Bước đầu phân lập và nghiên cứu chủng nấm metarhizum anisopliae trên côn trùng hại lạc tại xã nghi trung nghi lộc nghệ an

Trờng đại học vinhKhoa sinh học    ---Võ thị hoa Bớc đầu phân lập và nghiên cứu chủng nấm metarhizium anisopliae trên côn trùng hại lạc tại xã nghi trung - nghi lộc - nghệ an Khoá

Trờng đại học vinh

Khoa sinh học

  

-Võ thị hoa

Bớc đầu phân lập và nghiên cứu

chủng nấm metarhizium anisopliae

trên côn trùng hại lạc tại

xã nghi trung - nghi lộc - nghệ an

Khoá luận tốt nghiệp đại học

Chuyên ngành s phạm sinh học

Vinh – 2010 2010 Trờng đại học vinh

Khoa sinh học

  

-Bớc đầu phân lập và nghiên cứu

chủng nấm metarhizium anisopliae

trên côn trùng hại lạc tại

xã nghi trung - nghi lộc - nghệ an

Khoá luận tốt nghiệp đại học

Những năm học tại trường đại học Vinh đó cho em rất nhiều kiến thức làmnền tảng, cơ sở thực hiện đề tài khúa luận tốt nghiệp đại học Trong quỏ trỡnhnghiờn cứu đề tài, em đó nhận được sự chỉ bảo, giỳp đỡ rất tận tỡnh của cỏcthầy, cụ giỏo trường đại học Vinh

Trước hết, em muốn gửi lời cảm ơn chõn thành và biết ơn sõu sắc nhất tớithầy giỏo Nguyễn Dương Tuệ đó hướng dẫn, chỉ bảo nhiệt tỡnh, chu đỏo cho emtrong suốt quỏ trỡnh học tập và nghiờn cứu

Đồng thời, em xin chõn thành cảm ơn sự quan tõm, giỳp đỡ to lớn của thầy

cụ trong khoa Sinh học cựng cỏc anh chị cỏn bộ phũng thớ nghiệm Di truyền

-Vi sinh - Khoa Sinh học - trường đại học -Vinh trong suốt thời gian làm khúaluận

Cuối cựng, em xin cảm ơn gia đỡnh, bạn bố, cỏc bỏc nụng dõn xó NghiTrung - Nghi Lộc - Nghệ An đó ủng hộ, động viờn, giỳp đỡ, tạo điều kiện cho

em hoàn thành tốt luận văn này

Em xin chõn thành cảm ơn !

Vinh, tháng 5 năm 2010.

Sinh viên

Võ Thị Hoa

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Sơ lược tình hình nghiªn cøu chñng nấm Metarhizium anisopliae trªn thÕ giíi vµ ViÖt Nam 5

1.1.1 Trªn thÕ giíi 5

1.1.2 Ở Việt Nam 7

1.2 Tác hại của sâu hại trong sản xuất nông nghiệp 10

1.3 Đặc điểm của chủng nấm Metarhizium anisopliae 11

1.3.1 Đặc điểm phân loại và hình thái của Metarhizium anisopliae 11

1.3.2 Cơ chế tác động gây bệnh cho côn trùng của nấm Metarhizium anisopliae 12

1.3.3 Những bệnh lý biểu hiện ở côn trùng bị nấm mốc ký sinh tiêu diệt .13

1.3.4 Vai trò của nấm ký sinh trên côn trùng trong tự nhiên 15

1.4 Đánh giá thuốc trừ sâu sinh học 16

1.4.1 Ưu điểm của thuốc trừ sâu sinh học 16

1.4.2 Nhược điểm của thuốc trừ sâu sinh học 18

1.5 Chế phẩm trừ sâu sinh học từ nấm Metarhizium 18

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG, THỜI GIAN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu 21

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 21

2.1.2 Địa điểm nghiên cứu 21

2.1.3 Thời gian nghiên cứu 21

2.2 Phương pháp nghiên cứu 21

2.2.1 Phương pháp điều tra thực địa 21

2.2.2 Phương pháp thu mẫu sâu 22

2.2.3 Phương pháp phân lập nấm 22

2.2.4 Xác định số lượng bào tử chủng nấm Metarhizium anisopliae bằng phương pháp CFU (colony forming unit) và độ đo đục (Nephelometer) 24

2.2.5 Phương pháp quan sát trên chủng nấm Metarhizium anisopliae tiêu bản cố định 25

2.2.6 Phương pháp xác định sinh trưởng theo Blachman 25

2.2.7 Phương pháp tìm hiểu ảnh hưởng nhiệt độ đến sự sinh trưởng và phát triển của chủng Metarhizium anisoplieae 25

2.2.8 Phương pháp tìm hiểu ảnh hưởng độ ẩm đến sự sinh trưởng và phát triển của chủng Metarhizium anisoplieae 26

2.2.9 Phương pháp tìm hiểu ảnh hưởng độ pH đến sự sinh trưởng và phát triển của chủng Metarhizium anisoplieae 26

2.2.10 Thử nghiệm ảnh hưởng của chủng nấm Metarhizium anisoplieae đến đời sống của sâu hại lạc 26

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1 Tình hình sản xuất lạc và thực trạng sâu hại lạc tại xã Nghi Trung

-Nghi Lộc - Nghệ An 28

3.1.1 Đặc điểm về tình hình sản xuất lạc 28

3.1.2 Thực trạng sâu bệnh hại lạc 29

3.2 Kết quả nghiên cứu đặc điểm các chủng nấm phân lập 31

3.2.1 Tần số gặp các chủng nấm mốc trên sâu hại lạc 31

3.2.2 Đặc điểm của các chủng nấm mốc kí sinh trên sâu hại lạc 32

3.3 Kết quả nghiên cứu chủng Metarhizium anisopliae 37

3.3.1 Xác định số lượng bào tử chủng Metarhizium anisopliae bằng phương pháp CFU (colony forming unit) 37

ở các độ pha loãng thập phân 38

3.3.2 Kết quả đo độ đục 39

3.3.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới sự sinh trưởng, phát triển của chủng Metarhizium anisoplieae 40

3.3.4 Ảnh hưởng của độ ẩm tới sự sinh trưởng, phát triển của chủng Metarhizium anisoplieae 42

3.3.5 Ảnh hưởng của độ pH tới sự sinh trưởng, phát triển của chủng Metarhizium anisoplieae 44

3.3.6 Thử nghiệm về khả năng diệt sâu của chủng Metarhizium đến đời sống của một số loài sâu hại lạc 47

3.4 Xây dựng quy trình sản xuất sinh khối nấm phục vụ sản xuất 50

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 53

1 Kết luận 53

2 Kiến nghị 54

TÀI LIỆU THAM KHẢO 55 PHỤ LỤC

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 3.1.2: Tình hình sử dụng các biện pháp phòng trừ sâu hại lạc ở địa

phương 30Bảng 3.2.1: Tấn số gặp các chủng nấm mốc trên xác sâu 31Bảng 3.2.2: Một số đặc điểm của các chủng nấm mốc được phân lập sau

3 ngày nuôi cấy trên môi trường Czapeck 33

Bảng 3.3.1: số lượng bào tử chủng nấm Metarhizium anisopliae ở các độ

pha loãng thập phân 38Bảng 3.3.2a: Bảng thang mật độ bào tử và độ đục của chủng

Metarhizium anisopliae ở các độ pha loãng thập phân 39

Bảng 3.3.3: Ảnh hưởng của nhiệt độ tới sự sinh trưởng, phát triển của

Bảng 3.3.6: Kết quả thử nghiệm về khả năng diệt sâu của chủng

Metarhizium đến đời sống của một số loài sâu hại lạc 48

DANH MỤC HÌNH, ẢNH

Hình 3.2.1: So sánh tỉ lệ gặp các chủng nấm mốc kí sinh trên sâu hại lạc 32

Hình 3.3.1: So sánh mật độ bào tử chủng Metarhizium anisopliae 38s Hình 3.3.2b: Đường chuẩn NTU/CFU 39

Hình 3.3.3: So sánh tốc độ sinh trưởng của chủng Metarhizium anisoplieae ở các nhiệt độ khác nhau 42

Hình 3.3.4: So sánh tốc độ sinh trưởng của chủng Metarhizium anisoplieae ở các độ ẩm khác nhau 44

Hình 3.3.5: So sánh tốc độ sinh trưởng của chủng Metarhizium anisoplieae ở các độ pH khác nhau 46

Hình 3.3.6: So sánh tỷ lệ sâu chết do nhiễm nấm Metarhizium anisoplieae ở các độ pha loãng khác nhau 50

Ảnh 1: Một số sâu hại lạc 29

Ảnh 2: Các chủng nấm mốc kí sinh trên sâu đã phân lập trên môi trường Czapeck .35

Ảnh 3: Chủng Metarhizium anisopliae 36

Ảnh 4: Khuẩn ty và bào tử của chủng nấm Metarhizium anisopliae 36

Ảnh 5: Thể bình của chủng Metarhizium anisopliae 36

ĐẶT VẤN ĐỀ

Nghệ An là tỉnh cú diện tớch và sản lượng lạc lớn nhất cả nước với diệntớch trồng lạc khoảng trờn 25 ngàn ha/năm và sản lượng trờn dưới 45 ngàn

tấn/năm Lạc (Arachis hypogea L.) là cõy trồng lý tưởng trong hệ thống luõn

canh và cải tạo đất màu ở Nghệ An Nú cung cấp mặt hàng nụng sản xuấtkhẩu và là cõy thực phẩm cú giỏ trị kinh tế cao

Tuy nhiờn, năng suất lạc của Nghệ An núi riờng, của Việt Nam núichung vẫn cũn rất thấp so với nhiều nước thế giới như Trung Quốc 2,9 tấn/ha,

Mỹ 3,0 tấn/ha (Theo FAO, USDA (*) 2005) [3] Qua nghiờn cứu cụ thể tại địa

bàn xó Nghi Trung - Nghi Lộc - Nghệ An cho thấy cú rất nhiều nguyờn nhõnlàm giảm năng suất lạc, trong đú sõu bệnh là nguyờn nhõn chủ yếu Lạc ởNghi Trung được trồng 2 vụ/năm : Vụ Đụng Xuõn (tháng 7- tháng 11, âmlịch), vụ Xuân Hè (tháng1- tháng5, âm lịch) Cũng nh những loại cây khác, lạc

bị rất nhiều loại côn trùng phá hoại kể từ khi gieo trồng cho tới khi thu hoạch

nh cào cào, châu chấu, sâu róm, sâu khoang, sâu xanh, sâu cuốn lá Số lượngloài sõu hại và mật độ của chỳng trờn cõy lạc thay đổi tuỳ theo điều kiện khớhậu thời tiết, giống, điều kiện kỹ thuật canh tỏc Theo báo điện tử Nghệ Antrên toàn tỉnh có tới 900 ha lạc bị sâu phá hoại nh sâu xanh và sâu khoang, càocào, châu chấu trung bình mật độ 1-3 con/m2, có nơi 15-20 con/m2,chủ yếuvào cuối tháng hai Hàng năm, thiệt hại do sõu hại lạc khoảng 25-30% thậmchớ cú khi lờn đến 40-50%.[2]

Để bảo vệ mựa màng, người nụng dõn đó sử dụng thuốc hoỏ học cú độđộc cao để phun phũng ngừa sõu hại Hiện nay, thuốc trừ sõu cú khoảng 1.000loại tờn thương mại chứa khoảng trờn 5000 loại húa chất độc hại với số lượnghàng vạn tấn được bỏn trờn thị trường [5] Thực tế cho thấy việc sử dụngthuốc trừ sâu hoá học với số lợng nhiều liên tục mặc dù đã tiêu diệt đợc sâunhng đồng thời nó cũng tiêu diệt luôn cả thiên địch và nhiều vi sinh vật có lợi,tích luỹ độc hại cho nông phẩm, gây ô nhiễm nguồn nớc, gây hại các loài thuỷsinh, mất cân bằng sinh thái nhiều mực độ khác nhau Vì vậy, việc sử dụng

c¸c chÕ phÈm sinh häc phßng trõ s©u bÖnh võa n©ng cao n¨ng suÊt, phÈm chÊtc©y trång, võa bảo vệ môi trường sinh thái cũng như sức khoẻ con người lµ

®iÒu thùc sù cÇn thiÕt Biện pháp này được đánh giá là giải pháp tích cực, đầytính khả thi cho một nền nông nghiệp sạch

Tuy ở Việt Nam, người dân chưa có thói quen sử dụng nhiều chế phẩmsinh học diệt sâu hại nhưng người ta vẫn luôn đánh giá cao Những chế phẩmsinh học này được đưa vào nước ta từ đầu những năm 1970 với số lượng rất

ít Đầu tiên là chế phẩm Bt (Bacillus thuringiensis) đã được nghiên cứu năm

1971 Một số dòng virus NPV (Nucleopolyhedroviruses) và GV (Granuloviruses) cũng đã được nghiên cứu từ những năm 80 Năm 1990,

Viện Bảo vệ Thực vật đã phân lập và sản xuất thử một số loài nấm ký sinhgây bệnh côn trùng và cũng cho kết quả khả quan Những năm gần đây,những nghiên cứu sử dụng nấm có ích diệt côn trùng đã đạt khá nhiều thànhtựu Trong đó, người ta rất chú trọng tới việc nghiên cứu chủng nấm

Metarhizium anisopliae Đây là chủng nấm có khả năng diệt trên 200 loài sâu

như các loài rầy, mối, bọ xít, bọ cánh cứng, cào cào, mối và nhiều loài sâu ăn

lá khác [18] Nó hiện đang được sử dụng như là một sinh học trừ sâu để

kiểm soát một số loài gây hại của côn trùng và sử dụng trong sự kiểm soát của

bệnh sốt rét do muỗi đang được nghiên cứu [18] Ở nước ta đã có một số công trình nghiên cứu về chủng Metarhizium anisopliea như nghiên cứu sử dụng Metarhizium flovoviridae trừ mối (Nguyễn Dương Khuê, 2005), và

Metarhizium aniopliae phòng trừ rầy nâu, bọ xít, sâu cắn gié lúa, bọ cánh

cứng hại dừa (Phạm Thị Thùy và cộng sự, 2004 - 2005; Nguyễn Thị Lộc và

đồng nghiệp, 2002 ) [12] Tại Cần Thơ, từ năm 2005-2007 đã sử dụng nấm

Metarhizium anisopliae để phòng trị sâu ăn tạp, rầy đạt hiệu quả khá cao trên

70% sau 7-12 Tuy nhiên, những nghiên cứu ứng dụng chế phẩm sinh học từ

chủng nấm Metarhizium anisopliae trong phòng trừ sâu hại ở nước ta còn rất

ít, chỉ với quy mô thí điểm ở một số địa phương

Tại Nghệ An, năm 2004 chế phẩm sinh học được đưa vào ứng dụng sanglĩnh vực sản xuất nông nghiệp và chăn nuôi Bước đầu, chế phẩm được đưa vào

khảo nghiệm trờn 20 ha lạc ở 4 HTX tiờu biểu thuộc địa bàn 4 huyện: DiễnChõu, Quỳnh Lưu, Nam Đàn, Nghi Lộc Đối với diện tớch cú phun EMt khảnăng chống chịu bệnh tốt và năng suất cao hơn diện tớch khụng phun chế phẩm.Mới đõy nhất, chế phẩm sinh học cũn được ứng dụng vào thử nghiệm xử lýbệnh dịch vàng lựn xoắn lỏ hại cõy lỳa ở tỉnh Nghệ An và cho kết quả rất tốt,gúp phần đẩy lựi dịch bệnh này ở cõy [1]

Với mong muốn tìm hiểu thêm về đặc điểm về các điều kiện ảnh hởng tới

sự sinh trởng, phát triển của nấm Metarhizium anisopliae và khả năng tiêu diệt

sâu hại lạc của nấm này, chúng tôi lựa chọn đề tài khoá luận tốt nghiệp: "Bớc

đầu phân lập và nghiên cứu chủng nấm Metarhizium anisopliae trên côn trùng hại lạc tại xã Nghi Trung - Nghi Lộc - Nghệ An".

Mục tiêu đề tài

Do thấy đợc ý nghĩa quan trọng của việc sử dụng nấm Metarhizium

anisopliae trong diệt sâu hại lạc, ảnh hởng rất lớn đến năng suất, phẩm chất cây

trồng nên chúng tôi thực hiện đề tài này nhằm:

1.Tìm hiểu tình hình sâu hại lạc

2.Thu thập sâu hại lạc từ đó phân lập chủng nấm Metarhizium anisopliae

3 Nghiên cứu đặc điểm sinh học và các yếu tố ảnh hớng tới sự sinh trởng

phát triển của chủng Metarhizium anisopliae, định hớng việc điều khiển chủng

sinh trởng,phát triển tốt theo mục đích ngời sử dụng

4.Trên cơ sở những kết quả thu đợc, xây dựng quy trình sản xuất chếphẩm, sản xuất sinh khối ứng dụng vào thực tiễn

Nhiệm vụ đề tài

Để đạt đợc mục tiêu trên, đề tài bao gồm những nhiệm vụ:

1 Điều tra thực địa, thu thập, xử lý, bảo quản mẫu

2 Pha chế môi trờng nuôi cấy, phân lập chủng Metarhizium anisopliae,

theo dõi sự sinh trởng và phát triển của chủng

3 Tiến hành thí nghiệm về ảnh hởng của một số yếu tố môi trờng tới quá

trình sinh trởng,phát triển, tìm ra điều kiện tối u để chủng Metarhizium

anisopliae sinh trởng, phát triển tốt nhất.

4.Từ những yếu tố thích hợp nhất, xây dựng quy trình sản xuất sinh khối,

sản xuất chế phẩm nấm Metarhizium anisopliae để có thể sử dụng trong thực

tiễn

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Sơ lược tỡnh hỡnh nghiên cứu chủng nấm Metarhizium anisopliae trên

thế giới và Việt Nam

1.1.1 Trên thế giới

Nấm Metarhizium anisopliae là một loại nấm mốc kí sinh trên côn trùng

hại nhiều loại cây trồng, đặc biệt là cây lạc.Việc nghiên cứu nấm mốc kí sinh vàứng dụng của nấm mốc nhằm tiêu diệt côn trùng bắt đầu thực hiện đầu tiên bởi

II.Mechnikoff (1879) Nấm đợc ông nghiên cứu có tên là Entomphthora

anisopliae Sau đó vấn đề này thu hút nhiều nhà khoa học quan tâm và sử dụng

trên đối tợng nấm trên và đổi tên là Metarhizium anisopliae (1883).

Đến thế kỉ XX, nấm mốc kí sinh đợc nghiên cứu rộng rãi và đợc ứngdụng nhiều, số lợng loài nấm hại côn trùng đợc phát hiện và mô tả theo tài liệucủa Carle M.I, Ignofe (1967) đạt tới 530 loài

Nấm mốc ký sinh trờn nhiều loại cụn trựng khỏc nhau Về nấm ký sinh trờnmuỗi trong nhiều cụng trỡnh của nhiều tỏc giả Walker A.J (1938) , Miisprat.J(1946), Laird M (1960) … đó cho biết cú thể sử dụng nấm Coelomommyces đểđấu tranh sinh học với muỗi Về lĩnh vực nghiờn cứu nấm diệt muỗi này đóđược thực hiện khỏ tốt

Năm 1916, Lebedeva L.A đó mụ tả nấm Cordiceps clavulata Elletev ký sinh trờn Eulecamium corni Bouch ở vựng Curska.

Watsos W.Y.et al (1960) đó thụng bỏo về mối liờn quan giữa Spinicola

Smell với Matsecoeu macrocicatrices rich gõy bệnh cho thụng ở Canada.

N.P.Cherapanova (1946) đó nờu 36 loài nấm từ 14 giống Deuteromycetes:Aspergillum, Penicillium, Chaetomium,, Torula, Boteyotrichum, Stysanus(Stysanus là dạng ký sinh trờn 9 loài ve tớch)

Từ việc tỡm ra cỏc loài nấm ký sinh trờn cụn trựng cỏc tỏc giả cũng đónghiờn cứu tới hoạt tớnh sinh học của nấm diệt sõu

Cụng trỡnh đầu tiờn là của Carte A và Levrat D (1909) đó thụng bỏo nấmBeauveria basiana tiết ra enzim diastsza

Năm 1958, Huber đã tìm thấy lipaza, amilaza trong dịch nuôi cấy nấm

Cordyceps militaris, Metarhizium anisopliae, Beauveria basiana và Aspergillus flavus.

Đến năm 1965, Benz G cho biết tất cả các nấm kí sinh trên côn trùng đều

có khả năng tiết mọt lượng lớn enzim cần thiết để hòa tan chitin côn trùng

Năm 1966, Roberts đã mô tả và thử nghiệm độc tố nấm Metarhizium

anisopliae trên sâu hại.

Ngoài ra ,các tác giả trên thế giới còn nghiên cứu những ảnh hưởng nấmmốc lên mô, các cơ quan và chức năng sinh lý của côn trùng Các công trình đó

đã được mô tả nhiều sự phá hủy khác nhau: làm biến đổi thành phần , hìnhdạng của các enzim và phản ứng huyết tương (Sussman A.S 1957, Rubuov N.A1959) làm giảm khả năng sinh sản (Zigaev G.N 1963, Vinokurov G.M 1949)làm giảm trọng lượng và phá hủy sự hô hấp (Susman A.S 1952, Sasinakova A.1960) cũng như phá hủy chức năng hệ thống nội tiết của côn trùng(Enven A.B.1966)

Năm 2007, Hibelt và cộng sự đã phát hiện ra được hơn 700 loài nấm gây

hại cho côn trùng Trong đó quan trọng nhất là các giống Beauveria,

Metarhizium, Nomurasa Chúng kí sinh trên hơn 30 loại sâu, rệp, mối, cào cào,

châu chấu, bọ xít, bọ dừa [18].

Trong các chế phẩm sinh học dùng để diệt mối, đáng chú ý nhất là các chế

phẩm có nguồn gốc vi sinh vật, như: vi khuẩn Ballcilus thurigiensis, vi nấm

Metarhizium anisopliae, Bauveria bassiana Trải qua nhiều năm nghiên cứu và

thử nghiệm, kết quả cho thấy Metarhizium anisopliae là đối tượng có khả năng

ứng dụng phù hợp nhất

Metarhizium anisopliae có khả năng nảy mầm trên vỏ kitin của cơ thể côn

trùng, có hệ sợi xâm nhập và bên trong cơ thể vừa hút dinh dưỡng vừa thải chấtđộc và làm chết mối sau 12 đ ến 28 giờ (Hajek and St Leger, 1994) Sau khixâm nhiễm, gây bệnh cho mối, chúng lại sinh ra các bào tử, sợi nấm Các bào

tử và sợi nấm lại có thể lây nhiễm sang các cá thể mối khác (Hajek and St

Leger, 1994; Maureen S Wright, Alan R Lax, Gregg Henderson and Jian

Chen, 2000) Với các đặc điểm này, Metarhizium anisopliae đang được nghiên

cứu nhiều ở Mỹ, Úc, Trung Quốc… và được đánh giá có nhiều triển vọng.Hiện nay, ở Mỹ đã có sản phẩm diệt mối dạng bột được đăng ký với nhãnhiệu là Bioblat Đây là hướng nghiên cứu đáp ứng được vấn đề an toàn về môitrường khi tiến hành phòng trừ mối

Tại Malaysia, nấm xanh Metarhizium anisopliae đã được nghiên cứu để

phòng trừ mối đất đạt hiệu quả 64,75% sau 14 ngày Tại Philippines, đã nghiêncứu sử dụng nấm xanh để diệt rầy nâu hại lúa đạt hiệu lực 60% sau 10 ngày

Tại Úc, năm 1991 Milner đã nghiên cứu nấm Metarhizium anisopliae để phòng

trừ bọ hung hại mía đạt hiệu quả 68% Tại Nhật Bản, năm 1988 một số nhàkhoa học đã sử dụng nấm xanh để phòng trừ dòi hại rễ củ cải đạt hiệu quả trên

70%, sau 10 ngày (Phạm Thị Thùy, 2004) [4].Vào tháng 8/2007, một đội khoa

học gia ở Viện Công nghệ Hóa chất Ấn Độ khám phá một hướng hiệu quả hơncủa việc sản xuất dầu sinh học dùng lipase, một enzyme sản sinh số lượng đáng

kể bởi Metarizium anisopliae.

1.1.2 Ở Việt Nam

Cùng với việc nghiên cứu nấm mốc ký sinh trên côn trùng và ứng dụngcủa chúng trên thế giới, ở nước ta bước đầu cũng nghiên cứu các loại nấm kýsinh côn trùng để phòng trừ sâu hại việc nghiên cứu nấm mốc ký sinh trên cơthể côn trùng được phát triển từ những thập niên cuối cùng của thế kỷ XX Cónhiều tác giả đã nghiên cứu về nấm mốc ký sinh trên cơ thể côn trùng và đã cónhiều ứng dụng trong cuộc sống Trong đó nổi bật là các nhà khoa học như TạKim Chỉnh, Vũ Quang Côn, Hà Thị Quyến, Hoa Thị Minh Tú, Phạm ThịThùy

Tạ Kim Chỉnh là tác giả có nhiều đề tài được công bố và đã được ứngdụng như đề tài: "Phân lập các chủng vi nấm thuộc chi Paecilomyces từ nguồnmẫu khác nhau và khả năng diệt côn trùng của chúng", tại Viện Công nghệSinh học năm 1998 Đến năm 1999, tại báo cáo hội nghị Công nghệ sinh học

toàn quốc, Hà Nội, ông công bố "Quy trình sử dụng chế phẩm MA diệt mối vàcôn trùng hại rễ sống trong đất".Sau đó, ông và đồng nghiệp tiếp tục công bốthành công đề tài "Ảnh hưởng của điều kiện bảo quản giống đến đặc tính sinh

học của vi nấm diệt côn trùng Metarhizium anisopliae và Beauveria bassiana.

Hội nghị côn trùng học toàn quốc lần thứ IV, Hà Nội, 12/4-14/4/2002 Năm

2003, ông báo cáo đề tài " nghiên cứu khả năng sinh bào tử của một số chủng

vi nấm diệt côn trùng" tại hội nghị công nghệ sinh học toàn quốc, Hà Nội

Từ 2 chủng Mertahirium anisopliae và Beauveria bassiana phân lập được

với các môi trường nuôi cấy khác nhau, tác giả đã nghiên cứu khả năng hìnhthành bào tử của chủng và thử nghiệm khả năng diệt mối của chủng đó Kếtquả sau 9 ngày, chủng Metarhizium diệt mối với tỷ lệ 100%

Ngoài Tạ Kim Chỉnh thì Phạm Thị Thùy cũng đã có nhiều đề tài nghiêncứu khoa học cấp Nhà nước, cấp Bộ và cấp tỉnh, nghiên cứu sản xuất ra nhiềusản phẩm sinh học như Bacillus thuringiensis, Virus đa diện nhân (NVP.Ha,NPV.SI, NPV.Dp), vi nấm Beauveria và Metarhizium phục vụ cho việc phòngtrừ dịch sâu hại cây trồng, cây rừng theo hướng bảo vệ môi trường sinh thái,đồng thời tạo ra các sản phẩm trong nông nghiệp an toàn và bền vững Với kếtquả nghiên cứu công nghệ sản xuất nấm Metarhizium và vius NPV.Dp, năm

1995, PGS.TS Phạm Thị Thuỳ đã đoạt giải Ba, Giải thưởng Sáng tạo khoa họccông nghệ Việt Nam VIFOTEC về thành tích ứng dụng rộng rãi thuốc trừ sâusinh học virus và vi nấm Metarhazium trừ châu chấu hại ngô mía ở Bà Rịa-Vũng Tàu Năm 1999, khi dịch sâu róm thông bùng phát ở Sơn La và nhiều địa

phương khác, việc sản xuất các chế phẩm nấm, đặc biệt là nấm Beauveria và

Metarhizium không chỉ khống chế được nạn dịch sâu hại thông mà còn manglại hiệu quả kinh tế cao Phòng trừ dịch hại bằng nấm đã tiết kiệm được chi phítrong sản xuất như không phải mua hoá chất bằng ngoại tệ, đặc biệt là giảmcông lao động một cách đáng kể Nếu phun thuốc hoá học thì phải phun 10-15lần/vụ còn phun chế phẩm sinh học nấm chỉ 2-3 lần/vụ, đồng thời giúp bảo vệ

môi trường và sức khoẻ cộng đồng PGS TS Phạm Thị Thùy, Viện Bảo vệ thực

vật đã vinh dự được nhận giải thưởng Kovalevskaia năm 2009 vào ngày

12/03/2010 [4].

Mới đây nhất , trung tâm nghiên cứu phòng trừ mối đã cho ra đời ba chếphẩm Metavina 90DP, Metavina10DP và Metavina 80LS từ Metarhizium cùngthực hiện một mục tiêu diệt trừ mối tận gốc gây độc hại và giá thành lại rất rẻ

so với các phương pháp trước đây

Điển hình như ở Hưng Yên, năm 1993 đã sử dụng nấm xanh để phòng trừsâu đo chỉ sau 7 – 10 ngày hiệu quả khoảng 70 – 89% Tại Tiền Giang, Sóc

Trăng, Bạc Liêu đã sử dụng Metarhizium để phòng trừ rầy nâu, bọ xít, sâu cắn

gié bọ cánh cứng hại dừa đạt hiệu quả cao Năm 2003, Phạm Thị Thùy đã

nghiên cứu thành công đề tài về cải tiến sản xuất chế phẩm Metarhizium để

phòng trừ bọ hại dừa ở các tỉnh thuộc đồng bằng sông Cửu Long.Tại Cần Thơ,

từ năm 2005-2007 đã sử dụng nấm Metarhizium để phòng trị sâu ăn tạp, rầy

mềm đạt hiệu quả khá cao trên 70% sau 7-12 ngày

Vào cuối năm 2006, khi dịch rầy nâu bùng phát khắp nơi tại Đồng BằngSông Cửu Long, gây ra bệnh vàng lùn - lùn xoắn lá đã làm giảm thiệt hại đếnnăng xuất đáng kể của người dân trồng lúa Vì vậy, Tổ Phòng trừ Sinh học của

Bộ môn Bảo vệ Thực vật Trường Đại học Cần Thơ đã được Dự án nâng caoChất lượng Cây trồng Vật nuôi của Tỉnh Sóc Trăng kết hợp với Chi cục Bảo

Vệ Thực Vật Sóc Trăng đã cải tiến và đưa ra quy trình sản xuất chế phẩm nấmxanh từ gạo do chính nông dân sản xuất để phun xịt phòng trị rầy nâu (RN) gâyhại lúa Với diện tích phun xịt hơn 500 ha đã giảm mật số đáng kể của rầy nâutrên ruộng lúa, mặt khác không làm ô nhiễm môi trường, bảo tồn được các loàithiên địch trên ruộng lúa và đem lại kết quả rất khả quan, không gây ô nhiễmmôi trường, không độc hại với người sử dụng và bảo vệ được các loài côn trùng

có ích

Tại tỉnh Nghệ An, chế phẩm vi sinh (E Mt) ban đầu được biết đến với tưcách là một chất ứng dụng để xử lý làm sạch vệ sinh môi trường cho một sốbệnh viện, cơ quan, trường học trên địa bàn Trên cơ sở kết quả nghiên cứu ứng

dụng mới, năm 2004 chế phẩm sinh học được đưa vào ứng dựng sang lĩnh vựcsản xuất nông nghiệp và chăn nuôi Bước đầu, chế phẩm được đưa vào khảonghiệm trên 20 ha lạc ở 4 HTX tiêu biểu thuộc địa bàn 4 huyện trong tỉnh NghệAn: huyện Diễn Châu, Quỳnh Lưu, Nam Đàn, Nghi Lộc Về năng suất, đối vớidiện tích được phun chế phẩm sinh học tăng so với diện tích không phun Tại

xã Quỳnh Thuận, diện tích có phun là 24,28 tạ/ha và không phun chỉ đạt là 20,5tạ/ha; tại xã Diễn Thịnh là 34,6 tạ/ha có phun EMt và 30,1 tạ/ha không phun;

xã Khánh Sơn là 26,75 tạ/ha và 23,9 tạ/ha; xã Nghi Thịnh là 36,55 tạ/ ha và33,73 tạ/ha Tương ứng với tỷ lệ năng suất trên, tỷ lệ số cành và quả giữa câytrên diện tích có phun và không phun chế phẩm cũng có sự chênh lệch tăngđáng kể Kết quả, đến nay chế phẩm vi sinh đã được sử dụng rộng ở các địabàn huyện, trong đáng chú ý là vùng diện tích thâm canh lạc lớn như QuỳnhLưu, Diễn Châu, Nghi Lộc Không những vậy còn được thử nghiệm sang câyvừng và đậu tương ở Nam Đàn, Thanh Chương

Mới đây nhất, chế phẩm sinh học còn được ứng dụng vào thử nghiệm xử

lý bệnh dịch vàng lùn xoắn lá hại cây lúa ở tỉnh Nghệ An và cho kết quả rấttốt, góp phần đẩy lùi dịch bệnh này ở cây lúa, được các nhà chuyên mônthuộc Sở Nông nghiệp & PTNT ghi nhận, đánh giá cao (Theo Báo điện tửĐảng Cộng Sản Việt Nam)[1]

Với những thành tựu trong việc nghiên cứu và ứng dụng của chủng nấm

Metarhizium trong diệt sâu bọ hại cây trồng tại Việt Nam cho thấy một hướng

đi mới trong công tác phòng và tiêu diệt côn trùng có hại, nhằm thay thế thuốctrừ sâu hóa học hiện nay

1.2 Tác hại của sâu hại trong sản xuất nông nghiệp

Dịch hại, nhất là sâu ảnh hưởng đến nhiều mặt trong sản xuất nông nghiệp,chủ yếu làm giảm số lượng cây trồng, chất lượng sản phẩm và thẩm mỹ nông sản

- Số lượng: theo thống kê tổ chức FAO

Mức độ thiệt hại do sâu hại gây ra trên toàn thế giới 35% tổng số lượngnông nghiệp, thiệt hại trung bình khoảng 20% tổng sản lượng trồng trọt [9]

- Chất lượng nông sản: Nhiều loài sâu hại gây nên những ảnh hưởngxấu tới nông sản sau khi thu hoạch và cất giữ: Làm giảm giá trị dinh dưỡngtrong sản phẩm, giảm tỷ lệ nảy mầm và sức sống của hạt, dể lại độc tố trongsản phẩm.

- Thẩm mỹ nông sản: ảnh hưởng tới sự đồng đều của nông sản, ảnhhưởng hình thái, màu sắc của nông sản

Ngoài ra còn làm thay đổi theo chiều hướng xấu các thành phần sinh vật

1.3 Đặc điểm của chủng nấm Metarhizium anisopliae

1.3.1 Đặc điểm phân loại và hình thái của Metarhizium anisopliae

- Phân loại:

Theo Huang B., Li C., Humber RA, Hodge KT, Fan M and Li Z (2005)

[20]: trên cơ sở phân tích ADN, tỷ lệ % G + X, nấm Metarhizium anisopliae

Loài : Metarhizium anisopliae

Nấm Metarhizium anisopliae có màu xanh nên ở nước ta gọi là nấm lục

cương (nấm xanh) Trên thế giới nhiều nước đã sản xuất thành chế phẩm vớitên thương mại là Metaquino (Anh, Mỹ) Ở Việt Nam tên là: Mat (nấm Ma).Đến nay người ta thấy có 2 loài nấm chính gây bệnh trên côn trùng đó là :

Metarhizium anisopliae (Ma) và Metarhizium flavoviride (Mf) Trong đó:

- Metarhizium anisopliae (Ma): gây bệnh hơn 200 loài côn trùng dịch hại, bao

gồm mối, bọ trĩ, châu chấu, cào cào, bọ hại dừa, bọ xít, rầy nâu và nhiều sâunon thuộc họ ngài đêm thuộc bộ cánh vẩy.[18]

- Đặc điểm hình thái của Metarhizium anisopliae

Sợi nấm phát triển trong cơ thể rầy nâu và mọc dày đặc trên bề mặt cơ thểrầy Sợi nấm và bào tử lúc đầu có màu trắng sau đó chuyển sang màu xanh Sợinấm phân nhánh, có nhiều vết ngăn ngang, bề rộng 3-4mm, trong tế bào sợinấm có nhiều giọt mỡ (thấy óng ánh dưới kính hiển vi) Cành bào tử phân sinhmọc trên đám sợi dày đặc, thẳng hoặc hơi cong, màu lục nhạt, khi già kéo dài

ra, mảnh, có màu xám nhạt Cành bào tử phân sinh có vách ngăn ngang, nhẵn,phân nhánh cấp 1-2, ở phần ngọn hình thành một lớp dày gồm các thể bình ởđỉnh các nhánh Thể bình mọc đối hoặc vòng Cuống đính bào tử ngắn Bào tửtrần, hình cổ chai, hình trụ, hình que, một tế bào, kích thước khoảng 3,5 đến 6,4micromet Bào tử có màu xanh lục hoặc màu xám, thường đứng riêng rẽ và kếtthành chuỗi dài, dính kết vào nhau tạo thành lớp phấn màu lục trên bề mặt cơthể rầy nâu

1.3.2 Cơ chế tác động gây bệnh cho côn trùng của nấm Metarhizium anisopliae

- Độc tố của Metarhizium anisopliae

Đó là các ngoại độc tố: Dextruxin A,B,C,D Tập trung chủ yếu ở 2 loại là :Dex A,B

Dextruxin A có công thức nguyên là : C29H47O7N5 có điểm sôi là : 1880C.Dextruxin B có công thức nguyên là : C30H51O7N5 có điểm sôi là 2340C.Y.Kodairo (1961 - 1962) [21] đã tách được 2 chất này

Tác nhân gây bệnh của nấm Metarhizium anisopliae chính là một số ngoại

độc tố Dextruxin A,B,C,D

- Cơ chế tác động gây bệnh cho côn trùng của nấm Metarhizium

anisopliae

Nấm Metarhizium anisopliae gây hại cho bọ rầy, bọ xít và bọ rùa Bào tử

nấm rơi trên cơ thể côn trùng và khi độ ẩm cao kéo dài, bào tử nấm nảy mầm

và mọc vào trong cơ thể côn trùng Metarhizium có thể giải phóng các bào tử

(conidia) trong điều kiện độ ẩm thấp (<50%) Ngoài ra, Metarhizium

anisopliae có thể có được dinh dưỡng từ lipid trên lớp da ngoài này Các loại

nấm cũng có thể sản xuất chất chuyển hóa thứ cấp, như destruxin

Nấm phát triển bên trong cơ thể côn trùng ký chủ và ăn chất bổ của cơthể côn trùng Sau khi thâm nhập các bộ xương ngoài của côn trùng, họ pháttriển nhanh chóng côn trùng bên trong, gây ra các côn trùng chết Côn trùng mà

tiếp xúc với côn trùng bị nhiễm cũng bị nhiễm Metarhizium anisopliae Nó có

thể lây nhiễm ấu trùng và con trưởng thành của nhiều loại côn trùng, nhưng chủyếu lây nhiễm ấu trùng bọ cánh cứng vì con trưởng thành có một bộ xươngngoài mạnh mẽ Khi côn trùng chết, nấm xuất hiện lúc đầu thành một lớp trắng

ở những chỗ nối giữa các đốt ở cơ thể côn trùng ) Biểu bì của xác côn trùngthường trở nên đỏ Nếu ẩm độ xung quanh đủ cao, một mốc trắng phát triển xác côntrùng chẳng bao lâu chuyển sang xanh như những bào tử được sản sinh ra.[16]

Ví dụ như trên thân bọ xít khi hình thành bào tử, nếu là nấm M.anisoplae,chúng sẽ chuyển thành màu xanh lục đậm

Bào tử xuất hiện từ ký chủ đã chết sang ký chủ mới qua gió hoặc nước.Ngoài ra, côn trùng có thể thoát khỏi nhiễm nấm M.anisoplae nhanh chóngtrước khi nấm có thể xâm nhập vào lớp da ngoài do sản xuất chất độc khángnấm, có thể ức chế sự nảy mầm của bào tử

1.3.3 Những bệnh lý biểu hiện ở côn trùng bị nấm mốc ký sinh tiêu diệt

Trước thực trạng côn trùng phá hoại cây xanh, nhiều nhà khoa học trên thếgiới đã nghiên cứu tìm ra biện pháp diệt côn trùng Qua nhiều nghiên cứu củanhiều nhà khoa học trên thế giới, người ta đã phát hiện ra hiện tượng côn trùng

bị nấm mốc ký sinh trên nó tiêu diệt Nó ảnh hưởng lên mô, lên các cơ quan vàchức năng sinh lý của côn trùng

Từ những hiên tượng nấm phá hủy chức năng sinh lý của côn trùng, cácnhà nghiên cứu đã cho biết độc tố của nấm đã làm đình chỉ sự dinh dưỡng củacôn trùng, gây hiện tượng tê liệt, làm giảm độ mắn đẻ, phá hủy quá trình hôhấp, chèn ép cơ học sự tuần hoàn máu, phát triển và sinh sản các thể sợi nấmtrong xoang thân côn trùng

- Ảnh hưởng của nấm lên sự mắn đẻ của côn trùng

Các nhà khoa học đã cho nhộng hay con cái ở bộ cánh cứng nhiễm nấmthì thấy độ mắn đẻ của côn trùng giảm đáng kể Theo số liêu của SekhrinaT.A (1960) các con cái ở bộ Chelonia khi xử lý Boverin số lượng trứng giảmhơn đối chứng 41,3% trong điều kiện phòng thí nghiệm và ở ngoài đồng là3,3% Ảnh hưởng đặc biệt của nấm lên trứng của côn trùng Qua nghiên cứu,các tác giả trên thế giới thấy rằng trứng ở giai đoạn non của sự phát triển bàothai sẽ mẫn cảm cao hơn với nấm Gamper N.M.etal (1986)

- Ảnh hưởng của nấm lên giai đoạn ấu trùng của côn trùng

Prasertphon S (1997) đã thông báo độc tố được tạo thành ở một số nấmEntomophthora: E.apculata, E.cornata khi tiêm vào xoang cơ thể nhộng

Galleria mellonella ức chế quá trình biến thái

Kể từ tháng 7/2002 đến tháng 6/2003 Viện BVTV đã phối hợp với Chicục BVTV tỉnh Bình Định nghiên cứu ứng dụng chế phẩm nấm Metarhiziumanisopliae do Viện BVTV sản xuất để phòng trừ bọ cánh cứng hại dừa Số

liệu thử nghiệm chỉ sau 7 ngày phun nấm Metarhizium anisopliae tại Cát Lâm

huyện Phù Cát đạt hiệu lực 50,4% với sâu non, với trưởng thành đạt 50,2%,tại Mỹ Châu huyện Phù Mỹ hiệu lực với sâu non đạt 55,6%, trưởng thành đạt53,9%, và tại xã Hoài Hảo - huyện Hoài Nhơn có hiệu lực cao hơn cả là59,5% với sâu non, trưởng thành chỉ đạt 52,3%.[12]

- Ảnh hưởng của nấm đến sự hấp thụ oxy của côn trùng

Bệnh lý của côn trùng bị nhiễm cũng giống như ở các động vật có xươngsống, một trong những dấu hiệu chủ yếu của bệnh là sự biến đổi sự hô hấp.Trong công trình nghiên cứu của Sussman A (1992) cho biết nhộng bị nhiễmnấm chỉ ít lâu sau sự hấp thụ oxy của chúng đã tăng lên 7 lần Đã có giả thiếtcho rằng côn trùng bị chết do các khí quản và lỗ thở bị phá hủa trực tiếp haybằng cách phá hủy hệ thần kinh

- Bệnh lý mô học

Sự tấn công của nấm gây bệnh vào vật chủ có thể là được thực hiện bằng

sự xâm nhập trực tiếp qua vỏ, qua thành ống tiêu hóa, qua lỗ thở hay chỗ bịthương ở vỏ cuticun Các nấm diệt sâu xâm nhập vào cơ thể côn trùng quatoàn bộ vỏ cuticun ngoài Sự xâm nhập của nấm diệt sâu qua lớp cuticunngoài thực hiện bằng lực cơ học, khi tiến sâu vào lớp cuticun trong là nhờ vaitrò chủ yếu của hoạt động enzim do nấm tiết ra Ngoài tiết enzim các nấm còntiết ra độc tố trực tiếp vào huyết tương trong quá trình sinh sản Theo nghiên

cứu của Hajek and St Leger, 1994, Metarhizium anisopliae có khả năng nảy

mầm trên vỏ kitin của cơ thể côn trùng, có hệ sợi xâm nhập và bên trong cơthể vừa hút dinh dưỡng vừa thải chất độc và làm chết côn trùng (con mối) sau12h đến 28h Sau khi xâm nhiễm, gây bệnh cho côn trùng, chúng lại sinh racác bào tử, sợi nấm Các bào tử và sợi nấm lại có thể lây nhiễm sang các cáthể mối khác

Ngoài ra, nấm còn ảnh hưởng của đến trọng lượng, màu sắc côn trùng

1.3.4 Vai trò của nấm ký sinh trên côn trùng trong tự nhiên

Trong quá trình nghiên cứu nấm mốc ký sinh trên côn trùng thì vai tròtrấn át những dịch sinh sản lớn do sôn trùng gây hại ở các nấm diệt côn trùng

đã được trình bày rất rõ ràng trên nhiều công trình của nhiều tác giả trên thếgiới (V.paspelov 1932 - 1940, Dusky S.R.1959, Hall I.M.1964, Tanda 1959 -1964 ) E.A.Steinhaus (1949) cho biết các nấm diệt sâu ở trong thiên nhiênchưa cần đến con người đã làm được nhiệm vụ điều hòa và tiêu diệt một lượnglớn côn trùng gây hại Chúng không những có tác dụng hiệu quả tốt diệt sâu hại

mà cò thực sự là nhân tố kiểm soát điều hòa tự nhiên rất độc đáo [7]

Theo thông báo của Riekfora R và Reigrt P.W (1964)bệnh dịch nấm

tự nhiên do E.glylli đã làm giảm tới 99% số lượng quần thể châu chấu ởphía tây Canada vào năm 1963 Smirnoff W.A (1956) đã thông báo một tin

lý thú về sự nhiễm nấm Fusarium sp với côn trùng thuộc họ Diaspididea ởMaroc làm chết 90 - 95% cá thể trong quần thể của Leppi do Saphse beckivMewn Và L.gloveri paclc Bệnh dịch nấm phát triển được ngoài điều kiện

thời tiết thuận lợi còn cần nhiều yếu tố mật độ côn trùng cao và nhiều loại

ký sinh của chúng yếu

Bên cạnh đó có thể sự dụng các số liệu về dịch côn trùng hại do nấm gây

ra để dự đoán các dịch sinh sản lớn của côn trùng V.P.Poslennov (1932) làngười đầu tiên đã thí nghiệm sử dụng các số liệu về côn trùng bị nhiễm nấm

để dự đoán số liệu của chúng [7] E.G.Woronin (1966) nghiên cứu nấmEntomophthoraceae trên cây họ đậu ở Leningrad đã chỉ ra rằng trong mùa thu,các ổ trứng của rệp cây đậu bị bệnh do nấm này sẽ dẫn tới sự giảm số lượngquần thể rệp ngay trong tháng đầu tiên của vụ mùa sau Từ đó ông thấy rằngviệc thống kê số liệu rệp cây bị bệnh vào thời kỳ mùa thu là rất quan trọngcho việc dự báo sâu bệnh mùa vụ sau [7]

1.4 Đánh giá thuốc trừ sâu sinh học

Từ trước đến nay, sâu hại luôn là mối đe doạ của nhiều loại cây trồngtrong nông nghiệp.Thậm chí có nhừng thời điểm sâu hại cây trồng đã phát sinhthành một trận dịch lớn làm ảnh hưởng đến năng suất cây trồng Điển hình một

số trận dịch lớn xảy ra trên cây ngô ở Hà Giang vào năm 1991 làm giảm 60%sản lượng thu hoạch Việc tiêu diệt sâu hại cây trồng đã có từ lâu đời Từphương pháp thủ công như nhặt sâu cho đến việc ra đời thuốc trừ sâu hoá học

và ngày nay tiến bộ hơn là thuốc trừ sâu vi sinh Loại này được đưa vào nước ta

từ đầu những năm 1970 với số lượng rất ít

Thuốc trừ sâu vi sinh là những chế phẩm sinh học được sản xuất ra từ cácchủng vi sinh vật được nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng khác nhau theophương pháp thủ công, bán thủ công hoặc phương pháp lên men công nghiệp

để tạo ra những chế phẩm có chất lượng cao có khả năng phòng trừ được cácloại sâu hại cây trồng nông, lâm nghiệp

1.4.1 Ưu điểm của thuốc trừ sâu sinh học

Để hạn chế tác hại của sâu bệnh, bảo vệ môi trường cũng như sức khoẻcon người, thuốc trừ sâu sinh học được coi là một biện pháp đầy tính khả thi.Việc sử dụng thuốc trừ sâu hóa học đã gây tác hại rất lớn như làm phá huỷ môi

trường, tác động xấu đến sức khoẻ người dân; tiêu diệt đi một số nguồn sinh vật

có lợi cho con người như chim chóc, tôm cá… và làm mất những ký sinh thiênđịch như bọ rùa, ong ký sinh, các nguồn vi sinh vật khác như nấm, virus, tuyếntrùng…Vì vậy, việc sử dụng thuốc trừ sâu vi sinh thay thế thuốc trừ sâu hóahọc là giải pháp tích cực cho một nền nông nghiệp sạch, thân thiện với môitrường Thuốc trừ sâu sinh học có những ưu điểm sau:

- Không độc hại cho người và gia súc, không nhiễm bẩn môi trường sống,không ô nhiễm môi trường Cục Bảo vệ Môi trường Hoa kỳ (US EnvironmentalPrôtection Agency US-EPA) đã triển khai những đánh giá độc tố và thậm chícác protein Bt đã được thử ở liều lượng cao hơn Theo Extension ToxicologyNetwork (Extoxnet), các dự án về thông tin TTS ở một số trường đại học củaHoa kỳ cho thấy “Kết quả cuộc thử nghiệm trên 18 người mỗi ngày ăn 1 gram

Bt thương mại trong vòng 5 ngày, và trong các ngày khác nhau… không gây rachứng bệnh gì Những người ăn 1 gram Bt/ngày trong 3 ngày liên tục hoàn toànkhông bị ngộ độc hay nhiễm bệnh” Hơn nữa, ở mức phân tử protein nhanhchóng bị phân hủy bởi dịch vị dạ dày (trong điều kiện phòng thí nghiệm)(Extoxnet, 1996)

- Chưa tạo nên tính kháng thuốc của sâu hại

- Không ảnh hưởng đến chất lượng, phẩm chất nông sản, không ảnh hưởngđến đất trồng, không khí trong môi trường (do không để lại dư lượng)

- Không làm mất đi những nguồn tài nguyên sinh vật có ích như các loại

ký sinh thiên dịch và những vi sinh vật có lợi với con người

- Nếu sử dụng hợp lý, đúng phương pháp, đúng kỹ thuật trong điều kiệnnhiệt độ thích hợp sẽ mang lại hiệu quả kinh tế cao

- Hiệu quả thuốc vi sinh thường kéo dài vì chúng không chỉ tiêu diệt trực

tiếp lứa sâu đang phá hoại mà chúng còn có thể lan truyền cho thế hệ tiếp theo

ếu phun thuốc hoá học thì phải phun 10-15 lần/vụ còn phun chế phẩm sinhhọc nấm chỉ 2-3 lần/vụ

1.4.2 Nhược điểm của thuốc trừ sâu sinh học

- Tác động của thuốc trừ sâu vi sinh chậm nên hiệu quả chậm bởi vì thuốctrừ sâu vi sinh thường có quá trình gây bệnh và nhiễm bệnh khi vào cơ thể sâuthì thời gian ủ bệnh phải mất 1-3 ngày.

- Hiệu quả của thuốc ban đầu không cao do không xác định được mật độ

vi sinh vật

- Một vài loại thuốc trừ sâu vi sinh bị ảnh hưởng bởi điều kiện thời tiết nếunhư phun không đúng kỹ thuật, phun trong điều kiện không thích hợp sẽ khóđạt hiệu quả

- Khó cân đong ngoài đồng ruộng, thời gian bảo quản ngắn, thường 1 - 2năm, trong những điều kiện lạnh, khô

- Giá thành một chế phẩm thuốc trừ sâu sinh học hiện còn khá cao so vớithuốc trừ sâu hoá học, khoảng 60.000 đồng/kg chế phẩm, chưa phù hợp với sứcmua của người nông dân Sở dĩ giá thành chế phẩm vẫn còn cao, nguyên nhânchính là do công nghệ sản xuất của nước ta vẫn còn làm phương pháp thủ công,chưa có sự hỗ trợ của các thiết bị máy móc hiện đại Hiện Viện Bảo vệ thực vậtđang tiếp tục nghiên cứu để hạ giá thành sản xuất và sớm ứng dụng đại trà

- Tập quán, thói quen dùng thuốc trừ sâu sinh học của người dân chưa cao,chưa phổ biến.Từ hạn chế về tuyên truyền và phố biến kiến thức, người nôngdân chỉ mong muốn thuốc trừ sâu phải có hiệu quả tức thời và sử dụng thuậntiện, nên ít quan tâm đến các chế phẩm thuốc trừ sâu sinh học

1.5 Chế phẩm trừ sâu sinh học từ nấm Metarhizium

Chủng nấm Metarhizium phân lập từ nhiều loài sâu hại cây trồng là chủng

có có hiệu lực cao đối với sâu hại, đã được tuyển chọn để sản xuất ra chế phẩm

nấm xanh, chủ yếu là Metarhizium anisopliae Một số chế phẩm sinh học của nấm Metarhizium đang được sử dụng rộng rãi như:

M.a (OM2 – B) đã được đưa vào danh mục thuốc bảo vệ thực vật, với tênthương mại là Ometar, được phép sử dụng ở Việt Nam theo quyết định số63/2003/QĐ-BNN ngày 27 tháng 05 năm 2003 của Bộ Trưởng Bộ Nôngnghiệp và PTNT.Chế phẩm M.a (OM2– B) có hiệu lực rất cao đối với các loài

bọ cánh cứng, rầy, bọ xít hại cây trồng và có hiệu lực tương đối khá đối với càocào, mối và một số sâu ăn lá khác.

Sau khi phun 7 ngày, hiệu lực diệt trừ bọ cánh cứng hại dừa của M.a (OM2 – B) đạt từ 68 tới 89%, hiệu lực diệt trừ các loài rầy đạt từ 73,5 tới91,5% và hiệu lực trừ bọ xít hại cây trồng là từ 73-88% (tùy theo điều kiệnnhiệt, ẩm độ của từng vụ, từng vùng và trên từng cây trồng khác nhau) Chếphẩm nấm xanh có hiệu lực bền lâu và kéo dài tới hàng tháng sau khi phun.Chế phẩm M.a

(OM2 – B) có hiệu lực ổn định đối với sâu hại sau 8 tháng bảo quản ởnhiệt, ẩm độ bình thường Chế phẩm nấm xanh không gây ảnh hưởng xấu tớithiên địch của sâu hại, con người, gia súc và môi trường [18]

Chế phẩm nấm xanh, M.a (OM2 – B) đã được ứng dụng trên 650 ha câytrồng (lúa, ngô, lạc, cây ăn trái, nho, trà) và 7000 cây dừa Theo kết quả ghinhận được từ các địa phương thì chế phẩm này đã đạt hiệu quả cao trong việcquản lý các loài sâu, rầy hại lúa; sâu, rầy hại trà; mối và các loài sâu hại cây ăntrái, khi ứng dụng vào các mô hình sản xuất lúa sạch, trà sạch, nho sạch và tráicây an toàn tại ĐBSCL và một số tỉnh khác

Đặc biệt, chế phẩm nấm xanh còn có hiệu quả cao khi ứng dụng để trừ sâukhoang, bọ cánh cứng, cào cào, châu chấu, một loài côn trùng nguy hại nhất đốivới cây lạc hiện nay Tuy ở Việt Nam chưa có thói quen sử dụng nhiều chếphẩm nấm diệt sâu hại nhưng người ta vẫn luôn đánh giá cao Nhiều công trìnhnghiên cứu về chủng nấm Metarhizium anisopliae (MA) thành công và đượcứng dụng rộng rãi trong thực tiễn sản xuất Nhóm nghiên cứu về đã giành đượcnhiều giải thưởng khoa học Năm 1995, PGS.TS Phạm Thị Thuỳ đã đoạt giải

Ba, Giải thưởng Sáng tạo khoa học công nghệ Việt Nam VIFOTEC về thànhtích ứng dụng rộng rãi thuốc trừ sâu sinh học virus và vi nấm Metarhazium trừchâu chấu hại ngô mía ở Bà Rịa- Vũng Tàu Năm 2006, Phạm Thị Thùy vàđồng nghiệp bảo vệ thành công đề tài 'Nghiên cứu tuyển chọn chủng nấm

Metarhizium anisopliae (MA) trên bọ cánh cứng hại dừa ở 12 tỉnh đồng bằng

sông Cửu Long" Với nhiều công trình nghiên cứu về chủng nấm Metarhizium

anisopliae, bà tiếp tục nhận giải thưởng Kovalevskaia năm 2009 vào ngày

12/03/2010 Ngày 1/4/2006, đề tài “Nghiên cứu công nghệ sản xuất chế phẩm

nấm Metarhizium anisopliae sorok để ứng dụng phòng trừ sâu hại cây trồng”

của sinh viên Đại học Phương Đông - Lê Thùy Quyên - nhận giải nhất

Vifotec 2006 Ngày 6/1/2007, công trình này lại đạt giải thưởng sinh viên

nghiên cứu khoa học (Bộ GD-ĐT) Đây là công trình duy nhất đạt giải được

đề nghị Tổ chức Sở hữu trí tuệ thế giới (WIPO) trao tặng huy chương vàng.Năm 2009, từ chủng nấm xanh và nấm trắng, Tiến sĩ Nguyễn Thị Lộc -Trưởng Bộ môn Phòng trừ sinh học thuộc Viện lúa Đồng bằng sông CửuLong và cộng sự đã nghiên cứu, ứng dụng thành công hai chủng nấm xanh

và trắng đã cho ra đời hai chế phẩm sinh học là Ometar (nấm xanh) vàBiovip (nấm trắng) ứng dụng rộng rãi trừ sâu, rầy hại lúa tại Cần Thơ, AnGiang, Sóc Trăng, Trà Vinh, Tiền Giang

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG, THỜI GIAN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN

CỨU

2.1 Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

- Chủng nấm Metarhizium anisoplieae trên côn trùng hại lạc thu thập được

tại một số ruộng lạc ở xã Nghi Trung - Nghi Lộc - Nghệ An

- Các loại côn trùng như cào cào, châu chấu, sâu róm, sâu khoang, sâuxanh, sâu cuốn lá tại Nghi Trung - Nghi Lộc - Nghệ An

2.1.2 Địa điểm nghiên cứu

- Mẫu côn trùng thu ở ruộng lạc tại xã Nghi Trung - Nghi Lộc - Nghệ An

- Phân lập và nghiên cứu tại phòng thí nghiệm Di truyền - Vi sinh, đại họcVinh

2.1.3 Thời gian nghiên cứu

- Thu thập số liệu từ tháng 9/2009 đến tháng 3/2010

- Xử lý và hoàn thành luận văn từ tháng 4/2010 đến tháng 5/2010

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp điều tra thực địa

- Địa điểm thu mẫu là ruộng lạc tại xã Nghi Trung - Nghi Lộc - Nghệ An

- Trao đổi với bà con nông dân làm lạc khu vực điều ra, tìm hiểu tình hìnhsản xuất lạc tại địa phương về quy mô, biện pháp kĩ thuật phòng trừ sâu hạilạc

- Điều tra tình hình sâu trên ruộng lạc

- Để phát hiện chính xác, đánh giá được mức độ sâu hại ở ruộng lạc phảitiến hành điều tra quan sát từ xa đến gần theo một trình tự nhất định như sau:+ Giống lạc và giai đoạn sinh trưởng, phát triển nào của cây lạc

+ Các hiện tượng sâu bệnh, tình hình sâu bệnh qua hình dạng các vết ăn ởmức độ nhiều hay ít

+ Tiến hành thu mẫu định tính trên các ô tiêu chuẩn diện tích 1m2, các ôtiêu chuẩn lấy theo đường chéo góc (5 ô/ruộng) Phải bắt, đếm, sau đó tổng hợp

các loại sâu, đẻ phân tích, tính toán,phân biệt mỗi loại( phần trăm, hoặc mật độcon/m2 ) và tìm các loại sâu chủ yếu trong thời kì sinh trưởng của lạc.

* Chú ý: Để đạt hiêu quả cao cần quan sát các hoạt động của sâu ở các giaiđoạn con trưởng thành, trứng, nhộng, ấu trùng

2.2.2 Phương pháp thu mẫu sâu

- Thu lượm xác các loại sâu bị nhiễm nấm trên ruộng lạc

- Bắt các loại sâu trên cây lạc

- Mẫu thu được cho vào túi nilon vô trùng, đánh dấu ngày thu mẫu

2.2.3 Phương pháp phân lập nấm

- Phân lập nấm trên xác sâu bị chết ngoài tự nhiên:

+ Đưa xác sâu về phòng thí nghiệm

+ Nấm được tạo thuần khiết bằng phương pháp nuôi cấy đơn bào tử trênmôi trường Czapeck bằng kĩ thuật hộp trải và nuôi in vitro

* Thành phần môi trường Czapeck gồm có:

- Đặt đĩa petri vào tủ ấm ở 300C (gói bao etylen hoặc giấy báo) đến khinấm mọc, phân lập và bảo quản trong tủ lạnh

- Phân lập nấm từ sâu hại lạc

- Từ mẫu xác sâu (khoảng 20 con sâu bất kì chết có nấm trong khoảng 50mẫu thu được) khử trùng bằng cồn 70% (2 phút) để loại bỏ bớt vi sinh vật ởphía ngoài, sau đó bỏ vào bình tam giác 250ml.

- Mỗi mẫu bỏ trong các ống nghiệm riêng đã được khử trùng và dùng cácđũa thuỷ tinh riêng biệt (đã được khử trùng) cho từng mẫu và nghiền nát, sau đó bổsung một ít nước cất, lắc đều liên tục trong 10 phút, để lắng trong vòng 30 phút,chắt lọc lấy dịch ta được dung dịch huyền phù chuẩn bị cho thí nghiệm

- Lấy 0,1 ml dịch huyền phù bằng pipet vô trùng vào đĩa petri chứa môi trườngthạch Czapeck Dùng que trang đã khử trùng trang đều trên bề mặt đĩa petri

- Đặt đĩa petri có gói giấy báo vào tủ ấm ở 300C trong 5 ngày sau đó mô tảđăc điểm khuẩn lạc và đặt tên cho từng chủng nấm có trên đĩa thạch

- Lựa chọn khuẩn lạc điển hình tiếp tục cấy ria và làm sạch chủng

- Cấy chuyền sang ống thạch nghiêng có chứa môi trường Czapeck, ghinhãn bảo quản trong tủ lạnh

* Để đạt kết quả cao cần tiến hành phân lập với 3 đến 5 lần lặp lại, từ đólựa chọn chủng điển hình

2.2.4 Xác định số lượng bào tử chủng nấm Metarhizium anisopliae bằng phương pháp CFU (colony forming unit) và độ đo đục (Nephelometer).

Mẫu nấm được nuôi sau 14 ngày trong ống nghiệm (lúc đã tạo thành rấtnhiều bào tử) đem pha loãng thập phân thành dung dịch huyền phù từ 10-1 đến

10-7chuẩn bị cho thí nghiệm

Có nhiều phương pháp để định lượng vi sinh vật trong đó phương phápđếm số lượng khuẩn lạc trên môi trường đặc ở hộp petri là một phương phápphổ biến Theo quy định của Việt Nam và quốc tế (tổ chức kiểm định quốc tế

về dược phẩm- FDA- Food and Drug Administration)

Số lượng tế bào vi sinh vật có trong 1g đất hay 1ml được biểu thị bằng đơn

vị CFU/g( hay CFU/ml) là số khuẩn lạc được hình thành từ một cơ thể vi sinhvật (tế bào ban đầu trong môi trường nuôi cấy trong điều kiện phù hợp mà mắtthường khó có thể quan sát được)

Cùng với phương pháp CFU, chúng tôi sử dụng phương pháp hóa lý nhưphương pháp đo độ đục (Nephlometer) với máy Turbidity/Nephlometer của

Mỹ, từ đó tính ra đơn vị NTU ( Nephlo Turbidity Unit) tương ứng với số bào tử(đã biết theo phương pháp CFU) để kiểm tra nhanh hơn chính xác hơn

Đếm số lọc khuẩn ở các độ pha loãng thập phân 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5,

10-6, 10-7 và mỗi độ pha loãng lặp lại 3 lần

Tính kết quả:

Đếm tất cả các số khuẩn lạc trên đĩa sau khi nuôi (7 ngày) Chọn các đĩa

có số khuẩn lạc 30- 50 để tính kết quả (đối với nấm mốc theo quy định củaFDA- Food and Drug Asministration)

Mật độ tổng số nấm mốc trong 1g hay 1ml mẫu được tính như sau:

Mi (CFU/ml ) = Ai * Di/VTrong đó:

Mi: Mật độ tế bào nấm (CFU) trên 1g hay 1ml mẫu

Ai: tổng số khuẩn lạc trung bình đếm được trên các đĩa đã chọn

V: thể tích vật mẫu (ml) cấy vào trong đĩa

Di : độ pha loãng tương ứng

Phương pháp này có thể được mô tả ở hình dưới đây như sau:

Mẫu 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5

2.2.5 Phương pháp quan sát trên chủng nấm Metarhizium anisopliae tiêu bản cố định

Quan sát tiêu bản cố định là một phương pháp phổ biến trong nghiên cứu

vi sinh vật để nghiên cứu cấu tạo tế bào của chúng và xác định các nhóm visinh vật

a Các bước tiến hành:

+ Cố định vi sinh vật trên đèn cồn hoặc dùng tia tử ngoại.

+ Cách nhuộm: Nhuộm đơn và nhuộm kép

+ Quan sát các tiêu bản sống và tiêu bản cố định ở vật kính X40 và X100

2.2.6 Phương pháp xác định sinh trưởng theo Blachman

- Sinh trưởng của nấm (sinh trưởng tương đối)

100%

d

D d P

d



Trong đó:

d: số đo đường kính khuẩn lạc lần đầu ( mm )

D: số đo đường kính khuẩn lạc lần sau ( mm )

t1 - t0 : khoảng thời gian giữa 2 lần đo (h)

2.2.7 Phương pháp tìm hiểu ảnh hưởng nhiệt độ đến sự sinh trưởng và phát triển của chủng Metarhizium anisoplieae

- Chủng Metarhizium anisoplieae được nuôi cấy trong đĩa petri và nuôi

trong tủ ấm, điều chỉnh nhiệt độ ở 200C, 300C, 400C, 500C Đo đường kínhkhuẩn lạc bằng micrometer từ khi xuất hiện đến ngày thứ 3 và tính tốc độ sinhtrưởng của mỗi chủng nấm ứng với mỗi mức nhiệt độ tương ứng theoBlachman (1981)

2.2.8 Phương pháp tìm hiểu ảnh hưởng độ ẩm đến sự sinh trưởng và phát triển của chủng Metarhizium anisoplieae

- Chủng nấm Metarhizium anisoplieae được nuôi trong đĩa petri ở các độ

ẩm: 25%, 50%, 70% và 100% Các đĩa này được đặt trong tủ sinh trưởngGrowth Cabinet (do hãng Conthern sản xuất) và điều chỉnh độ ẩm thích hợp

Đo đường kính khuẩn lạc đến ngày thứ 3 Sau đó tính tốc độ sinh trưởng củamỗi chủng theo Bachman (1981)

2.2.9 Phương pháp tìm hiểu ảnh hưởng độ pH đến sự sinh trưởng và phát triển của chủng Metarhizium anisoplieae

- Chủng nấm Metarhizium anisoplieae được nuôi trên môi trường Czapeck

có pH bằng 3, 4, 5, 6, 7 Đo đưòng kính khuẩn lạc của chủng Metarhizium

anisoplieae từ khi xuất hiện đến ngày thứ 3 ở các độ pH từ đó xác định tốc độ

sinh trưởng của mỗi chủng theo Blachman (1981)

2.2.10 Thử nghiệm ảnh hưởng của chủng nấm Metarhizium anisoplieae đến đời sống của sâu hại lạc

- Thu thập các mẫu sâu hại lạc ở xã Nghi Trung – Nghi Lộc – Nghệ An, các cáthể được lựa chọn có sức khỏe bình thường, chiều dài trung bình khoảng 2 cm

- Chuẩn bị giống nấm: Các chủng nấm được nuôi sau 7 ngày ở 300C, sau

đó gạt lấy toàn bộ hệ sợi và bào tử nấm Lấy 0,1g mỗi mật độ từ 10-1 đến 10-7

của chủng vào 100ml nước cất ta được dịch huyền phù chuẩn bị cho thínghiệm

- Tiến hành thí nghiệm:

* Lô nhiễm nấm:

+ Chủng nấm được lựa chọn cho thí nghiệm ở các mật độ 10-1, 10-2, 10-3,

10-4, 10-5, 10-6, 10-7

+ Số sâu hại lạc dùng cho thí nghiệm được chia thành 7 lô và đánh dấu thứ

tự 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7 Mỗi lô khoảng 20 con được nuôi vào đĩapetri có phủ vải màn Thức ăn cho sâu là lá lạc còn tươi Sau 2 ngày thay lá lạcmới cho sâu 1 lần

+ Phun dịch huyền phù có chứa nấm lên các đĩa petri đã đựng sâu

+ Kiểm tra tình hình sức khỏe của sâu trong mỗi lô, tỷ lệ sâu chết từ ngàythứ nhất đến khi chết hết.

* Lô đối chứng:

- Tiến hành làm tương tự đối với một đĩa petri đựng sâu nhưng khôngphun nấm