Xây dựng quy trình nhân giống khoai lang tím nhật (beniazuma) nhập nội bằng phương pháp nuôi cấy mô in vitro

Vì vậy, để cây khoai lang thực sự có vị trí xứng đáng trong sản xuấtnông nghiệp ở nước ta thì định hướng đẩy mạnh công tác chọn tạo, bình tuyểncác giống khoai lang ngắn ngày có năng suất

Xây dựng quy trình nhân giống

khoai lang tím Nhật (Beniazuma) nhập nội bằng phơng pháp nuôi cấy mô in vitro

Luận văn thạc sĩ nông nghiệp

Chuyên ngành: Trồng trọt

M số: 60.62.01ã số: 60.62.01

Ngời thực hiện : nguyễn ngọc khuê

Người hướng dẫn khoa học: pgs.ts nguyễn đình san

Nghệ An - 2012

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan các số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn làtrung thực và chưa từng được sử dụng để bảo vệ một học vị, một công trìnhnghiên cứu nào

Tôi xin cam đoan rằng, mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn nàyđều đã được cảm ơn Trong luận văn tôi có sử dụng các thông tin từ nhiềunguồn khác nhau, các thông tin trích dẫn được sử dụng đều được ghi rõ cácnguồn gốc, xuất xứ

Tác giả luận văn

NGUYỄN NGỌC KHUÊ

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành đề tài này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy

giáo PGS TS Nguyễn Đình San – cán bộ hướng dẫn khoa học, kỹ thuật viên CN Phùng Văn Hào đã hướng dẫn tận tình và tạo mọi điều kiện thuận

lợi giúp đỡ tôi trong suốt thời gian nghiên cứu và hoàn thiện luận văn.

Tôi xin chân thành cảm ơn những ý kiến đóng góp vô cùng quý báu của các thầy giáo, cô giáo khoa Nông – Lâm – Ngư, sự tạo điều kiện và ủng hộ của các cán bộ phòng thí nghiệm Nuôi cấy mô - tế bào thực vật khoa Sinh, trường Đại học Vinh.

Cảm ơn gia đình, bạn bè đã luôn ủng hộ, động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài.

Xin chân thành cảm ơn!

Vinh, tháng 10 năm 2012

Tác giả

NGUYỄN NGỌC KHUÊ

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ CÁI VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Các mốc quan trọng trong lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật 13Bảng 3.1.1 Ảnh hưởng của H2O2 10% và thời gian khử trùng đến tỉ lệ sốngcủa mẫu nuôi cấy 36Bảng 3.1.2 Ảnh hưởng của HgCl2 0,1% và thời gian khử trùng đến tỉ lệ sốngcủa mẫu cấy 38Bảng 3.2.1 Ảnh hưởng của nồng độ GA3 đến khả năng tái sinh chồi 43Bảng 3.2.2 Ảnh hưởng tổng hợp của nước dừa vàGA3 đến khả năng tái sinhchồi 45Bảng 3.3.1 Ảnh hưởng của Kinetine đến khả năng bật chồi và hệ số nhânchồi khoai lang 48Bảng 3.3.2 Ảnh hưởng của nồng độ Kinetine đến khả năng sinh trưởng pháttriển của chồi khoai lang 50Bảng 3.3.3 Ảnh hưởng của IAA đến khả năng bật chồi và hệ số nhân chồikhoai lang 51Bảng 3.3.4 Ảnh hưởng của nồng độ IAA đến khả năng sinh trưởng phát triểncủa chồi khoai lang 53Bảng 3.4.1 Ảnh hưởng của nồng độ α - NAA đến hiệu quả ra rễ của cây

khoai lang in vitro 56

Bảng 3.4.2 Ảnh hưởng của α – NAA và than hoạt tính đến hiệu quả ra rễ của

cây khoai lang in vitro 59 Bảng 3.5 Ảnh hưởng của các loại giá thể đến sức sống của cây ex vitro 63

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Cây khoai lang và các bộ phận 5Hình 3.1.1 Ảnh hưởng của H2O2 10% và thời gian khử trùng đến tỉ lệ sốngcủa mẫu nuôi cấy 37Hình 3.1.2 Ảnh hưởng của HgCl2 0,1% và thời gian khử trùng đến tỉ lệ sốngcủa mẫu cấy 39Hình 3.1.3 Sự phát sinh chồi từ đốt thân ở giai đoạn vào mẫu 41Hình 3.2.1 Ảnh hưởng của nồng độ GA3 đến khả năng tái sinh chồi 43Hình 3.2.2 Ảnh hưởng tổng hợp của nước dừa vàGA3 đến khả năng tái sinhchồi 45

Hình 3.2.3 Chồi in vitro ở giai đoạn tái sinh chồi 47

Hình 3.3.1 Ảnh hưởng của Kinetine đến khả năng bật chồi và hệ số nhân chồikhoai lang 49Hình 3.3.2 Ảnh hưởng của IAA đến khả năng bật chồi và hệ số nhân chồikhoai lang 52

Hình 3.3.3 Chồi khoai lang in vitro trong giai đoạn nhân nhanh 55

Hình 3.4.1 Ảnh hưởng của nồng độ α - NAA đến hiệu quả ra rễ của cây khoai

lang in vitro 57

Hình 3.4.2 Ảnh hưởng của α – NAA và than hoạt tính đến hiệu quả ra rễ của

cây khoai lang in vitro 59

Hình 3.4.3 Chồi khoai lang Beniazuma trong giai đoạn ra rễ 61

Hình 3.5.1 Ảnh hưởng của các loại giá thể đến sức sống của cây ex vitro 63 Hình 3.5.2 Cây khoai lang ex vitro ở giai đoạn huấn luyện 65

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ CÁI VIẾT TẮT iii

DANH MỤC BẢNG iv

DANH MỤC HÌNH v

MỤC LỤC vi

MỞ ĐẦU 1

1 Lý do chọn đề tài 1

2 Mục đích nghiên cứu của đề tài 3

3 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài 3

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU 4

1.1 Giới thiệu chung về cây khoai lang 4

1.1.1 Nguồn gốc và sự phân bố 4

1.1.2 Đặc điểm sinh học của cây khoai lang 4

1.1.3 Giá trị của cây khoai lang 8

1.1.4 Vài nét về giống khoai lang tím Nhật Bản 10

1.2 Nuôi cấy mô tế bào thực vật và ứng dụng trong tạo giống cây trồng 11

1.2.1 Khái niệm và cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật 11

1.2.2 Lịch sử phát triển và những thành tựu ứng dụng NCMTB thực vật trong tạo giống cây trồng 13

1.3 Tình hình nghiên cứu ứng dụng NCMTB thực vật trong việc tạo giống khoai lang trên thế giới và ở Việt Nam 22

1.3.1 Trên thế giới 22

1.3.2 Ở Việt Nam 26

CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN

CỨU 28

2.1 Đối tượng và địa điểm nghiên cứu 28

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 28

2.1.2 Địa điểm nghiên cứu 28

2.2 Nội dung nghiên cứu 28

2.3 Phương pháp nghiên cứu 29

3.4 Xử lý số liệu 35

CHƯƠNG III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 36

3.1 Giai đoạn vào mẫu 36

3.2 Giai đoạn tái sinh chồi 42

3.3 Giai đoạn nhân nhanh 47

3.5 Giai đoạn huấn luyện thích nghi 62

3.6 Một số lưu ý trong quá trình nhân giống khoai lang Nhật Beniazuma bằng phương pháp in vitro 67

3.6.1 Vô trùng 67

3.6.2 Giai đoạn ở phòng thí nghiệm 67

3.6.3 Giai đoạn huấn luyện thích nghi 68

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 69

TÀI LIỆU THAM KHẢO 71 PHỤ LỤC

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Khoai lang (Ipomoea batatas L) là một loài cây lương thực với các rễ củ

lớn, chứa nhiều tinh bột, có vị ngọt, củ khoai lang là nguồn cung cấp rau ăn

củ quan trọng Nó đóng vai trò cả rau và lương thực Khoai lang được trồng

và phân bố rất nhiều nơi trên thế giới như Châu Á, Châu Phi, Châu MỹLatinh

Trong số các cây lương thực, cây có củ giữ một vai trò quan trọng trongsản xuất lương thực ở những nước nghèo, chậm và đang phát triển (TrịnhXuân Ngọ, Đinh Thế Lộc, 2004) Theo số liệu thống kê của Tổ chức Nônglương Liên Hợp Quốc năm 2010 trên thế giới 77% khoai lang sử dụng làmlương thực, 13% làm thức ăn gia súc, 6% làm nguyên liệu chế biến thànhnhiều sản phẩm khác nhau như luộc để ăn sáng, làm mứt, làm bánh kẹo, nướcgiải khát, rượu, làm thuốc, dùng thay thế cho bột mì để làm bánh bích quy,phần loại bỏ đi rất ít chiếm 3% (Cúc Phương, 2005) Phần thân, lá, ngọnđược sử dụng làm rau xanh cho con người đồng thời là nguồn thức ăn tốt chogia súc (FAO, Horton, 1988)

Vùng Bắc Trung Bộ gồm sáu tỉnh: Thanh Hóa, Nghệ An, Hà Tĩnh,Quảng Bình, Quảng Trị, Thừa Thiên Huế Đây là một trong bảy vùng kinh tếcủa đất nước có địa hình, khí hậu, đất đai phong phú gồm các tiểu vùng sinhthái khác nhau thích hợp cho nhiều loại cây trồng và vật nuôi Dân số BắcTrung Bộ có khoảng hơn 10 triệu người chiếm 13% dân số của cả nước, trong

đó khoảng 5 triệu người trong độ tuổi lao động Tuy nhiên, đến nay BắcTrung Bộ vẫn là vùng kinh tế còn gặp nhiều khó khăn Vùng Bắc Trung Bộdẫn đầu tám vùng trên cả nước về diện tích và sản lượng khoai lang Giốngkhoai lang phổ biến hiện nay ở Bắc Trung Bộ là Chiêm Dâu, Hoàng Long,Sộp… năng suất thấp khoảng 60 – 70 tạ/ha, nhiều giống khác có diện tích

nhỏ, chủ yếu để giải quyết thức ăn chăn nuôi theo hình thức tự cung tự cấp.Năng suất khoai lang thấp có nhiều nguyên nhân, nhưng chủ yếu là do chưa

có giống tốt phù hợp cho từng vùng sinh thái và cơ cấu mùa vụ của từng địaphương, các biện pháp thâm canh chưa được chú trọng đúng mức Trong sảnxuất còn ít phát triển các giống mới cho từng vùng trồng thích hợp, chưa đẩynăng suất trung bình lên được bao nhiêu như những cây có củ khác

Trong vài năm gần đây, nhu cầu tiêu dùng khoai lang chất lượng caotăng ở các nước khu vực Châu Á Nắm bắt thị trường, một số nông dân ở cáctỉnh Lâm Đồng, Tiền Giang, Đắc Nông, Vĩnh Long… đã sản xuất khoai langNhật ruột đỏ bán tươi ngay tại ruộng, giá 5000 – 7000 đồng/kg, năng suấtbình quân 25 tấn/ha đem lại thu nhập cao cho nông dân [30] Ở Nghệ An cũng

đã sản xuất giống khoai lang này nhưng diện tích trồng chưa lớn, chủ yếuđang mua củ từ các nơi khác về bán do gặp khó khăn trong bảo quản và chếbiến sản phẩm Thực tế sản xuất cho thấy, sau vài vụ trồng bằng dây giốngcủa vụ trước và trồng nhiều vụ trên một chân đất nên năng suất đã giảm rõ rệt

Để cải thiện chất lượng giống nông dân phải mua giống gốc để trồng, rất thụđộng và tốn kém Nếu cải tiến giống khoai lang theo phương pháp truyềnthống bằng cách gơ củ giống cũng phải mất đến hai năm mới khôi phục gầnnhư hoàn toàn đặc tính của giống gốc

Vì vậy, để cây khoai lang thực sự có vị trí xứng đáng trong sản xuấtnông nghiệp ở nước ta thì định hướng đẩy mạnh công tác chọn tạo, bình tuyểncác giống khoai lang ngắn ngày có năng suất cao, phẩm chất củ ngon để sửdụng làm lương thực, thực phẩm và các giống có sinh khối cao để phục vụchăn nuôi, mở rộng diện tích trồng tập trung tại các vùng sản xuất nôngnghiệp gắn với chế biến, đẩy mạnh công nghệ chế biến các sản phẩm từ khoailang đang được các nhà nghiên cứu quan tâm và là yêu cầu cấp thiết của sảnxuất

Xuất phát từ thực tiễn sản xuất nhằm cải tiến sự thoái hóa giống nhanhchóng ảnh hưởng đến năng suất, chất lượng cây khoai lang, đồng thời đưa ranhững nghiên cứu ban đầu phục vụ cho các công tác giống sau này, chúng tôi

tiến hành thực hiện đề tài: “Xây dựng quy trình nhân giống khoai lang tím Nhật (Beniazuma) nhập nội bằng phương pháp nuôi cấy mô in vitro”

2 Mục đích nghiên cứu của đề tài

Bằng phương pháp nuôi cấy mô xây dựng quy trình nhân giống khoailang tím Nhật nhập nội, tạo ra cây giống có chất lượng cao đưa vào sản xuất

3 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài

3.1 Ý nghĩa khoa học

- Kết quả nghiên cứu sẽ đưa ra được một quy trình nhân giống cây khoailang Nhật bằng phương pháp in vitro Đánh giá được tác động của một số chấtđiều tiết sinh trưởng trong nhân giống khoai lang

- Bổ sung nguồn tài liệu tham khảo cho công tác nghiên cứu, giảng dạy vàsản xuất giống khoai lang Nhật

3.2 Ý nghĩa thực tiễn

Sản xuất được cây con sinh trưởng, phát triển tốt, đồng đều và sạchbệnh với khối lượng lớn, thuận lợi cho việc áp dụng các biện pháp kỹ thuậttrong giai đoạn sản xuất khoai lang thương phẩm, từ đó kích thích sản xuất câykhoai lang Nhật phát triển

CHƯƠNG I.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU

1.1 Giới thiệu chung về cây khoai lang

1.1.1 Nguồn gốc và sự phân bố

Sự tồn tại lâu nhất khám phá từ củ khô ở Caves của Chilea Canyon thuộcPeru (Engle, 1970) Người ta đã tìm thấy sự hiện diện của khoai lang lần đầutiên tại vùng Mayan của Trung Mỹ Astin (1977) cho rằng, nguồn gốc khoailang được bao quanh vùng Yucatan Penisula tới miền Bắc và sông Orinoco tớimiền Nam, với hai trung tâm có đa dạng loài, giống cao, đó là ở Guatamala vàNam Peru Một công trình khoa học khác I Batatas (1982) đã chỉ ra đa dạngloài khoai lang cao nhất ở Colombia, Equador và Nam Peru Như vậy, khoailang có nguồn gốc Nam Mỹ Trong cuộc thám hiểm tìm ra Châu Mỹ,Christophe Columbus (1942) đã tìm thấy và đưa nó vào Tây Ban Nha và gọi

là khoai tây ngọt, mãi sau này mới gọi là khoai lang

Khoai lang phân bố từ 420B – 380N, độ cao bắt đầu sát mực nước biểnđến hơn 3000m so với mặt biển Khoai lang có tính thích ứng rộng trên nhiềuvùng sinh thái Ngày nay, khoai lang được trồng rộng khắp trong các khu vựcnhiệt đới và ôn đới ấm với lượng nước đủ để hỗ trợ sự phát triển của nó [8]

1.1.2 Đặc điểm sinh học của cây khoai lang

1.1.2.1 Đặc điểm phân loại

Theo hệ thống phân loại thực vật của Linnea thì khoai lang thuộc cây hai

lá mầm Magnoliopsida, bộ cà Solanales, họ bìm bìm Convolvovulaceae, thuộc

chi Ipomoea Trong chi Ipomoea có khoảng 500 loài chia thành 13 phân chi,

khoai lang được xếp trong phân chi Batatas [8]

1.1.2.2 Đặc điểm hình thái

Khoai lang là loài cây thân bò sống lâu năm, bộ phận sử dụng chủ yếu là

rễ củ phình to, có thể ăn lá và thân non

- Thân: Có thể là dạng bò hay đứng thẳng, nửa đứng nửa bò Trên thânkhoai lang một số giống có lông tơ Thân có nhiều loại màu sắc khác nhaunhư tím, xanh, đỏ… và có nhiều lông, các giống tốt cho mục đích lấy củthường có đốt ngắn và to Trên mỗi đốt thân có các rễ bất định mọc ra Vì vậy,khoai lang chủ yếu được trồng bằng đoạn thân [8]

- Lá: Gồm cuống lá và phiến lá (gân và thịt lá) Lá đơn, mọc cách,mỗi mắt trên thân mọc một lá Lá có cuống dài 6 – 20 cm, có lợi cho việc

sử dụng ánh sáng Lá khoai lang có dạng hình tim hoặc xẻ thùy [7] Màusắc lá thay đổi từ màu xanh đến màu xanh tím, tím Sự sinh trưởng của láảnh hưởng lớn đến năng suất Chỉ số diện tích lá 4 - 4,5 giúp hiệu suấtquang hợp cao nhất [6]

Hình 1.1 Cây khoai lang và các bộ phận

- Rễ và rễ củ: Rễ khoai lang mọc ở các mắt đốt Có ba loại rễ là rễ con, rễdày hay còn gọi là rễ củ và rễ đực Rễ củ quan trọng nhất, quyết định năngsuất khoai lang Sự hình thành rễ củ phụ thuộc vào đặc điểm di truyền củagiống và sự tác động của môi trường Rễ khoai lang có mối cộng sinh với vikhuẩn cố định đạm, có khả năng đồng hóa và chịu được hàm lượng CO2 trongđất cao Củ khoai lang có lớp vỏ củ nhẵn nhụi có màu từ đỏ, tím, nâu haytrắng, lớp cùi thịt có màu từ trắng, vàng, cam hoặc tím [4]

- Hoa, quả và hạt: Hoa mọc ở các nách lá hoặc ngọn thân, mọc thànhchùm hoặc riêng rẽ, tràng hình phễu màu hồng tím hay phớt hồng Hoa có

5 nhị đực và nhụy cái, nhị đực thấp hơn nhụy cái nên tự thụ phấn rất hiếm.Hoa thường nở rộ vào tháng 11 trong điều kiện ngày ngắn Quả sóc hìnhtròn màu nâu đen, một quả có 1 – 4 hạt Các hạt hầu như chỉ dành cho mụcđích gây giống

1.1.2.3 Đặc điểm sinh thái

- Nhiệt độ: Khoai lang không chịu được sương giá và mẫn cảm với nhiệt

độ thấp < 100C Khoai lang có nguồn gốc nhiệt đới nên sinh trưởng tốt cần cónhiệt độ tương đối cao Nhiệt độ thích hợp nhất cho sự phát triển thân lá và củ

là từ 20 – 300C Thời kỳ đầu nhiệt độ cao, đủ nước, đủ thức ăn cây sẽ sinhtrưởng tốt và hình thành củ sớm có lợi cho năng suất củ, nhiệt độ cao vừa phảithì tượng tầng hoạt động mạnh và vận chuyển chất hữu cơ tốc độ nhanh

Miền Bắc trồng khoai lang ở vụ Đông và đầu Đông Xuân vào lúc gióđông là tốt nhất Trung bộ đến Nam bộ nhiệt độ quanh năm thích hợp chotrồng khoai lang, năng suất phụ thuộc chủ yếu vào chế độ mưa Thời kỳ saukhi củ phát triển yêu cầu nhiệt độ cao vừa phải 30 – 320C, chênh lệch ngàyđêm càng lớn càng tốt

- Ánh sáng: Khoai lang có phản ứng ánh sáng ngày ngắn Thời gian chiếusáng thích hợp trong một ngày 8 – 10 giờ Khoai lang sinh trưởng phát triểntốt trong điều kiện có cường độ chiếu sáng cao Khoai lang ra hoa trong điềukiện ngày ngắn và đêm dài, vào mùa Đông và đầu Xuân ở các vùng ôn đới.Ngày dài và đêm ngắn sẽ thúc đẩy sinh trưởng dây lá hơn là củ và ngược lại.

Ở Việt Nam khoai lang trồng vào mùa khô, các tỉnh duyên hải miền Trung vàđồng bằng sông Cửu Long có điều kiện ánh sáng tốt, thâm canh cao và đủ ẩm,khoai dễ đạt năng suất cao [4]

- Nước: Theo Miller, trong thời kỳ phát triển dây lá mà thiếu nước năngsuất sẽ giảm, trong 40 ngày đầu của quá trình sinh trưởng khoai lang cầnnhiều nước nhất Khi củ phình to, cây cần nước, độ ẩm thích hợp 65 – 80% Ởnước ta khả năng cung cấp nước cho khoai lang là khác nhau với các mùa vụkhác nhau Điều kiện ngày ngắn đêm mưa hay mưa phùn vụ xuân miền Bắckhoai sinh trưởng thân lá tốt hơn củ Vụ khoai mùa cho năng suất và phẩmchất củ cao hơn vì khoai trồng vào cuối mùa mưa thu hoạch vào đầu mùa khô,

độ ẩm thích hợp cho khoai lấy củ Các tỉnh Bắc Trung Bộ cũng có mùa vụ sảnxuất khoai lang phần lớn tương tự như vùng đồng bằng Bắc Bộ Miền Namkhoai lang được trồng chủ yếu trong vụ Đông Xuân khi nước lụt đã rút [5]

- Đất đai: Khoai lang dễ tính không kén đất lắm, có tính thích ứng rộngvới tất cả các loại đất không ngập nước Tuy nhiên, khoai lang sinh trưởng vàphát triển tốt nhất trên đất tơi xốp và nhẹ, tầng đất mặt sâu, thích hợp nhất làđất cát pha Trồng khoai lang nhất thiết phải có luống, đối với trồng lấy củluống phải cao rộng Khoai lang thích cọ xát cơ giới, thích đất có kết cấu [7].Khoai lang cũng có rất ít kẻ thù tự nhiên nên thuốc phòng trừ dịch hại ítkhi phải dùng tới Do thân phát triển nhanh che lấp và kìm hãm sự phát triểncủa cỏ dại nên việc diệt trừ cỏ cũng đỡ tốn thời gian hơn Trong khu vực nhiệt

đới, khoai lang có thể để ở ngoài đồng và thu hoạch khi cần thiết còn tại khuvực ôn đới thì nó được thu hoạch khi sương giá bắt đầu.

1.1.3 Giá trị của cây khoai lang

1.1.3.1 Giá trị dinh dưỡng và làm thuốc

Thành phần chủ yếu của củ khoai lang là đường bột Trong 100g chấtkhô có 28 – 30g đường bột (tỷ lệ 30%), có dạng gluco, manto, dextrin, tinhbột Độ biến động phụ thuộc vào giống, nơi trồng, khí hậu, độ dài ngày, tỷ lệsâu bệnh, kỹ thuật trồng trọt Ở Việt Nam chất khô của củ khoai lang là 9,2 –33,6% (Ngô Xuân Mạnh, Đinh Thế Lộc, Nguyễn Đăng Hùng, 1994) Hàmlượng caroten nhiều dễ tổng hợp vitamin A, vì vậy ăn khoai lang nhiều rất tốtcho mắt và gan; ngoài ra trong củ còn chứa các sinh tố quan trọng khác nhưvitamin C, B1, B2 Hàm lượng protein thấp 2% ở dạng dễ đồng hóa Khoailang còn có nhiều axit amin quan trọng, đủ 18 loại thường và 8 loại khôngthay thế Về tinh bột chiếm 16,6 – 17,48% so với trọng lượng khô Sự biếnđộng hàm lượng đường tổng số từ 0,38 – 5,64% trọng lượng củ tươi (NgôXuân Mạnh, 1994)

Các giống khoai lang có lớp thịt màu vàng cam sẫm chứa nhiều vitamin

A hơn các giống khác có thịt màu nhạt và việc trồng các giống này đượckhuyến khích tại châu Phi do thiếu hụt vitamin A là vấn đề nghiêm trọng tạikhu vực này [7]

Mặc dù có vị ngọt nhưng khoai lang trên thực tế là thức ăn tốt cho nhữngngười bị tiểu đường do các nghiên cứu sơ bộ trên động vật cho thấy nó hỗ trợ

sự ổn định cho nồng độ đường trong máu và làm giảm sức kháng insulin [7]

Do có nhiều tính ưu việt nên khoai lang có vai trò đáng kể trong cuộcđấu tranh đẩy lùi sự thiếu hụt lương thực và suy dinh dưỡng là hai vấn đề cấpthiết trên thế giới hiện nay

Khoai lang là một trong những cây lương thực quan trọng, được dùnglàm nhiều loại thức ăn quen thuộc như bánh, cháo, chè, mứt… Lá khoai lang

là loại rau dân dã vừa ngon, vừa mát và bổ Củ và rau khoai lang là vị thuốc

phòng chữa bệnh thận, táo bón đã được dùng từ lâu trong dân gian, có nơi gọi

nó là “Sâm Nam” [28]

Theo Đông Y, khoai lang có nhiều tên gọi như Cam thử, Phiên chử Củkhoai lang tính bình, vị ngọt, vào hai kinh tỳ và thận Có tác dụng bồi bổ cơthể, ích khí, cường thận, kiện vị, tiêu viêm, thanh can, lợi mật, sáng mắt, chữavàng da, ung nhọt, viêm tuyến vú, phụ nữ kinh nguyệt không đều, trẻ em camtích, lỵ Rau lang bổ hư tổn, ích khí lực, kiện tỳ vị, tư thận âm Kiêng kị vớicác trường hợp thấp trệ, tiêu chảy, viêm dạ dày đa toan, đường huyết thấp.Khoai lang đỏ vàng có tính chất bổ nhiều hơn công, còn khoai lang trắng thìcông nhiều hơn bổ Đặc điểm này phần nào đã được chứng minh qua thànhphần hóa học của chúng [28]

1.1.3.2 Giá trị kinh tế và khả năng phát triển cây khoai lang ở nước ta

Ngày nay khi nền công nghiệp chế biến phát triển với rất nhiều các sảnphẩm có giá trị sử dụng và tính tiện ích cao thì những nguồn nguyên liệu nhưkhoai lang là vô cùng quan trọng

Từ củ khoai lang người ta đã cho ra nhiều sản phẩm như bột khoai đểlàm bánh, mứt , rượu Sochu Khoai lang còn là nguyên liệu chế biến tinhbột, cồn, nước giải khát, mì, miến, phụ gia dược phẩm, màng phủ sinh học[29] Tại Nam Mỹ, nước lấy từ khoai lang đỏ trộn lẫn với nước chanh để làmmột loại thuốc nhuộm vải bằng cách thay đổi tỉ lệ thành phần của các loạinước này mà người ta thu được các tông màu từ hồng tới tía hay đen [29]

Khoai lang là cây rau lương thực được trồng trên nhiều chân đất và dễthích nghi với điều kiện thời tiết khí hậu từ Bắc vào Nam Đẩy mạnh pháttriển khoai lang có mấy tác dụng sau:

- Góp phần giải quyết vững chắc vấn đề lương thực cho con người do

có khả năng cho năng suất cao tới 30 tấn/ha khoai tươi

- Tạo điều kiện thuận lợi giải quyết thức ăn cho gia súc, đẩy mạnh pháttriển chăn nuôi Thực tế là vùng nào trồng khoai lang vùng đó chăn nuôi pháttriển tốt và có nhiều phân bón để thâm canh.

- Thực hiện được luân canh tăng vụ, cải tạo đất, góp phần xóa dần chế

độ thâm canh cây lúa và sử dụng một cách hợp lý nguồn nhân lực

- Có thể thu về ngoại tệ lớn cho những người nông dân như những câytrồng khác

Do có những tác dụng trên, cây khoai lang có vị trí quan trọng trong sảnxuất lương thực và có ảnh hưởng trong nông nghiệp nước nhà Khả năng mởrộng diện tích và nâng cao năng suất khoai lang là rất lớn, nhất là các tỉnhmiền Nam có thời tiết thuận lợi, đất đai bỏ hoang nhiều, vấn đề luân canh tăng

vụ áp dụng tiến bộ kỹ thuật chưa được chú ý [5] Đẩy mạnh phát triển trồngcây khoai lang bằng cách nắm vững kỹ thuật thâm canh, cải tiến sự thoáigiống là một việc làm cần thiết

1.1.4 Vài nét về giống khoai lang tím Nhật Bản

Giống khoai lang tím Nhật là giống khoai lang mới, có nguồn gốc NhậtBản Hiện nay giống khoai này đã được trồng trên nhiều vùng và cho kết quảcao như Đắc Nông, Đắc Lăk, Vĩnh Long, [27]

Khoai lang Nhật Beniazuma là cây thân thảo, dạng dây leo, hình bò lanrộng, thân to mập, ít phân cành và có màu tím, lá hình tim màu xanh, ngọn và

lá non màu xanh vàng Đầu ngọn màu tím thấy rõ, khi trưởng thành màu tím

mờ đi Củ thuôn dài, nhẵn, vỏ củ màu tím, ruột màu vàng đậm Hàm lượngchất khô 27 - 33% Độ đường và chất lượng cao phù hợp với ăn tươi (luộc,nướng), chế biến, xuất khẩu, khả năng sinh trưởng phát triển mạnh, thời giansinh trưởng ngắn 105 - 120 ngày Năng suất trung bình 20 tấn/ha

Khoai lang Nhật Bản Beniazuma cũng như những giống khoai lang khác,

là loài không chịu được sương giá Vì vậy, trong khu vực nhiệt đới khoai lang

có thể để ngoài đồng và thu hoạch khi cần thiết, còn ở khu vực ôn đới thì nóthì nó được thu hoạch sớm trước khi sương giá bắt đầu.

1.2 Nuôi cấy mô tế bào thực vật và ứng dụng trong tạo giống cây trồng 1.2.1 Khái niệm và cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật

1.2.1.1 Khái niệm

Kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật (NCMTB) hay nhân giống in

vitro đều là thuật ngữ mô tả các phương pháp nuôi cấy các bộ phận thực vật

(tế bào đơn, mô, cơ quan) trong ống nghiệm có chứa môi trường dinh dưỡngthích hợp như muối khoáng, vitamin, đường và các chất điều hòa sinh trưởngthực vật trong điều kiện vô trùng (Bùi Văn Thế Vinh, 2009)

Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật nói chung và kĩ thuật nhân giống

vô tính in vitro nói riêng đều dựa vào cơ sở khoa học là tính toàn năng, sự

phân hoá và phản phân hoá của tế bào

1.2.1.2 Cơ sở khoa học

- Tính toàn năng của tế bào

Theo Haberland (1902) mỗi một tế bào bất kì của một cơ thể sinh vật đabào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh.Theo quan điểm sinh học hiện đại thì mỗi một tế bào đã chuyên hoá đềuchứa một lượng thông tin di truyền (bộ ADN) tương đương với lượng thôngtin di truyền của một cơ thể trưởng thành Vì vậy, trong điều kiện nhất địnhmột tế bào bất kì đều có thể phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh Đặc tính

đó của tế bào gọi là tính toàn năng của tế bào

Quá trình phát sinh hình thái trong NCM-TB thực chất là kết quả của sựphân hoá và phản phân hoá

- Sự phân hoá và phản phân hoá của tế bào

Cơ thể sinh vật trưởng thành bao gồm nhiều cơ quan có chức năng khácnhau được hình thành từ nhiều loại tế bào Tất cả các tế bào đó đều bắt nguồn

từ một tế bào ban đầu (tế bào hợp tử)

Ở giai đoạn đầu tế bào hợp tử phân chia thành nhiều tế bào phôi sinhchưa mang chức năng riêng biệt Sau đó, các tế bào phôi sinh này tiếp tụcđược biến đổi thành các tế bào chuyên hoá đặc hiệu cho các mô, cơ quan khácnhau Đó là sự phân hoá

Tuy nhiên, khi tế bào đã phân hoá thành các tế bào có chức năng chuyênbiệt, chúng không hoàn toàn mất khả năng biến đổi của mình Trong điều kiệnthích hợp chúng có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ.Quá trình đó gọi là quá trình phản phân hoá tế bào

Sự phân hóa và phản phân hóa tế bào có thể biểu thị theo sơ đồ sau:

Phân hóa tế bào

Tế bào phôi sinh ->tế bào dẫn ->tế bào chuyên hóa

< -Phản phân hóa tế

Về bản chất, phân hóa và phản phân hóa là những quá trình hoạt hóagen Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển cá thể, có một sốgen được hoạt hóa (mà trước đây bị ức chế) để cho ra tính trạng mới Điềunày xảy ra theo một chương trình đã được mã hóa trong cấu trúc AND củamỗi tế bào Mặt khác khi tế bào nằm trong một khối mô của cơ thể thường

bị ức chế bởi các tế bào xung quanh Khi tách riêng rẽ các tế bào thì sẽ loạitrừ sự ức chế sinh trưởng đó, nếu gặp điều kiện thuận lợi thì các gen sẽđược hoạt hóa, quá trình phân hóa được thực hiện theo một chương trình đãđịnh [2], [14], [19], [20]

1.2.2 Lịch sử phát triển và những thành tựu ứng dụng NCMTB thực vật trong tạo giống cây trồng

1922

Kotte và Robins nuôi cấy đỉnh sinh trưởng của rễ một cây hòathảo và nhận thấy sự ảnh hưởng của khoáng và glucose Tuynhiên, sự sinh trưởng ngừng lại sau đó dù đã được cấy chuyền

1934

White nuôi cấy thành công đầu rễ cà chua trong thời gian vôhạn trên môi trường chứa khoáng, glucose và dịch chiết nấmmen Sau đó, phát hiện ra sự ảnh hưởng của các vitamin nhóm

B (B1, B6) và acid nicotinic và sử dụng để thay thế cho dịchchiết nấm men

vật đầu tiên là IAA

môi trường agar bằng cách cấy chuyền 6 tháng một lần

hưởng của nó trong việc phân chia tế bào mô thân cây thuốc lá.1957

Skoog và Miller nhận thấy sự ảnh hưởng của tỷ lệcytokinin/auxin lên sự biệt hóa và tái sinh cơ quan của mô sẹothuốc lá

1954

sẹo bằng máy lắc

1960

Bergman tiến hành thu tế bào đơn bằng lọc đơn giản và đưa ra

kỹ thuật gieo tế bào đơn

Cooking tạo ra các tế bào trần bằng enzym cellulase

1962

Murashige và Skoog đã cải tiến môi trường nuôi cấy và môitrường của họ được dùng làm cơ sở cho việc nuôi cấy nhiềuloại cây khác nhau cây khác nhau

cà độc dược và tạo thành các cây đơn bội

1970

Nagata và Takebe tái tạo thành công vách tế bào trần cây thuốc

lá và mở rộng ra khả năng lai các giống khác nhau của cùngmột loài thực vật và tái sinh cây mới bằng các kỹ thuật dunghợp tế bào trần

1.2.2.2 Thành tựu

Phương pháp NCMTB thực vật có ý nghĩa quan trọng đối với nghiêncứu lý luận sinh học cơ bản, đồng thời nó có giá trị đóng góp trực tiếp chothực tiễn sản xuất và đời sống.

Phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật được ứng dụng trong một

 Chọn lọc tế bào có những đặc tính mong muốn, cho phát triển thànhcây con thay vì chọn lọc cây ngoài đồng ruộng (nuôi cấy tế bào đơn)

Sản xuất dòng cây đồng hợp tử (nuôi cấy bao phấn và túi phấn)

 Vi nhân giống những giống cây có giá trị khoa học và thương mại

 Bảo quản phôi và cơ quan trong điều kiện nhiệt độ thấp

 Nuôi cấy phôi sinh dưỡng, phôi hợp tử

 Nuôi cấy quang tự dưỡng

1.2.2.3 Các bước thực hiện nuôi cấy mô tế bào thực vật

Quá trình vi nhân giống được chia thành các giai đoạn sau:

- Chọn lựa và khử trùng mẫu cấy

Khi chọn cây mẹ phải chú ý xác định đúng cây cần nhân giống Cây mẹphải sạch bệnh và tốt nhất là chọn cây trồng trong nhà kính hoặc trong phòng

tăng trưởng Kết quả nhân giống tốt nhất có thể đạt được khi mẫu cấy được

lấy vào thời điểm sinh trưởng mạnh nhất của cây mẹ

Mẫu thu được phải rửa dưới vòi nước từ 30 phút – 2 giờ, sau đó rửa mẫu

bằng xà phòng sẽ làm giảm đáng kể nguồn lây nhiễm trên mẫu cấy Dung dịch

thường sử dụng để khử trùng mẫu là hypochloride sodium 0,5 – 5,25%, cồn,hypochlorite calcium, oxy già, nitrate bạc, dung dịch bromie, clorua thủyngân Sau khi khử trùng, mẫu cấy phải được rửa lại vài lần với nước cất vôtrùng trong tủ cấy để sửa sạch các chất khử trùng còn bám trên bề mặt mẫu,những phần bị tổn thường phải cắt bỏ, đồng thời mẫu cấy phải được cắt theokích thước thích hợp

Mẫu cấy của vài loài thực vật có thể hóa nâu hoặc đen sau vài ngày kể từkhi bắt đầu nuôi cấy Từ kinh nghiệm thực tiễn người ta rút ra rằng để làmgiảm hiện tượng hóa nâu của mẫu cấy nên:

 Sử dụng mẫu cấy nhỏ ở mô non Gây vết thương trên mẫu với kíchthước nhỏ nhất

 Ngâm mẫu vào dung dịch acid ascorbic trong vài giờ trước khi cấyvào môi trường

 Nuôi cấy mẫu trong môi trường lỏng có lượng O2 thấp, không có ánhsáng trong 1 – 2 tuần

 Chuyển mẫu từ môi trường có chất kích thích sinh trưởng nồng độthấp sang môi trường có chất kích thích sinh trưởng nồng độ cao

 Chuyển mẫu liên tục trong khoảng thời gian 2 – 4 tuần kể từ khi bắtđầu nuôi cấy thì một lượng lớn các hợp chất phenol sẽ không tích tụ

 Tạo thể nhân giống in vitro:

+ Mẫu nuôi cấy được cấy trên môi trường chọn lọc đặc biệt nhằm mục

đích tạo thể nhân giống in vitro Có hai thể nhân giống in vitro: thể chồi, thể

cắt đốt

+ Tạo thể nhân giống in vitro dựa vào đặc điểm nhân giống ngoài tự

nhiên của cây trồng Tuy nhiên, có những loài cây trồng không có khă năngnhân giống, người ta thường nhân giống bằng cách tạo cụm chồi từ mô sẹo.+ Để nhân giống, trong môi trường nuôi cấy thường bổ sung cytokinin,GA3 và các chất hữu cơ khác

- Nhân giống in vitro

Đây là giai đoạn quan trọng trong việc nhân giống cây trồng bằngphương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật nhằm mục đích tăng sinh khối thểnhân giống Vật liệu nuôi cấy là những thể chồi, môi trường nuôi cấy thôngthường giống với môi trường tạo thể chồi, đôi khi nồng độ chất sinh trưởng

giảm thấp cho phù hợp với quá trình nhân giống kéo dài Cây nhân giống in

vitro có trạng thái sinh lý trẻ và được duy trì trong thời gian vô hạn.

- Tái sinh cây hoàn chỉnh in vitro

Ở giai đoạn này cây non được tạo ra hoàn chỉnh có đầy đủ thân, lá và rễchuẩn bị chuyển ra vườn ươm cây Cây con phải khỏe mạnh nhằm nâng caosức sống khi ra môi trường bình thường Các chất có tác dụng tạo chồi đượcloại bỏ, thay vào đó là các chất kích thích quá trình tạo rễ Điều kiện nuôi cấytương tự với điều kiện tự nhiên bên ngoài, một bước thuần hóa trước khi được

tách ra khỏi điều kiện in vitro Sự ra rễ phụ thuộc vào nhiều yếu tố: hàm lượng

auxin nội sinh, tỷ lệ C/N, ánh sáng, sự trẻ hóa của mẫu, kiểu di truyền Người

ta thường bổ sung auxin để kích thích quá trình ra rễ in vitro.

- Chuyển cây con in vitro ra vườn ươm

Đây là giai đoạn khó khăn nhất trong quá trình nhân giống vô tính Cây

in vitro nuôi cấy trong điều kiện ổn định về dinh dưỡng, ánh sáng, nhiệt độ,

độ ẩm nên khi chuyển ra đất cây dễ mất nước và mau héo

Để tránh tình trạng này, vườn ươm cây cấy mô phải mát, cường độ chiếusáng thấp, nhiệt độ không khí mát, ẩm độ cao cây non thường được cấytrong luống ươm cây có cơ chất dễ thoát nước, tơi xốp, giữ được ẩm, trong

những ngày đầu cần phải được phủ nylon để giảm quá trình thoát nước ở lá( thường 7 – 10 ngày kể từ ngày cấy) Rễ được tạo ra trong quá trình cấy mô

sẽ dần dần bị lụi đi và rễ mới xuất hiện, cây con thường được xử lý với chấtkích thích ra rễ bằng cách ngâm hay phun lên để rút ngắn thời gian ra rễ

1.2.2.4 Vai trò các chất điều hòa sinh trưởng trong NCMTB thực vật

Chất điều hòa sinh trưởng hoạt động với liều lượng rất thấp, ở liều lượngcao chúng trở nên độc, điều này cho phép một vài chất kích thích tố được sửdụng như các chất diệt cỏ

Có 5 nhóm chất điều hòa quan trọng trong nuối cấy mô thực vật: auxin,cytokinin, gibberillin, abscisic acid và etylen

- Auxin

Auxin là hợp chất có nhân indole, gồm có 2 loại là auxin có nguồn gốcnội sinh do thực vật tạo ra (IAA) và auxin tổng hợp do con người tạo ra (IBA,NAA, 2,4-D, …)

Auxin tác động lên sự kéo dài tế bào Hiệu quả này là sự nối tiếp cho sựgia tăng tính đàn hồi của thành tế bào và cho sự xâm nhập của nước vào bêntrong tế bào, sự căng của thành tế bào giảm đi và tế bào kéo dài ra [9]

Auxin thay đổi tính thẩm thấu của màng tế bào, sự thay đổi này thể hiệnbằng một sự phóng thích ion H+ Ion này gây ra một hoạt tính acid chịu tráchnhiệm làm giảm tính đề kháng của thành tế bào bởi sự hấp thu ion K+

Auxin tác động lên các quá trình chuyển hóa, đặc biệt nhất là sự tổng hơpARN ribosome

Auxin kích thích sự phân chia tế bào một cách đặc biệt trong quá trìnhhình thành mô sẹo và sự hình thành rễ bất định Auxin cũng ức chế sự pháttriển của chồi nách và sự hình thành phôi sinh dưỡng trong môi trường nuôicấy mô sẹo [16]

- Cytokinin

Cytokinin gồm Kinetin, IBA, Zeatin và 2-iP Người ta biết rằng trongmôi trường nuôi cấy, việc bổ sung cytokinin sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho sựphân chia tế bào và hình thành chồi Cytokinin có vai trò trong sự tạo cơ quanthực vật, chúng kích thích mạnh mẽ sự thành lập chồi non, ngược lại chúng làchất đối kháng với sự tạo rễ.

Cytokinin kích thích quá trình chuyển hóa, bảo vệ các chất chuyển hóachống lại tác dụng của enzyme phân giải, làm chậm quá trình lão hóa

Các chồi nách được xử lý bằng cytokinin sẽ phát triển và cạnh tranh vớicác chồi ngọn

Tóm lại, cytokinin giúp duy trì sự sống của mô, kích thích sự phân chia tế

bào và định hướng tế bào trong quá trình phân hóa, tạo điều kiện nuôi cấy in vitro

- Gibberellin

Gibberellin cũng như auxin, đã nổi bật rất lâu trước khi được nhận dạng.Chất gibberellin đầu tiên được nhận dạng là GA3, đây là các chất có cấu trúcnội sinh

Tính chất chính của gibberellin là sự kéo dài của các đốt thân Tác độngnày cũng có thể áp dụng trên các cuống hoa và điều này cho phép có một sựchín tốt hơn hoặc những phát hoa phát triển hơn (trên các loài nho có chùmnhiều trái, chất gibberellin cho phép làm các chùm nho thưa trái, thoáng hơn).Các gibberellin cũng có tác động trên sự đậu trái của các trái không hạt,chẳng hạn trái lê, quýt, mận và một vài loại cây khác [23]

Khi áp dụng trên các cây ngắn ngày được nuôi cấy bằng chu kỳ sáng

thích hợp, nó có thể hoàn toàn (như cây Volubilis) hoặc từng phần bị ức chế (như cây Chenopodium rubrum) thậm chí kích thích sự ra hoa (như cây

Plumbago) Áp dụng trên các cây dài ngày, nó có thể ức chế sự ra hoa trong

chu kỳ sáng thuận lợi chẳng hạn như cây Equinard, Lolium tenmulentum Tóm lại, trong nuôi cấy in vitro, sự chế ngự của kỹ thuật sẽ vượt qua các

sự cân bằng giữa chất điều hòa với nhau và trong số đó có hai chất chính màvai trò tạo cơ quan là cơ bản: auxin và cytokinin Theo Skoog:

 Nếu tỷ lệ auxin/cytokinin cao, người ta thu được chức năng sinhtạo rễ Nếu tỉ lệ auxin/cytokinin thấp, mô sẽ phát triển về phía chức năngsinh tạo thân

 Nếu tỉ lệ này gần một đơn vị người ta sẽ thu được sinh tạo mô sẹo

1.2.2.5 Các yếu tố khác ảnh hưởng đến NCMTB thực vật [39]

Trong điều kiện nuôi cấy in vitro, các yếu tố ảnh hưởng lên sự phát triển

của cây bao gồm các yếu tố hóa học lẫn vật lý

- Carbon

Trong điều kiện in vitro, ban đầu các mô, tế bào thực vật không có khả

năng tự tổng hợp hoặc khả năng tổng hợp tế bào kém nên ta phải bổ sung các

loại đường để cung cấp carbon cho cây in vitro Thông thường, đường

saccharose tạo nên nguồn carbon tốt nhất Việc trải qua quá trình khử trùngtrong nồi hấp autoclave gây ra việc phân hủy đường do sự thủy phân, nhưngđiều này không thể hiện điều bất lợi nào đến sự phát triển của thực vật

quang hợp, thế nhưng trong điều kiện nuôi cấy in vitro, mức độ quang hợp của

cây tương đối thấp và các cấu phần của cây được tạo thành chủ yếu nhờ sự bổsung dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy Người ta cũng đã nghiên cứu vànhận thấy khả năng kéo dài thân cây thông qua tác động của ánh sáng trongquá trình nuôi cấy nhờ hệ thống phytochrome của thực vật (Jabben, 1980)

- Nhiệt độ

Mỗi một loài cây có một khoảng nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng

và phát triển Thậm chí, sự chênh lệch nhiệt độ giữa các chu kỳ sáng tối cũng

có những ảnh hưởng lớn đến quá trình phát triển của cây Những nghiên cứu

về ảnh hưởng của sự chênh lệch này đã được Kozai và cộng sự tiến hành và

đưa ra kết quả vào năm 1992 trên đối tượng là cây khoai tây in vitro.

- Độ ẩm

Trong môi trường nuôi cấy in vitro, độ ẩm luôn duy trì ở mức cao, độ ẩmtương đối khoảng 90 - 95% Áp suất hơi bên trong mặt lá gần cân bằng với

môi trường xung quanh dẫn đến tình trạng cây con in vitro bị thiểu năng khí

khổng, nhiều khi bị tiêu biến lông sừng và cây dễ bị mất nước khi đưa ra vườnươm Đây cũng là một hạn chế trong nuôi cấy mô tế bào thực vật trong điều

kiện in vitro Hiện nay nhiều hệ thống thoáng khí đã được nghiên cứu, một

phần cũng để giảm bớt hiện tượng bất lợi trên

- Không khí

Thực vật có khả năng quang hợp, thế nên trong bình nuôi cấy luôn có sựthay đổi nồng độ CO2 và O2 theo chu kì sáng, tối là do hoạt động quang hợp

và hô hấp của mô thực vật

Trong bình, còn có sự phóng thích ethylene từ mẫu cấy Chính sựhình thành ethylene cũng đã gây ra những ảnh hưởng xấu lên sự pháttriển bình thường của cây như làm giảm sự mở lá, làm ngắn chồi, câyhướng ngang đất,…

1.3 Tình hình nghiên cứu ứng dụng NCMTB thực vật trong việc tạo giống khoai lang trên thế giới và ở Việt Nam

1.3.1 Trên thế giới

Cây khoai lang được coi là một trong bảy loài cây lương thực quan trọngtrên thế giới và xếp quan trọng hàng thứ năm đối với các nước đang pháttriển Nó được trồng trên hơn 100 quốc gia trên thế giới với chức năng làmột nguồn thực phẩm giá trị đối với con người, gia súc cũng như là vật liệuthô cho các ngành công nghiệp chế biến

Cây khoai lang tạo được lượng sinh khối và chất dinh dưỡng lớn nhấttrên cùng một đơn vị diện tích khi so sánh với bất cứ loài cây trồng nào.Chẳng hạn trong một nghiên cứu tại Nhật Bản khi so sánh với 20 loài tráicây và rau quả khác trong việc làm ngăn chặn cũng như làm giảm lượngcholesterol thì khoai lang được xếp đầu bảng Ngoài ra, khoai lang còn mangtính giải độc cao đối với các loại kim loại nặng

Cây khoai lang thích nghi được với nhiều điều kiện sinh thái nông nghiệpkhác nhau, nó không những phát triển ở vùng đất giàu dinh dưỡng mà có thểmọc ở những vùng đất nghèo dinh dưỡng cũng như những vùng đất bị khô hạn.Tại Ai Cập, khoai lang được trồng ở những vùng đất khác nhau với tổngdiện tích là 11.200 ha với năng suất là 30 tấn/ha Trong vòng vài ba năm quanhu cầu xuất khẩu khoai lang tăng lên rất nhiều nhưng Ai Cập chỉ xuất được

6.000 tấn sang châu Âu Lý do là dịch hại và bệnh đã ngăn cản việc làm chokhoai lang ở Ai Cập không đạt được năng suất tối đa Trong đó, bệnh virusđược coi là nguyên nhân chính làm giảm năng suất Do đó, Viện Kỹ thuật Gentrong Nông nghiệp của Ai Cập (AGERI) đã áp dụng kỹ thuật nhằm cải tạogiống khoai lang gồm các bước như sau:

- Cải tạo giống địa phương bằng việc sản xuất nguồn cây giống sạch bệnh

- Phát triển một hệ thống nhân giống có hiệu quả có khả năng ngăn chặn

sự lây lan của virus

- Phát triển một hệ thống phát hiện virus ở các cánh đồng trồng khoai lang

- Ngoài ra họ còn thiết lập các hệ thống theo dõi đảm bảo chất lượng củasản phẩm khoai lang được sản xuất ra

Kết quả nghiên cứu nuôi cấy đỉnh sinh trưởng của Castro và Andrate(1995) đã chỉ ra trên môi trường MS bổ sung 0,005 mg/l NAA, 0,5 mg/l BA

và 0,25 mg/l GA3 cho kết quả tốt

Các nghiên cứu của Anura Hettiarachchi và Sri Lanka (1988), Castro vàAndrate (1995) trên các giống khoai lang khác nhau: Kết quả đều không thấy

sự khác biệt giữa các giống Các nghiên cứu về cây khoai lang trên thế giớirất đa dạng và phong phú

* Hướng nghiên cứu tạo cây khoai lang in vitro sạch virus [36], [37],

[38]:

Năm 1975, Alconero và cộng tác viên đã kết hợp phương pháp nuôi cấy đỉnhsinh trưởng và xử lý nhiệt để loại trừ virus cây khoai lang Đỉnh sinh trưởng cókích thước từ 0,4 - 0,8 mm được cấy trên môi trường MS, bổ sung kinetin và auxin(NAA, IAA) Sau thời gian 20 - 50 ngày, đỉnh sinh trưởng hình thành mô sẹo.Trong số cây con được kiểm tra virus thì có 47% không nhiễm bệnh

Anura Hettiarachchi và Sri Lanka (1988), sử dụng môi trường MS

bổ sung auxin (2,4-D), cytokinin (KN, BA), GA3 (0,1 mg/l) để nuôi cấy đỉnh

sinh trưởng cây khoai lang Đỉnh sinh trưởng với 2 - 3 lá mầm được cắt vàcấy trên các môi trường có các chất điều hòa sinh trưởng ở những nồng độkhác nhau, và đặt trong phòng nuôi cấy ở nhiệt độ 27 ± 2oC, cường độ ánhsáng 2000 - 3000 lux Kết quả thí nghiệm cho thấy 2,4-D (1 mg/l) và BA(0,25 mg/l) tạo cây con tốt hơn Trường hợp 2,4-D và KN ở nồng độ cao hơntương ứng 2,5 mg/l và 1,5 mg/l sẽ tạo ra mô sẹo.

Mervat và cộng tác viên (2009), nghiên cứu loại trừ virus đốm gợn sóngkhoai lang (SPFMV) Các mẫu ngoài đồng ruộng được kiểm tra hiện diệnvirus bằng phương pháp dot-ELISA Những cây khoai lang bị nhiễm viusđược xử lý ở nhiệt độ 42oC/ ngày (16giờ chiếu sáng) và 39oC/ đêm (8 giờbóng tối) trong thời gian 3 tuần trước khi tách đỉnh sinh trưởng Những câyhình thành từ nuôi cấy đỉnh sinh trưởng tiếp tục kiểm tra virus bằng dot-ELISA Kết quả nghiên cứu cho thấy không có cây nào bị nhiễm [22]

Trong nghiên cứu ảnh hưởng của các chất điều hoà sinh trưởng đến sựnuôi cấy đỉnh sinh trưởng và nhân giống khoai lang, Iftekhar Alam và cộngtác viên (2010) đã cho thấy hơn 75% tạo chồi khi sử dụng môi trường MS có

bổ sung 2 mg/l KN và 0,5 mg/l GA3 Và các chồi này hình thành trực tiếpthành cây mà không phát triển mô sẹo Theo tác giả, TDZ và BA làm cho chồiphát triển qua mô sẹo nên không dùng trong nuôi cấy đỉnh sinh trưởng [21]

* Vi nhân giống:

Nhân giống invitro giống khoai lang từ mô sẹo là nghiên cứu sớmnhất của cây khoai lang do Yamaguchi và cộng sự công bố vào năm 1974.Kết quả cho thấy sự hình thành mô sẹo từ rễ củ trên môi trường White có bổsung 1 mg/l NAA và tái sinh chồi trên môi trường MS có bổ sung 1 mg/lABA, 0,02 mg/l kinetin và 0,04 mg/l 2,4-D Năm 1984, sự tái sinh chồi qua

mô sẹo từ lá, đỉnh chồi, thân và rễ cũng thực hiện bởi Liu và Cantiliffe trênmôi trường MS có bổ sung 0,5 đến 2 mg/l 2,4-D.

Sự tái sinh chồi khoai lang invitro từ rễ đã được công bố bởi Hwang và

cộng sự (1983) Theo nghiên cứu này, đầu tiên các đoạn rễ kích thước 2 – 3 cmđược nuôi cấy lên môi trường MS biến đổi có bổ sung nồng độ muối khoángcao, 100 mg/l meo-inositol, 2 mg/l BA, 0,1 mg/l NAA, 30 mg/l đường và 10 g/lagar Sau đó, từ các nốt rễ sẽ tạo mô sẹo và các vùng giống như mô phân sinh

để phát triển tiếp thành chồi Mười năm sau, Berlamino (1993) thực hiện lại quá

trình tái sinh chồi từ các nốt rễ khoai lang invitro trên giống Benniazuma thông

qua nuôi cấy mô lá trên môi trường MS có bổ sung 0,5 mg/l 2,4-D và 0,1 mg/l

BA và thu tần số tái sinh là 60% với 9 chồi/rễ

Chee và cộng sự (1990) cho rằng bằng cách giảm nồng độ đường trongmôi trường nuôi cấy xuống còn 1,6% cùng với việc bổ sung 2,4 – D sẽ tăngcường sự phát triển phôi Năm 1995, sự tái sinh khoai lang qua cuống lá đượcDesai và cộng tác viên thực hiện thành công trên 27 giống Giai đoạn đầu,các lá cấy lên môi trường MS có bổ sung 0,1 mg/l 2,4 – D và 0,2 mg/lzeatin cho tới khi cuống lá bắt đầu phình lên (2 – 4 ngày) Giai đoạn thứ hai,chúng cấy chuyển sang môi trường MS có bổ sung 0,8 mg/l zeatin và đạt tần

số tái sinh chồi cao

Một tần số tái sinh cây cao được thiết lập từ các mô sẹo có nguồn gốc từ

các mảnh lá khoai lang in vitro nuôi cấy trên môi trường LS có bổ sung 0,5

mg/l 2,4 – D, 3g/l dịch chiết nấm men, 50 g/l đường và chuyển sang môitrường thứ hai gồm khoáng LS có bổ sung 2 mg/l ABA hoặc 2 mg/l AgNO3

để tái sinh thành cây (Otani và cộng tác viên, 1996)

Một quy trình tái sinh cây trực tiếp gồm 2 giai đoạn cũng được công bốbởi Prakash và cộng tác viên (1996) Các mô cuống lá trong môi trường MS

có bổ sung 2,4 – D trong giai đoạn đầu tiên và TDZ trong giai đoạn thứ hai

Công bố này cho thấy khả năng tái sinh cây phụ thuộc vào kiểu di truyền,giai đoạn phát triển và hướng đặt mô cuống lá trên môi trường nuôi cấy.

Năm 1997, Liu và cộng tác viên đã thiết lập thành công một hệ thốnghiệu quả qua nuôi cấy dịch huyền phù tế bào có khả năng phát sinh phôi vàtái sinh thành cây khoai lang bằng cách sử dụng 2,4–D và ABA Cũng trongnăm 1997, Sihachakr nghiên cứu thành công hệ thống tái sinh cây khoai langqua con đường phát sinh phôi Các nhân tố ảnh hưởng đến việc tạo mô sẹo

và hình thành chồi cũng được thực hiện Công bố này đã cung cấp một loạimôi trường cải biên trong nghiên cứu tái sinh khoai lang, môi trường SPM(Standard Sweet Potato Medium) SPM là môi trường MS có bổ sung vitaminDtaba 100mg/l; myo – inositol 50mg/l và 30g/l đường Kết quả cho thấy trênmôi trường SPM có bổ sung tổ hợp của 0,5 mg/l kinetin và 0,1 mg/l 2,4 – D

mô sẽ tái tạo chồi

* Quang tự dưỡng:

Sự phát triển của cây khoai lang in vitro được cải thiện dưới các điều

kiện vi nhân giống quang tự dưỡng (không bổ sung đường trong môi trườngnuôi cấy, cường độ chiếu sáng 100 µM.m-2.s-1 PPFD và nồng độ CO2 cao)(Kozai và ctv, 1993)

Về nguồn gen thu thập và nhập nội, chương trình cây có củ quốc gia đãnhập nội và tổ chức sưu tập nguồn gen trong cả nước trong đó có Trườngđại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh tham gia Các nguồn gen này hiện đượclưu trữ tại Trung tâm Cây có củ thuộc Viện Khoa học Nông Nghiệp ViệtNam và Trung tâm Nghiên cứu Nông Nghiệp Hưng Lộc, Viện Khoa họcNông Nghiệp miền Nam gồm nhiều mẫu giống và dòng lai.

Kết quả chọn tạo giống khoai lang từ 1991 - 1995 của Trung tâm Nghiêncứu Nông Nghiệp Hưng Lộc và Trường đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh đãtuyển chọn 36 dòng triển vọng có năng suất củ tươi cao và phẩm chất củ ngon,với các giống khoai lang tốt như: K4, TN66, HL-4, NC1525, HL-419, HL-518.Năm 1993 - 1994, các giống K4, HL-4, TN66 đã được Bộ Nông nghiệp và Pháttriển Nông thôn công nhận (Hoàng Kim, Nguyễn Thị Sâm, Nguyễn Thị Thủy,Nguyễn Đức Tuyến, Trương Văn Hộ và Enrique Chujoy, 1995)

Hiện nay, trên lĩnh vực công nghệ sinh học, cây khoai lang chưa đượcnghiên cứu nhiều ở nước ta Tuy nhiên vẫn có một số các nghiên cứu nổi bật,

trong đó có nghiên cứu của Nguyễn Mỹ Uyên và cộng tác viên (2006) Khảo

sát sự tăng trưởng in vitro của cây khoai lang Ipomoea batatas L trong điều kiện chiếu sáng tự nhiên Và nghiên cứu của Nguyễn Thị An (2011) Tìm hiểu quy trình vi nhân giống khoai lang HL518 từ đốt thân, tại trường Đại học Kỹ

Thuật Công Nghệ Thành phố Hồ Chí Minh

CHƯƠNG II.

ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng và địa điểm nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

- Đối tượng nghiên cứu là cây khoai lang tím Nhật nhập nội (Ipomoea

batatas L.) được Viện Khoa học kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam nhập nội

năm 2004 Đây là giống khoai lang đang được người dân ưa chuộng về giá trịthương phẩm và giá trị kinh tế

- Vật liệu nuôi cấy là đỉnh sinh trưởng và các đoạn thân mang chồi náchlấy từ dây khoai lang mập, khỏe, không bị sâu bệnh

2.1.2 Địa điểm nghiên cứu

- Địa điểm: Các thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm “Nuôicấy mô tế bào thực vật”, Tổ Sinh – Địa, Trung tâm Thực hành thí nghiệm,Trường Đại học Vinh

- Thời gian nghiên cứu: từ tháng 1/2012 – 8/2012

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Xác định ảnh hưởng của hóa chất khử trùng HgCl2, H2O2 và thời giankhử trùng thích hợp đến mẫu nuôi cấy

- Xác định ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng GA3 và nước dừađến khả năng tái sinh chồi cây khoai lang

- Xác định ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng Kinetine, IAAđến khả năng nhân nhanh chồi cây khoai lang

- Xác định ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng α - NAA vàthan hoạt tính đến khả năng ra rễ của chồi cây khoai lang

- Xác định ảnh hưởng của loại giá thể đến khả năng sinh trưởng phát triển

của cây con sau nuôi cấy mô ex vitro.

2.3 Phương pháp nghiên cứu

Các thí nghiệm được tiến hành theo sơ đồ sau:

- Điều kiện thí nghiệm: Quá trình nuôi cấy invitro được tiến hành trong

môi trường nhân tạo, vô trùng, có thể thay đổi các điều kiện về nhiệt độ, ẩm

độ, điều kiện chiếu sáng Ánh sáng trong phòng nuôi cấy là ánh sáng đèn neonvới cường độ chiếu sáng: 2000 – 3000 lux, thời gian chiếu sáng: 16h sáng/8htối, nhiệt độ phòng cấy: 20 – 30oC, độ ẩm: 70 – 74%

 Giai đoạn tạo vật liệu khởi đầu

- Chọn mẫu: Cây giống được trồng trên cát vô trùng Chọn những cây

có thân khỏe mạnh, không sâu bệnh, có nhiều chồi bên Cắt thành những đoạnthân dài 2 – 3cm (gồm cả chồi nách)

Giai đoạn tạo vật liệu khởi

Giai đoạn nhân nhanh

- Xử lý mẫu: Rửa sạch mẫu cấy bằng xà phòng dưới vòi nước chảy 3lần trong 10 – 15 phút Rửa lại bằng nước cất vô trùng Lắc cồn 70o trong 1phút Sau đó khử trùng bằng hóa chất khử trùng.

- Hóa chất khử trùng: oxy già H2O2, thủy ngân clorua HgCl2

- Các công thức thí nghiệm được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toànvới 3 lần nhắc lại, tiến hành trên 10 bình, mỗi bình cấy 3 mẫu

- Thời gian: 4 tuần

- Các chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ mẫu nhiễm, tỷ lệ mẫu chết, tỷ lệ mẫu sốngsạch bệnh

- Các thí nghiệm tiến hành:

Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng oxy già và

thời gian đến tỷ lệ sống của mẫu cấy

CT1: 10% H2O2 + 10 phútCT2: 10% H2O2 + 20 phútCT3: 10% H2O2 + 30 phútCT4: 10% H2O2 + 40 phút

Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng HgCl2 vàthời gian đến tỷ lệ sống của mẫu cấy

CT1: 0,1% HgCl2 + 5 phút

CT2: 0,1% HgCl2 + 10 phútCT3: 0,1% HgCl2 + 15 phútCT4: 0,1% HgCl2 + 20 phút

- Các chỉ tiêu theo dõi:

∑ mẫu nhiễm

+ Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) = x 100

∑ mẫu nuôi cấy

∑ mẫu nuôi cấy

 Giai đoạn tái sinh chồi

- Mẫu: các mẫu sạch bệnh từ TN1, TN2

- Môi trường: Các mẫu sạch bệnh được cấy chuyển vào môi trường táisinh chồi là môi trường MS bổ sung Saccarose 3%, Agar 0,8%, pH = 5,7 Cácchất điều tiết sinh trưởng là GA3 (Gibberellic acid) và nước dừa

- Thời gian: 4 tuần

- Các công thức thí nghiệm tiến hành trên 10 bình, mỗi bình cấy 1 mẫu,mỗi công thức lặp lại 3 lần