Nghiên cứu thu nhận enzym α amylase từ trực khuẩn cỏ khô

Các chủng vi sinh vật nói chung và vi khuẩn Bacillus nói riêng đã và đang được sử dụng rất phổ biến trong các chế phẩm sinh học để phục vụ cho các ngành sản xuất như: rượu, bia, công ng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH

-

NGUYỄN THỊ HOÀNG HẢI

NGHIÊN CỨU THU NHẬN ENZYM

α – AMYLASE TỪ TRỰC KHUẨN CỎ KHÔ

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH

-

NGUYỄN THỊ HOÀNG HẢI

NGHIÊN CỨU THU NHẬN ENZYM

α – AMYLASE TỪ TRỰC KHUẨN CỎ KHÔ

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Mã số: 60 42 40

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS.TS LƯƠNG ĐỨC PHẨM

MỞ ĐẦU

Vi sinh vật trong tự nhiên rất đa dạng và phong phú Chúng có mặt khắp nơi: trong đất, trong nước, trong không khí,… kể cả trong cơ thể con người Ngoài tác hại do vi sinh vật gây ra như: gây bệnh cho thực vật, động vật và con người; thì nguồn lợi mà chúng mang lại cho chúng ta vô cùng to lớn nếu ta hiểu, biết và

sử dụng chúng hợp lý Các chủng vi sinh vật nói chung và vi khuẩn Bacillus nói

riêng đã và đang được sử dụng rất phổ biến trong các chế phẩm sinh học để phục vụ cho các ngành sản xuất như: rượu, bia, công nghiệp dệt, thuộc da, bổ sung vào thức ăn cho gia súc để dễ tiêu hoá, thức ăn trong nuôi trồng thuỷ sản, trong y học và nghiên cứu,… là nhờ khả năng sinh các loại enzym thuỷ phân của các chủng vi sinh vật này

Enzym là những chất xúc tác sinh học, ngoài những tính chất của một chất xúc tác nó còn có những tính chất ưu việt hơn như: có hiệu suất xúc tác rất cao ở điều kiện nhiệt độ và áp suất bình thường, có tính đặc hiệu cao Các tính chất này vẫn được bảo tồn khi tách enzym ra khỏi hệ thống sống, hoạt động trong điều kiện

invitro Vì vậy, enzym ngày càng được sử dụng rộng rãi trong thực tế, với quy mô

ngày càng lớn, dẫn đến việc hình thành và phát triển ngành công nghệ sản xuất enzym Việc sử dụng enzym trong thực tế không chỉ có ý nghĩa về kinh tế mà còn giải quyết nhiều vấn đề xã hội, các vấn đề bức xúc về môi trường

Trước kia, enzym thường được thu nhận từ tế bào thực vật hoặc động vật (chẳng hạn amylase được lấy từ hạt nảy mầm, protease từ nhựa đu đủ, dạ dày,…) Tuy nhiên quá trình sinh tổng hợp enzym ở động vật và thực vật gắn liền với sự trao đổi chất và nhu cầu của tế bào Ngoài ra, người ta còn phải phá bỏ các tổ chức tế bào để tách chiết và thu nhận enzym Như vậy, việc dùng tế bào động vật, thực vật làm nguồn nguyên liệu để thu nhận enzym là khá hạn chế,

thiếu tính kinh tế và không đáp ứng được nhu cầu về số lượng enzym cần thiết cho sản xuất

Trong khi đó, ở vi sinh vật hầu như chứa đầy đủ các loại enzym và việc sử dụng nguồn enzym từ vi sinh vật mang lại lợi ích lớn hơn, cụ thể như nguồn nguyên liệu dùng để nuôi cấy vi sinh vật thường rẻ tiền hơn vì chúng thường là phế phụ phẩm công nông nghiệp (như cám, trấu, bã mía, bã khoai mỳ,…) hoặc nguồn nguyên liệu tự nhiên như dầu mỏ, khí đốt,… Mặt khác, điều kiện nuôi cấy dễ dàng, và enzym có hoạt tính cao hơn Vì thế, khoảng 50 năm gần đây các chế phẩm enzym từ vi sinh vật đã dần thay thế các enzym có nguồn gốc thực vật, động vật

Trong hàng loạt các loại enzym khác nhau thì amylase là enzym phân giải tinh bột tạo đường cho các sinh vật Từ những năm đầu thế kỷ 18 các nhà khoa học đã bắt đầu nghiên cứu về amylase và đến nay đã biết khá rõ về loại enzym này Amylase được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực sản xuất như công nghiệp thực phẩm, công nghiệp dệt,…Sản xuất amylase công nghiệp đã được chú

ý từ rất lâu và ngày càng phát triển ở nhiều nước trên thế giới Việt Nam chúng

ta là một trong nhiều nước đã và đang có rất nhiều nghiên cứu và ứng dụng enzym amylase, nhưng nền công nghiệp sản xuất enzym ở nước ta chưa thật sự phát triển

Xuất phát từ cơ sở trên chúng tôi chọn đề tài cho luận văn: “Nghiên cứu

thu nhận enzym α-amylase từ trực khuẩn cỏ khô”

Nội dung của đề tài gồm một số vấn đề sau:

1 Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng sinh trưởng và sinh enzim amylase có hoạt tính mạnh từ đất vườn qua trung gian cỏ khô

2 Nghiên cứu hình thái tế bào, hình thái khuẩn lạc, và các đặc điểm sinh học của chủng tuyển chọn

3 Khảo sát các điều kiện nuôi cấy tối ưu để thu được dịch enzym amylase có hoạt độ cao

4 Định danh chủng được tuyển chọn bằng kỹ thuật di truyền phân tử

5 Nuôi cấy chủng đã tuyển chọn trong thiết bị bình lên men tam giác 1 lít với các điều kiện nuôi cấy tối ưu Nghiên cứu động học quá trình sinh tổng hợp amylase với 3 thông số là pH, sinh trưởng và hoạt độ enzym

6 Tách chiết enzym amylase từ dịch lên men nhờ các tác nhân tủa

7 So sánh hiệu suất thu nhận và hoạt độ chế phẩm enzym (CPE) amylase thu được từ các tác nhân tủa khác nhau

8 Nghiên cứu độ bền nhiệt và độ bền pH của CPE amylase

Chương I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giống vi khuẩn Bacillus [5], [16], [38], [39]

Bacillus là vi khuẩn Gram dương, hình que có kích thước khác nhau (0,5 –

2,5) ×(1,2 - 10) μm Chúng phân bố rộng rãi trong tự nhiên, trong đất, nước, không khí

Là vi khuẩn dị dưỡng hoá năng, thu năng lượng nhờ sự oxi hoá các hợp chất hữu cơ, có chùm tiên mao giúp chúng có khả năng di động, sống hiếu khí hoặc hiếu khí tuỳ tiện

Bacillus có khả năng sinh bào tử, bào tử được hình thành khi tế bào đã trải

qua giai đoạn phát triển mạnh nhất, hoặc khi thiếu chất dinh dưỡng Mỗi tế bào sinh dưỡng sinh ra một bào tử Khi bào tử trưởng thành, tế bào sinh dưỡng tự

phân giải giải phóng bào tử Các tế bào Bacillus đặc trưng là sinh bào tử màø vẫn

giữ hình dáng trực khuẩn khi mang bào tử, trong một số trường hợp tế bào vi khuẩn chỉ phình to một ít khi chứa bào tử Tuỳ loài mà bào tử có thể nằm chính tâm, lệch tâm hay gần đầu tế bào

Bào tử có khả năng chịu nhiệt, tia tử ngoại, phóng xạ và nhiều độc tố, vì vậy chúng có khả năng giữ ở trạng thái bào tử nhiều năm Bào tử không phải cơ quan sinh sản mà là một trạng thái bảo vệ nòi giống, nó được tạo ra để giúp tế bào chịu được các điều kiện bất lợi của môi trường Đó là dạng nghỉ của tế bào Bào tử ở dạng tự do không có quá trình trao đổi chất, khi gặp điều kiện thuận lợi mỗi bào tử cho ra một tế bào sinh dưỡng

Đa số Bacillus sinh trưởng tốt ở pH = 7, một số phù hợp với pH = 9 – 10 như

Bacillus alcalophillus, hoặc với pH = 2 – 6 như Bacillus- acidocaldrius

Về nhiệt độ, có nhiều chủng ưa nhiệt độ cao (450C – 750C), hoặc ưa lạnh (50C –250C), nhưng thường gặp Bacillus sống ở nhiệt độ tối ưu là 340C – 370C

Hầu hết Bacillus không gây bệnh cho người và động vật Một số loại gây

bệnh cho côn trùng như Bacillus thuringiensis, B poplliae, B lentimorbus, B

cereus, B anthracis (trong đó B cereus và B anthracis có thể gây bệnh cho

người)…đa số còn lại trong tự nhiên là có ích

Bacillus có khả năng sinh enzym ngoại bào: α-amylase, protease kiềm,

cellulase… và các enzym này được ứng dụng rất nhiều trong công nghiệp, bảo vệ môi trường, nông nghiệp…

Sau đây là một số loài Bacillus thường gặp trong tự nhiên

1.1.1 Bacillus subtilis

Bacillus subtilis được phát hiện và đặt tên vào năm 1872, nó phân bố phổ

biến trong đất và đặc biệt là ở cỏ khô nên Bacillus subtilis được gọi là trực

khuẩn cỏ khô

Là những vi khuẩn hình que, ngắn, nhỏ, kích thước (3 -5) × 0,6 μm, nhiều khi tế bào nối lại với nhau thành chuỗi dài ngắn khác nhau hoặc tế bào đứng riêng rẽ

Khuẩn lạc khô, không màu hoặc màu xám nhạt, hơi nhăn hoặc tạo ra lớp màng mịn lan trên bề mặt thạch, có mép nhăn bám chặt vào môi trường thạch

Nhiệt độ thích hợp cho Bacillus subtilis sinh trưởng là 300C – 500C, thường nuôi cấy ở 370C

Bào tử hình bầu dục, kích thước 0,6 – 0,9 μm, phân bố lệch tâm, gần tâm nhưng không chính tâm Bào tử có thể sống vài năm đến vài chục năm Đã có

những chứng cứ về việc duy trì sức sống bào tử B subtilis trong 200-300 năm

Vi khuẩn B subtilis có màng nhày (giác mạc) giúp vi khuẩn có khả năng

chịu được điều kiện khắc nghiệt vì màng nhày có thể dự trữ thức ăn và bảo vệ vi khuẩn tránh tổn thương khi khô hạn Màng nhày có thể quan sát được khi nhuộm

tiêu bản, qua kính hiển vi chúng ta có thể nhìn thấy màng nhày của B subtilis là

không màu, trong suốt, còn tế bào vi khuẩn bắt màu nâu đỏ trên nền tiêu bản xanh hoặc đen

B subtilis có khả năng sinh ra một số enzym như: α-amylase, protease

kiềm có giá trị cao, đặc biệt có khả năng tổng hợp riboflavin (tiền vitamin B2)

Vì vậy, B subtilis được ứng dụng khá nhiều trong các ngành công nghiệp

1.1.2 Bacillus mesentericus

Bacillus mesentericus còn được gọi là trực khuẩn khoai tây do chúng có

mặt chủ yếu trên khoai tây Chúng gần giống Bacillus subtilis khuẩn lạc ăn sâu

và bám chặt vào môi trường thạch, bề mặt nhăn nhúm, khô, không mọc lan ra

môi trường, màu xám nhạt-trắng, hoặc hơi vàng nâu, hoặc hồng như Bacillus

mensentericus ruber hoặc đen như Bacillus mensentericus niger

Bacillus mensentericus sinh trưởng phát triển tốt nhất ở nhiệt độ 36 –

450C, tối đa 50 – 550C, pH = 4,5 – 5 thì ngừng phát triển

Bacillus mensentericus có hoạt tính amylase và protease lớn hơn hẳn Bacillus subtilis, nhưng lên men đường lại kém hơn

Bacillus mensentericus và Bacillus subtilis rất phổ biến trong tự nhiên,

chúng lây nhiễm làm hư hỏng thực phẩm, nhất là các loại thực phẩm có chứa nitơ và các sản phẩm giàu đường (bánh kẹo, hoa quả) Ngoài ra, chúng còn sinh

ra một loại hợp chất có hoạt tính kháng một số vi khuẩn khác gọi là bacterioxin,

ở Bacillus subtilis gọi là subtilin

1.1.3 Bacillus cereus

Vi khuẩn này có mối quan hệ gần gũi với Bacillus anthracis, B mycoides,

B thuringiensis Bào tử của chúng hình bầu dục, kích thước 0,9 × (1,2 – 1,5) μm,

nằm lệch tâm, phát tán khắp nơi, trong đất, trong không khí…Chúng thường sinh sôi nảy nở trên thực phẩm như cơm và có thể sinh ra độc tố làm cho thực phẩm

hư hỏng và gây ngộ độc thực phẩm

Tế bào của B cereus dày, kích thước (1 -1,5) × (3 – 5) μm có khi dài hơn,

đứng riêng rẽ hoặc xếp thành chuỗi

Khuẩn lạc của B cereus phẳng, hơi lõm, bề mặt hơi xù xì (dạng bột, hoặc

dạng hạt nhỏ) trắng đục, mép lồi lõm

1.1.4 Bacillus megaterium

Megaterium có nghĩa là “con thú lớn”, tế bào của nó khá lớn khoảng gấp

hơn 2 lần tế bào của Bacillus subtilis, kích thước (1,2 – 1,5) × (3 – 12) μm Ở các

ống nuôi già thì tế bào ngắn hơn, tròn hơn, đôi khi hình thoi với đầu hẹp lại Tế bào chứa nhiều hạt nhỏ và chất dự trữ (hạt mỡ, glycogen)

Bào tử lớn, hình ovan hay bầu dục, kích thước 1,5 × (0,7 – 1) μm, chúng nằm lệch tâm thường theo chiều ngang hoặc chiều xiên của tế bào

Khuẩn lạc tròn đều, lồi nhẵn nhưng thường có vòng viền quanh khuẩn lạc hoặc các vòng đồng tâm trên bề mặt, không thuỳ, không nếp, mép tròn đều hay lượn sóng, màu trắng sữa hay đục, có khi có màu nâu nhạt

Sinh trưởng trên môi trường dinh dưỡng đơn giản không cần thêm bất kỳ

yếu tố dinh dưỡng nào khác

1.1.5 Bacillus pumilus

Bào tử phát tán rộng, có mặt trong đất nhiều hơn Bacillus subtilis Khuẩn

lạc nhỏ, xung quanh viền mờ lan không ranh giới Tế bào của nó gần giống tế

bào B subtilis

1.1.6 Bacillus polymyxa

Kích thước tế bào là (0,6 – 1) × (2 – 7) μm, đứng riêng rẽ hoặc xếp thành đôi, chuỗi ngắn Khi hình thành bào tử tế bào sẽ phồng lên hình quả chanh Bào tử hình bầu dục kéo dài khoảng (1,7 – 2,6 μm), trên bề mặt cắt ngang như hình sao, nằm giữa tế bào, chúng phát tán rộng

Khuẩn lạc của B polymyxa vô màu, phẳng hoặc lồi, trơn, lan dần ra xung

quanh, mép đôi khi có thuỳ

Chúng thường sinh trưởng phát triển trên thực vật đang bị hỏng Vì vậy,

người ta thường phân lập chúng từ thực phẩm Chúng là nguồn để sản xuất kháng sinh polymyxin

1.1.7 Bacillus simplex

Tế bào B simplex nhỏ bé, có kích thước (2 – 5) × 0,6 μm, thường đứng

riêng rẽ không gắn thành chuỗi Bào tử hình bầu dục có kích thước 0,6 × 0,9 μm, nằm lệch tâm

Khuẩn lạc của B simplex giống khuẩn lạc B cereus, chỉ khác là khuẩn lạc

của B simplex có khả năng sinh sắc tố lục nhạt, vàng và tiết vào môi trường

1.1.8 Bacillus brevis

B brevis là trực khuẩn có kích thước (0,7 – 1,0) × (3 – 5) μm, đứng riêng

rẽ, đôi khi xếp thành chuỗi Bào tử có hình bầu dục nằm cuối tế bào làm cho tế bào có một đầu hơi phồng to

Khuẩn lạc của B brevis màu trắng, đôi khi có màu vàng, lồi hoặc phẳng,

lấp lánh, mép răng cưa giống như dạng mỡ đặc

1.1.9 Bacillus aslersporus

Tế bào dày (1,0–1,2) × (3 –7) μm, đứng riêng rẽ hoặc xếp thành đôi Bào tử hình trụ hay hình kéo dài, kích thước 1,0 × (1,5–2) μm, nằm giữa tế bào Khi

hình thành bào tử tế bào phồng lên một chút trông giống như dạng Clostridium

Khuẩn lạc của B aslersporus nhỏ, màu trắng hay màu lục nhạt, phẳng,

mềm, nhày, đồng chất

1.2 Khái quát chung về enzym [1], [4], [15], [23], [49]

Sinh vật được xem như là một hệ thống mở có liên quan chặt chẽ đến quá trình trao đổi chất trong tế bào của cơ thể, và giữa cơ thể với môi trường ngoài Quá trình trao đổi chất của sinh vật là biểu hiện sinh động nhất của sự sống Khi

cơ thể không còn khả năng trao đổi chất thì cơ thể sẽ chết Quá trình trao đổi chất liên tục được xảy ra giữa trong và ngoài tế bào, tạo nên sự biến đổi liên tục

của vật chất trong thiên nhiên Các phản ứng sinh học xảy ra thường xuyên không chỉ ở trong tế bào sinh vật mà ở cả ngoài môi trường bao quanh tế bào Các phản ứng sinh học này được xúc tác bởi một loại protein đặc biệt được gọi là enzym Các enzym tham gia phản ứng trong tế bào gọi là enzym nội bào, còn các enzym thuỷ phân có chức năng phân huỷ chất hữu cơ ngoài tế bào thành chất dinh dưỡng có thể hấp thụ vào tế bào gọi là enzym ngoại bào Cả hai loại enzym này đều được tổng hợp trong tế bào

1.2.1 Enzym cảm ứng

Những enzym được tạo thành từ VSV không phải chỉ phụ thuộc vào loại VSV mà còn phụ thuộc thành phần môi trường nuôi cấy, điều kiện nuôi cấy Hiện tượng trên là do trong môi trường có chất khó đồng hoá, VSV tiết vào môi trường một hoặc các enzym tương ứng để tạo thành chất có thể đồng hoá được

Các enzym được tiết ra như thế được gọi là enzym cảm ứng và các cơ chất

kích thích quá trình tổng hợp enzym cảm ứng gọi là chất cảm ứng

1.2.2 Bản chất sinh học của enzym

Các loại enzym đều có các đặc tính sinh học chung như sau:

+ Enzym được tạo ra trong tế bào sinh vật

+ Enzym tham gia phản ứng cả trong tế bào sống và cả khi enzym được tách khỏi tế bào sống

+ Enzym tham gia phản ứng trong điều kiện nhiệt độ ôn hoà, vì enzym được tổng hợp và hoạt động trong điều kiện nhiệt độ của tế bào và nhiệt độ của

cơ thể Phần lớn nhiệt độ của cơ thể sinh vật dao động trong khoảng 30-40oC

+ Enzym có thể tham gia xúc tác các phản ứng trong và ngoài cơ thể + Phản ứng enzym là những phản ứng tiêu hao năng lượng rất ít Trong khi đó, các phản ứng hoá học được xúc tác bởi các chất xúc tác hoá học đòi hỏi năng lượng rất lớn

+ Enzym chịu sự điều khiển bởi gen và các điều kiện phản ứng Điều này có ý nghĩa rất lớn trong việc điều khiển sự tổng hợp enzym trong tế bào sinh vật

1.2.3 Bản chất hoá học của enzym

Phân tích thành phần hoá học của enzym người ta chia thành hai nhóm: + Nhóm enzym đơn cấu tử: là các enzym được cấu tạo chỉ có protein Các hydrolase thuộc loại này

+ Nhóm enzym đa cấu tử: bao gồm những enzym có hai thành phần:

• Phần protein thuần được gọi là apoprotein hay apoenzym Ngày nay mới tìm thấy một số ARN có hoạt tính enzym chuyển hoá tiền chất thành các ARN Các enzym ARN được gọi là Ribozim Hiện nay đã biết có 3500 enzym có bản chất protein và 100 ribozim

• Phần thứ hai là thành phần không phải protein mà là những chất hữu

cơ đặc hiệu có vai trò thúc đẩy quá trình xúc tác Thiếu thành phần thứ hai này thì các enzym không hoạt động, nên gọi chúng là chất cộng tác (cofactor) Các chất hữu cơ đặc hiệu này có thể gắn rất chặt với phần protein bằng liên kết đồng hoá trị được gọi là nhóm phụ (prosthetic), hoặc cũng có thể gắn lỏng lẻo và dễ dàng tách chúng khỏi protein được gọi là coenzym

Apoenzym quyết định tính đặc hiệu cao và làm tăng hoạt độ xúc tác của enzym Còn những chất hữu cơ đặc hiệu quyết định kiểu phản ứng, trực tiếp tham gia phản ứng và làm tăng độ bền của apoenzym đối với các yếu tố gây biến tính

Ngoài ra, trong thành phần của enzym còn có sự hiện diện một số kim loại, các kim loại này thường rất dễ tách ra khỏi enzym Trong trường hợp enzym mất kim loại chúng sẽ mất hoạt tính Khi đưa trở lại các kim loại tương ứng vào enzym thì hoạt tính của enzym lại được khôi phục, tính chất này mang tính thuận nghịch Vai trò của kim loại trong hoạt động của enzym vẫn chưa thực

sự làm sáng tỏ Tuy nhiên các nhà khoa học cho rằng có thể kim loại đóng vai trò liên kết giữa enzym và cơ chất, giữa apoenzym và coenzym, tham gia trực tiếp vào quá trình vận chuyển điện tử như vai trò của sắt trong cytochrome và

peroxydase

1.2.4 Tính chất hoá học của enzym

Enzym có thể hoà tan trong nước, trong dung dịch muối loãng tạo thành các dung dịch keo ưa nước, nhưng enzym không tan trong dung môi không phân cực Khi enzym được hoà tan vào nước, các phân tử nước lưỡng cực sẽ kết hợp với các ion, các nhóm ion hoặc các nhóm phân cực trong phân tử enzym tạo thành lớp vỏ hydrat Lượng nước hydrat này khá lớn và có vai trò quan trọng làm môi trường cho các phản ứng sinh hoá

Enzym bị kết tủa bởi các tác nhân gây tủa protein như muối trung tính bão hoà (NaCl, (NH4)2SO4 …), dung môi hữu cơ ở nhiệt độ thấp (etanol, aceton…) nên các chất này được dùng để thu chế phẩm enzym hoạt động Tuy nhiên, protein sẽ bị biến tính làm cho enzym mất hoạt tính do sự tác động của các tác nhân như: nhiệt độ cao, môi trường acid hay kiềm quá cao, các muối kim loại nặng Vì

vậy, người ta đã dùng các yếu tố trên để kìm hãm hoạt tính enzym khi cần thiết

1.2.5 Cấu trúc enzym

Không phải toàn bộ các thành phần của enzym tham gia vào hoạt động xúc tác, mà chỉ có những bộ phận rất đặc biệt mang tính đặc hiệu trong phân tử enzym mới tham gia xúc tác phản ứng Bộ phận đặc hiệu này được gọi là trung tâm hoạt động của enzym Phần còn lại đóng vai trò như một cái khung, giữ cho cấu trúc không gian thích hợp với khả năng xúc tác Mỗi enzym thường có một trung tâm hoạt động Tuy nhiên cũng có enzym có hai thậm chí có bốn trung tâm hoạt động

1.2.6 Cơ chế tác dụng của enzym

Bản chất của các phản ứng enzym là khi có sự tham gia xúc tác của các enzym, các cơ chất sẽ được hoạt hoá mạnh, từ đó làm thay đổi tính chất hoá học của cơ chất Dưới tác dụng của enzym, cơ chất có thể có những thay đổi không chỉ về cấu trúc hoá học, mà còn thay đổi tính chất hoá học Quá trình xúc tác của enzym xảy ra qua ba giai đoạn:

• Giai đoạn thứ nhất: enzym sẽ kết hợp với cơ chất bằng những liên kết yếu, nhờ đó sẽ tạo ra phức hệ enzym-cơ chất thường không bền, phản ứng xảy ra rất nhanh, đòi hỏi một ít năng lượng

• Giai đoạn thứ hai: cơ chất bị thay đổi cấu hình không gian và mức độ bền vững của các liên kết Kết qủa là các liên kết trong cơ chất bị phá vỡ

• Giai đoạn thứ ba: đây là giai đoạn cuối cùng, sản phẩm được tạo thành và tách khỏi enzym Enzym được giải phóng dưới dạng tự do như ban đầu

Cơ chế xúc tác tổng quát của enzym được tóm tắt như sau:

E + S ↔ ES → E + P Trong đó, E: enzym (enzyme); S: cơ chất (substrate); P: sản phẩm

(products)

1.2.7 Các yếu tố ảnh hưởng đến vận tốc phản ứng enzym

• Nồng độ cơ chất

Khi phân giải một loại cơ chất nào đó, phần cơ chế tác dụng của enzym cho thấy phản ứng khi có enzym tham gia sẽ trải qua ba giai đoạn:

Giai đoạn đầu nếu nồng độ cơ chất thấp thì vận tốc phản ứng (V) phụ thuộc tuyến tính với nồng độ cơ chất

Giai đoạn kế tiếp nếu V xấp xỉ giá trị cực đại thì V không phụ thuộc vào

cơ chất

Giai đoạn tiếp theo nếu nồng độ cơ chất tiếp tục tăng cao thì hầu như V không tăng nữa mà đạt giá trị gần với Vmax vì các enzym đã bão hoà cơ chất

• Nồng độ enzym

Nếu thừa cơ chất, V phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ enzym: V = k[E] Trong đó: V: vận tốc phản ứng

[E]: nồng độ enzym k: hằng số vận tốc phản ứng

• Nhiệt độ

Nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến phản ứng enzym Tốc độ phản ứng chỉ tăng đến một giới hạn nhiệt độ nhất định, vượt quá nhiệt độ đó vận tốc phản ứng sẽ giảm và dẫn đến mức triệt tiêu do cấu trúc protein đã bị phá vỡ Nhiệt độ tối

ưu của những enzym khác nhau là hoàn toàn khác nhau Phần lớn enzym hoạt động mạnh nhất ở nhiệt độ 40-50oC, có một số enzym khác là 600C hoặc 700C,

thậm chí một số enzym của vi khuẩn Bacillus subtilis lại hoạt động mạnh ở 900C

Nếu tăng nhiệt độ cao hơn mức tối ưu thì hoạt tính của enzym sẽ bị giảm, khi đó enzym không có khả năng phục hồi lại hoạt tính Ngược lại, ở nhiệt độ

00C thì hoạt tính của enzym bị hạn chế rất mạnh, nhưng khi đưa nhiệt độ lên từ từ thì hoạt tính của enzym sẽ tăng dần đều đến mức tối ưu

Nhiệt độ tối ưu của một enzym phụ thuộc rất nhiều vào sự có mặt của cơ chất, kim loại, pH, các chất bảo vệ

Người ta thường sử dụng hệ số nhiệt Q10 để biểu thị ảnh hưởng của nhiệt độ đến vận tốc phản ứng Hệ số này càng lớn thì phản ứng càng khó xảy ra ở nhiệt độ thường

• pH môi trường

pH thường ảnh hưởng đến mức độ ion hoá cơ chất, enzym, và đặc biệt ảnh hưởng đến độ bền của enzym Đa số enzym bền ở pH = 5-9, độ bền của enzym tăng nếu có mặt cơ chất, coenzym, hoặc Ca2+ Mỗi enzym có một giá trị pH tối

ưu (pHopt) tại đó V đạt Vmax

Nhiều enzym hoạt động rất mạnh ở pH trung tính, cũng có enzym hoạt động ở pH acid hoặc pH kiềm

• Các chất kìm hãm (I)

Các chất kìm hãm hoạt động của enzym làm giảm hoạt tính enzym nhưng lại không bị enzym làm thay đổi tính chất hoá học, cấu tạo hoá học và tính chất vật lý của chúng Các chất này bao gồm các ion, các phân tử vô cơ, các chất hữu

cơ và cả protein Các chất kìm hãm có ý nghĩa rất lớn trong điều khiển các qúa trình trao đổi chất ở tế bào sinh vật

Cơ chế kìm hãm của các chất kìm hãm có thể thuận nghịch hoặc không thuận nghịch, đặc hiệu hoặc không đặc hiệu Sau đây chúng ta chỉ xét các chất kìm hãm thuận nghịch Tuỳ thuộc vào bản chất tạo phức EI, bản chất của chất kìm hãm người ta chia thành các loại chất kìm hãm sau:

 Các chất kìm hãm cạnh tranh

Các chất này có cấu trúc tương tự như cấu trúc của cơ chất vì thế chúng có khả năng kết hợp với trung tâm hoạt động của enzym Kết quả là trung tâm hoạt động của enzym bị chất kìm hãm chiếm mất, do đó cơ chất mất một phần

khả năng tương tác làm tốc độ phản ứng giảm

 Các chất kìm hãm không cạnh tranh

Các chất kìm hãm không cạnh tranh kết hợp với enzym ở một vị trí không phải trung tâm hoạt động, kết quả là chúng làm thay đổi cấu trúc không gian của phân tử enzym theo chiều hướng bất lợi cho hoạt động xúc tác Vì thế các chất kìm hãm làm giảm hoạt động của enzym

Khi kết hợp với chất kìm hãm, enzym vẫn có khả năng kết hợp với cơ chất khi đó sẽ tạo thành phức hợp EIS

Trong thực tế chất kìm hãm chỉ kết hợp với phức hợp ES mà không kết hợp với E tự do Các chất kìm hãm có thể là những chất sau:

 Kìm hãm bởi sản phẩm của phản ứng

Các sản phẩm của phản ứng có thể đóng vai trò như chất kìm hãm không cạnh tranh Nếu enzym xúc tác cho phản ứng của cơ chất A và B tạo thành sản phẩm P1 và P2, enzym có ái lực với P1, P2 và cả cơ chất A, B Khi đó P1và P2 trở thành chất kìm hãm của enzym

 Kìm hãm do thừa cơ chất

Khi ES được tạo thành có thể có một cơ chất gắn với ES làm chúng không thể chuyển hoá tiếp được: ES + S ↔ ESS

• Chất hoạt hoá

Là những chất có tác dụng làm tăng hoạt tính enzym Chất hoạt hoá enzym có thể là anion, các ion kim loại, các chất hữu cơ có cấu trúc phức tạp có nhiệm vụ chuyển nhóm hydrogen hoặc phá vỡ một số liên kết trong phân tử tiền enzym hoặc phục hồi các nhóm chức năng trong trung tâm hoạt động của enzym

Các chất hoạt hoá chỉ có tác dụng hoạt hoá ở một nồng độ nhất định, vượt

quá nồng độ này chúng sẽ gây ức chế hoạt động của enzym

1.3 Hệ enzym amylase [4], [8], [13], [16], [27], [44]

Amylase thuộc hệ enzym thuỷ phân (hydrolase) chúng thuỷ phân các liên kết α-1,4 và α-1,6 glucoside của tinh bột Từ xưa chủ yếu người ta thu nhận amylase từ malt, nhưng ngày nay việc thu nhận chủ yếu từ nuôi cấy VSV

Cũng như nhiều VSV khác, vi khuẩn Bacillus tạo ra rất nhiều enzym

ngoại bào như: amylase, protease, celullase, Trong đó amylase rất quan trọng

vì chúng được sử dụng phổ biến và mang lại nhiều lợi ích cho nền sản xuất công nghiệp Các loại amylase thường gặp khi nuôi cấy VSV gồm: α – amylase, β-

amylase và γ-amylase

1.3.1 Giới thiệu về enzym α – amylase

• Cấu tạo:

α-amylase có cấu tạo gồm 3 tiểu đơn vị:

* A là tiểu đơn vị lõi có cấu trúc đặc trưng helix (α/β) 8 barel

* Tiểu đơn vị C được nối với A có cấu trúc tám đoạn β-sheet song song

* Tiểu đơn vị B gồm hai đoạn β-sheet được lồng vào giữa đoạn β-sheet thứ

ba và α-helix thứ ba của tiểu đơn vị A Tiểu đơn vị B quyết định độ bền hoạt độ của enzym và liên kết enzym-cơ chất Ion canxi nối giữa tiểu đơn vị A và B, có từ 1-30 nguyên tử gam Ca/mol

Khi tách hoàn toàn canxi ra khỏi enzym thì α-amylase mất hết hoạt tính, vì

Ca duy trì cấu hình hoạt động của enzym Mặt khác, Ca còn có tác dụng đảm bảo độ bền rất lớn của enzym đối với các tác động gây biến tính và sự thuỷ phân của các enzym phân giải protein

Tuỳ thuộc vào dạng enzym mà có thể có thêm một số tiểu đơn vị khác được gắn với đầu C-terminal hoặc đầu N-terminal của phân tử protein

Tâm hoạt động của α-amylase có chứa các nhóm –COOH và NH3

• Tính chất lý hóa

Điều kiện hoạt động của α-amylase từ các nguồn khác nhau thường không

Hình 1.1 Cấu trúc phân tử α-amylase [50]

giống nhau

- pH

pH tối thích cho hoạt động của α-amylase từ nấm sợi là 4,5-4,8 và của vi khuẩn là 5,8-6,0 Nhìn chung pH tối ưu nằm trong khoảng acid yếu 4,8-6,9 pH<4,0 α-amylase của vi khuẩn bị vô hoạt hoàn toàn, tuy nhiên một số α-

amylase chịu acid cao như của Bacillus acidocaldarious (pH tối thích là 3,5) và chịu kiềm mạnh như B licheniformis (pH tối thích là 9,0)

- Nhiệt độ

Nhìn chung α-amylase bền nhiệt hơn so với các amylase khác, đặc tính này được cho rằng có liên quan đến hàm lượng ion canxi trong phân tử (α-amylase của các vi khuẩn ưa nhiệt có chứa canxi nhiều hơn α - amylase của nấm

mốc 3 - 4 lần) α - amylase của vi khuẩn có độ bền nhiệt cao hơn cả

Bảng 1.1 Độ bền nhiệt của α-amylase từ các nguồn khác nhau

(theo Miller, Johson và Palmer)

Hoạt độ α-amylase, % so với hoạt độ ban đầu Nhiệt độ ( o C)

của nấm sợi của malt của vi khuẩn

• Cơ chế tác dụng

α-amylase có khả năng phân cắt các liên kết α-1,4 glucoside trong phân tử polysaccharid một cách ngẫu nhiên Vì thế người ta gọi nó là enzym amylase nội phân (endoamylase) Khi tác dụng lên tinh bột tạo ra sản phẩm chủ yếu là dextrin phân tử lượng thấp (phản ứng không màu với iod), ngoài ra còn có maltose, và một ít glucose Vì vậy, người ta gọi α-amylase là amylase dextrin

hoá hay amylase dịch hoá

1.3.2 Nguồn thu nhận enzym amylase

Enzym có thể được thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau như động vật, thực vật, vi sinh vật (VSV) Tuy nhiên việc khai thác enzym từ thực vật, động vật thường gặp khó khăn vì nguồn nguyên liệu hạn chế, hiệu suất thấp nên giá thành cao Hiện nay phần lớn enzym đều được thu nhận từ vi sinh vật, vì có những điểm nổi bật sau:

- VSV có tốc độ sinh trưởng, phát triển và sinh sản cực kỳ nhanh, từ đó tổng hợp enzym với cường độ rất mạnh, nên trong một thời gian ngắn có thể thu được một lượng enzym rất lớn

- Hệ enzym của VSV rất phong phú, từ các chủng VSV khác nhau ta có thể thu nhận được nhiều loại enzym khác nhau, trong đó có những enzym chuyên biệt chỉ có ở VSV mà hầu như không thấy ở động vật, thực vật

- Môi trường nuôi cấy VSV đơn giản, rẻ tiền, thường là những phế phụ liệu của ngành công nghiệp nên giá thành enzym rẻ hơn và dễ áp dụng cho các

cơ sở sản xuất

- VSV chịu ảnh hưởng rất lớn bởi thành phần dinh dưỡng, các tác động của môi trường, do đó người ta có thể thay đổi thành phần dinh dưỡng hoặc các yếu tố tác động để điều khiển quá trình tổng hợp enzym theo yêu cầu

- Việc cải tạo giống VSV để tạo ra các chủng VSV có khả năng tổng hợp

ra các loại enzym theo ý muốn có thể thực hiện được và chỉ trong thời gian ngắn,

vì khả năng thích ứng với môi trường của VSV là rất mạnh

- Sản xuất enzym từ VSV có thể thực hiện trên qui mô công nghiệp, tự động hóa và cơ giới hoá

Người ta đã biết nhiều loại VSV có khả năng tổng hợp amylase, trong đó được sử dụng nhiều hơn cả là nấm sợi, giả nấm men và vi khuẩn, còn xạ khuẩn thì ít hơn

- Các giống nấm sợi thường được dùng để thu amylase là Aspergillus,

Rhizopus

- Nhiều chủng vi khuẩn cũng có khả năng tạo lượng lớn amylase như:

Bacillus polymyxa, Phytomonas destructans, Clostridium acetobutylicum,… trong

đó các chủng vi khuẩn ưa nhiệt tạo nhiều amylase đáng chú ý là Bacillus

diastaticus, B stearothermophilus, B coagulans, B circulans; vi khuẩn ưa ẩm tạo

amylase mạnh được nghiên cứu nhiều hơn cả và sử dụng rộng rãi nhất là B

subtilis

Những chủng VSV tạo nhiều amylase thường được phân lập từ các nguồn tự nhiên Trong công nghiệp, các biến chủng tạo ra được bằng cách gây đột biến, nhờ tác nhân lý học hoặc hoá học hoặc phối hợp cả hai loại tác nhân trên, là những chủng hoạt động rất mạnh và có khả năng sinh tổng hợp nhiều

amylase

1.3.3 Một số yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp amylase của VSV [18], [23]

 Giống vi sinh vật

Có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng đến sự hình thành amylase và lượng amylase của VSV như: chủng VSV, môi trường dinh dưỡng, điều kiện nuôi cấy,… Trong các yếu tố trên thì chủng giống VSV là điều kiện đầu tiên và cơ bản nhất

Không phải các chủng VSV đều có khả năng tổng hợp amylase như nhau Ngay cả những chủng cùng chi, thậm chí là cùng loài cũng rất khác nhau về lượng enzym do chúng sinh ra Chính vì thế mà việc tuyển chọn chủng VSV có khả năng tạo nhiều amylase là vô cùng quan trọng

Ngoài việc tuyển giống có khả năng sinh amylase cao, thì việc bảo quản giống, tiến hành nuôi cấy trong điều kiện tối ưu cũng vô cùng quan trọng nhằm đảm bảo khả năng sinh tổng hợp enzym cao nhất và ổn định nhất Vì tầm quan trọng như vậy mà nhiều nước trên thế giới đã đưa công tác này lên tầm cỡ quốc gia và đã thành lập các trung tâm, chi nhánh giữ giống gọi là bảo tàng VSV

 Nguồn dinh dưỡng

Trong môi trường nuôi cấy VSV cần phải đảm bảo đầy đủ, thích hợp các thành phần và tỉ lệ các chất dinh dưỡng cho từng VSV cụ thể

• Ảnh hưởng nguồn cacbon

Thành phần và hàm lượng cacbon có ảnh hưởng lớn đến sinh tổng hợp

enzym Theo số liệu của Grigorev về ảnh hưởng của nguồn cacbon tới cường độ

sinh tổng hợp amylase có thể xếp theo thứ tự sau:

Với α–amylase: tinh bột > dextrin > maltozơ > lactozơ > glucozơ > sacarozơ > galactozơ > manozơ > arabinozơ

Với glucoamylase: tinh bột > dextrin > maltozơ > sacarozơ > glucozơ > lactozơ > lactozơ > arabinozơ > galactozơ > manozơ

Nồng độ nguồn cacbon cũng ảnh hưởng lớn đến sự tạo thành enzym Mỗi loài VSV chỉ có thể thích hợp với một nồng độ hydratcacbon nhất định

• Ảnh hưởng nguồn nitơ

Nitơ cần cho sự hình thành các axit amin để cấu tạo nên các protein cấu trúc cho các phân tử của enzym Nguồn nitơ bổ sung vào môi trường nuôi cấy có thể là nitơ vô cơ hoặc nitơ hữu cơ Nguồn nitơ thường dùng là nitrat amon, sunfat

amon, urê,… Các hợp chất hữu cơ là những nguyên liệu giàu đạm như cao ngô, bột đậu tương, khô lạc, khô đậu,… Ngoài ra một số axit amin, bazơ purin, pyrimidin cũng thường được bổ sung vào môi trường nuôi cấy VSV

Ngoài hai nhân tố cơ bản trên, trong môi trường dinh dưỡng của VSV sinh enzym nói chung cần phải có mặt nhiều nguyên tố khoáng ở dạng muối magiê, photpho, kali,…và các nguyên tố vi lượng Ví dụ ion Mg2+ có tác dụng làm ổn định amylase ở nhiệt độ cao, Ca2+ có trong thành phần protein của α – amylase

 Điều kiện nuôi cấy

Trong môi trường nuôi cấy VSV các yếu tố như, nhiệt độ, độ pH, độ ẩm, thời gian nuôi cấy,… cũng ảnh hưởng lớn đến sự tạo thành enzym của VSV

• Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhiệt độ tối thích cho sinh tổng hợp enzym của các VSV là khác nhau Ví dụ ở đa số nấm mốc trên môi trường rắn là 28-32oC, của vi khuẩn 30-35oC

• Ảnh hưởng của pH môi trường

pH ban đầu của môi trường ảnh hưởng không nhỏ đến sự phát triển và tạo

thành enzym Đa số nấm mốc phát triển và tạo amylase ở môi trường axit yếu, trong khi đó vi khuẩn lại thích hợp trong môi trường trung tính pH môi trường không chỉ ảnh hưởng đến lượng enzym tổng hợp mà còn ảnh hưởng đến chủng

loại enzym được tổng hợp Ví dụ ở Asperillus oryzae khi pH môi trường là 6,5 thì

ưu thế tổng hợp thuộc về α – amylase, trong khi đó ưu thế tổng hợp glucoamylase khi pH môi trường là 4,5

• Ảnh hưởng độ ẩm của môi trường nuôi cấy

Trong quá trình sản xuất cần phải duy trì độ ẩm của môi trường, vì độ ẩm sẽ làm giảm độ thoáng khí của môi trường, còn độ ẩm thấp lại kìm hãm sự sinh trưởng và phát triển của VSV Độ ẩm môi trường xốp thích hợp nuôi nấm mốc là

50 – 60%, còn đối với vi khuẩn là 50 – 70%

• Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy

Thời gian nuôi cấy ảnh hưởng lớn đến sự hình thành enzym Đối với đa số nấm mốc khi nuôi ở môi trường xốp sự tạo thành amylase cực đại thường kết thúc khi nấm mốc bắt đầu sinh bào tử, thời gian kết thúc sự tạo thành amylase thường từ 30-42 giờ Còn đối với vi khuẩn sự tạo thành amylase tốt nhất từ khoảng 40-50 giờ Còn nuôi cấy chìm sinh trưởng của chủng giống đạt cực đại tới pha ổn định trước, khoảng từ 5 đến 8 giờ sau thì hoạt độ enzym đạt cực đại

1.3.4 Tách chiết enzym từ các nguồn nguyên liệu [4], [10], [12], [14]

- Đối với enzym ngoại bào: người ta tách sinh khối và các chất cặn bã khỏi canh trường bằng phương pháp lọc hoặc ly tâm Sử dụng thêm các chất trợ lọc (diatomite, than hoạt tính…) hoặc các chất tạo kết tủa để các chất này dễ dàng bị lắng cặn kéo theo sinh khối giúp quá trình lọc dễ dàng hơn

- Đối với enzym nội bào: để thu nhận enzym cần phải phá vỡ tế bào bằng các phương pháp sau:

▪ Phương pháp vật lý

Nghiền tế bào trong máy đồng hoá hoặc nghiền với bột thuỷ tinh hay cát trắng sạch trong cối sứ Thay đổi nhiệt độ đột ngột hoặc tạo áp suất thẩm thấu cao để phá vỡ thành tế bào

▪ Phương pháp hoá học

Sử dụng acid để thuỷ phân thành tế bào Tuy nhiên cho acid quá nhiều có thể làm biến tính enzym Hoặc có thể dùng kiềm, nhưng nếu enzym có tính acid thì không dùng được

▪ Phương pháp sinh học

Phương pháp sinh học được sử dụng nhiều nhất là phương pháp enzym Dùng các enzym tương ứng với các cơ chất có trong thành tế bào để thuỷ phân, như vậy thành tế bào sẽ bị phá vỡ

Sau khi phá vỡ tế bào, các enzym được tách chiết bằng các dung môi

khác nhau như: nước, dung dịch đệm, muối trung tính Phần lớn các enzym thuỷ phân tan tốt trong nước, do đó nước là dung môi tốt nhất để chiết rút enzym, có thêm một ít focmalin để sát trùng Nhiệt độ nước để rút chiết enzym thường là 25-280C Cần làm lạnh nhanh dịch chiết xuống 10-120C để ngăn cản VSV lạ phá

hỏng dịch enzym

1.3.5 Ứng dụng của amylase trong thực tế sản xuất và đời sống [6], [15], [28], [29], [46]

 Trong sản xuất bánh kẹo

Mục đích của việc sử dụng enzym vào sản xuất các loại bánh quy là làm tăng mùi và vị của bánh Thêm các enzym protease và amylase khi chế biến bột làm tăng hàm lượng các acid amin tự do và lượng đường khử, từ đó chúng tham gia vào các phản ứng oxi hoá khử và kết qủa tạo cho bánh quy có mùi, vị và màu hấp dẫn

 Trong công nghệ sản xuất bánh mì

Trong sản xuất bánh mì, enzym được xem như chất phụ gia để làm tăng chất lượng bánh: làm tăng thể tích bánh, bánh có màu sắc đẹp hơn và mùi thơm hơn Trong quá trình sản xuất người ta sử dụng enzym protease, α-amylase, β-amylase, trong đó:

o Enzym protease có tác dụng làm giảm độ nhớt của bột nhào do gluten gây ra và làm tăng hệ số tiêu hoá protein

o Enzym α-amylase, β-amylase tham gia thuỷ phân tinh bột tạo ra đường, nhờ đó nấm men dễ dàng chuyển hoá đường thành cồn, CO2, từ đó làm tăng thể tích của bánh và tạo màu sắc, hương vị của bánh

Ngày nay, nguồn enzym amylase và protease được sử dụng chủ yếu từ

nấm mốc Aspergillus oryzae, và A awamori

 Trong sản xuất bia

Ngày nay, các nước trên thế giới ứng dụng enzym trong các công đoạn sản xuất bia Người ta thường sử dụng enzym amylase và protease của vi khuẩn, vì các loại enzym thu nhận từ vi khuẩn thường có hoạt tính cao và khả năng chịu nhiệt độ cao rất tốt mà nhiệt độ cao thường làm biến tính enzym trong malt

Người ta sử dụng rộng rãi chế phẩm enzym amylase của nấm mốc

Aspergillus oryzae, A niger, A awamori,…và của vi khuẩn Bacillus subtilis, B diastaticus,…để đường hoá thay malt Dùng amylase VSV có thể thay thế từ 50-

100% malt bằng nguyên liệu khác như bột gạo, bột bắp, bột sắn…nhưng thông thường chỉ thay thế từ 60-70% malt thì chất lượng bia tốt hơn, thơm ngon hơn

Ý nghĩa của việc sử dụng enzym VSV thay thế malt trong sản xuất bia đã tiết kiệm được hàng tấn malt đại mạch loại tốt, giảm giá thành và rút ngắn thời gian sản xuất Đối với Việt Nam cũng như những nước phải nhập malt với giá thành cao thì biện pháp trên có ý nghĩa to lớn

 Trong sản xuất rượu

Sử dụng amylase của VSV ở giai đoạn đường hoá trong sản xuất rượu, cồn đã rút ngắn thời gian và tăng hiệu suất do khả năng thuỷ phân sâu sắc của phức

hệ enzym VSV Vai trò của α-amylase trong sản xuất rượu là làm dịch hoá

nhanh ở giai đoạn nấu và ở cả giai đoạn đầu của sự đường hoá, dextrin hoá và tích tụ đường

Enzym amylase được thu nhận từ nấm mốc Aspergillus usamii, A awamori,

A oryzae và từ vi khuẩn Bacillus subtilis, B diastaticus Sản phẩm cuối cùng của

sự thuỷ phân tinh bột nhờ amylase nấm mốc chủ yếu là glucose, đường dễ lên men, do đó sự lên men rượu xảy ra nhanh hơn Còn chế phẩm amylase từ vi khuẩn chịu được nhiệt độ cao nên được sử dụng trong giai đoạn dịch hoá tinh bột

trước khi đường hoá là rất thích hợp

 Trong sản xuất mật tinh bột

Ngày nay người ta dùng chế phẩm amylase VSV thay cho acid và malt để thuỷ phân tinh bột tạo mật tinh bột (mật glucose, maltose) Khi thuỷ phân tinh bột nhờ amylase VSV làm cho chất lượng dịch thuỷ phân tốt hơn và dễ dàng tinh chế hơn, vì không xảy ra sự phân huỷ đường bởi acid, bởi nhiệt, và không phân huỷ các tạp chất có lẫn trong tinh bột

Hai loại enzym được sử dụng chủ yếu là α-amylase và γ-amylase (glucoamylase) từ nấm mốc, vi khuẩn và giả nấm men α-amylase dùng để dịch

hoá tinh bột và tạo maltose, còn γ-amylase dùng để đường hoá tạo glucose

 Trong sản xuất chất tẩy rửa

Enzym amylase có khả năng phân giải các vết bẩn do carbohydrate trong quần áo Người ta thường sử dụng α-amylase của vi khuẩn vì enzym này thường chịu được nhiệt độ cao (đến 90oC) và pH kiềm (pH = 9) Ngoài ra, enzym này còn được dùng phối hợp với protease kiềm cho hiệu quả tẩy rửa các chất carbohydrate và protein được tốt hơn

 Trong công nghiệp dệt

Enzym amylase được dùng để rũ hồ vải trước khi tẩy trắng và nhuộm Trong vải mộc chứa 5% tinh bột và nhiều tạp chất khác Để làm vải mềm, có khả năng nhúng ướt, tẩy trắng và bắt màu tốt khi nhuộm thì nhất thiết phải tách bỏ tinh bột

Ngày nay, người ta sử dụng α-amylase của VSV như vi khuẩn Bacillus

subtilis, Bacillus mesentericus hay nấm mốc Aspergillus oryzae thay cho amylase

malt và pancreatin α-amylase của vi khuẩn chịu được nhiệt độ cao, hoạt động mạnh ở 85-90oC Một số enzym của amylase của B.subtilis có thể hoạt động ở

105-115oC

Khi rũ hồ vải, lượng chế phẩm enzym tính cho mỗi lít dung dịch là 0,3-0,6g,

nhiệt độ xử lý là 90oC, trong thời gian từ 5-15 phút Phương pháp này không làm hại vải, mà tạo độ mao dẫn tốt đồng thời đảm bảo vệ sinh

 Trong chăn nuôi

Amylase được sử dụng riêng rẽ hay phối hợp với các enzym khác như protease, cellulase, pectinase…để sản xuất các loại thức ăn dễ tiêu hoá cho gia súc, gia cầm, đặc biệt là vật nuôi còn non giúp tăng trọng nhanh, sinh sản tốt, sức đề kháng cao…

 Trong y học và nghiên cứu khoa học

Amylase cùng các enzym khác được dùng trong chữa trị bệnh do thiếu enzym, khả năng chuyển hoá các chất kém, các bệnh về tiêu hoá,…

Ngoài ra, chế phẩm amylase còn được dùng để điều chế môi trường nuôi VSV phục vụ cho công tác khoa học Một dung dịch bền vững chứa α-amylase cho phép phát hiện các oligosaccharide phân tử lượng lớn với độ nhạy rất cao

Chương II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Tủ cấy vô trùng Bếp ổn nhiệt

Cân điện tử Máy lắc

Kính hiển vi điện tử Máy đo OD

Tủ ấm Tủ lạnh

Nồi hấp thanh trùng Máy ly tâm

KH2PO4 Thuốc thử Folin

HCl đậm đặc Na2CO3

2.2 Các môi trường được sử dụng

2.2.1 Môi trường phân lập và nuôi Bacillus (MPA) [5]

2 2.2 Môi trường cảm ứng sinh tổng hợp α-amylase của Bacillus [7]

Tinh bột tan 1%

Để thử hoạt tính amylase sử dụng dung dịch lugol, đo vòng thuỷ phân

tinh bột

2.3 Các phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp phân lập các chủng Bacillus từ đất vườn qua trung gian cỏ

khô [5], [17]

Lấy một ít đất vườn (10g) cho vào bình tam giác và thêm 90ml nước cất vô trùng lắc đều để tạo huyền phù, gia nhiệt tới 850C trong 20 – 25 phút Cắt nhỏ

một ít cỏ khô, rắc xung quanh cỏ ít bột CaCO3 rồi cho vào bình tam giác trên sao cho nước vừa ngập cỏ, để từ 1 – 2 ngày ở nhiệt độ phòng Đổ 10ml môi trường phân lập vào đĩa petri vô trùng, để nguội và cấy một lần que cấy vòng từ màng VSV mọc trên mặt lớp cỏ khô lên bề mặt môi trường đặc, dùng que gạt gạt đều, sau đó gói đĩa petri và cho vào tủ ấm 25-35oC Sau 2-3 ngày thấy xuất hiện các

khuẩn lạc riêng biệt trên mặt môi trường thạch

2.3.2 Phương pháp giữ giống cấy chuyền [11]

Đổ môi trường giữ giống vào ống nghiệm, để nghiêng ống nghiệm Tiếp theo, dùng que cấy vô trùng lấy dịch vi khuẩn phân lập đã được pha loãng bằng nước cất vô trùng, và cấy zic zắc trên bề mặt thạch nghiêng Nút ống nghiệm lại đặt vào tủ ấm ở 34oC, sau 24h thấy xuất hiện khuẩn lạc thì chuyển ống nghiệm vào tủ lạnh ở 4oC để giữ giống

Giống được cấy chuyền hàng tháng và hoạt hoá trước khi nhân giống

2.3.3 Một số phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học của Bacillus

 Phương pháp nhuộm Gram [18]

Với mục đích chọn các chủng có khả năng nhuộm màu Gram (+) Đây là phương pháp làm tiêu bản nhuộm màu được sử dụng phổ biến để quan sát đặc điểm hình thái, đếm số lượng vi khuẩn Những tiêu bản này có thể giữ được lâu

• Nguyên tắc: Khả năng bắt màu của VSV có liên quan đến muối Magie của

acid Ribocleic Khi nhuộm muối này có phản ứng với thuốc nhuộm loại tryphenylmetan (gelatin violet, oryatan violet, metyl violet) và không bị mất màu dưới tác dụng của cồn Những vi khuẩn như thế gọi là vi khuẩn Gram dương, ngược lại những vi khuẩn không giữ được màu khi nhuộm gọi là vi khuẩn Gram âm

• Cách tiến hành: Cho một giọt nước cất lên phiến kính, dùng que cấy vô

trùng lấy một ít tế bào vi khuẩn mọc trên môi trường đặc hoà vào giọt nước Hơ

phiến kính lên ngọn lửa đèn cồn 2-3 lần, chú ý không để phiến kính nóng quá vì như thế tế bào vi khuẩn sẽ bị biến dạng Khi giọt nước bay hơi dần vi khuẩn sẽ gắn chặt vào phiến kính

Nhuộm màu nhờ tím Gentian bằng cách nhỏ thuốc nhuộm này lên vết bôi, giữ 1-2 phút rồi rửa bằng nước cất Tiếp theo nhỏ dung dịch Lugol lên tiêu bản để trong 1 phút, rồi đổ thuốc đi và tráng bằng nước cất Sau đó rửa bằng cồn 96o trong thời gian khoảng 30-40 giây Rửa lại tiêu bản bằng nước cất rồi để khô vết bôi

Sau đó nhuộm bổ sung bằng Fucshin loãng khoảng 1-2 phút Rửa lại bằng nước cất cho đến khi hết màu rồi đợi khô

Quan sát dưới kính hiển vi quang học, nếu vi khuẩn nhuộm màu tím là vi khuẩn Gram dương, ngược lại vi khuẩn nhuộm màu hồng là vi khuẩn Gram âm

 Phương pháp nhuộm bào tử [11]

Bào tử vi khuẩn không phải là cơ quan sinh sản và thường có 2 dạng: hình cầu và hình bầu dục Khi tế bào sống trong môi trường không thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển hoặc khi tế bào đã trải qua giai đoạn phát triển mạnh nhất thì bào tử được hình thành

• Nguyên tắc: Khi tế bào được xử lý bằng nhiệt hay/và acid thì tế bào chất

của bào tử rất dễ bắt màu Nhuộm cả tế bào chất của bào tử và tế bào với thuốc nhuộm có hoạt tính nhuộm mạnh rồi tẩy màu của tế bào chất của tế bào và nhuộm nó với một thuốc nhuộm phân biệt khác Khi đó tế bào chất mang một màu và bào tử sẽ mang màu khác

• Cách tiến hành: Nuôi vi khuẩn trên môi trường MPA đặc trong tủ ấm

34oC, sau 5 ngày làm vết bôi trên một phiến kính sạch và để khô tự nhiên

Nhỏ vài giọt HCl 0,5% lên vết bôi, hơ nóng trên ngọn lửa đèn cồn cho bốc hơi trong 2 phút rồi rửa với nước

Nhuộm vết bôi với thuốc nhuộm Fuchsin, qua miếng giấy lọc, hơ nóng

cho đến bốc hơi trong vòng 5 phút Rửa vết bôi bằng nước Tẩy màu bằng dung dịch H2SO4 1% trong 2 phút Rửa vết bôi bằng nước

Nhuộm vết bôi bằng xanh methylene trong 5-15 phút Rửa lại với nước và để khô tự nhiên

Quan sát dưới kính hiển vi với vật kính dầu (×100) Bào tử sẽ mang màu đỏ, tế bào sinh dưỡng mang màu xanh

 Phương pháp phát hiện hoạt tính catalase [19]

Phương pháp này dùng để xác định vi khuẩn hiếu khí Trước khi thử hoạt tính catalase cần phải tiến hành cấy dàn vi khuẩn trên đĩa petri có môi trường MPA đặc, nuôi trong tủ ấm 340C Sau 24h thấy xuất hiện khuẩn lạc thì nhỏ một giọt dung dịch H2O2 10% lên khuẩn lạc Nếu thấy có bọt khí xuất hiện thì chứng tỏ có catalase trong tế bào, và kết luận là chủng vi khuẩn hiếu khí

 Quan sát đặc điểm khuẩn lạc [17]

Quan sát một số chỉ tiêu của chủng nghiên cứu trên môi trường nuôi

Bacillus: - Khả năng phát triển của khuẩn lạc

- Bề mặt khuẩn lạc

- Màu sắc khuẩn lạc

 Làm tiêu bản tế bào sống [5]

Loại tiêu bản này dùng để xem hình dạng, kích thước và sự sắp xếp các

tế bào, khả năng hình thành bào tử

• Cách tiến hành: Lấy một phiến kính khô và sạch đặt lên giá đỡ, nhỏ một

giọt nước cất lên giữa phiến kính Dùng que cấy lấy một ít VSV mọc trên môi trường đặc MPA hoà nhẹ vào giọt nước trên phiến kính để tạo huyền phù Đậy nhẹ lá kính để tránh tạo thành bọt khí Dùng giấy thấm hút lượng nước thừa ở quanh lá kính Mọi thao tác phải ở cạnh ngọn lửa đèn cồn, và mọi dụng cụ phải được làm sạch, vô trùng Sau đó đặt tiêu bản lên bàn kính và quan sát với vật kính 40X

2.3.4 Phương pháp xác định sự sinh trưởng của vi khuẩn theo mật độ quang [11], [25]

• Nguyên tắc: Phương pháp xác định nồng độ tế bào bằng máy so màu quang

học được sử dụng rộng rãi Cơ sở của phương pháp này là tính chất hấp phụ hoặc làm lệch một phần ánh sáng của các dung dịch có vật chất lơ lửng Để đánh giá tốc độ phát triển của vi khuẩn ta có thể đo sự tăng sinh khối qua giá trị OD (Optical Density) ở bước sóng 620nm (OD620)

• Cách tiến hành: Sau khi nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường lỏng với các

điều kiện phù hợp với mục đích thí nghiệm trên máy lắc, thì lấy dịch sau nuôi cấy đo OD bằng máy so màu ở bước sóng 620nm Tất cả dịch nuôi cấy đều được pha loãng 10 lần trước khi đo OD620

2.3.5 Phương pháp nghiên cứu khả năng phân huỷ tinh bột [17], [20]

Sử dụng phương pháp đục lỗ trên đĩa thạch

• Nguyên tắc: Enzym ngoại bào α-amylase có khả năng phân huỷ tinh bột

tạo ra đường, mà tinh bột là một polysaccharide có cấu trúc không gian tương đối phức tạp Khi môi trường chứa tinh bột được nhuộm bằng iod, iod được giữ lại trong cấu trúc mạng không gian của tinh bột và làm cho môi trường có màu xanh đậm Nếu VSV có khả năng phân giải tinh bột thì cấu trúc không gian của tinh bột bị phá vỡ, nên xuất hiện vòng phân giải trong suốt

• Cách tiến hành: Nuôi vi khuẩn trên môi trường cảm ứng sinh tổng hợp

amylase dạng lỏng ở 37oC trên máy lắc với chế độ lắc 200 vòng/phút Sau 40h lấy các dịch nuôi đó đem ly tâm với chế độ 5000 vòng/phút trong 15 phút để thu dịch enzym

36-Tiếp theo, đổ môi trường đặc thử hoạt tính amylase có chứa 1% tinh bột đã được khử trùng vào đĩa petri, chờ cho môi trường nguội và đông lại Sau đó dùng khuyên đục lỗ (đường kính khoảng 1cm) đã được khử trùng để đục lỗ trên bề mặt môi trường tạo thành các giếng

Dùng pipet Man hút dịch enzym nhỏ vào các giếng trong đĩa petri Gói đĩa lại và đặt vào tủ lạnh 3-4h để dịch trong giếng khuếch tán đều, sau đó đặt vào tủ ấm 34oC

Sau 24h dùng dung dịch Lugol đổ lên môi trường có chứa tinh bột Nếu có enzym amylase thì xuất hiện vùng chưa bị phân giải có màu xanh mực, và vùng trong suốt xung quanh giếng là do tinh bột bị phân giải bởi amylase Tiến hành đánh giá khả năng sinh amylase bằng cách đo đường kính vòng phân giải tinh bột của amylase

2.3.6 Phương pháp xác định hoạt độ α- amylase theo Heinkel, 1956 [7]

• Nguyên tắc

Amylase xúc tác phản ứng thuỷ giải tinh bột thành đường (đường đơn, đường đôi, hay dextrin phân tử lớn) Lượng tinh bột còn lại phản ứng màu với iod Xác định lượng tinh bột bị thuỷ giải, từ đó suy ra hoạt độ amylase theo định nghĩa:

Hoạt độ amylase được biểu thị là số mg tinh bột bị thuỷ giải bởi 1ml dịch enzym (hay 1mg nguyên liệu chứa enzym) trong 1 phút ở điều kiện chuẩn là 50 0 C, pH=6

Dung dịch iod: 1g I2 và 2g KI, thêm nước thành 100ml, bảo quản lạnh Khi

dùng pha loãng 500 lần

Dung dịch HCl 1N: 8,4ml HCl đậm đặc pha thành 100ml

Dung dịch HCl 0,1N: pha loãng từ dung dịch HCl 1N

• Tiến hành thí nghiệm

Dựng đường chuẩn tinh bột

- Hút 1ml dung dịch từ các ống nghiệm, thêm vào 5ml dung dịch I2KI đã

pha loãng 500 lần Đem so màu ở bước sóng 560nm

-Vẽ đồ thị tương quan giữa hàm lượng tinh bột và giá trị ΔOD

- Hút 1ml dung dịch từ các ống nghiệm trên, thêm vào mỗi ống 5ml dung

dịch I2KI đã pha loãng

- Lắc đều, đem đo OD tại bước sóng 560nm

• Công thức tính: hoạt độ α-amylase trong 1ml dịch enzym

HđA

v t

K V X

*

*

*

=

Trong đó: X: số mg tinh bột suy ra từ đường chuẩn

V: tổng thể tích hỗn hợp phản ứng enzym (10,5ml)

t: thời gian enzym phản ứng (10 phút)

v: thể tích enzym cho vào hỗn hợp phản ứng enzym (0,5ml) K: hệ số pha loãng

2.3.7 Các phương pháp nghiên cứu xác định điều kiện nuôi cấy tối ưu [5], [12], [14], [20], [21], [45]

Khả năng sinh trưởng và sinh amylase không chỉ phụ thuộc vào chủng giống VSV mà điều kiện nuôi cấy cũng ảnh hưởng rất nhiều Do đó chúng tôi tiến hành các thí nghiệm sau để xác định các điều kiện nuôi cấy tối ưu để chủng nghiên cứu sinh trưởng và sinh amylase tốt nhất

2.3.7.1 Loại cơ chất

Tiến hành nuôi cấy chủng đã chọn trong môi trường sinh tổng hợp amylase có chất cảm ứng khác nhau: bột gạo, bột mỳ, bột bắp, tinh bột tan ở nhiệt độ 37oC với chế độ lắc 200 vòng/phút Sau mỗi mốc thời gian: 20h, 30h, 40h, 45h, 50h, 55h, 60h, 70h đo OD620 xác định khả năng sinh trưởng, và ly tâm loại bỏ sinh khối ở 5000 v/p trong 15 phút lấy dịch enzym để xác định hoạt độ amylase theo phương pháp Heinkel Chọn loại cơ chất và thời gian nuôi cấy

thích hợp thu amylase có hoạt độ cao nhất

2.3.7.2 Nồng độ cơ chất

Nuôi chủng đã chọn trong môi trường sinh tổng hợp amylase có chứa loại

cơ chất thích hợp như đã xác định ở thí nghiệm 2.3.7.1 với nồng độ khác nhau: 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5% trên máy lắc với chế độ lắc 200 vòng/phút ở nhiệt độ

37oC Sau thời gian tối ưu được xác định ở mục 2.3.7.1 đo OD620 xác định khả năng sinh trưởng và đo hoạt độ amylase theo phương pháp Heinkel Từ đó xác định được nồng độ cơ chất tối ưu cho khả năng sinh amylase của chủng đang

nghiên cứu

2.3.7.3 Nhiệt độ

Chủng đã chọn được nuôi trong môi trường sinh tổng hợp amylase có chứa loại cơ chất với nồng độ thích hợp như đã xác định ở mục 2.3.7.1 và 2.3.7.2 ở nhiệt độ khác nhau: 25 – 280C; 30 – 330C; 35 – 370C; 40 – 420C trên máy lắc

200 vòng/phút Sau thời gian thích hợp đo OD620 xác định sự sinh trưởng và đo hoạt độ amylase theo phương pháp Heinkel Từ đó suy ra nhiệt độ tối ưu cho chủng đang nghiên cứu sinh amylase

2.3.7.4 pH ban đầu

Nuôi chủng đã chọn trên môi trường sinh tổng hợp amylase có các điều kiện nuôi cấy tối ưu như đã xác định ở các thí nghiệm trên, với pH ban đầu khác nhau: từ 5,0 đến 8,5 (mỗi bước nhảy là 0,5) trên máy lắc với chế độ 200 vòng/phút với thời gian thích hợp Tiến hành xác định sự sinh trưởng và hoạt độ amylase Từ đó vẽ đồ thị biểu diễn sự biến thiên của hoạt độ amylase theo pH Suy ra pH ban đầu tối ưu cho chủng đã chọn sinh amylase

2.3.7.5 Độ hiếu khí

Chủng vi khuẩn đã chọn được nuôi trong môi trường sinh tổng hợp amylase với các điều kiện nuôi cấy tối ưu như đã xác định ở các thí nghiệm trên trong các bình tam giác 500ml với dịch lên men có thể tích khác nhau : 50, 75,

100, 150, 200, 250, 300ml trên cùng máy lắc với chế độ 200 vòng/phút, cùng thời gian thích hợp Xác định sự sinh trưởng và hoạt độ amylase, kết quả thí nghiệm này cho phép xác định được tỉ lệ thể tích dịch lên men và thể tích bình nuôi cấy tối ưu để thu được hoạt độ amylase cao nhất

2.3.7.6 Ảnh hưởng của các loại muối

• Nồng độ NaCl

Nuôi chủng đã chọn trong môi trường cảm ứng sinh amylase với các điều kiện tối ưu, có nồng độ muối NaCl thay đổi: 0; 0,03; 0,05; 0,08; 0,1; 0,12% trên cùng máy lắc với chế độ 200 vòng/phút Sau thời gian thích hợp xác định khả năng sinh trưởng và hoạt độ amylase Suy ra nồng độ NaCl tối ưu cho khả năng sinh amylase

• Nồng độ CaCl 2

Chủng nghiên cứu được nuôi trong môi trường cảm ứng có nồng độ muối CaCl2 khác nhau: 0; 0,01; 0,015; 0,02; 0,025% trên máy lắc 200 vòng/phút và các điều kiện nuôi cấy tối ưu đã xác định ở các thí nghiệm trên Sau thời gian phù hợp đo khả năng sinh trưởng và hoạt độ amylase Từ đó kết luận được nồng độ CaCl2 tối ưu để sinh amylase có hoạt độ cao

2.3.7.7 Nồng độ NaCl ức chế sinh trưởng

Nuôi chủng đã chọn trên môi trường MPA có nồng độ muối NaCl khác nhau: từ 1% đến 7% (mỗi bước nhảy 1%) với điều kiện nhiệt độ, pH thích hợp trên máy lắc 200 vòng/phút Sau thời gian sinh trưởng tối ưu như đã xác định ở mục 2.3.7.1 tiến hành đo pH và sự sinh trưởng OD620, so sánh với pH và OD620 của môi trường MPA Từ đó xác định được nồng độ NaCl cao nhất ức chế sự sinh trưởng của chủng nghiên cứu

2.3.8 Phương pháp phân loại để xác định loài của chủng đã tuyển chọn [20]:

sử dụng kỹ thuật PCR

 Nguyên tắc: Khuếch đại một trình tự lên nhiều lần bằng một cặp mồi

chuyên biệt Phản ứng PCR là một chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm 3 bước:

• Bước 1 (biến tính): trong một dung dịch đầy đủ thành phần cho sự sao chép, DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn Tmax của phân tử, thường là 94-

950C trong vòng 30s-1phút

• Bước 2 (lai): nhiệt độ được hạ thấp để các mồi bắt cặp với khuôn, nhiệt độ này dao động trong khoảng 40-700C và kéo dài 30s-1phút

• Bước 3 (tổng hợp): nhiệt độ được nâng lên đến 720C để DNA polymerase hoạt động tốt nhất Thời gian của giai đoạn này phụ thuộc vào độ dài ngắn của trình tự DNA, thường kéo dài từ 30s đến vài phút

 Giải trình tự các axit nucleic

Các phương pháp nhằm xác định trình tự axit nucleic đều dựa vào 2 nguyên tắc:

• Nguyên tắc hoá học (phương pháp Maxam và Gilbert): dựa vào các phản

ứng thuỷ giải hoá học đặc hiệu phân tử DNA, tạo thành một tập hợp nhiều phân đoạn có kích thước chênh nhau 1 nucleotide

• Nguyên tắc enzym học (phương pháp Sanger và các phương pháp cải

biên): dựa vào sự tổng hợp mạch bổ sung cho trình tự cần xác định nhờ DNA polymerase Với việc tổng hợp thêm các dideoxynucleotide cùng với các deoxynucleotide thông thường, kết quả tổng hợp cũng là sự hình thành một tập hợp nhiều đoạn DNA có kích thước chênh nhau 1 nucleotide

Ở cả 2 phương pháp trên, các phân đoạn DNA sẽ được phân tách qua điện

di trên gel polyacrylamid Nếu sử dụng đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ thì kết quả trình tự cần xác định sẽ được đọc trên bản phóng xạ tự ghi từ bản điện di

2.3.9 Phương pháp nghiên cứu động học

Với các điều kiện tối ưu đã xác định được ở mục 2.3.7 sẽ tiến hành nuôi cấy chủng sản – chủng đã tuyển chọn có hoạt độ enzym α - amylase cao nhất - trong bình lên men tam giác 1lít Chúng tôi sẽ nghiên cứu động học quá trình sinh tổng hợp α – amylase với 3 thông số là pH, sinh trưởng và hoạt độ amylase Qua các mốc thời gian: 20, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70h tiến hành đo pH, đo