục càng gần với thời gian động dục của bò cho phôi càng tốt Do vậy, trước khi cấy truyền phôi phải gây động dục đồng pha giữa bò cho và bò nhận phôi Gây động dục đồng pha nhằm tạo ra được nhiều bò nhận phôi có thời gian động dục đồng thời với bò cho phôi (nếu cấy phôi tươi) hoặc phù hợp với tuổi phôi (nếu cấy phôi đông lạnh) Mức độ động dục đồng pha (phù hợp tuổi phôi) ảnh hưởng rất lớn lên tỷ lệ đậu thai sau khi phôi được cấy truyền Tuy nhiên, mức lệch pha +24 giờ cũng có thể chấp nhận được
Để gây động dục đồng pha, người ta có thể sử dụng PMSG, PGE;„, progesferon v.v Những hóc-môn này được dùng riêng lẻ hoặc kết hợp với các liều lượng và phác đồ khác nhau tương tự như kỹ thuật gây động dục đồng loạt đã được trình bày ở Chương 5
- Kỹ thuật cấy phôi
Con nhận cần phải được sờ khám trước khi cấy phôi để kiểm tra xem nó có thể vàng hoạt động tốt không Phôi có thể được cấy bằng phương pháp phẫu thuật hay không phẫu thuật
Cấy phôi không phẫu thuật về cơ bản giống kỹ thuật thụ tỉnh nhân tạo, chỉ khác ở vị trí cấy và vị trí bơm tính: phôi được cấy vào 1/3 phia trên sừng tử cung, con tinh duoc bơm vào thân tử cung Phôi được đưa vào cọng rạ 0,25ml và đặt vào đầu sừng tử cung tương ứng với phía buồng trứng có thể vàng hoạt động
Nhìn chung, phong bế thần kinh tuỷ sống thường được sử dụng trong cấy phôi không phẫu thuật để loại bỏ co bóp trực tràng và do đó cho phép đặt phôi chính xác hơn
và ít gây tổn thương hơn
Cấy phôi phẫu thuật được thực hiện thông qua vết cắt tương ứng với phía buồng trứng có thể vàng chức năng Phôi được cấy bằng ống thông nhỏ vào đầu sừng tử cung cùng phía Vết cắt được gây mê cục bộ trong lúc phẫu thuật
Cấy phôi bằng phẫu thuật nhìn chung được thực hiện khi rất khó đưa qua tử cung và
kỹ thuật này cho phép cấy phôi chính xác hơn và gây ít tổn thương sừng tử cung Vì thế
có thể sử dụng thành công nhiều con nhận hơn và nhìn chung tỷ lệ có chửa cao hơn Tuy nhiên, kỹ thuật này tốn nhiều thời gian.