Bước đầu nghiên cứu vi khuẩn hiếu khí trong bùn đáy ao nuôi tôm tại xã hưng hoà tp vinh nghệ an

Sau mỗi vụ nuôi tôm,ngời dân thờng thực hiện tiến hành xử lý nền đáy ao bằng nhiều biện phápkhác nhau nh nạo vét, phơi khô, xử lý bằng chế phẩm vi sinh hoặc chế phẩmhoá học… Mục đích của

Trờng đại học vinh

Khoá luận tốt nghiệp đại học

Ngành khoa học sinh học

Vinh, 2009

Lời cảm ơn

Trong quá trình thực hiện đề tài, em đã nhận đợc sự góp ý,

động viên và giúp đỡ của các thầy cô giáo, các bạn sinh viên và các

hộ gia đình ở xã Hng Hoà (Thành phố Vinh – Nghệ An).

Em xin chân thành cảm ơn Ban chủ nhiệm khoa Sinh học; các thầy cô giáo, các cán bộ trong Khoa nói chung và trong Tổ bộ môn

Di truyền - Vi sinh - Phơng pháp giảng dạy nói riêng đã tạo điều kiện tốt nhất về cơ sở vật chất và tinh thần để em hoàn thành đề tài.

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo hớng dẫn Thạc sĩ Nguyễn Lê ái Vĩnh đã quan tâm, giúp đỡ và hớng dẫn tận tình để em có thể nâng cao kiến thức, phơng pháp nghiên cứu khoa học và thực hiện đề tài.

-Qua đây, em cũng xin chân thành cảm ơn các hộ nuôi tôm tại xã Hng Hòa cung cấp những thông tin và kinh nghiệm sản xuất cần thiết phục vụ cho đề tài này Xin cảm ơn tới sự quan tâm, giúp đỡ,

động viên của tất cả bạn bè trong suốt thời gian qua.

TP Vinh, tháng 5 năm 2009

Sinh viên

Lê Thị Hơng

mục lục

Trang

Mở đầu 1

Chơng I TổNG QUAN TàI LIệU 4

1.1 Tổng quan về khu hệ vi khuẩn trong môi trờng nớc và ao hồ nuôi trồng thủy sản 4

1.2 Tình hình ô nhiễm môi trờng thủy sản và khả năng xử lý bằng biện pháp vi sinh vật 5

1.2.1 Tình hình ô nhiễm môi trờng thủy sản 5

1.2.2 Khả năng xử lý bằng biện pháp VSV 7

1.3 Vi khuẩn gây bệnh ở động vật thủy sản và khả năng kiểm soát nguồn bệnh bằng vi sinh vật 10

1.3.1 Vi khuẩn gây bệnh ở động vật thủy sản 10

1.3.2 Khả năng kiểm soát nguồn bệnh bằng biện pháp VSV 12

Chơng II ĐốI TƯợNG Và PHƯƠNG PHáP NGHIÊN CứU 14

2.1 Đối tợng nghiên cứu 14

2.2 Địa điểm và phơng pháp thu mẫu 14

2.2.1 Địa điểm nghiên cứu 14

2.2.2.Thời gian nghiên cứu 14

2.3 Phơng pháp lựa chọn địa điểm thu mẫu 15

2.4 Các phơng pháp nghiên cứu 15

2.4.1 Phơng pháp pha loãng mẫu theo dãy thập phân 11

2.4.2.Phơng pháp MPN (Most Probable Number) 15

2.4.3 Phơng pháp cấy ria ống thạch nghiêng và hộp trải 16

2.4.4 Phơng pháp phân lập và mô tả đặc điểm khuẩn lạc vi khuẩn 16

2.4.5 Phơng pháp thử hoạt độ Amilaza và Proteaza 17

2.4.6 Phơng pháp đếm khuẩn lạc (CFU) 18

2.4.7 Môi trờng nuôi cấy vi khuẩn 19

2.4.8 Phơng pháp xử lý số liệu 19

Chơng III KếT QUả NGHIÊN CứU Và THảo luận 20

3.1 Một số đặc điểm về các ao nuôi tôm tại xã Hng Hòa (Thành phố Vinh -Nghệ An) 20

3.2 Kết quả định lợng vi khuẩn hiếu khí tổng số 21

3.2.1 Kết quả đợt I (ngày 12/11/2008) 21

3.2.2 Kết quả đợt II (ngày 15/12/2008) 22

3.2.3 Kết quả đợt III (ngày 9/02/2008) 23

3.2.4 Đánh giá về sự biến động số lợng vi khuẩn trong bùn đáy ao qua các đợt nghiên cứu 25

3.3 Thành phần và số lợng vi khuẩn đợc phân lập từ các ao nghiên cứu trong đợt 2 (ngày 15/12/2008) 27

3.4 Kết quả xác định hoạt độ enzim amylaza và proteaza của một số chủng vi khuẩn đợc phân lập 30

3.4.1 Kết quả xác định hoạt độ amylaza 30

3.4.2 Kết quả xác định hoạt độ proteaza 31

3.5 Kết quả nghiên cứu về khả năng sinh trởng của hai chủng C11A1 và TB4 32

Kết luận và đề nghị 35

1 Kết luận 35

2 đề NGHị 35

Tài liệu tham khảo 36

Phụ lục 39

Mở đầu

Trong khoảng 10 năm trở lại đây, nghề nuôi tôm ở Việt Nam đã phát triển mạnh mẽ Tính đến cuối năm 2001, diện tích nuôi tôm thơng phẩm ở nớc

ta đã đạt 230.000 ha, năng suất bình quân là 4,7 tấn/ha, cá biệt có mô hình đạt

9 - 11 tấn/ ha Theo báo cáo của Bộ Thủy sản, tính đến tháng 6/2005, diện tích nuôi tôm nớc lợ đạt 542.900 ha, tăng 11,2% so với cùng kỳ năm 2004, sản l-ợng nuôi đạt 562.800 tấn

Đối với việc nuôi tôm thâm canh cao sản, hai yếu tố quan trọng quyết

định năng suất tôm là tôm giống sạch bệnh và môi trờng ao nuôi Hiện nay,việc làm sạch và duy trì ao nuôi sạch vẫn còn nhiều bất cập, khiến cho nhữngngời nuôi tôm gặp rất nhiều rủi ro Tình hình trên đang đặt ra cho các nhàkhoa học và sản xuất nhiều vấn đề cần giải quyết, trong đó có việc xử lý bùn

đáy ao, đặc biệt trong những ao, đầm nuôi thả tôm mật độ cao Mỗi năm, đáycác ao nuôi tôm thâm canh có thể hình thành một lớp bùn dày 10 - 15 cm, t-

ơng đơng 30 - 50 tấn chất khô giàu hữu cơ/ha Bùn có thành phần chủ yếu làchất hữu cơ, sinh khối vi sinh vật và xác động vật, thực vật thủy sinh Khiphân hủy tự nhiên sẽ làm suy giảm lợng ôxy hòa tan và sinh ra các chất độchại đối với tôm nh NH3, H2S, CH4

Chất lợng nền đáy ao nuôi tôm có ảnh hởng rất lớn đến chất lợng nớc aonuôi tôm nh oxy hoà tan, độ trong của nớc, sự phát triển của tảo, sự tạo ra cáckhí độc, sự phát triển của các loại vi khuẩn gây bệnh Sau mỗi vụ nuôi tôm,ngời dân thờng thực hiện tiến hành xử lý nền đáy ao bằng nhiều biện phápkhác nhau nh nạo vét, phơi khô, xử lý bằng chế phẩm vi sinh hoặc chế phẩmhoá học… Mục đích của những biện pháp này là làm giảm các chất độc hại Mục đích của những biện pháp này là làm giảm các chất độc hạitrong bùn đáy ao, giảm các loài vi sinh vật gây bệnh; đặc biệt là kích thích sựphát triển các loài vi sinh vật hiếu khí có khả năng phân giải các chất hữu cơ

có trong bùn đáy ao, đây cũng là một trong những cách để xử lý môi trờngnhờ vi khuẩn hiếu khí

Việc nghiên cứu về khu hệ vi khuẩn trong bùn đáy các ao nuôi tôm cũng

đã đợc tiến hành ở nhiều nơi Tuy nhiên, các nghiên cứu chủ yếu tập trung vàothời gian đang nuôi tôm, còn trong thời gian ao không nuôi tôm thì cha đợcnghiên cứu nhiều Hơn nữa, các ao đầm nuôi tôm tại xã Hng Hòa (Thành phốVinh - Nghệ An) là những ao đầm có thời gian nuôi cha lâu, chỉ khoảng 6 nămtrở lại đây, các nghiên cứu về những vấn đề này hầu nh cha đợc thực hiện

Với những lý do trên và trong khuôn khổ của một khóa luận tốt nghiệp,chúng tôi lựa chọn đề tài: “Bớc đầu nghiên cứu vi khuẩn hiếu khí trong bùn

đáy ao nuôi tôm tại xã Hng Hòa (Thành phố Vinh - Nghệ An)”

Mục tiêu của đề tài là:

- Xác định mật độ của vi khuẩn hiếu khí trong bùn đáy trong thời giankhông nuôi tôm của một số ao nuôi

- Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của một số chủng vi khuẩn phânlập đợc

- Qua hoạt động này, rèn luyện các phơng pháp, kỹ năng nghiên cứukhoa học, đánh giá về sự sinh trởng - phát triển và khả năng ứng dụng của cácchủng vi khuẩn hiếu khí trong bùn đáy ao nuôi tôm trong việc cải thiện môi tr-ờng nuôi tôm.

Nhiệm vụ của đề tài là:

- Tìm hiểu về tình hình sản xuất và các đặc điểm của một số ao nuôitôm tại xã Hng Hoà (Thành phố Vinh – Nghệ An)

- Tiến hành các đợt thu mẫu và bố trí thí nghiệm để điều tra về vi khuẩnhiếu khí tổng số trong bùn đáy của một số ao trong thời gian ao không nuôitôm

- Phân lập, mô tả và bảo quản các chủng vi khuẩn hiếu khí từ các mẫubùn đáy ao thu thập đợc

- Nghiên cứu hoạt tính enzim amylaza và proteaza của các chủng đợcphân lập

- Nghiên cứu khả năng sinh trởng của một số chủng vi khuẩn có hoạttính enzim amylaza và proteaza mạnh

Chơng I TổNG QUAN TàI LIệU 1.1 Tổng quan về khu hệ vi khuẩn trong môi trờng nớc và ao hồ nuôi trồng thủy sản

Vi sinh vật (VSV) có mặt ở khắp mọi nơi trong các nguồn nớc Sự phân

bố của chúng hoàn toàn không đồng nhất mà rất khác nhau tùy thuộc và đặctrng của từng loại môi trờng [1] Số lợng, thành phần VSV trong nớc phụthuộc nhiều vào các yếu tố môi trờng nh: ánh sáng, nhiệt độ, pH, hàm lợngchất hữu cơ… Mục đích của những biện pháp này là làm giảm các chất độc hại

Thành phần VSV trong nớc gồm có vi khuẩn, nấm mốc, nấm men, xạkhuẩn, virut, vi tảo… Mục đích của những biện pháp này là làm giảm các chất độc hại Trong đó, vi khuẩn chiếm tỉ lệ là cao nhất [10] Vikhuẩn trong nớc chủ yếu là các loài dị dỡng hoại sinh Những loài này có khảnăng phân hủy các chất hữu cơ, sử dụng hoặc chuyển hóa các chất độc trongmôi trờng nớc nh NH3, H2S, CH4… Mục đích của những biện pháp này là làm giảm các chất độc hại Vi khuẩn luôn giữ vai trò quan trọng vềthành phần, số lợng cũng nh ảnh hởng tích cực hoặc tiêu cực đến hệ sinh tháinớc [12]

ở các ao, hồ đầm nuôi trồng thủy sản, hàm lợng chất dinh dỡng vàmuối khoáng cao nên số lợng loài và thành phần VSV phong phú, đa dạng, tậptrung khá nhiều loại Vai trò của chúng đối với các hệ sinh thái nớc cũng có sựkhác nhau [14] Ngoài những sinh vật tự dỡng còn có rất nhiều các nhómVSV dị dỡng có khả năng phân hủy các chất hữu cơ, ở các tầng nớc khácnhau Các ao hồ đầm nuôi trồng thủy sản còn luôn chịu tác động mạnh mẽ củacon ngời Đặc biệt, việc cung cấp các nguồn dinh dỡng làm thức ăn của vậtnuôi thủy sản Các thức ăn thừa và chất thải của vật nuôi thờng làm cho nớcgiầu chất hữu cơ và gây ra hiện tợng “phú dỡng” Đây cũng chính là môi trờngthuận lợi cho sự phát triển của VSV trong các ao hồ Sự gia tăng số lợng VSVtrong nớc giúp cho quá trình chuyển hóa vật chất nhanh hơn, tăng cờng quátrình tự làm sạch của nớc Bên cạnh đó, VSV cũng có thể gây ô nhiễm ao hồnuôi trồng thủy sản bởi các VSV gây bệnh, sự suy giảm của oxi hòa tan, thay

đổi pH, thay đổi nồng độ các ion trong nớc… Mục đích của những biện pháp này là làm giảm các chất độc hại[12]

1.2 Tình hình ô nhiễm môi trờng thủy sản và khả năng xử lý bằng biện pháp vi sinh vật

1.2.1 Tình hình ô nhiễm môi trờng thủy sản

Không chỉ tại Việt Nam m ngay cà ngay c ả tại nhiều nước trong khu vựcĐông Nam Á như Philippin, Đ i Loan, Thái Lan, Indonesia hoà ngay c ạt động nuôitrồng thủy sản, nhất l nuôi tôm à ngay c đã tạo ra một sự chuyển đổi hiệu quả v à ngay c đem

lại nhiều lợi ích thiết thực cho nông dân Hiện nay, trên 80% sản lượng tômtrên thế giới l tà ngay c ừ nguồn tôm nuôi công nghiệp với các giống tôm chính nhưtôm sú, tôm thẻ, tôm thẻ đỏ đuôi Số liệu thống kê cho biết tổng số lượng trạinuôi tôm trên thế giới l khoà ngay c ảng 380 000 trại nuôi, chiếm khoảng 1,25 triệu

ha, với sản lượng h ng nà ngay c ăm từ 50 tới 10 000 kg/ha Hoạt động nuôi tôm baogồm nuôi quản canh, bán thâm canh v thâm canh Vià ngay c ệc tăng trưởng nhanhchóng các hoạt động nuôi tôm trong hai thập niên gần đây mang lại một sự

mở rộng diện tích nuôi tôm trên to n cà ngay c ầu, nhưng cũng l m thay à ngay c đổi nhanhchóng công nghệ nuôi trồng thủy sản Những công nghệ kỹ thuật tiên tiếnxuất hiện khá rõ nét trong hoạt động nuôi con giống, xây dựng công thức chothức ăn, v kà ngay c ỹ thuật cho ăn Tuy nhiên, những vấn đề đã xuất hiện đó l bùngà ngay cphát bệnh dịch do nhiều loại VSV khác nhau nh virut, vi khuẩn, nấm… Mục đích của những biện pháp này là làm giảm các chất độc hại ự sxuống cấp của môi trường, triệt phá rừng ngập mặn, thiếu hụt các trại nuôitôm giống có chất lượng Ngo i ra, vià ngay c ệc thay đổi môi trường tự nhiên venbiển đó l m xuà ngay c ất hiện những lo ngại liên quan tới chất lượng nước v à ngay c đất, sựcân bằng môi trường Phần lớn sản phẩm dư thừa trong nuôi tôm đợc tích tụdưới đáy ao Đây chính l nguà ngay c ồn gây nguy hại cho con tôm v à ngay c cho hoạt độngnuôi tôm Lớp bùn đáy ao n y rà ngay c ất độc, thiếu ôxy v chà ngay c ứa nhiều chất độc nhưamoni, nitrit, hydrogen sulfit Chất lượng nước v chà ngay c ất lượng đáy ao sẽ tácđộng trực tiếp tới con tôm Con tôm luôn bị căng thẳng, thể hiện qua việc kém

ăn, mức tăng trưởng giảm v dà ngay c ễ bị mắc bệnh Phần lớn, các bệnh của con tômđều có nguồn gốc từ môi trường m chúng sinh sà ngay c ống

Môi trường bên ngo i trà ngay c ại nuôi tôm, chất thải dơ bẩn thường khôngđược quản lý tốt sẽ l m à ngay c ảnh hưởng tới hệ sinh thái ven biển Điều n y khôngà ngay cchỉ tác động lên môi trường đất m còn lên các giá trà ngay c ị t i nguyên ven bià ngay c ển,bao gồm cả các trại nuôi tôm Việc tái sử dụng ao bị ô nhiễm hay đổ đống ramôi trường xung quanh sẽ tạo điều kiện l m à ngay c cho nguồn nước ô nhiễm v tácà ngay cđộng lên các hoạt động ven biển

C¸ch đ©y nhiều năm người ta đ· thấy rằng việc nu«i t«m th©m canhthiếu khoa học thì kh«ng bền vững Việc t«m chết h ng loà ngay c ạt do bệnh nguyªntấn c«ng l do à ngay c ảnh hưởng của điều kiện sinh th¸i xấu g©y ra Trong nu«i trồngthủy sản, thức ăn kh«ng ăn hết, ph©n v sà ngay c ự chuyển hãa dinh dưỡng l nguà ngay c ồngốc chủ yếu của sự « nhiễm nước nu«i thủy sản Người ta quan s¸t thấy rằng,trong hệ thống th©m canh t«m th× chỉ cã 15 - 20% thức ăn được dïng v oà ngay cph¸t triển m« động vật, cã tới 15% tổng lượng thức ăn hao hụt do kh«ng ănhết v thà ngay c ất tho¸t, chỉ cã 40 - 45% l à ngay c được sử dụng trong qu¸ tr×nh chuyển hãab×nh thường, duy tr× v là ngay c ột vỏ Lượng chất thải sinh ra cã liªn quan với c«ngnghệ sản xuất thức ăn v hà ngay c ệ thống nu«i t«m.

Nitơ v photpho l nhà ngay c à ngay c ững nguyªn tố chủ yếu trong chất thải bắt nguồn

từ thức ăn Việc cho thức ăn qu¸ nhiều, nước kh«ng ổn định, thức ăn dễ tan,thức ăn khã hấp thu v khà ngay c ả năng duy tr× nitơ l nhà ngay c ững yếu tố liªn quan vớinước thải cã chứa nhiều nitơ v photpho Thà ngay c ức ăn thừa, chiếm tỷ lệ lớn (30 -40%) của « nhiễm nitơ Người ta ước lượng rằng, cã khoảng 63 - 78% nitơ và ngay c

76 - 80% photpho cho t«m ăn bị thất tho¸t v o m«i trà ngay c ường C¸c nguồn kh¸ccủa chất thải hữu cơ l mà ngay c ảnh vụn thực vật phï du hoặc tảo dạng sợi (lab-lab)

v chà ngay c ất lắng đọng hoặc chất hữu cơ ho tan/huyà ngay c ền phï l do nà ngay c ước lấy v oà ngay cmang theo Chất thải nu«i thủy sản cßn cã chứa một Ýt dư lượng của c¸c chấtkh¸ng sinh, dược phẩm, thuốc trị liệu v kÝch thÝch tà ngay c ố

Nước thải mang theo một lượng lớn hợp chất nitơ, photpho v c¸c chà ngay c ấtdinh dưỡng khác, g©y nªn sự phï dưỡng, kÌm theo sự tăng sức sản xuất banđầu v nà ngay c ở rộ của vi khuẩn Sự cã mặt của c¸c hợp chất hữu cơ sẽ l m già ngay c ảm

«xy ho tan v tà ngay c à ngay c ăng BOD, COD, sulfit hydrogen, amoniac v h m là ngay c à ngay c ượngmetan trong vực nước tự nhiªn Một vấn đề kh¸c do việc nu«i thủy sản g©ynªn đã l sà ngay c ự l m là ngay c ắng đọng bïn ở c¸c vïng l©n cận, như rừng ngập mặn v à ngay c ởnhững nơi nước tô

Việc sử dụng kháng sinh đã gây nên sức chống chịu thuốc ở vi sinh vật

v có và ngay c ết trong mô của ký chủ Sử dụng thuốc điều trị v hóa chà ngay c ất gây tácđộng bất lợi đối với sinh vật phù du v sinh và ngay c ật đáy do ảnh hưởng độc tố sinhthái học (ecotoxic) của chúng Sự tích tụ chất hữu cơ nặng đến cuối vụ nuôicũng đó gây nên sự tự ô nhiễm chính trong ao, l m à ngay c ảnh hưởng ngược lại đốivới động vật nuôi do thiếu ôxy v tà ngay c ắc nghẽn cơ quan hô hấp Sự rò rỉ nướcthải cũng như nước ao nuôi l m mà ngay c ặn hóa đất nông nghiệp quanh vùng và ngay cnước ngầm

Chính vì những tác động trên nên việc đánh giá thực trạng ô nhiễm nướctại các khu vực nuôi thủy sản v tìm già ngay c ải pháp khắc phục, xử lý để cải thiệnchất lượng nước ao nuôi v bà ngay c ảo vệ môi trường nước nói chung l rà ngay c ất cần thiết

1.2.2 Khả năng xử lý bằng biện pháp VSV

Hiện nay, việc áp dụng công nghệ sinh học v các chà ngay c ế phẩm sinh học

để giữ v cà ngay c ải thiện năng suất nuôi đó được chấp thuận rộng rãi như mộtphương thức chữa trị hiệu quả, rẻ tiền v tà ngay c ốt hơn nhiều so với việc sử dụngkháng sinh

Chế phẩm Chứa hỗn hợp vi khuẩn cộng sinh Nitrosomonas eutropha và

Nitrobacter vinograskii có hiệu quả trong việc loại bỏ amoniac và nitrat hơn.

Việc bổ sung vi khuẩn cộng sinh trong nôi trồng thủy sản nh các bể nuôi tôm

có thể làm tăng hiệu suất, tăng kích thớc và làm giảm tỉ lệ chuyển hóa thức ăn(giảm lợng thức ăn cần cho 1kg tôm thu hoạch) và tăng tổng lợng tôm thuhoạch

Cơ sở khoa học của việc sử dụng các chế phẩm vi sinh vật trong nuôitrồng thủy sản là: Trong tự nhiên, nhờ hoạt động sống của vi sinh vật một lợnglớn các chất hữu cơ đợc khoáng hóa Các hợp chất hữu cơ đợc chuyển hóa quahàng loạt các phản ứng hóa học, xúc tác, mỗi phản ứng là một enzyme Trongquá trình chuyển hóa vật chất trong tự nhiên có nhiều loại VSV cùng thamgia, sản phẩm chuyển hóa của loài VSV này lại là cơ chất cho VSV khác, hoạt

động của VSV diễn ra phức tạp và có mối liên quan chặt chẽ với nhau Sựphân hủy các chất hữu cơ diễn ra với tốc độ khác nhau phụ thuộc vào thànhphần, số lợng và điều kiện môi trờng Thành phần chủ yếu của hợp chất hữucơ trong nớc và bùn ao nuôi tôm bao gồm: protein, lipit, hydratcacbon, kitin

Các vi khuẩn có khả năng phân giải protein thờng gặp thuộc chi

Pseudomonas, Clostridium, Bacillus Chúng phân giải protein thành các

polypeptit, axit amin, NH3

Có 3 nguyên tắc cơ bản để lựa chọn các chủng VSV sản xuất chế phẩmsinh học phục vụ cho nuôi trồng thủy sản là: Các chủng VSV phải có hoạt tínhsinh học mạnh nh khả năng sinh phức hệ enzyme cao và ổn định; Không gây

độc cho ngời, vật nuôi, cây trồng, VSV hữu ích và nuôi cấy dễ dàng, sinh ởng tốt trong môi trờng tự nhiên, thuận lợi cho quá trình nhân giống thu sinhkhối

tr-Các nhóm VSV sử dụng trong sản xuất chế phẩm sinh học dùng để

xử lý môi trờng nuôi trồng thủy sản

Nhóm vi sinh vật phân hủy các hydratcacbon bao gồm chi Bacillus,

Aspegillus, Streptomyces, Streptococcus, Clostridium Trong quá trình này,

các hydratcacbon (tinh bột, xenluloza, pectin, hemixenluloza ) đợc phân giảithành những phần nhỏ hơn, tạo ra các sản phẩm của quá trình trao đổi chất nhcác chất khí (NH3, CO2) , axit focmic, axit axetic, axit propionic, axit béo,axit lactic các chất khoáng và sinh khối mới của VSV.Một trong những đặc điểm quan trọng của VSV là chúng sinh trởng nhanh,khi nuôi cấy trong môi trờng thích hợp chỉ sau 24 giờ từ một tế bào VSV cóthể thu đợc một khối lợng rất lớn sinh khối VSV Hơn nữa, VSV nuôi cấy dễdàng trên các cơ chất rẻ tiền, không tốn nhiều diện tích và việc sản xuất khôngphụ thuộc vào sự thay đổi của thời tiết

Nhóm VSV dị d ỡng hoại sinh : Một số loài của chi vi khuẩn Bacillus

(Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus sp., Bacillus megaterium )

dùng để làm sạch môi trờng nhờ khả năng sinh các enzyme (proteaza,amylaza, xenlulaza, kitinaza) phân hủy các hợp chất hữu cơ và kiểm soát sựphát triển quá mức của VSV gây bệnh do cơ chế cạnh tranh nguồn dinh dỡnggiữ cho môi trờng luôn ở trạng thái cân bằng sinh học

Nhóm VSV khử amoni và nitrat: Các loài thuộc chi Nitrosomonas,

Nitrobacter chúng amon hóa NH3 và nitrat hóa NO3 thành nitơ phân tử làmgiảm độc cho môi trờng

ở Việt Nam một số chế phẩm sinh học đang sử dụng trong việc xử lýmôi trờng nuôi tôm nh: ACCELOBACĐAG, AGROSTIMTM, VIME - Yucca,BIO - DIBAPES, ENVIRON- ACTM, ECO MARINE, MIC - 999, SUPERMAZO, MIC - 888, BRF-2 AQUAKIT, SUPER CLEAN, ESM, BIOMARINE, BIO - BACTER, POND-CLEAR, SOIL PRO, BIO- DW, BIO -

YUCCA, BZT, Trung Quốc, Long Lizyme, Microzyme, BIOTIC For Shrimp,Super MAZAL, EMS có tác dụng khử ô nhiễm bùn, nớc, loại thải khí độc(NH3, H2S, NO2 ), phân hủy các chất thải và chất hữu cơ, tăng nguồn dinh d-ỡng cho sự phát triển của VSV, kích thích sự tăng trởng, cải thiện hệ sốchuyển hóa thức ăn, giảm chất cặn bã, độ axit ở đáy ao, ổn định pH cho môitrờng, ngăn ngừa dịch bệnh, tăng độ ôxy hòa tan, kiểm soát các chất lơ lửngtrong nớc

Trong quá trình nuôi tôm cao sản, khối lợng bùn đợc tạo ra hàng nămrất lớn, làm ô nhiễm môi trờng và phát sinh bệnh cho tôm Sử dụng các chếphẩm VSV đã góp phần làm giảm thiểu ô nhiễm môi trờng

1.3 Vi khuẩn gây bệnh ở động vật thủy sản và khả năng kiểm soát nguồn bệnh bằng vi sinh vật

Theo tác giả Bùi Quang Tề – 1998, những bệnh do vi khuẩn của độngvật Thủy sản (chủ yếu là tôm) thờng gặp ở Viêt Nam, gồm các nhóm sau:

- Bệnh nhiễm trùng (đốm đỏ) do vi khuẩn Aesomonas di động ở động

- Nhóm 2: Là các loài Aesomonas di động bao gồm A.hydrophyla;

A.caviae; A.sobsia Đặc tính chung của 3 loàivi khuẩn này là di động nhờ có

tiêm mao Vi khuẩn Gram âm dạng hình que ngắn, hai đầu tròn, kích thớc 0,5

x 10 - 1,5micromet Vi khuẩn yếm khí tùy tiện tùy tiện, Cytochromoxidase

d-ơng tính, khử nitrat không mẫn cảm với thuốc thử Vibsiostat 0/129; Tỷ lệ

Guamin + Cytozin trong ADN là 57 - 63 [13]

Ba loài vi khuẩn Aesomonas di động có những đặc điểm khác nhau Các loài VK Aesomonas di động đều đợc phân lập từ cá nớc ngọt nhiễm bệnh Ngoài ra có thể gặp vi khuẩn Gram âm P.Seudomonas fluoresens hoặc

Psoteus rettgesi.

Bệnh do vi khuẩn Vibrio ở động vật thủy sản

Tác nhân gây bệnh:

Giống Vibrio thuộc họ Vibrinaceae Đặc điểm chung các loại vi khuẩn thuộc giống Vibrio: Gram âm, hình que, thẳng hoặc hơi uốn cong, kích thớc

0,3 - 0,5 x 1,4 - 2,6 micromet Chúng không hình thành bảo tử và chuyển

động nhờ một tiêm mao hoặc nhiều tiêm mao mảnh Tất cả chúng đều yếm

khí tùy tiện và hầu hết đều oxi hóa và lên men trong môi trờng O/F Glucozse

Thiosulphatecitrate bile salt agar (TCBS) là môi trờng chọn lọc của Vibrio.

Chúng mẫn cảm với Viberiostat 2,4-diamino - 6,7 + Cytizen - CtrogADN là

38 - 51mol%[13].

Những loài gây bệnh cho động vật thủy sản là: V.alaginolyticus,

V.anguillsium, V.osdalli, V.salmonicicla, V.hasvey, V.pasahaemolyticus, V.vulnificus…[13].

Đối với Tôm Vibrio gây bệnh phát sáng, đỏ dọc thân, ăn mòn vỏ kitin… Mục đích của những biện pháp này là làm giảm các chất độc hại

Động vật thủy sản yếu không có sức đề kháng, các loài vi khuẩn Vibrio

spp cơ hội gây bệnh nặng làm động vật thủy sản chết rải rác tới hàng loạt [13].

Bệnh do vi khuẩn Pseudomonas ở động vật thủy sản

Tác nhân gây bệnh

Pseudomonas là một giống thuộc họ Pseudomonasdacceae Vi khuẩn

Gram âm, hình que hoặc hơi uốn cong, không sinh bào tử, kích thớc 0,5 - 10

x 1,5 - 5miromet Chuyển động bằng một hay nhiều tiêm mao Phát triển

trong môi trờng đơn giản và hiếu khí Thờng gặp các loài: P fluorescens, P.

chlososaphis, P anguilliseptica, P démoalla, P putida [13].

Bệnh vi khuẩn dạng sợi ở tôm

Tác nhân gây bệnh

Chủ yếu do vi khuẩn dạng sợi Leucothrix mucor ngoài ta còn có thể gặp

một số vi khuẩn dạng sợi khác: Cytophagr Sp., Flexibactes Sp., Thiothrix Sp.,

Flavobactesium sp.… Mục đích của những biện pháp này là làm giảm các chất độc hại Các vi khuẩn này có thể độc lập hoặc phối hợp với nhaugây bệnh, tập trung nhiều ở mang, thân và các phần phụ, các vi khuẩn dạng

sợi và vi khuẩn thuộc họ Cytophagaceae chỉ có giai đoạn tế bào dinh dỡng,

chúng không hình thành quần thể và không hình thành bào tử Chúng là sinhvật hoại sinh song tự do trong nớc biển và cửa sông Chúng có thể bám trên bềmặt ngoài của nhiều động vật thủy sinh Chúng có khả năng phân giải

xenlulozo và nhiều hợp chất hữu cơ khác [13].

1.3.2 Khả năng kiểm soát nguồn bệnh bằng biện pháp VSV

Chế phẩm sinh học v việc quản lý à ngay c cho ăn ở một mức độ lớn l một phà ngay c

-ơng pháp kiểm soát mầm bệnh trong các ao nuôi tôm Chế phẩm sinh học đóđược chấp thuận rộng rãi để khống chế các nguồn dịch bệnh trong nuôi tôm,tăng sức đề kháng v chà ngay c ống lại bệnh dịch Ngo i ra, cũng giúp à ngay c hạn chế việc

sử dụng kháng sinh hay hóa chất m và ngay c ẫn còn được cho phép tại một v i khuà ngay cvực Ngược lại với các kháng sinh, chế phẩm sinh học cung cấp một phươngthức an to n v bà ngay c à ngay c ền vững đối với người nuôi v ngà ngay c ười tiêu dùng

Các nhóm VSV dùng để sản xuất thức ăn và kiểm soát VSV gây bệnh

(probiotic) Gồm: Enterococcus faecium, Streptomyces cinnamonensis,

Bacillus subtilis, Lactobacillus sp., Acetobacteria sp., Saccharomyces sp., Pediococcus acidilatici, Lactobacillus acidophilus, L sporogenes ).

Tại ao có sử dụng chế phẩm sinh học thì mức phát sáng do vi khuẩn

V.harveyi thấp hay gần nh triệt tiêu v à ngay c cho một kết quả thu họach rất tốt Việc

bổ sung thêm Bacillus sp., đã đem lại lợi ích cho tôm trong việc chống bệnh phát sáng (Vibriosis) v khỏe mạnh hơn dẫn tới việc tăng sản là ngay c ợng tôm nuôi

Chế phẩm sinh học còn chứa axit lactic (Lactobacillus v à ngay c Carnobacterium

sp.) l à ngay c một loại vi khuẩn hứa hẹn có tác dụng chống lại mầm bệnh v cungà ngay ccấp một nguồn kích thích miễn dịch Carnobacterium divergens l mà ngay c ột loại

chế phẩm sinh học tiềm năng khác có tác dụng l m già ngay c ảm áp lực gây bệnh của

vi khuẩn Vibrio anguillarum.

Vi khuẩn lactic: Đây là nhóm VSV đóng vai trò quan trọng trong việc

kiểm soát các VSV gây bệnh bởi các chủng VSV này có khả năng sinh axitlactic, bacteroxin có tác dụng ức chế sự phát triển của các VSV gây bệnhcho tôm, cá trong môi trờng Nhóm VSV này thờng đợc sử dụng để bổ sungvào thức ăn cho tôm, cá, làm cân bằng khu hệ VSV đờng ruột, ngăn cản sựthâm nhập của các VSV có hại vào đờng ruột, tăng khả năng phòng ngừa một

số bệnh đờng ruột Đồng thời, còn có tác dụng tăng khả năng tiêu hóa và hấpthụ thức ăn, giúp cho vật nuôi khỏe mạnh và phát triển nhanh

Các vi khuẩn có ích, các enzyme tiêu hóa đợc bổ sung với thức ăn(probiotic) Một số chế phẩm đang đợc bán trên thị trờng nh: feedadd nc 5.1,Primi, MIC - E, TOPe - 35, V.E.m, AR - 01, Biozyme, Thepazyme, larva là

hỗn hợp vi khuẩn (Enterococcus eacium, Streptomyces cinnamonensis,

Bacillus subtilis, Lactobacillus sp.; Acetobacteria sp., Saccharomyces sp., Pediococcus acidilatici, Lactobacillus acidophilus, L sporogenes ), các hệ

enzyme, các vitamin: A, E, B1, B2, B3, B6 các nguyên tố vi lợng

Các chế phẩm trên là các tác nhân làm tăng tính ngon miệng, giúp tiêuhóa hoàn toàn các chất dinh dỡng có trong thức ăn, giảm tiêu hao thức ăn dotiêu hóa kém, tăng cờng sức đề kháng, phòng ngừa các bệnh đờng ruột nhnhiễm E.coli, ức chế sự phát triển của vi khuẩn có hại Các chế phẩm này còntăng hàm lợng các VSV có lợi trong thành ruột của tôm

Trong những năm gần đây, để giảm thiểu những bất lợi do sử dụng hóachất trong nuôi trồng thủy sản, việc nghiên cứu và sử dụng các chế phẩm sinhhọc trong quá trình nuôi tôm ở nớc ta đang phát triển mạnh Theo Cục Bảo vệnguồn lợi thủy sản, hiện có khoảng trên 200 thơng hiệu chế phẩm sinh học vàvitamin đang bán trên thị trờng nớc ta Đa số các chế phẩm sinh học có nguồngốc nhập ngoại và một số chế phẩm đợc sản xuất trong nớc nhng phần lớn cácchế phẩm này cha đợc công bố về xuất xứ nguồn gốc

Chơng II ĐốI TƯợNG Và PHƯƠNG PHáP NGHIÊN CứU 2.1 Đối tợng nghiên cứu

Đối tợng nghiên cứu của đề tài là các chủng vi khuẩn hiếu khí có trongbùn đáy của một số ao nuôi tôm tại xã Hng Hòa (TP Vinh - Nghệ An)

2.2 Địa điểm và phơng pháp thu mẫu

2.2.1 Địa điểm nghiên cứu

Dựa vào kết quả điều tra hiện trờng, chúng tôi đã lựa chọn 3 ao nuôitôm tại xã Hng Hòa (TP Vinh - Nghệ An) để thu mẫu là:

* Ao 1: Ao nhà bác: Hoàng Nghĩa Tuý

Có ba vị trí thu mẫu ký hiệu: M1A1 (mẫu 1 Ao 1); M2A1 (mẫu 2 Ao 1);

2.2.2.Thời gian nghiên cứu

Thời gian thu mẫu: Chúng tôi tiến hành thu mẫu 3 đợt:

- Đợt 1: vào ngày 10/11/2008 - Là thời gian vừa mới thu hoạch tôm

xong, cha xả hết nớc

- Đợt 2: vào ngày 15/12/2008 – Là thời gian đã xả hết nớc, ao nuôi

tôm để không

- Đợt 3: vào ngày 08/02/2009 - Là thời gian để không đã khá lâu, bùn

đã khô, bắt đầu cày xới ao

- Thu mẫu và phân lập số liệu từ tháng 10/2008 - 2/2009 - Là thời gian

không nuôi tôm

- Thời gian xử lý số liệu và hoàn thành báo cáo từ tháng 2/2009 -4/2009

2.3 Phơng pháp lựa chọn địa điểm thu mẫu

Tại mỗi ao chúng tôi tiến hành thu 3 mẫu tại 3 vị trí khác nhau trong aotheo hình tam giác

Mỗi vị trí đợc lấy khoảng 500g mẫu bùn ở độ sâu khoảng 0 – 5 cm,các mẫu đợc đựng trong bình thủy tinh vô trùng, ghi nhãn, đa về phòng thínghiệm và tiến hành phân tích ngay

2.4 Các phơng pháp nghiên cứu

2.4.1 Phơng pháp pha loãng mẫu theo dãy thập phân

Mẫu bùn đợc pha loãng tuần tự thành dãy các nồng độ thập phân 1/10,1/100, 1/1000 mỗi bậc pha loãng là 1/10 đợc thực hiện bằng cách: Cân 10gmẫu cho vào 90 ml nớc cất đã đợc khử trùng, lắc đều Sau đó hút 1 ml dungdịch đó cho vào 9 ml nớc cất đã đợc khử trùng hoặc môi trờng trong 1 ốngnghiệm Sau khi lắc kỹ sẽ đợc độ pha loãng 1/100 Tiếp tục lấy 1ml dung dịchmẫu 9 ml nớc cất… Mục đích của những biện pháp này là làm giảm các chất độc hại ta sẽ đợc các nồng độ pha loãng thích hợp

2.4.2.Phơng pháp MPN (Most Probable Number)

Đây là phơng pháp dùng để đánh giá vi sinh vật theo số lợng VSV cóxác suất lớn nhất hiện diện trong một đơn vị thể tích mẫu Là phơng pháp địnhlợng dựa trên kết quả định tính của một loạt thí nghiệm đợc lặp lại ở một số độpha loãng khác nhau, thực hiện lặp lại 3 lần ở 3 độ pha loãng bậc 10 liên tiếp,tổng cộng 3 x 3 = 9 ống nghiệm trên mẫu

Quy trình:

Cho vào ống nghiệm 9ml môi trờng: MPA lỏng, hút 1 ml dung dịchmẫu ở ba nồng độ pha loãng (10-2, 10-3, 10-4) vào trong ống nghiệm chứa môitrờng (mỗi một độ pha loãng cho vào 3 ống nghiệm môi trờng) nuôi ở 300 Ctrong vòng 48h Dựa vào các hiện tợng nh sinh hơi, đổi mầu, đục… Mục đích của những biện pháp này là làm giảm các chất độc hại Ghi nhậncác ống nghiệm dơng tính ở từng độ pha loãng Sử dụng số liệu này dựa vàobảng Mac Crady suy ra mật độ vi sinh vật đợc trình bày dới dạng sốMPN/100ml

2.4.3 Phơng pháp cấy ria ống thạch nghiêng và hộp trải

ống thạch nghiêng

- Dùng que cấy vòng thao tác vô trùng lấy giống

- Cấy giống lên bề mặt môi trờng ở đáy ống, dàn đều sinh khối ở đáyống nghiệm Sau đó cấy theo hình sin từ đáy ống nghiệm lên đầu trên ống củamặt thạch nghiêng [14]

Hộp trải

- Dùng que cấy vòng thao tác vô trùng lấy giống

- Ria các đờng ria trên đĩa petri chứa môi trờng MPA (ria chữ T theo ờng zích zắc) Sau mỗi đờng ria, đốt khử trùng đầu que cấy và làm nguội trớckhi thực hiện đờng ria tiếp theo [14]

đ Gói ống nghiệm và đĩa petri nuôi ở 300C, 48h trong tủ ấm

2.4.4 Phơng pháp phân lập và mô tả đặc điểm khuẩn lạc vi khuẩn

Vi khuẩn khi phát triển trên các bề mặt môi trờng đặc sẽ hình thànhkhuẩn lạc đặc trng cho mỗi loài Vì vậy việc mô tả các khuẩn lạc là một trongnhững tiêu chí cần thiết đối với công tác nghiên cứu VSV [5]

Dùng nớc cất vô trùng, pha loãng vi khuẩn rồi cấy vào mỗi hộp petri0,5ml sau đó dùng que trang dàn đều và giữ trong tủ ấm ở 28 - 300C, trongthời gian 1-5 ngày Tùy vào nhóm vi sinh vật mà thời gian hình thành khuẩnlạc có thấy đợc bằng mắt thờng có sự khác nhau Thông thờng khuẩn lạc vikhuẩn có thể nhìn thấy đợc sau 24h - 48h [7]

Khuẩn lạc vi sinh vật xuất hiện không chỉ khác nhau về thời gian màcòn khác nhau về màu sắc, hình dạng, tốc độ sinh trởng, mép khuẩn lạc, bềmặt khuẩn lạc… Mục đích của những biện pháp này là làm giảm các chất độc hại Do mỗi loại VSV có những đặc tính sinh lý, sinh hóa khácnhau, nên chúng sinh trởng và phát triển khác nhau [3,7]

Nhìn chung, khuẩn lạc của mỗi loại vi sinh vật đều có nét đặc trngriêng, tuy nhiên chúng có thể khác nhau về dinh dỡng nhiệt độ, pH … Mục đích của những biện pháp này là làm giảm các chất độc hại do đó

để mô tả khuẩn lạc VSV cần phải chú ý đến môi trờng nuôi cấy và điều kiệnnuôi cấy, hay nói cách khác, khi mô tả khuẩn lạc cần thiết phải ghi rõ trong

điều kiện nào và bằng loại môi trờng dinh dỡng nào [5]

Những đặc điểm để nhận dạng khuẩn lạc vi khuẩn và phân biệt những

vi khuẩn khác nhau trên môi trờng MPA là:

+ Hình dạng khuẩn lạc của các vi khuẩn khác nhau nh hình tròn, hìnhamip, hình rễ… Mục đích của những biện pháp này là làm giảm các chất độc hại có các kích thớc khác nhau

+ Thời gian xuất hiện khuẩn lạc: Đa số vi khuẩn thì sau 24h thì có thểnhìn thấy khuẩn lạc, tuy nhiên ở một số chúng thì muộn hơn

+ Màu sắc: Khuẩn lạc vi khuẩn thờng có màu sắc nh: xanh, đỏ, tím,vàng, sữa, trắng, trong… Mục đích của những biện pháp này là làm giảm các chất độc hại

+ Mép khuẩn lạc: tròn, bóng, xù xì… Mục đích của những biện pháp này là làm giảm các chất độc hại

+ Độ lồi của khuẩn lạc khác nhau

+ Mùi của vi khuẩn hôi thối

+ Độ đặc của khuẩn lạc ở: Dạng mỡ, dạng bột nhão, dạng nhớt

2.4.5 Phơng pháp thử hoạt độ Amilaza và Proteaza

- Chọn các chủng vi sinh vật đã phân lập có khả năng sinh trởng mạnh,gặp nhiều ở các mẫu thu đợc để thử hoạt độ Amilaza và Proteaza

Hoạt độ là hoạt tính tơng đối của enzim biểu thị lợng cơ chất đợc phângiải trong 1 đơn vị thời gian ở điều kiện thí nhghiệm ở đây, các điều kiện thínghiệm nh sau: pH = 7,0, nhiệt độ = 300C, S = 1g, VSV = 1mg, thời gian:1giờ

Hoạt độ proteaza

Nguyên lý của phơng pháp: dùng phản ứng màu của lòng trắng trứng vớithuốc thử biurê (Ermacov, 1969) đo trên máy quang phổ ở bớc sóng 520nm + Tính hoạt độ proteaza:

x = 100% - B/A x 100% (đơn vị của x là %).

Trong đó: x: là hoạt độ của amylaza.

A: kết quả so mầu của mẫu đối chứng.B: kết quả so mầu của mẫu nghiên cứu

Trong đó: x: là hoạt độ của proteaza.

M: kết quả so mầu của mẫu đối chứng

N: kết quả so mầu của mẫu nghiên cứu.

2.4.6 Phơng pháp xác định số lợng vi khuẩn (CFU)

Chuẩn bị huyền phù bằng pha loãng mẫu ở các độ pha loãng khác nhau

theo dãy số thập phân

Chon hai nồng độ thích hợp, chuyển 0,05ml mẫu vào đĩa petri vô trùng

(mỗi nồng độ hai đĩa)

Dùng que trang vô trùng,trang đều trên mặt thạch

Nuôi ở 300C , 72h

Chọn các đĩa có các số lợng khuẩn lạc từ 25 - 250 CFU/ trên đĩa