TỔNG QUAN
Canxi hydroxyapatite
Canxi hydroxyapatite (HA) là một hợp chất có màu sắc đa dạng, bao gồm trắng, trắng ngà, vàng nhạt hoặc xanh lơ, tùy thuộc vào điều kiện hình thành và kích thước hạt HA có điểm nóng chảy ở 1760 °C và điểm sôi ở 2850 °C Độ tan trong nước của nó là 0,7 g/l, với khối lượng phân tử đạt 1004,60 và khối lượng riêng là 3,156 g/cm³ Theo thang độ cứng Mohs, HA có độ cứng là 5.
HA là hợp chất bền nhiệt, chỉ bị phân hủy ở khoảng 800 - 1200 o C tùy thuộc vào phương pháp điều chế và dạng tồn tại
Các phương pháp tổng hợp như kết tủa, sol-gel và điện hóa, cùng với các điều kiện như nhiệt độ phản ứng, nồng độ và thời gian già hóa sản phẩm, sẽ ảnh hưởng đến hình dạng của các tinh thể.
Các tinh thể HA thường xuất hiện dưới nhiều hình dạng như hình que, hình kim, hình vảy và hình cầu Việc nhận diện các dạng tồn tại của tinh thể HA có thể thực hiện thông qua phương pháp hiển vi điện tử quét (SEM) hoặc hiển vi điện tử truyền qua (TEM).
Hình 1.1: Ảnh SEM các dạng tồn tại của tinh thể HA
Cấu trúc tinh thể của HA được tìm ra bởi Naray - Szabo và Meheml [ ] Cấu trúc mạng của HA bao gồm các ion Ca 2+ , PO4
3- và OH - được sắp xếp trong các ô đơn vị như hình 1.2
Cấu trúc ô mạng cơ sở của tinh thể hydroxyapatite (HA) bao gồm 14 ion Ca2+, trong đó 6 ion nằm hoàn toàn trong ô mạng đơn vị, còn 8 ion còn lại nằm trên chu vi hai mặt đáy, chia sẻ với các ô đơn vị kề bên Mỗi ô chứa 4 ion, cùng với 10 nhóm PO4.
3- thì 2 nhóm nằm ở bên trong ô đơn vị còn 8 nhóm thì nằm trên chu vi của hai mặt đáy nhưng chỉ có 6 nhóm thuộc về ô đơn vị, 6 nhóm này gồm 2 nhóm ở bên trong ô đơn vị cộng với 4 trong số 8 nhóm nằm trên chu vi của 2 mặt đáy Tương tự, chỉ có 2 trong số 8 nhóm OH - chỉ ra trong hình là thuộc về ô đơn vị Số lượng các ion xuất hiện trong ô đơn vị có thể không đúng với công thức phân tử của HA Điều này có thể giải thích do sự lặp lại của các ô đơn vị trong hệ đối xứng ba chiều Với cách giải thích như trên, trong một phân tử HA bao gồm có 10 ion Ca 2+ , 6 nhóm PO4
3- và 2 nhóm OH - , từ đó có thể khẳng định HA có công thức hóa học tỷ lượng là Ca10(PO4)6(OH)2
Phân tử HA có cấu trúc mạch thẳng với các liên kết Ca - O là liên kết cộng hóa trị Hai nhóm OH được gắn với nguyên tử P ở hai đầu mạch, như thể hiện trong hình 1.3.
Hình 1.3: Công thức cấu tạo của phân tử HA
HA không phản ứng với kiềm nhưng phản ứng với axit tạo thành các muối canxi và nước:
Ca 10 (PO 4 ) 6 (OH) 2 + 2HCl 3Ca 3 (PO 4 ) 2 + CaCl2 + 2H2O
HA tương đối bền nhiệt, bị phân hủy chậm trong khoảng nhiệt độ từ 800 đến
1200oC tạo thành oxy - hydroxyapatit theo phản ứng:
Ca 10 (PO 4 ) 6 (OH)2 Ca 10 (PO 4 ) 6 (OH) 2-2x O x + xH2O (0 ≤ x ≤ 1) Ở nhiệt độ lớn hơn 1200oC, HA bị phân hủy thành β-Ca 3 (PO 4 ) 2 (β-TCP) và
Ca 10 (PO 4 ) 6 (OH)2 2β-Ca 3 (PO 4 ) 2 + Ca4P 2 O 9 + 2H2O
Ca 10 (PO 4 ) 6 (OH)2 2β-Ca 3 (PO 4 ) 2 + CaO + 2H2O
Hyaluronic Acid (HA) tự nhiên và nhân tạo đều có tính tương thích sinh học cao do có cùng bản chất và thành phần hóa học Ở dạng bột mịn kích thước nano, HA mang lại nhiều ứng dụng trong y tế và làm đẹp.
HA là dạng canxi photphate dễ hấp thụ nhất, với tỷ lệ Ca/P tương tự như trong xương và răng Dạng màng và xốp của HA có thành phần hóa học và đặc tính tương đồng với xương tự nhiên, cho phép các mô sợi và mạch máu dễ dàng xâm nhập Vật liệu này có tính tương thích sinh học cao, dẫn đến sự tái sinh xương nhanh chóng mà không bị cơ thể đào thải Thêm vào đó, HA không gây độc, không gây dị ứng và có tính sát khuẩn cao.
Vật liệu HA có nhiều dạng như màng, bột, khối xốp và composite, và đã được ứng dụng rộng rãi trong y học và dược học nhờ vào các đặc tính nổi bật của nó Ở dạng bột, HA rất cần thiết cho việc bổ sung canxi, đặc biệt cho trẻ em và người cao tuổi, vì lượng canxi hấp thụ từ thực phẩm hàng ngày thường thấp Canxi trong thực phẩm và thuốc thường ở dạng hợp chất hòa tan, dẫn đến khả năng hấp thụ không cao, và thường cần kết hợp với vitamin D để tăng cường hấp thụ HA dạng bột mịn với kích thước nano được cơ thể hấp thụ nhanh chóng qua niêm mạc lưỡi và thực quản, ít bị ảnh hưởng bởi axit dạ dày, nhờ đó mang lại hiệu quả cao trong việc cung cấp canxi cho cơ thể.
HA kích thước nano được dùng làm thuốc bổ sung canxi với hiệu quả cao [12]
Thuốc bổ sung canxi sử dụng nguyên liệu HA bột dạng vi tinh thể, với lớp màng n-HA dày nanomet, được phủ lên bề mặt kim loại và hợp kim qua các phương pháp điện hóa và điện di, giúp tăng cường khả năng liên kết giữa xương nhân tạo và mô, xương tự nhiên Những tiến bộ trong việc tạo màng n-HA không chỉ kéo dài tuổi thọ các chi tiết ghép mà còn mở rộng ứng dụng của nó từ ghép xương hông sang ghép xương đùi, xương khớp gối và nhiều vị trí khác Gốm xốp HA cũng được ứng dụng rộng rãi trong y sinh học.
Các nhà khoa học Nhật Bản đã phát triển một hỗn hợp bao gồm tinh thể hydroxyapatite (HA) kích thước nano và polyme sinh học, có khả năng phủ và bám dính trên bề mặt răng thông qua cơ chế epitaxy Hỗn hợp này tạo ra lớp men răng cứng chắc, "bắt chước" cấu trúc tinh thể HA tự nhiên của men răng, giúp cải thiện khả năng sửa chữa khuyết tật răng.
- Chế tạo mắt giả: HA tổng hợp từ san hô có cấu trúc bền vững, nhẹ và đặc biệt có khả năng thích ứng cao với cơ thể [15]
- Chế tạo những chi tiết để ghép xương và sửa chữa khuyết tật của xương [16]
Hình 1.5: Gốm y sinh HA tổng hợp bằng các phương pháp khác nhau
Tùy thuộc vào mục đích cấy ghép hoặc thay thế, sản phẩm gốm HA có thể được chế tạo với kích thước và độ xốp khác nhau Những sản phẩm này sau đó được gia công thành các chi tiết phù hợp, hoặc gốm HA cũng có thể được sử dụng ở dạng hạt để lấp đầy các khuyết tật của xương.
Hình 1.6: Sửa chữa khuyết tật của xương bằng gốm HA dạng khối xốp hoặc dạng hạt Ngoài ra, còn có một số ứng dụng của gốm HA như:
- Làm điện cực sinh học cho thử nghiệm sinh học [18];
- Làm vật liệu truyền dẫn và nhả chậm thuốc [8];
Gần đây, người ta phát hiện HA dạng xốp có khả năng vận chuyển và phân tán isulin trong ruột [8]
1.1.3 Các phương pháp tổng hợp
Nghiên cứu và chế tạo vật liệu HA đã được triển khai từ lâu trên toàn cầu, mang lại nhiều thành tựu quan trọng trong lĩnh vực y học, dược phẩm và vật liệu y sinh học Loại vật liệu tiên tiến này đã góp phần tạo ra những bước tiến mới trong xét nghiệm và điều trị Tùy thuộc vào mục đích sử dụng, HA có thể được tổng hợp theo nhiều phương pháp khác nhau, bao gồm các phương pháp cơ bản thường được áp dụng để sản xuất vật liệu HA kích thước nano.
Việc tổng hợp HA bằng cách kết tủa từ các ion Ca 2+ và PO4
3- có thể thực hiện theo nhiều cách khác nhau, được phân ra thành hai nhóm chính:
* Phương pháp kết tủa tử các muối chứa ion Ca 2+ và PO4
3- dễ tan trong nước: Các muối hay được dùng là Ca(NO 3 ) 2 , CaCl 2 , (NH 4 ) 2 HPO 4 …
Để phản ứng tạo ra hydroxyapatite (HA) từ 10Ca(NO3)2, 6(NH4)2HPO4 và 8NH4OH, cần duy trì pH của hỗn hợp phản ứng trong khoảng từ 10 đến 12 Việc kiểm soát pH là yếu tố quan trọng để đảm bảo phản ứng diễn ra thuận lợi, tạo ra sản phẩm mong muốn cùng với 20NH4NO3 và 6H2O.
Phương pháp kết tủa từ các hợp chất chứa Ca²⁺ ít tan hoặc không tan trong nước được thực hiện qua phản ứng giữa Ca(OH)₂, CaO, CaCO₃ với axit H₃PO₄ trong môi trường kiềm Phản ứng này tạo ra các sản phẩm kết tủa đặc trưng, phản ánh tính chất hóa học của các hợp chất canxi.
Alginate
Alginate là một loại polyme sinh học phong phú nhất từ biển, chỉ đứng sau cellulose về độ phổ biến Được phát hiện bởi nhà hóa học E.C.C Stanford vào năm 1881, alginate là một polysaccarit chủ yếu có trong rong nâu, với hàm lượng có thể lên tới 40% khối lượng chất khô.
Alginate là một hợp chất có mặt trong hệ thống gian bào dưới dạng gel, bao gồm các ion natri, canxi, magie, stronti và bari Chức năng chính của alginate là tạo ra bộ khung cho mô rong, giúp tăng cường độ bền vững và độ mềm dẻo của chúng.
Alginate là một nhóm muối của axit alginic, thuộc họ copolyme nhị phân không phân nhánh Chúng bao gồm các gốc β-D-mannuronic (M) và α-L-guluronic (G) được liên kết với nhau thông qua liên kết 1-4 glucozid.
Cấu trúc của alginate thay đổi tùy thuộc vào vị trí của các monome trong chuỗi mạch, dẫn đến sự hình thành các đoạn homopolyme (MM hoặc GG) và heteropolyme (MG hoặc GM) Khối lượng phân tử của alginate thường dao động từ 50 đến 1000 kDa.
Hình 1.9: Đặc trưng cấu trúc của alginate: a) Các monome của alginate; b) Cấu trúc chuỗi, cấu dạng ghế; c) Các kiểu phân bố các khối trong mạch alginate
Độ tan của alginate trong nước phụ thuộc vào ba yếu tố chính: độ cứng của nước, độ pH và lực ion tổng của các chất tan Đặc biệt, độ cứng của nước, như hàm lượng ion Ca2+, là yếu tố quyết định chính Độ pH của dung môi cũng rất quan trọng vì nó ảnh hưởng đến điện tích trên các gốc uronic Ngoài ra, lực ion của môi trường và hàm lượng các ion tạo gel cũng hạn chế sự hòa tan của alginate.
Alginate có độ nhớt cao khi nằm trong vách tế bào, nhưng độ nhớt sẽ giảm khi được tách chiết bằng các phương pháp khác nhau Độ nhớt của alginate phụ thuộc vào khối lượng phân tử, với alginate có khối lượng phân tử lớn thì độ nhớt càng cao Tỷ lệ mannuronic/guluronic (M/G) cũng ảnh hưởng đến độ nhớt, và tỷ lệ này cùng trọng lượng phân tử bị tác động bởi nhiều yếu tố như loài rong, độ trưởng thành, khu vực sinh trưởng, kỹ thuật chiết xuất và thời gian bảo quản Độ nhớt dung dịch alginate có thể biến thiên từ 10 mPa.s đến 1000 mPa.s (dung dịch 1%) Thêm một chút muối canxi sẽ làm tăng độ nhớt của sản phẩm và độ cứng của gel canxi alginate Alginate với tỷ lệ G cao hoặc M/G thấp sẽ tạo ra gel rắn hơn.
Alginate, giống như các polysaccarit tự nhiên khác, có độ ổn định thấp khi tiếp xúc với nhiệt và ion kim loại, với thứ tự ổn định là natri alginate > amoni alginate > axit alginic Alginate có độ nhớt cao kém ổn định hơn so với alginate có độ nhớt trung bình hoặc thấp Bột alginate dễ bị giảm độ nhớt nếu không được bảo quản ở nhiệt độ thấp; ví dụ, alginate có độ nhớt khoảng 50 mPa.s khi lưu trữ ở 10 - 20°C trong 3 năm chỉ thay đổi rất ít Ngược lại, alginate có độ nhớt cao (khoảng 4000 mPa.s) khi bảo quản ở 25°C sau một năm giảm 10% độ nhớt, và ở 33°C giảm 45% Dung dịch alginate ổn định trong khoảng pH từ 5,5 đến 10 ở nhiệt độ phòng trong thời gian dài, nhưng sẽ chuyển sang dạng gel khi pH dưới 5,5.
Dung dịch natri alginate có khả năng tạo gel khi tiếp xúc với các ion hóa trị II, III, đặc biệt là trong dung dịch CaCl2 Quá trình tạo gel xảy ra gần như ngay lập tức khi nhỏ giọt dung dịch natri alginate vào dung dịch CaCl2, tạo ra các hạt gel hình cầu Các gel này có thể được hình thành ở nhiều nhiệt độ khác nhau.
Khi đun nóng đến 100oC, canxi alginate không bị chảy ra mà có khả năng tạo gel nhờ vào cấu trúc “hộp trứng” của phân tử Sự tạo gel xảy ra khi có mặt các ion hóa trị II, III ở nồng độ thích hợp, khiến các phân tử sắp xếp song song Các đoạn GGGG tạo thành khoảng không gian giống như chỗ đặt trứng, nơi các ion canxi liên kết với nhóm carboxyl và nguyên tử oxy vòng trong Kết quả là các phân đoạn GGGG được nối với nhau qua các ion Ca2+, làm cho các phân tử gần nhau hơn và ép nước ra ngoài, tạo thành gel alginate.
Hình 1.10: Các mô hình liên kết giữa ion Ca2+ và alginate a) Mô hình hạt gel canxi alginate; b) Liên kết của block G với ion canxi
Gel được hình thành nhờ tương tác tĩnh điện giữa ion canxi, do đó gel này không thay đổi tính chất khi nhiệt độ thay đổi và có độ đàn hồi thấp Khả năng tạo gel và độ bền của nó phụ thuộc vào hàm lượng các đoạn guluronic (G) Phản ứng tạo liên kết gel sẽ không diễn ra ở các đoạn poly-mannuronic và các đoạn MG (mannuronic - guluronic) Khi tỷ lệ G cao hơn M, khả năng tạo gel của alginat sẽ được cải thiện đáng kể.
Khả năng tạo gel của muối alginate phụ thuộc vào kích thước của ion kim loại, với ái lực của alginate đối với các ion kim loại hóa trị II giảm dần theo thứ tự: Pb2+, Cu2+, Cd2+, Ba2+, Sr2+, Ca2+, và Co2+ Gel tạo thành sẽ có những tính chất khác nhau tùy thuộc vào loại ion liên kết và loại alginate sử dụng.
Oligoalginate là các oligosaccarite được chiết xuất từ alginate, với sự đa dạng về cấu trúc và tính chất nhờ vào tỷ lệ và trình tự của các gốc M và G Alginate bao gồm ba loại khối: khối M (axit mannuronic), khối G (axit guluronic) và khối MG (hỗn hợp) Mỗi khối thường chứa từ 3 đến 30 đơn vị monome Gần đây, các oligome của alginate đã được sản xuất thông qua cắt mạch alginate bằng enzym, mang lại các lợi ích như kích thích sự phát triển của vi khuẩn bifidobacteria, thúc đẩy quá trình nảy mầm hạt giống và phát triển cây trồng, cũng như khả năng kháng virus Oligoalginate giàu khối G có khả năng loại bỏ các ion kim loại độc hại, trong khi oligoalginate giàu khối M kích thích hệ miễn dịch bảo vệ chống lại nhiễm trùng và tổn thương do bức xạ Các phương pháp điều chế oligoalginate hiện nay bao gồm sử dụng enzym đặc hiệu hoặc axit thủy phân.
Alginate là một trong những polysaccharide đa dạng nhất với nhiều ứng dụng, từ kỹ thuật truyền thống đến thực phẩm và y sinh học.
Các ứng dụng của alginate dựa trên ba đặc điểm chính: khả năng tạo dung dịch có độ nhớt cao, khả năng tạo gel khi thêm muối canxi vào dung dịch natri alginate trong nước, và khả năng tạo màng và sợi canxi alginate Quá trình tạo gel xảy ra khi canxi thay thế natri trong alginate, giữ các phân tử alginate dài với nhau mà không cần đun nóng, và gel thu được không bị chảy khi đun nóng.
Trong ngành kỹ thuật, alginate là một ứng dụng quan trọng trong việc tạo chất tạo màng cho in vải sợi, nhờ vào khả năng mang lại màu sắc rực rỡ và độ đồng nhất Nhu cầu alginate cho in vải sợi chiếm khoảng 50% tổng sản lượng alginate toàn cầu Ngoài ra, alginate còn được sử dụng để tráng bề mặt giấy nhằm đạt được sự đồng nhất và làm tác nhân gắn kết trong sản xuất que hàn.
Composite canxi hydroxyapatite với alginate
Xương tự nhiên là mô phức tạp với 70% axit hyaluronic (HA) và 30% collagen loại I, trong đó HA được phân bố đều trong nền collagen Mối liên kết giữa xương và các mô sống xung quanh tạo ra khung xương vững chắc, kích thích sự phát triển mô xương mới Điều này yêu cầu vật liệu sinh học tiên tiến hoạt động như mạng lưới tế bào tạm thời, hỗ trợ sự phát triển tế bào gốc Vật liệu nano composite HA/polyme sinh học đang được xem xét như một lựa chọn tiềm năng cho kỹ thuật mô, với mục tiêu tái tạo cấu trúc phân cấp phức tạp của xương.
Năm 1993, FDA đã phê duyệt sản phẩm Collagraft, một composite HA/tricanxi phosphate kết hợp với collagen từ xương bò và tủy xương bệnh nhân, cho thấy tính tương thích sinh học cao và cải thiện tính chất cơ học khi kết hợp với polyme Nghiên cứu tại Phòng thí nghiệm Quốc gia Lawrence Berkeley đã phát triển composite HA và poly 2-hydroethyl methacrylat, hứa hẹn ứng dụng quan trọng trong cấy ghép xương và răng, cũng như liệu pháp chữa khuyết tật xương Một nhóm nhà khoa học Nhật Bản đã thành công trong việc phát triển xương nhân tạo từ HA và collagen, có tính năng như vật liệu xốp, dễ dàng cắt và cấy ghép vào cơ thể.
1.3.1 Đặc điểm, tính chất và ứng dụng
Gốm xốp và màng HA có độ bền cơ học thấp, nhưng có thể cải thiện bằng cách tạo ra gốm composite Giải pháp này bao gồm việc phân tán bột HA vào các polyme sinh học như alginate, maltodextrin, tinh bột, collagen và chitosan Sự hiện diện của các polyme không chỉ giúp phân bố đồng đều các hạt HA mà còn giảm hiện tượng kết tụ Mạng lưới cấu trúc của polyme hạn chế sự phát triển của tinh thể HA, dẫn đến kích thước hạt nhỏ hơn so với HA tinh khiết Vật liệu này có tính tương thích sinh học cao hơn, thích hợp cho các ứng dụng như chi tiết cấy ghép xương, kẹp nối xương và chất truyền dẫn thuốc.
Việc sử dụng polyme sinh học làm chất nền giúp gia công và chế tạo các chi tiết trở nên dễ dàng hơn Đồng thời, các polyme này có khả năng liên kết với tế bào sinh học nhờ vào các nhóm chức của chúng, tạo nên ưu điểm nổi bật cho vật liệu composite chứa HA.
Các loại composite từ polyme phân hủy sinh học kết hợp với hydroxyapatite (HA) đang được nghiên cứu để tạo ra xương thay thế với tính chất sinh học và cơ học cải thiện Vật liệu sinh học tự nhiên như collagen, gelatin, chitosan và alginate đã được ứng dụng rộng rãi trong y sinh học Trong số này, alginate nổi bật nhờ tính chất ưa nước, không độc, tương thích sinh học và giá thành hợp lý, khiến nó trở thành chất nền phổ biến trong công nghệ mô, xương, sụn và da.
Gần đây, vật liệu composite sinh học dựa trên hydroxyapatite (HA) đã được phát triển như một hệ thống hiệu quả cho việc truyền dẫn thuốc, kháng sinh và kháng nấm trong các lĩnh vực phẫu thuật chỉnh hình và nha khoa Sự kết hợp giữa HA và alginate không chỉ tăng cường khả năng gắn kết tế bào mà còn cung cấp một khung xương lý tưởng cho kỹ thuật mô Nhiều nghiên cứu đã thực hiện chế tạo composite HA/Alg làm chất độn xương thông qua các kỹ thuật như tách pha, phun giọt và phân tán trong polyme.
Composite HA/Alg là sản phẩm từ việc phân tán hạt HA vào chuỗi polyme alginate, đóng vai trò như khung đỡ cho sự phát triển của xương và mô Composite này có cơ tính tốt nhờ sự kết hợp bột HA với alginate liên kết ngang ion với canxi Đặc tính cơ học của composite HA/Alg có thể được cải thiện khi hàm lượng alginate tăng lên.
HA hình cầu với alginate đảm bảo vật liệu thay thế xương được giữ lại ở vị trí cấy ghép tránh sự nhiễm trùng về sau
1.3.2 Kỹ thuật và phương pháp chế tạo
Phương pháp composite được áp dụng để chế tạo vật liệu xốp chứa HA, trong đó HA thường được sử dụng dưới dạng hạt và chất nền là alginate Sự kết hợp giữa hạt HA và alginate tạo ra vật liệu composite, mang lại một phương pháp đơn giản và hiệu quả để kết hợp các đặc tính của hai loại vật liệu này.
Quá trình kết hợp HA dạng hạt và gốm xốp vào alginat được thực hiện thông qua các kỹ thuật chế tạo nhựa truyền thống Quy trình này bao gồm các bước pha trộn, nghiền, gia nhiệt và nén hoặc đúc phun ép.
Kết tủa các tinh thể HA trong alginate hoặc phân tán chúng trong dung dịch alginate trong quá trình hóa cứng là phương pháp hiệu quả để tạo ra các hạt nano.
Sự có mặt của alginate thông qua quá trình đồng hòa tan và đồng kết tủa là một trong những phương pháp phổ biến nhất, giúp tránh được sự kết hợp không mong muốn.
Phương pháp trực tiếp để tạo ra HA (Hyaluronic Acid) sử dụng các hợp chất như Ca(NO3)2, Na3PO4, (CH3COO)2Ca và H3PO4, nhằm sản xuất các hạt lớn.
Na 2 HPO 4 , CaCl 2 , Ca(OH) 2 …
Composite HA/Alg được hình thành từ việc phân tán trực tiếp hạt HA vào chuỗi polyme alginate, đóng vai trò là khung đỡ cho sự phát triển của xương và mô Composite này có cơ tính tốt nhờ sự kết hợp bột HA với alginate liên kết ngang ion với canxi, và đặc tính cơ học có thể cải thiện khi hàm lượng alginate tăng Việc chế tạo composite HA/Alg từ hạt HA hình cầu với alginate giúp giữ vật liệu thay thế xương ở vị trí cấy ghép, giảm nguy cơ nhiễm trùng Các composite này được chế tạo với hàm lượng khác nhau thông qua phương pháp kết tủa trực tiếp, và ảnh hưởng của hàm lượng alginate được khảo sát qua các đặc trưng hình thái học của tinh thể HA, sự tương tác hóa học giữa HA và alginate, cũng như vi cấu trúc của vật liệu composite Nghiên cứu này mở ra hướng mới trong việc phát triển composite HA và alginate cho ứng dụng sửa chữa và tái tạo xương.
Composite HA/Alg có thể được chế tạo bằng nhiều phương pháp khác nhau, trong đó Lin và Yeh đã phát triển một sản phẩm xốp từ gel canxi alginate liên kết ngang với HA kích cỡ nanomet thông qua phương pháp đông khô Việc thêm HA vào thành phần không chỉ tăng cường độ nén mà còn cải thiện khả năng gắn kết tế bào xương với alginate tinh khiết Bên cạnh đó, gel composite HA/collagen/alginate được chế tạo từ hỗn hợp bột HA, collagen và dung dịch alginate, cho thấy khả năng hình thành xương khi thử nghiệm trên xương đùi chuột.
[45] Người ta cũng nghiên cứu quá trình hình thành composite HA/Alg dạng sợi (đường kớnh khoảng 10 àm) thụng qua dung dịch natri alginate pha trộn với tinh thể
HA được chiết xuất từ xương đùi lợn trong dung dịch CaCl2 Quá trình tổng hợp composite HA/Alg bằng phương pháp trộn cơ học thông thường liên quan đến sự tham gia của Ca2+ để tạo liên kết ngang với alginate Tuy nhiên, vấn đề về liên kết bề mặt giữa pha vô cơ và polyme trong vật liệu này vẫn cần được nghiên cứu thêm.
1.3.3 Ứng dụng của composite HA/polyme
Tình hình nghiên cứu về HA và composite HA/ Alginate ở nước ta
Vật liệu composite HA/polyme vẫn còn mới mẻ và chưa được nghiên cứu nhiều Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã công bố một số kết quả nghiên cứu, trong đó nổi bật là vào năm 2009, họ đã chế tạo vật liệu composite collagen/hydroxyapatite bằng phương pháp đồng kết tủa để ứng dụng trong y sinh học Năm 2012, họ tổng hợp vật liệu composite hydroxyapatite trên nền tinh bột từ canxinitrat, sử dụng hai phương pháp: điều chế HA trực tiếp trong môi trường tinh bột và trộn cơ học HA với tinh bột Từ năm 2013 đến nay, đã có một số bài báo được công bố về tổng hợp và khảo sát các yếu tố ảnh hưởng của composite hydroxyapatite/tinh bột và hydroxyapatite/maltodextrin bằng phương pháp kết tủa trực tiếp.
- Ở nước ta: Vật liệu composite HA/polyme là tương đối mới mẻ, có một số nghiên cứu đã được công bố nhưng chưa có nhiều Cụ thể như:
Năm 2005, Viện Công nghệ Xạ hiếm đã khởi xướng nghiên cứu chế tạo gốm HA theo công nghệ Italia và đạt được những thành công ban đầu trong thử nghiệm trên động vật.
Một số nhóm nghiên cứu tại Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam cùng với Đại học Bách khoa Hà Nội đã tiến hành nghiên cứu và phát triển composite xốp chứa axit hyaluronic (HA) hoặc màng HA trên các nền vật liệu khác nhau.
Năm 2012, vật liệu composite hydroxyapatite (HA) đã được tổng hợp từ tinh bột canxinitrat qua hai phương pháp: điều chế HA trực tiếp trong môi trường tinh bột và trộn cơ học HA với tinh bột Phòng Hóa Vô cơ thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã nghiên cứu chế tạo HA bột kích thước nano bằng phương pháp hóa học từ Ca(OH)2 và Ca(NO3)2, ứng dụng vào sản xuất bột HA cho thực phẩm chức năng bổ sung canxi như Fecafovit và Growbust HA xốp với cấu trúc tự nhiên và nhân tạo được chế tạo qua các phương pháp phản ứng pha rắn, nén ép – thiêu kết, và phản ứng thủy nhiệt Tuy nhiên, các nghiên cứu hiện tại mới chỉ tạo ra bột HA đơn chất vô cơ mà chưa gắn polyme sinh học, dẫn đến khả năng hấp thụ của cơ thể chưa cao Do đó, để tối ưu hóa các đặc tính của HA, Phòng Hóa Vô cơ đã tiến hành nghiên cứu các dạng phức hợp như HA - tinh bột sắn, HA - alginate và HA - oligoalginate.
Các phương pháp phân tích xác định cấu trúc, thành phần và các đặc trưng của vật liệu
1.5.1 Phương pháp nhiễu xạ tia X
Phương pháp nhiễu xạ tia X là công cụ hiệu quả để nghiên cứu cấu trúc tinh thể của vật liệu, cho phép xác định nhanh chóng và chính xác các pha tinh thể, cũng như định lượng và đo kích thước hạt với độ tin cậy cao.
Phương pháp nhiễu xạ tia X hoạt động dựa trên nguyên lý chiếu tia X vào tinh thể, kích thích các nguyên tử và tạo ra các tâm phát sóng thứ cấp Các sóng thứ cấp này, bao gồm tia X, điện tử và nơron, tương tác với nhau, dẫn đến hiện tượng triệt tiêu và tăng cường theo các phương khác nhau, tạo ra hình ảnh giao thoa Hình ảnh giao thoa này phản ánh cấu trúc tinh thể, cho phép phân tích cách sắp xếp các nguyên tử trong ô mạng, từ đó xác định cấu trúc mạng tinh thể và các pha cấu trúc trong vật liệu.
Phương trình nhiễu xạ Bragg là lý thuyết phổ biến trong nghiên cứu nhiễu xạ tia X trên tinh thể, giải thích hiện tượng nhiễu xạ một cách đơn giản Theo lý thuyết này, mạng tinh thể được coi là tập hợp các mặt phẳng song song với khoảng cách d nhất định Khi tia X chiếu vào bề mặt tinh thể, khả năng xuyên thấu mạnh của tia X cho phép không chỉ các nguyên tử bề mặt mà cả các nguyên tử bên trong tham gia vào quá trình tán xạ.
1.5.2 Phương pháp phổ hồng ngoại Để xác định cấu trúc phân tử của chất cần nghiên cứu thường dùng phương pháp phổ hồng ngoại (FTIR) Trên phổ dựa vào các tần số đặc trưng của các nhóm chức trong phân tử mà có thể xác định sự có mặt của các nhóm chức đó có trong mẫu Phổ hồng ngoại chính là phổ dao động - quay vì khi hấp thụ bức xạ hồng ngoại thì cả chuyển động dao động và chuyển động quay của các nhóm chức đều bị kích thích Phổ dao động - quay của phân tử được phát sinh do sự chuyển dịch giữa các mức năng lượng dao động và quay Dạng năng lượng được sinh ra khi chuyển dịch giữa các mức này ở dạng lượng tử hóa, nghĩa là chỉ có thể biến thiên một cách gián đoạn
1.5.3 Phương pháp hiển vi điện tử quét
Phương pháp hiển vi điện tử quét (SEM) cho phép quan sát mẫu với độ phóng đại cao từ hàng nghìn đến hàng chục nghìn lần Chùm điện tử được tạo ra qua hai tụ quang và hội tụ lên mẫu nghiên cứu Khi chùm điện tử va chạm vào mẫu, nó phát ra các điện tử phản xạ thứ cấp Các điện tử này được gia tốc và chuyển đổi thành tín hiệu sáng, sau đó được khuyếch đại và hiển thị trên màn hình.
Mỗi điểm trên mẫu nghiên cứu tương ứng với một điểm trên màn hình, với độ sáng tối phụ thuộc vào lượng điện tử thứ cấp phát ra và bề mặt của mẫu Phương pháp này có ưu điểm là không yêu cầu chuẩn bị mẫu phức tạp, đồng thời cho phép thu được hình ảnh ba chiều rõ nét.
1.5.4 Phương pháp hiển vi điện tử truyền qua
Phương pháp hiển vi điện tử truyền qua (TEM) sử dụng chùm điện tử xuyên qua mẫu nghiên cứu, yêu cầu mẫu phải đủ mỏng để cho phép chùm điện tử xuyên qua Chùm tia điện tử, được tạo ra từ hai sung phóng điện tử, được hội tụ lên mẫu và khi va chạm, sẽ phát ra các chùm tia điện tử phản xạ và điện tử truyền qua Chùm điện tử truyền qua này được gia tốc và chuyển đổi thành tín hiệu sáng, sau đó được khuếch đại và đưa vào mạng lưới điều khiển để hiển thị độ sáng trên màn ảnh Mỗi điểm trên mẫu tương ứng với một điểm trên màn hình, với độ sáng phụ thuộc vào lượng điện tử phát ra tới bộ thu Thấu kính điện tử trong hệ thống đo có chức năng phóng đại và có khả năng điều chỉnh tiêu cự Khi tia điện tử có bước sóng khoảng 0,4 nm chiếu lên mẫu ở hiệu điện thế 100 kV, hình ảnh thu được cho phép xác định chi tiết hình thái học và kích thước hạt một cách chính xác thông qua độ tương phản tán xạ và nhiễu xạ.
1.5.5 Phương pháp phân tích nhiệt
Phương pháp phân tích nhiệt (DTA-TGA) là kỹ thuật hóa lý phổ biến để phân tích cấu trúc và tính chất nhiệt của vật liệu Trong giản đồ phân tích nhiệt, hai đường cong chính là DTA và TGA Đường DTA cho biết thời điểm xảy ra hiệu ứng thu nhiệt và phát nhiệt, trong khi đường TGA cho thấy sự biến đổi khối lượng mẫu khi gia nhiệt Mỗi quá trình hóa học và vật lý như phản ứng pha rắn, phân hủy mẫu, hay chuyển pha đều có hiệu ứng nhiệt tương ứng Các quá trình này có thể đi kèm hoặc không đi kèm với sự thay đổi khối lượng, như thăng hoa, bay hơi hay phá vỡ mạng tinh thể Từ việc phân tích các hiệu ứng mất khối lượng và nhiệt, ta có thể dự đoán các giai đoạn cơ bản trong quá trình phân hủy nhiệt của mẫu.
Khối lượng phân tử trung bình (Mw) và độ phân tán khối lượng phân tử (PDI) của polysaccharide được xác định bằng phương pháp sắc ký thẩm thấu gel (GPC), một kỹ thuật phân tích hiệu quả và nhanh chóng Trong quá trình này, mẫu được bơm vào cột sắc ký chứa vật liệu pha tĩnh có cấu trúc xốp, tạo ra các lỗ trống giữa và bên trong các hạt Khi mẫu đi qua cột, các phân tử có khối lượng nhỏ sẽ mất nhiều thời gian hơn để thoát ra do phải đi qua cả lỗ giữa các hạt và lỗ của chính các hạt vật liệu Thời gian lưu này được so sánh với mẫu chuẩn để xác định khối lượng phân tử của polymer.
Polyme có các chuỗi phân tử với độ dài khác nhau, do đó khối lượng phân tử được xác định bằng khối lượng phân tử trung bình khối (Mw) và khối lượng phân tử trung bình số (Mn) Tỉ lệ giữa Mw và Mn thể hiện mức độ phân tán khối lượng phân tử, được gọi là chỉ số phân tán polydispersity (PDI).
Trong nghiên cứu này, khối lượng phân tử trung bình và độ phân tán khối lượng phân tử của các polysaccharide được xác định bằng máy HP-GPC 1100 Agilent với detector RI GI362A, sử dụng cột Ultrahydrgel 250 và 2000 Å Nhiệt độ cột được duy trì ở 40°C, với chất chuẩn Pullulan có khối lượng phân tử từ 700 đến 4.000.000 Dalton, và tốc độ dòng là 1 ml/phút Phân tích được thực hiện tại Trung tâm Phân tích, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh.
THỰC NGHIỆM
Dụng cụ, thiết bị, hóa chất
- Bình cầu hai cổ 500 ml;
- Bình nhỏ giọt để điều chỉnh tốc độ;
- Đũa thủy tinh, thìa cân, quả bóp, con từ;
- Giấy đo pH vạn năng;
- Ống li tâm loại 50 ml;
- Cân điện tử có độ chính xác ± 10 -4 g;
- Máy khuấy từ gia nhiệt;
- Bể siêu âm tần số 46 kHz, công suất 200 W;
- Axit photphoric H3PO4 85% (d = 1,69), loại P (Trung Quốc); Canxi hidroxit Ca(OH)2, loại P (Trung Quốc);
Alginate là sản phẩm tự nhiên được chiết xuất từ rong nâu thuộc họ Sargassaceae, cụ thể là loài Turbinaria ornata, tại Nha Trang, Việt Nam Sản phẩm này được cung cấp bởi Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang.
- Cồn tinh khiết 96 o (Việt Nam).
Alginate và các oligoalginate
2.2.1 Chuẩn bị alginate và các oligoalginate
Alginate là sản phẩm tự nhiên được chiết xuất từ rong nâu thuộc họ Sargassaceae, cụ thể là loài Turbinaria ornata tại Nha Trang, Việt Nam Sản phẩm này được cung cấp bởi Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang.
Phân đoạn các thành phần khối polyM, polyG và polyMG được thực hiện bằng cách thủy phân 5g natri alginate trong 500ml dung dịch HCl (0,085 M) trong 3 giờ Sau khi thủy phân, dung dịch được ly tâm và phần dung dịch được trung hòa bằng NaOH (1M) đến pH=7 để thu được phân đoạn polyMG Phần cặn không tan tiếp tục được thủy phân lần 2 trong dung dịch HCl (0,3 M) trong 2 giờ, sau đó được trung hòa đến pH=2,85 và ly tâm lần 2 để thu được polyM Cuối cùng, phần cặn không tan được hòa tan bằng dung dịch NaOH ở pH=8, thu được phân đoạn polyG.
2.2.2 Xác định các thành phần đặc trưng của alginate và các oligoalginate
Sử dụng các phương pháp phân tích thực nghiệm như đã đưa trong phần 2.4
Tổng hợp composite HA/Alg
Composite giữa HA và alginate được tổng hợp theo sơ đồ bố trí thí nghiệm được trình bày trên hình 2.1
Hình 2.1: Sơ đồ bố trí nghiệm tổng hợp composite HA/Alg
Các bước tiến hành cho quy mô tạo ra khoảng 2g vật liệu:
- Huyền phù Ca(OH)2 và dung dịch H3PO4 được chuẩn bị trong nước cất với nồng độ lần lượt là 0,5 M và 0,3M
- Hòa tan alginate vào nước cất với hàm lượng 2% (w/v)
- Dung dịch H3PO4 và dung dịch alginate được nhỏ đồng thời vào huyền phù Ca(OH)2 trên máy khuấy từ
Hỗn hợp phản ứng được khuấy và gia nhiệt bằng máy khuấy từ đến nhiệt độ nghiên cứu, duy trì ổn định trong suốt thời gian phản ứng Nhiệt độ thí nghiệm được theo dõi bằng nhiệt kế thủy ngân Sau khi thêm hết các dung dịch, hỗn hợp cần được khuấy tiếp trong 4 giờ.
- Thêm vào hỗn hợp một thể tích tương tự etanol để đồng kết tủa alginat và
- Hỗn hợp đem ly tâm với tốc độ 5000 vòng/phút để thu sản phẩm composite HA/Alg
- Làm khô trong máy đông khô ở