Nghiên cứu phương pháp thu nhận collagen từ da cá tra (pangasius hypophthalmus)

Collagen chiếm 30 % tổng lượng protein của cơ thể, đóng vai trò then chốt trong thành phần cấu tạo của các mô liên kết như da, gân, xương, dây chằng,…Collagen là một loại vật liệu sinh h

i

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

LÊ THỊ THU HƯƠNG

NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN COLLAGEN TỪ

DA CÁ TRA (PANGASIUS HYPOPHTHALMUS)

LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT

TP HỒ CHÍ MINH NĂM 2018

ii

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

LÊ THỊ THU HƯƠNG

NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN COLLAGEN TỪ

DA CÁ TRA (PANGASIUS HYPOPHTHALMUS)

Chuyên ngành: Chế biến Thực phẩm và Đồ uống

Mã số chuyên ngành: 62540201

Phản biện độc lập 1: PGS.TS Quản Lê Hà

Phản biện độc lập 2: PGS.TS Đặng Minh Nhật

Phản biện 1: GS.TSKH Nguyễn Minh Tuyển

Phản biện 2: GS.TS Lê Văn Việt Mẫn

Phản biện 3: TS Lê Thị Minh Thủy

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

1 GS.TS Phan Đình Tuấn

2 PGS.TS Nguyễn Hoàng Dũng

iii

LỜI CAM ĐOAN

Tác giả xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân tác giả Các kết quả nghiên cứu và các kết luận trong luận án này là trung thực, và không sao chép từ bất kỳ một nguồn nào và dưới bất kỳ hình thức nào Việc tham khảo các nguồn tài liệu đã được thực hiện trích dẫn và ghi nguồn tài liệu tham khảo đúng quy định

Tác giả luận án

Lê Thị Thu Hương

iv

TÓM TẮT LUẬN ÁN

1 Tính cấp thiết của luận án

Collagen là một loại protein chủ yếu của chất nền ngoại bào và mô liên kết [1], [2] Collagen chiếm 30 % tổng lượng protein của cơ thể, đóng vai trò then chốt trong thành phần cấu tạo của các mô liên kết như da, gân, xương, dây chằng,…Collagen là một loại vật liệu sinh học được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp sản xuất mỹ phẩm, thực phẩm và dược phẩm [3], [4]

Trước đây, collagen được tinh chế từ các nguồn nguyên liệu da và xương của trâu, bò, lợn Từ năm 2000 đến nay, do sự bùng nổ của bệnh bò điên, bệnh lở mồm long móng ở lợn và gia súc; thêm vào đó, vì lý do tôn giáo một số đạo cấm sử dụng sản phẩm có nguồn gốc từ bò, lợn nên đa số các nghiên cứu tách chiết collagen tập trung vào nguồn nguyên liệu thay thế có nguồn gốc từ thủy sản

Việt Nam là một trong những quốc gia xuất khẩu thủy sản lớn của thế giới, chủ yếu là mặt hàng phi lê cá tra, cá ba sa Lượng phụ phẩm của hai loại cá này thải ra hàng năm lên tới hàng trăm ngàn tấn Tại thời điểm hiện tại, phụ phẩm cá tra, cá ba sa chủ yếu được chế biến thành thức ăn gia súc và phân bón có giá trị kinh tế thấp Trong khi đó,

da cá tra chứa một lượng collagen khá lớn, đây là sản phẩm có giá trị cao, được ưa chuộng trên thị trường thế giới, có rất nhiều ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm, dược phẩm và vật liệu sinh học

Nghiên cứu phương pháp thu nhận collagen từ da cá tra nhằm đa dạng hóa các sản phẩm

có nguồn gốc từ thủy sản, nâng cao giá trị kinh tế của loài cá tra, cá ba sa, từ đó nâng cao thu nhập cho người nuôi trồng và chế biến thủy sản là rất cần thiết

2 Mục tiêu của luận án

Đề tài “Nghiên cứu phương pháp thu nhận collagen từ da cá tra (Pangasius

hypophthalmus)” được thực hiện với mục tiêu:

(1) Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ tách chiết collagen và xác định các giải pháp kỹ thuật để nâng cao hiệu suất thu nhận collagen;

(3) Xác định một số đặc tính hóa lý của collagen tách chiết từ da cá tra

3 Nội dung nghiên cứu

- Xác định thông số kỹ thuật của ba công đoạn chính trong quy trình công nghệ tách chiết collagen: tách tạp chất, trích ly và tinh sạch collagen

- Tối ưu hóa quá trình trích ly collagen bằng phương pháp bề mặt đáp ứng (Response Surface Mothodology) sử dụng phần mềm Design Expert 10: Thiết kế thí nghiệm theo phương án quay bậc hai tâm xoay Box – Hunter; đánh giá tính ý nghĩa của các hệ số hồi quy theo chuẩn Student; đánh giá tính phù hợp của phương trình hồi quy theo chuẩn Fisher; Tối ưu hóa giá trị các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất trích ly collagen bằng phương pháp bề mặt đáp ứng; Kiểm tra sự tương thích giữa thực nghiệm và mô hình dự đoán

- Nghiên cứu động học và cơ chế của quá trình trích ly collagen: với các thông số ảnh hưởng và vùng khảo sát đã xác định được qua nghiên cứu tối ưu hóa ở trên, tiến hành khảo sát sự thay đổi hàm lượng collagen trích ly theo thời gian và theo sự thay đổi hàm lượng của các thông số ảnh hưởng Kết quả thực nghiệm thu được dùng để kiểm chứng, đánh giá sự tương thích của ba mô hình với thực nghiệm để chọn mô hình phù hợp mô

vi

(1) Đã xây dựng được mô hình toán học mô tả quy luật ảnh hưởng của nồng độ acetic acid, hàm lượng enzyme pepsin và tỷ số dung môi / da cá đến hiệu suất trích ly collagen; (2) Xác định được quá trình trích ly collagen từ da cá tra tuân theo quy luật động học bậc hai;

(3) Xác định được bản chất của collagen tách chiết từ da cá tra và các đặc tính của nó

* Về mặt thực tiễn

(1) Đưa ra giải pháp kỹ thuật hiệu quả để làm sạch da cá tra trước khi trích ly bằng cách

sử dụng LASNa để loại lipid và H2O2 để khử màu da cá với các thông số kỹ thuật cụ thể

(2) Xây dựng được phương trình hồi quy mô tả quan hệ giữa hiệu suất trích ly collagen với các yếu tố ảnh hưởng: nồng độ acetic acid, hàm lượng enzyme pepsin và tỷ số dung môi/da cá, từ đó xác định được các giá trị tối ưu

(3) Xác định được điều kiện tốt nhất để loại muối ra khỏi collagen bằng phương pháp thẩm tích với hiệu suất tách muối cao nhất đạt 95,75%

(4) Xác định được điều kiện tốt nhất để loại lipid ra khỏi collagen thành phẩm bằng kỹ thuật trích ly lipid bằng dung môi CO2 siêu tới hạn

(5) Đánh giá các đặc tính chất lượng của collagen thành phẩm cho thấy sản phẩm phù hợp để dùng làm vật liệu sinh học hoặc sử dụng trong nuôi cấy tế bào

vii

ABSTRACT

Fish skin is the byproduct of fishery companies in the Mekong River Delta Basa fish

(Pangasius hypophthalmus) skin contains large amounts of collagen, highly valuable

protein in the food, cosmetics and pharmaceutical industries The aims of this thesis

"Research on methods of extraction collagen from tra fish (Pangasius hypophthalmus)

skin" were as follows: (1) Research on extraction process of collagen from tra fish

(Pangasius hypophthalmus) skin; (2) Optimisation and kinetics studies on the extraction

of collagen from tra fish skin; (3) Studies on the characterizations of collagen from tra fish skin

The thesis presented an overview of the structure, origin and application of collagen; the collagen extraction methods and the theoretical basis of kinetic of solid – liquid extraction

Statistical optimization of process conditions using the central composite design (CCD) appeared to be an effective tool for the extraction process of soluble collagen from the

fish skin (Pangasius hypophthalmus) Each of the three independent variables (acetic

acid concentration, liquid to solid ratio, and pepsin content) showed a significant effect

in the yield of extracted collagen The mathematical model gave an R2 of 0,993 and a P value of less than 0,0001, which implied a good agreement between the predicted values and the actual values of the yield of PSC, thus confirmed a good generalization of the mathematical model

The optimal conditions to obtain maximum yield of PSC were identified as follows: 0,47

M of acetic acid concentration, 55 mL/g of liquid to solid ratio and 0,49 % of pepsin content Under these optimized conditions, the experimental PSC extraction yield agreed closely with the predicted yield of 92,44 %

Kinetic models based on the second order rate equation were successfully developed to describe the extraction process with different processing variables Extraction rate constant, initial extraction rate and equilibrium concentrations of collagen for different acetic acid concentrations, pepsin contents and liquid to solid ratios were predicted The

viii

model verification showed that the experimental values agreed with the predicted ones, with percentage error differences in the range of 0,18 - 4,05 %

The extraction of collagen from basa fish (Pangasius hypophthalmus) skin mainly

consists of three phases: Phase 1- Removing fat and pigments: basa fish skin was treated

by LASNa 0,5 % to remove fat, during 6 hours and H2O2 1 % to remove pigments, during 2 hours The compositions of basa fish skin after treatment by LASNa were as follows: hydroxyproline - 13,8 mg/g; moisture - 79,54 %; organic substance - 20,33 %; lipid – 0,98 % and ash – 0,13 %; color parameters obtained as follows: L = 73,065 ± 0,12; a = -3,64 ± 0,11 and b =18,32 ± 0,68 Phase 2 - Extraction of collagen from basa fish skin and fractional precipitation to obtain collagen: Collagen was extracted from basa fish skin with acetic acid - 0,47 M, pepsin - 0,49 % and L/S - 55 ml/g during 24 hours at a temperature of 4 °C, then NaCl was added to a final concentration of 0,9 M

in order to precipitate collagen Phase 3 - Refining collagen in two main stages (removing sodium chloride in solution collagen by dialysis and removing lipid by SCCO2) After purification, the compositions of collagen were: 0,159 % of NaCl; 0,1467

% of lipid (by dry weight)

The collagen from basa fish skin is identified as type I collagen The collagen consist of three chains as follows: the α chain with molecular weight of about 130 kDa, the β chain with molecular weight of about 250 kDa (as components of two α chain) and the γ chain chain with molecular weight of about 300 kDa (as components of 3 α chain) The denature temperature of collagen is 39 oC The final product’s compositions were: hydroxyproline 97,76 mg/g (corresponding collagen content is 927,7 mg/g); organic compounds 92,8 %; moisture 7,0 %; lipid 0,03 % and ash 0,20 %; without detection of heavy metals (As, Pb) The product met the microbiological standards of Vietnam Pharmacopoeia IV-2009

ix

LỜI CÁM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới: GS.TS Phan Đình Tuấn và PGS.TS Nguyễn Hoàng Dũng, những người thầy đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận án này

Xin cảm ơn dự án RBE (Research Based Education)- JICA, thầy PGS.TS Nguyễn Hoàng Dũng, chủ nhiệm đề tài B1-07 “Fish collagen extraction and application” và cô

PGS.TS Phan Ngọc Hòa chủ nhiệm đề tài B2-06 “Purification collagen from Pangasius

hypophthalmus fish skin and application”, GS Shigeru Morimura - cố vấn đề tài, cùng

toàn thể các thành viên thực hiện đề tài đã hỗ trợ và cho tôi nhiều ý kiến quý báu trong quá trình thực hiện luận án

Tôi xin trân trọng cảm ơn sự giúp đỡ quý báu của GS.TS Lê Văn Việt Mẫn, TS Trần Bích Lam, GS.TS Đống Thị Anh Đào, Cô Nguyễn Thị Nguyên, PGS.TS Mai Thanh Phong, PGS.TS Lê Kim Phụng, TS Hoàng Minh Nam, Khoa Kỹ Thuật Hóa Học, Trường Đại học Bách Khoa Thành phố Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu thực nghiệm và dành cho tôi nhiều ý kiến trao đổi khoa học bổ ích cho luận án

Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu Trường Đại học Bách Khoa Thành phố Hồ Chí Minh, Phòng Sau đại học, Ban chủ nhiệm Khoa Kỹ thuật Hóa Học và Bộ môn Công Nghệ Thực Phẩm đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu

Tôi xin trân trọng cảm ơn tập thể cán bộ giảng viên Khoa Kỹ thuật Hóa học & Môi trường, Ban Giám hiệu Trường Đại học Lạc Hồng đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp

đỡ tôi trong quá trình vừa công tác vừa thực hiện luận án

Tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã động viên và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua Một lần nữa, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và gởi lời chúc tốt đẹp nhất tới quý thầy

cô, bạn bè, đồng nghiệp, các em sinh viên và gia đình đã hỗ trợ, động viên và khuyến khích tôi trong suốt thời gian qua

x

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH xv

DANH MỤC BẢNG BIỂU xviii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT xx

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Nguồn gốc, cấu tạo, tính chất và ứng dụng của collagen 3

1.1.1 Nguồn nguyên liệu tách chiết collagen 3

1.1.1.1 Collagen tách chiết từ da bò 3

1.1.1.2 Collagen tách chiết từ da lợn 3

1.1.1.3 Collagen tách chiết từ cá 4

1.1.2 Cấu tạo phân tử collagen 4

1.1.2.1 Thành phần amino acid của phân tử collagen 5

1.1.2.2 Cấu trúc của collagen 7

1.1.3 Phân loại collagen 10

1.1.3.1 Collagen dạng sợi 10

1.1.3.2 Collagen không ở dạng sợi 10

1.1.4 Tính chất của collagen 12

1.1.4.1 Tính hydrate hóa của collagen 13

1.1.4.2 Độ nhớt của dung dịch collagen 14

1.1.5 Ứng dụng của collagen 15

1.1.5.1 Ứng dụng của collagen trong thực phẩm 15

1.1.5.2 Ứng dụng của collagen trong lĩnh vực vật liệu sinh học 16

xi

1.1.5.3 Ứng dụng của collagen trong dược phẩm 17

1.2 Đặc điểm của cá tra 19

1.3 Các phương pháp tách chiết collagen từ da cá 19

1.3.1 Tình hình nghiên cứu tách chiết collagen từ da cá trong nước và trên thế giới 19

1.3.2 Trình tự tách chiết collagen từ da cá 21

1.2.2.1 Quá trình tách tạp chất để sản xuất collagen 22

1.2.2.2 Quá trình trích ly collagen 26

1.2.2.3 Quá trình tinh sạch collagen 30

1.4 Nghiên cứu động học của quá trình trích ly rắn –lỏng 32

1.4.1 Mô hình hấp phụ Peleg 33

1.4.2 Mô hình khuếch tán Fick 33

1.4.3 Mô hình động học bậc hai 33

1.5 Những vấn đề tồn tại và định hướng nghiên cứu 34

1.5.1 Những vấn đề tồn tại 34

1.5.2 Định hướng nghiên cứu 34

CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35

2.1 Nguyên vật liệu, hóa chất 35

2.1.1 Nguyên liệu 35

2.1.2 Hoá chất 35

2.2 Quy trình tách chiết collagen từ da cá tra 37

2.3 Phương pháp nghiên cứu 39

2.3.1 Sơ đồ nghiên cứu 39

2.3.2 Hoạch định thí nghiệm 41

2.3.2.1 Khảo sát quá trình tách tạp chất từ da cá tra (Pangasius hypophthalmus) 41

2.3.2.2 Khảo sát quá trình trích ly collagen từ da cá tra 42

xii

2.3.2.3 Nghiên cứu động học và cơ chế trích ly collagen 45

2.3.2.4 Phương pháp tinh sạch collagen 50

2.3.3 Phương pháp phân tích 53

2.3.3.1 Phương pháp hóa lý 53

2.3.3.2 Phương pháp phân tích vi sinh 59

2.3.4 Phương pháp xử lý số liệu 60

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 61

3.1 Phân tích nguyên liệu da cá tra 61

3.2 Khảo sát quá trình tách tạp chất từ da cá tra 62

3.2.1 Tách tạp chất từ da cá tra bằng NaOH 62

3.2.2 Tách tạp chất từ da cá tra bằng LASNa 64

3.2.3 Tách tạp chất từ da cá tra bằng ethanol 65

3.2.4 Xử lý màu da cá tra bằng H2O2 68

3.3 Khảo sát sự ảnh hưởng của các yếu tố đến hiệu suất trích ly collagen 71

3.3.1 Ảnh hưởng của nồng độ acetic acid đến hiệu suất trích ly collagen 71

3.3.2 Ảnh hưởng của tỷ số dung môi : da cá (L/S) đến hiệu suất trích ly collagen 73

3.3.3 Ảnh hưởng của hàm lượng enzyme pepsin đến hiệu suất trích ly collagen 74

3.4 Tối ưu hóa quá trình trích ly collagen bằng phương pháp bề mặt đáp ứng sử dụng phần mềm Design Expert 10 75

3.4.1 Phân tích thống kê và dự đoán phương trình hồi quy 75

3.4.2 Tối ưu hóa giá trị các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất trích ly collagen bằng phương pháp bề mặt đáp ứng RSM-CCD 78

3.5 Nghiên cứu động học của quá trình trích ly collagen từ da cá tra bằng dung dịch acetic acid kết hợp với enzyme pepsin 81

3.5.1 Nghiên cứu động học của quá trình trích ly collagen theo mô hình Peleg 81

xiii

3.5.2 Nghiên cứu động học của quá trình trích ly collagen theo mô hình khuếch tán Fick

84

3.5.3 Nghiên cứu động học của quá trình trích ly collagen theo mô hình động học phản ứng bậc hai 87

3.5.4 Xác định hàm lượng collagen và tốc độ trích ly theo mô hình động học bậc hai 91 3.5.5 Kiểm tra sự phù hợp của mô hình động học bậc hai với thực nghiệm 93

3.6 Khảo sát quá trình tinh sạch collagen 95

3.6.1 Khảo sát quá trình thẩm tích loại muối ra khỏi dung dịch collagen bằng màng cellulose - RCDMB (Regenerated Cellulose Dialysis Membrane Tubing) 95

3.6.1.1 Thẩm tích lần thứ nhất 95

3.6.1.2 Thẩm tích lần thứ hai 96

3.6.2 Tách lipid bằng CO2 siêu tới hạn (SCCO2) 97

3.6.2.1 Ảnh hưởng của áp suất dòng CO2 đến hiệu suất tách lipid 97

3.6.2.2 Ảnh hưởng của lưu lượng dòng CO2 đến hiệu suất tách lipid 98

3.6.2.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ dòng CO2 đến hiệu suất tách lipid 99

3.6.2.4 Ảnh hưởng của hàm lượng chất trợ dung môi- ethanol đến hiệu suất tách lipid .100

3.6.2.5 Khảo sát tốc độ tách lipid theo thời gian ở các điều kiện tối ưu 102

3.7 Xác định đặc tính hóa lý của collagen thành phẩm 103

3.7.1 Xác định thành phần hóa học của collagen thành phẩm 103

3.7.2 Kết quả điện di collagen thành phẩm trên gel polyacrylamide – SDS 103

3.7.3 Nhiệt độ biến tính của collagen từ da cá tra 104

3.7.4 Cấu trúc sợi collagen từ da cá tra 105

3.7.5 Cấu trúc phân tử collagen từ da cá tra 107

3.7.6 Thành phần các amino acid trong collagen từ da cá tra 108

3.7.7 Thành phần các kim loại nặng trong collagen da cá tra 110

3.7.8 Kiểm nghiệm vi sinh trong collagen da cá tra 110

xiv

3.8 Đặc tính của collagen da cá tra 111

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 112

DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 114

TÀI LIỆU THAM KHẢO 115

xv

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Cấu trúc của sợi dây chằng 7

Hình 1.2 Cấu trúc phân tử collagen loại I 8

Hình 1.3 (A) Hình ảnh vi sợi collagen với chu kì D = 67 nm nhìn qua kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) (B) Biểu đồ thể hiện sự sắp xếp hai chiều của các phân tử collagen trong vi sợi Chu kì D hình thành từ sự sắp xếp so le của các phân tử collagen trong vi sợi 9

Hình 1.4 Cá tra (Pangasius hypophthalmus Sauvage, 1878) 19

Hình 1.5 Sơ đồ trình tự tách chiết collagen 21

Hình 1.6 Giản đồ pha của CO2 23

Hình 1.7 Cơ chế phá vỡ melanin 25

Hình 1.8 Giai đoạn đầu và cuối của quá trình thẩm tích 32

Hình 2.1 Quy trình tách chiết collagen từ da cá tra 38

Hình 2.2 Sơ đồ nghiên cứu 39

Hình 2.2 Sơ đồ nghiên cứu 40

Hình 2.3 Thiết bị trích ly collagen 43

Hình 2.4 Sơ đồ nguyên lý hoạt động của thiết bị CO2 siêu tới hạn THAR SFC SN.11419 mô phỏng trên máy tính 52

Hình 3.1 Ảnh hưởng của nồng độ NaOH đến sự thay đổi hàm lượng lipid (a), hydroxyproline (b), tro (c) và hàm ẩm (d) trong da cá tra theo thời gian 63

Hình 3.2 Ảnh hưởng của nồng độ LASNa đến sự thay đổi hàm lượng lipid (a), hydroxyproline (b), tro (c) và hàm ẩm (d) trong da cá tra theo thời gian 64

Hình 3.3 Ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến sự thay đổi hàm lượng lipid (a), hydroxyproline (b), tro (c) và hàm ẩm (d) trong da cá tra theo thời gian 66

Hình 3.4 (a) Da cá trước khi xử lý màu bằng H2O2 và (b) da cá sau khi xử lý màu bằng H2O2 70

Hình 3.5 (a) Hiệu suất trích ly collagen ở các nồng độ acetic acid khác nhau đạt được sau 24h với tỷ số L/S là 60 ml/g và hàm lượng pepsin là 0,5 %; (b) Sự gia tăng hiệu suất trích ly collagen theo thời gian ở các nồng độ acetic acid khác nhau 72

ly collagen 79Hình 3.8b Ảnh hưởng của nồng độ acetic acid và tỷ số L/S đến hiệu suất trích ly collagen 79Hình 3.8c Ảnh hưởng của hàm lượng pepsin và tỷ số L/S đến hiệu suất trích ly collagen 80Hình 3.9 (a) Kết quả thực nghiệm (các ký hiệu) và mô hình (đường liền nét) của quá trình trích ly collagen từ da cá tra theo mô hình Peleg với sự ảnh hưởng của nồng độ acetic acid 81Hình 3.9 (b) Kết quả thực nghiệm (các ký hiệu) và mô hình (đường liền nét) của quá

trình trích ly collagen từ da cá tra theo mô hình Peleg dưới tác động của tỷ số L/S 82

Hình 3.9 (c) Kết quả thực nghiệm (các ký hiệu) và mô hình (đường liền nét) của quá

trình trích ly collagen từ da cá tra theo mô hình Peleg dưới tác động của hàm lượng

enzyme pepsin 82Hình 3.10 (a) Kết quả thực nghiệm (các ký hiệu) và mô hình (đường liền nét) của quá

trình trích ly collagen từ da cá tra theo mô hình khuếch tán Fick dưới tác động của nồng

độ acetic acid 84Hình 3.10 (b) Kết quả thực nghiệm (các ký hiệu) và mô hình (đường liền nét) của quá

trình trích ly collagen từ da cá tra theo mô hình khuếch tán Fick dưới tác động của tỷ số

L/S 85Hình 3.10 (c) Kết quả thực nghiệm (các ký hiệu) và mô hình (đường liền nét) của quá

trình trích ly collagen từ da cá tra theo mô hình khuếch tán Fick dưới tác động của hàm

lượng enzyme pepsin 85Hình 3.11 (a) Kết quả thực nghiệm (các ký hiệu) và mô hình (đường liền nét) của quá trình trích ly collagen từ da cá tra theo mô hình động học bậc hai dưới tác động của nồng

độ acetic acid 87Hình 3.11 (b) Kết quả thực nghiệm (các ký hiệu) và mô hình (đường liền nét) của quá trình trích ly collagen từ da cá tra theo mô hình động học bậc hai dưới tác động của tỷ

số L/S 88

xvii

Hình 3.11 (c) Kết quả thực nghiệm (các ký hiệu) và mô hình (đường liền nét) của quá trình trích ly collagen từ da cá tra theo mô hình động học bậc hai dưới tác động của hàm

lượng enzyme pepsin 88

Hình 3.12 Sự gia tăng hàm lượng NaCl trong môi trường thẩm tích theo thời gian ở các tỉ số collagen/dung dịch đệm khác nhau (Thẩm tích lần thứ nhất) 95

Hình 3.13 Sự gia tăng hàm lượng NaCl trong môi trường thẩm tích theo thời gian ở các tỉ số collagen/dung dịch đệm khác nhau (Thẩm tích lần thứ hai) 96

Hình 3.14 (a) - Ảnh hưởng của áp suất dòng CO2 đến hiệu suất tách lipid; (b)- Hình điện di SDS-PAGE của các mẫu collagen Cột 0- collagen trước khi trích ly lipid, cột 1-3 collagen sau khi trích ly lipid ở áp suất tương ứng 100, 200 và 300 bar, cột 4 - protein chuẩn 98

Hình 3.15 (a)- Ảnh hưởng của lưu lượng dòng CO2 đến hiệu suất tách lipid; (b)- Hình điện di SDS-PAGE của các mẫu collagen Cột 0- collagen trước khi trích ly lipid, cột 1-3 collagen sau khi trích ly lipid ở lưu lượng dòng CO2 tương ứng 5, 10 và 15 g/phút, cột 4 - protein chuẩn 99

Hình 3.16 (a)- Ảnh hưởng của nhiệt độ dòng CO2 đến hiệu suất tách lipid; (b)- Hình điện di SDS-PAGE của các mẫu collagen Cột 0 - collagen trước khi trích ly lipid, cột 1-3 collagen sau khi trích ly lipid ở nhiệt độ dòng CO2 tương ứng 34, 38 và 42 oC, cột 4 - protein chuẩn 100

Hình 3.17 (a) -Ảnh hưởng của chất trợ dung môi- ethanol đến hiệu suất tách lipid; (b)- Hình điện di SDS-PAGE của các mẫu collagen Cột 0 - collagen trước khi trích ly lipid, cột 1-3 collagen sau khi trích ly lipid với hàm lượng ethanol tương ứng 5, 10 và 15 % , cột 4 - protein chuẩn 101

Hình 3.18 (a) - Kết quả khảo sát tốc độ tách lipid theo thời gian; (b)- Hình điện di SDS-PAGE của các mẫu collagen Cột 1-4 collagen sau khi trích ly lipid với thời gian lưu tương ứng 10, 20, 30 và 40 phút, cột 5 - protein chuẩn 102

Hình 3.19 SDS-PAGE của collagen da cá tra cột 1, 2, 3, 4 và cột 0 - protein chuẩn.104 Hình 3.20 Đường cong biến tính nhiệt của dung dịch collagen 0,3 % 105

Hình 3.21 Ảnh SEM chụp cấu trúc collagen tách chiết từ da cá tra 106

Hình 3.22 Ảnh TEM chụp bó sợi collagen tách chiết từ da cá tra 106

Hình 3.23 Phổ FTIR của collagen tách chiết từ da cá tra 108

xviii

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1 Thành phần amino acid của collagen tách chiết từ da một số loài cá 6

Bảng 1.2 Cấu tạo của chuỗi và sự phân bố của các loại collagen trong cơ thể người 12 Bảng 1.3: Đặc tính collagen loại I dạng sợi của Công ty Collagen Solutions 17

Bảng 1.4 Tóm tắt quá trình trích ly collagen từ một số loại da cá bằng phương pháp acid 27

Bảng 1.5 Tóm tắt quá trình trích ly collagen từ một số loại da cá bằng phương pháp enzyme 28

Bảng 2.1 Danh mục hóa chất sử dụng trong quá trình thực hiện luận án 35

Bảng 2.2 Giá trị mã hóa và giá trị thực nghiệm của các yếu tố khảo sát 44

Bảng 3.1 Thành phần hóa lý của da cá tra 61

Bảng 3.2 So sánh hiệu quả tách tạp chất và mức độ thất thoát hydroxyproline khi xử lý da cá tra bằng NaOH, LASNa và ethanol ở các điều kiện đã chọn 68

Bảng 3.3 Độ sáng của da cá Tra sau xử lý H2O2 ở các nồng độ khác nhau 69

Bảng 3.4 Thành phần hóa học của da cá tra sau khi xử lý H2O2 71

Bảng 3.5 Kế hoạch thực nghiệm xác định hiệu suất trích ly collagen theo 76

Bảng 3.6 Kết quả phân tích ANOVA cho mô hình đáp ứng bậc hai 77

Bảng 3.7 Kết quả phân tích sự phù hợp của mô hình với thực nghiệm 78

Bảng 3.8 So sánh kết quả thực nghiệm và mô hình 80

Bảng 3.9 Các thông số động học và giá trị tương quan thống kê của quá trình trích ly collagen từ da cá tra theo mô hình Peleg 83

Bảng 3.10 Các thông số mô hình và giá trị tương quan thống kê của quá trình trích ly collagen từ da cá tra theo mô hình khuếch tán Fick dưới tác động của nồng độ acetic acid, tỷ số L/S và hàm lượng enzyme pepsin 86

Bảng 3.11 Các thông số mô hình và giá trị tương quan thống kê của quá trình trích ly collagen từ da cá tra (Pangasius hypophthalmus) theo mô hình động học bậc hai dưới tác động của nồng độ acetic acid, tỷ số L/S và hàm lượng enzyme pepsin 89

Bảng 3.12 Các hệ số cơ bản của ba mô hình nghiên cứu 91

xix

Bảng 3.13 Hàm lượng collagen xác định từ thực nghiệm và mô hình dự đoán theo thời gian trích ly ở các nồng độ acetic acid, hàm lượng enzyme pepsin, tỷ số L/S khác nhau

94

Bảng 3.14 Nồng độ NaCl trong dung dịch collagen sau hai lần thẩm tích 97

Bảng 3.15 Thành phần hóa lý của collagen thành phẩm 103

Bảng 3.16 Thành phần amino acid của collagen tách chiết từ da cá tra 109

Bảng 3.17 Thành phần các kim loại nặng trong collagen da cá tra 110

Bảng 3.18 Chỉ tiêu vi sinh trong collagen da cá tra 110

Bảng 3.19 Mô tả sản phẩm collagen da cá tra 111

xx

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

ASC Acid - Solubilized Collagen

CCD Central Composite Design

DOC Deoxycholate

DMSO Dimethyl Sulfoxide

EDTA Ethylendiamin Tetraacetic Acid

FTIR Fourier Transformation Infra-red

LASNa Sodium Lauryl Benzen Sulfonate

L/S Liquid/ Solid

MPD 2- Methyl – 2, 4 – Pentanediol

PSC Pepsin - Solubilized Collagen

RCDMB Regenerated Cellulose Dialysis Membrane Tubing

RMSD Root Mean Square Deviation

RSM Response Surface Methodology

SCCO2 Supercritical Carbon Dioxide

SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis

± SD Standard Deviation

SEM Scanning Electron Microscope

TEM Transmission Electron Microscopy

1

MỞ ĐẦU

Collagen là một loại protein chủ yếu của chất nền ngoại bào và mô liên kết [1], [2] Collagen chiếm 30 % tổng lượng protein ở cơ thể người, đóng vai trò then chốt trong thành phần cấu tạo của các mô liên kết như da, gân, xương, dây chằng,… Collagen là một loại vật liệu sinh học được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp sản xuất mỹ phẩm, thực phẩm và dược phẩm [3], [4]

Trước đây, collagen được tinh chế từ các nguồn nguyên liệu da và xương của trâu, bò, lợn Hiện nay, do sự bùng nổ của bệnh bò điên, bệnh lở mồm long móng ở lợn và gia súc; thêm vào đó, vì lý do tôn giáo một số đạo cấm sử dụng sản phẩm có nguồn gốc từ

bò, lợn nên trong những năm gần đây đa số các nghiên cứu tách chiết collagen tập trung vào nguồn nguyên liệu thay thế có nguồn gốc từ thủy sản [5] như: nghiên cứu tinh chế collagen từ da cá biển để làm vật liệu nha khoa [6]; nghiên cứu tính chất hóa sinh của dịch chiết collagen từ các loài cá có giá trị kinh tế thấp [7]; tinh chế collagen từ da cá

nóc bạc (Lagocephalus gloveri) [8]; tinh chế collagen từ da cá đuối gai (Raja kenojei) [9]; nghiên cứu tính chất của collagen trích ly từ da cá nóc (Takifugu rubripes) [10];

nghiên cứu cấu trúc của collagen trích ly từ da cá [11],…Nhìn chung, đa số các nghiên cứu tách chiết collagen từ da cá hiện có tập trung vào các loại cá vùng ôn đới, các nghiên cứu tách chiết collagen trên cá nhiệt đới chưa nhiều, mới chỉ có một vài nghiên cứu về xác định đặc tính của collagen tách chiết từ da và xương cá hồng (bigeye snapper) [12]; nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình trích ly collagen loại I tách từ da cá

đuối (Pomadasys kaakan) [13]

Ở nước ta, các nhà máy chế biến cá tra, cá ba sa trên địa bàn Đồng bằng Sông Cửu Long hàng năm thải ra hàng ngàn tấn phế liệu da và xương cá, đây là nguồn nguyên liệu rất phong phú để tách chiết collagen

Đề tài “Nghiên cứu phương pháp thu nhận collagen từ da cá tra (Pangasius

hypophthalmus)” được tiến hành với mục tiêu:

Để đạt được mục tiêu trên, đề tài tập trung vào các nội dung sau:

(1) Xác định thông số kỹ thuật của ba công đoạn chính trong quy trình công nghệ tách chiết collagen: tách tạp chất, trích ly và tinh sạch collagen

(2) Tối ưu hóa quá trình trích ly collagen bằng phương pháp bề mặt đáp ứng (Response Surface Mothodology) sử dụng phần mềm Design Expert 10: Thiết kế thí nghiệm theo phương án cấu trúc có tâm (CCD); đánh giá tính ý nghĩa của các hệ số hồi quy theo chuẩn Student; đánh giá tính phù hợp của phương trình hồi quy theo chuẩn Fisher; Tối

ưu hóa giá trị các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất trích ly collagen bằng phương pháp

bề mặt đáp ứng; Kiểm tra sự tương thích giữa thực nghiệm và mô hình dự đoán

(3) Nghiên cứu động học và cơ chế của quá trình trích ly collagen: với các thông số ảnh hưởng và vùng khảo sát đã xác định được qua nghiên cứu tối ưu hóa ở trên, tiến hành khảo sát sự thay đổi hàm lượng collagen trích ly theo thời gian và theo sự thay đổi hàm lượng của các thông số ảnh hưởng Kết quả thực nghiệm thu được dùng để kiểm chứng, đánh giá sự tương thích của ba mô hình với thực nghiệm để chọn mô hình phù hợp mô

tả đúng nhất động học quá trình trích ly collagen

(4) Nghiên cứu đặc tính hóa lý của collagen da cá tra và khả năng ứng dụng của collagen trong công nghiệp

3

1.1 Nguồn gốc, cấu tạo, tính chất và ứng dụng của collagen

1.1.1 Nguồn nguyên liệu tách chiết collagen

Trước đây, collagen được trích ly từ da và xương của một số loài động vật có xương sống như lợn và trâu bò Collagen nguyên thể trích ly từ các nguồn này được ứng dụng nhiều trong công nghiệp dược phẩm, mỹ phẩm và thực phẩm [14] Tuy nhiên, collagen

từ lợn và trâu bò có một số hạn chế nhất định nên trong những năm gần đây, các nhà khoa học đã tập trung nghiên cứu tách chiết collagen từ những nguồn nguyên liệu thay thế có nguồn gốc từ phế liệu thủy sản như: da, xương, vây, vảy của các loài cá nước ngọt và cá biển, da mực, da ếch,… [5]

1.1.1.1 Collagen tách chiết từ da bò

Collagen trích ly từ da bò đã được sử dụng từ rất lâu trong lĩnh vực y khoa, nó cũng đóng vai trò quan trọng trong lĩnh vực sản xuất mỹ phẩm và các sản phẩm chăm sóc sức khỏe [15] Tuy nhiên, mãi đến năm 1970 nghiên cứu về trích ly collagen từ da bò mới được hiểu biết rõ, khi các nhà nghiên cứu phát triển hệ thống tách chiết collagen từ da

bò và điều chế nó thành dạng lỏng [16]

1.1.1.2 Collagen tách chiết từ da lợn

Từ nhiều năm nay, da lợn là nguồn collagen dùng trong sản xuất các sản phẩm như vỏ bao xúc xích và các loại màng Trong lĩnh vực y khoa, màng collagen từ da lợn cho thấy rất hữu ích trong phẫu thuật chỉnh hình Gần đây, các nhà nghiên cứu cho rằng collagen dạng bột nhão tách chiết từ da lợn phủ lên vết thương rộng không có dấu hiệu đào thải

và không gây ra triệu chứng viêm sưng quá mức, chính vì vậy có thể xem collagen tách chiết từ da lợn là một lựa chọn hiệu quả thay thế cho da trong điều trị vết thương rộng [17]

4

1.1.1.3 Collagen tách chiết từ cá

Tương tự như collagen loại I tách chiết từ động vật hữu nhũ, collagen cá gồm ba chuỗi polypeptid, mỗi chuỗi có khoảng 1000 amino acid với trọng lượng khoảng 100 kDa Collagen cá có hàm lượng hydroxyproline thấp hơn collagen động vật hữu nhũ, do đó chúng có ít liên kết ngang và kém bền hơn so với collagen của động vật có xương sống trên cạn [18]

Nguồn collagen từ động vật hữu nhũ rất phù hợp để ứng dụng trong sinh học dược, tuy nhiên do sự tồn tại của các mối nguy sinh học và tín ngưỡng tôn giáo nên collagen tách chiết từ phế phụ phẩm của ngành chế biến thủy hải sản sẽ là nguồn collagen thay thế có hiệu quả và đầy triển vọng [14], [19], [20]

1.1.2 Cấu tạo phân tử collagen

Những hình ảnh đặc trưng về thành phần cấu tạo và cấu trúc của collagen đã được công

bố vào thập niên 1940 và 1950 Thành phần amino acid của collagen khác với các protein

đã biết, điểm đặc trưng nhất của collagen là có hàm lượng glycine và proline rất cao [21] Những thử nghiệm ban đầu để xác định cấu trúc cơ sở của collagen bằng phương pháp thủy phân từng phần cho thấy: trong chuỗi collagen thông thường, glycine có thể chiếm 1/3 tổng chiều dài chuỗi [22] Nghiên cứu về collagen ở động vật có xương sống trưởng thành cho thấy có một lượng carbohydrate thấp (khoảng dưới 1 %) trong collagen Năm 1966, người ta xác định được carbohydrate đó là galactose hoặc glucosylgalactose liên kết với nhóm hydroxyl của hydroxylysine [23]

Nghiên cứu nhiễu xạ tia X trên sợi collagen cho thấy, collagen có cấu trúc xoắn bộ ba (triple-helices) [24] Quan sát nhiễu xạ trên sợi cơ collagen từ gân đuôi chuột cho thấy một sự phản xạ mạnh mẽ có tính đối xứng ở 2,9 Ao và phản xạ cầu nằm trong khoảng 11-16Ao tùy thuộc vào mức độ hydrate hóa [25] Sự cải tiến hình ảnh nhiễu xạ bằng cách kéo căng [26] cho thấy sự biến đổi cấu trúc dạng hình que và cấu trúc dạng xoắn

ốc Theo Ramachandran và Kartha [24], collagen bao gồm ba sợi bện thành dạng dây thừng xoắn theo chiều từ trái qua phải, trong khi đó từng sợi collagen xoắn từ phải qua trái Cấu trúc xoắn của collagen giải thích tính đặc trưng của ảnh nhiễu xạ tia X và các amino acid đặc trưng của chúng

5

1.1.2.1 Thành phần amino acid của phân tử collagen

Phân tử collagen được cấu tạo từ 20 loại amino acid Trong đó glycine có hàm lượng cao nhất, chiếm 33 % tổng số amino acid, khoảng 12 % proline, alanine và hydroxyproline mỗi loại chiếm 11 %, tổng lượng amino acid còn lại khoảng 23 % Hàm lượng hydroxylysine, histidine, phenylalanine, isoleucine, tyrosine và amino acid chứa lưu huỳnh vào khoảng 1 % hoặc thấp hơn Các amino acid có cực chiếm khoảng 40 % phân tử collagen, trong đó 11 % là amino acid có tính bazơ, 9 % là amino acid có tính acid và khoảng 17 % là amino acid ở dạng hydroxy, khoảng 5 % acid aspartic và glutamic còn lại tồn tại ở dạng amid Các amino acid không phân cực chiếm khoảng 40

% phân tử collagen [8], [9], [11], [27], [28]

Cá bơn

Cá đuối

Cá nóc bạc

Cá nóc

hổ

Cá dìa

Cá bống biển

Cá đuối

Cá đuối

đỏ

Cá rô phi

Hydroxyproline 59 72 77 68,1 50,6 74,2 80,2 102 84 Aspartic acid 55 37 27 49,7 61,6 50,9 42,7 43,1 59,7 Threonine 22 36 20 26,2 35,9 26,7 30,6 27,4 25,8

Glutamic acid 80 75 95 77,6 103 78 86 80,1 96,1

Glycine 322 348 363 333 252 326 326 335 251,5 Alanine 114 114 96 123 123 127 110 106 104,4 Valine 28 27 24 27,9 36,5 20,6 28 26,9 18,9 Methionine 20 16 21 8,42 7,39 8,49 7,56 8,71 13,8 Isoleucine 14 17 12 7,11 21,1 9,93 15,3 12,3 13,4 Leucine 30 23 20 15,8 41,6 23 26,8 23,5 27,3

Phenylalanine 13 12 28 11,5 18,8 13,7 13,6 9,52 17,5

Lysine 31 28 25 30,1 44,5 29,4 19,2 24,1 34,9 Histidine 8 9 5 5,95 10,4 6,32 10,8 4,48 7,8 Arginine 51 49 52 59,0 58,4 50,6 47,1 47,0 82,3

(*) Kết quả tính theo số amino acid/ 1000 amino acid tổng số

(-) Không xác định

7

1.1.2.2 Cấu trúc của collagen

Collagen là một protein có cấu trúc chặt chẽ với nhiều mức cấu trúc có trật tự từ đơn giản đến phức tạp: phân tử collagen, vi sợi, sợi và bó sợi collagen Hình 1.1 mô tả mối liên hệ giữa phân tử collagen, vi sợi, sợi và bó sợi collagen ở dây chằng [30]

Hình 1.1 Cấu trúc của sợi dây chằng

a Cấu trúc của phân tử collagen

Phân tử collagen được hình thành từ ba chuỗi polypeptide, mỗi chuỗi polypeptide được tạo nên bởi một dãy các α- amino acid được sắp xếp theo dạng bộ ba như sau: Gly-X-

Y, với Gly = Glycine, X và Y là các amino acid khác, thông thường X là proline (Pro)

và Y là hydroxy-proline (Hyp) Ba chuỗi polypeptide cuộn lại xung quanh một trục, hình thành cấu trúc xoắn bộ ba Phân tử collagen có cấu trúc hình sợi dài với đường kính khoảng 1,5 nm và chiều dài 300 nm, trọng lượng phân tử khoảng 285 kDa [31] Tùy thuộc vào từng loại collagen mà cấu trúc xoắn bộ ba có thể được hình thành từ ba chuỗi polypeptide giống nhau hoặc khác nhau Collagen loại I (type I) được hình thành từ hai

Phân tử collagen Vi sợi collagen Sợi collagen Bó sợi

collagen

Sợi dây chằng

Nguyên bào sợi

Mạch máu

Dạng gấp nếp Đầu sợi

collagen

8

chuỗi α1 và một chuỗi α2, các chuỗi α1, α2 có một sự khác biệt nhỏ về thành phần amino acid [32]

Hình 1.2 Cấu trúc phân tử collagen loại I [32]

b Sự sắp xếp các phân tử trong vi sợi collagen

Vi sợi collagen được hình thành từ quá trình tự sắp xếp các phân tử collagen Vi sợi collagen có dạng hình trụ với đường kính 10 - 500 nm [33] Dùng kính hiển vi điện tử hoặc kính hiển vi lực nguyên tử có thể quan sát được những dải sáng và tối cách đều nhau Chu kỳ của các dải này khoảng 67 nm, được gọi là chu kỳ D Sự hình thành các dải này, ban đầu được giải thích theo mô hình của Hodge và Petruska [34] Theo mô hình này năm phân tử collagen được sắp xếp so le như hình 1.3 Mô hình giải thích sự xuất hiện của dải tối còn gọi là “khoảng trống” hay “vùng trống”, là vị trí chỉ có bốn phân tử collagen hiện diện, còn dải sáng được gọi là “vùng chồng lắp” là vị trí cả năm

9

phân tử collagen hiện diện Sự chuyển mô hình Hodge và Petruska từ dạng 2D vốn có sang dạng 3D ở vi sợi collagen đã gây tranh luận trong nhiều năm Dựa vào kết quả nhiễu xạ tia X và kỹ thuật phân tích cấu trúc bậc cao như TEM, một số mô hình đã được đưa ra để mô tả sự sắp xếp phân tử trong vi sợi collagen Những mô hình này có thể dựa trên hai giả thuyết cơ bản Giả thuyết thứ nhất: năm phân tử collagen tạo thành một cấu trúc vi sợi do sự hình thành các liên kết ở vùng telopeptide Giả thuyết thứ hai: các phân

tử collagen tạo thành mạng 3D kết tinh (hoặc giống dạng kết tinh) [31], [33]

Hình 1.3 (A) Hình ảnh vi sợi collagen với chu kì D = 67 nm nhìn qua kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) (B) Biểu đồ thể hiện sự sắp xếp hai chiều của các phân tử collagen trong vi sợi Chu kì D hình thành từ sự sắp xếp so le của các phân tử

collagen trong vi sợi [30]

Theo mô hình vi sợi, các đoạn phân tử collagen gắn chặt với nhau ở vùng chồng lắp và lỏng lẻo hơn ở vùng trống [35] Chu kì D ở mô hình vi sợi hình thành do sự sắp xếp các phân tử collagen do Smith đưa ra đã được thừa nhận rộng rãi [36] Mô hình phù hợp với kết quả quan sát qua kính hiển vi điện tử và nhiễu xạ tia X

c Sợi collagen: sợi collagen được hình thành từ sự sắp xếp một lượng lớn các vi sợi

collagen song song với nhau

10

1.1.3 Phân loại collagen

Collagen được phân thành 27 loại khác nhau dựa vào sự tổ hợp của các siêu phân tử [37] Loại collagen phong phú nhất là collagen dạng sợi, là thành phần collagen chủ yếu cấu tạo nên da, gân, xương, sụn và những loại mô khác

Hiện tại, đã trích ly được khoảng 13 loại collagen Chúng khác nhau về chiều dài của chuỗi xoắn ốc cũng như cấu tạo và kích thước của những phần không xoắn ốc (đầu C tận cùng và đầu N tận cùng của chuỗi collagen) [38] Collagen trong cơ thể có thể phân thành 2 nhóm chính là collagen có cấu trúc sợi và collagen không có cấu trúc sợi Mỗi loại collagen có những đặc điểm khác nhau về cấu trúc cụ thể là trật tự sắp xếp các amino acid trong chuỗi polypeptide tạo nên các chuỗi alpha, beta, gama và khác nhau

về vị trí của nó trong cơ thể

1.1.3.1 Collagen dạng sợi

Collagen loại I, II và III là những collagen dạng sợi điển hình chiếm đến 80 - 90 % tổng hàm lượng collagen trong cơ thể người Collagen loại V và XI cũng là những collagen dạng sợi, có cấu trúc tương đồng với collagen loại I - III [39] Nhìn chung các collagen dạng sợi có cấu trúc phân tử tương tự nhau Chúng bao gồm một vùng cấu trúc xoắn bộ

ba với khoảng 1000 amino acid và vùng đầu C tận cùng và đầu N tận cùng không có cấu trúc xoắn Với cấu trúc có trật tự so le ¼, những collagen này tạo nên độ bền cơ học chủ yếu của gân, da, thành mạch máu, dây thần kinh,… [40], [41]

1.1.3.2 Collagen không ở dạng sợi

Collagen loại IV, VI-X và XII-XIX không ở dạng sợi, chúng biểu hiện sự không đồng nhất về cấu trúc, phân bố ở các mô bào, các tổ chức đại phân tử và các protein chức năng Một biểu hiện thường thấy là chúng có một hoặc nhiều đột biến trong chuỗi collagen ở dạng xoắn bộ ba, sự đột biến thường xảy ra ở đoạn giữa amino acid 330 và

1530, ngắn nhất là ở collagen loại VI và dài nhất là ở collagen loại VII [40], [42] FACIT là collagen liên kết với sợi cơ, bao gồm các collagen loại IX, XII, XIV, XVI và XIX Collagen loại IX biểu hiện ở sụn và thường thấy ở liên kết cộng hóa trị với collagen

11

sợi loại II trong cùng một mô bào ở những vùng khác nhau Loại XII và XIV được tìm thấy không chỉ ở những mô giàu collagen loại I mà còn hiện diện ở những mô có collagen loại II Loại XVI và XIX có cấu trúc tương tự FACIT và vì vậy cũng được xếp vào nhóm này Collagen loại XVI phân bố rộng rãi ở các mô, chủ yếu là ở tim, thận, cơ trơn, ruột, buồng trứng, tinh hoàn, mắt, thành động mạch Loại XIX được tìm thấy ở tế bào hình que ở người và dạng nguyên bào sợi [39], [40], [42]

MACIT là những dạng collagen liên kết màng, bao gồm các collagen loại XIII và XVII [40] Collagen loại XIII được tìm thấy ở nhiều mô bào [43] Collagen loại XVII nằm ở thể bán liên kết, kết nối tế bào biểu mô với tế bào da, giác mạc và phổi [44], [45]

Cả hai loại collagen XV và XVIII có cấu trúc xoắn bộ ba bị phá vỡ ở mức độ cao cùng với vùng hình cầu lớn ở cả hai đầu N- và C- tận cùng Chúng chứa một vài vị trí liên kết tiềm năng với serine của glycosaminoglycans và liên kết asparagine của oligosaccharide Hai loại collagen này tham gia cấu tạo các màng cơ bản của hầu hết các mô, tuy nhiên collagen XVIII được tìm thấy nhiều ở gan [40], [42] Collagen XV là thành phần của chất nền ngoại bào, cần thiết cho tổng hợp các tế bào cơ xương và vi mạch [46], trong khi collagen XVIII cần thiết cho sự phát triển bình thường của mắt [47] Đầu C tận cùng của các đoạn bị phân giải của collagen XVIII được xem là một chất ức chế nội sinh của

sự hình thành mạch và sự phát triển khối u [48]

Hơn 90 % collagen trong cơ thể động vật có xương sống là các collagen loại I, II, III, V

và XI, chúng tạo nên bộ khung và độ bền cơ học cho các mô Trong các collagen dạng sợi này, collagen loại I là loại phổ biến nhất ở động vật có xương sống [38]

12

Bảng 1.2 Cấu tạo của chuỗi và sự phân bố của các loại collagen trong cơ thể người

[38]

I (1(I))22(I), trimer (1(I))3

Da, gân, xương, giác mạc, men răng,

Giác mạc, xương, mạch máu, sụn,

nướu răng

VI 1(VI) 2(VI) 3(VI) Da, cơ tim

XI 1(XI) 2(XI) 3(XI) Sụn, đĩa đệm cột sống, dịch thủy tinh

thể

1.1.4 Tính chất của collagen

Tính chất chức năng của collagen phụ thuộc vào những đặc tính hóa lý bên trong nó chẳng hạn như thành phần và trình tự amino acid, trọng lượng phân tử, hình dạng và sự phân bố điện tích trong phân tử Trạng thái tự nhiên và mật độ điện tích của phân tử

13

collagen cho thấy chúng có khả năng kết hợp với các thành phần khác như nước, ion, lipid, cacbohydrate, vitamin, màu và mùi tùy thuộc vào môi trường (pH, độ mạnh của ion, nhiệt độ) trong suốt quá trình chuẩn bị, xử lý và bảo quản

1.1.4.1 Tính hydrate hóa của collagen

Tương tự như protein, khả năng hydrate hóa là tính chất quan trọng nhất trong các tính chất chức năng đặc biệt của collagen như tính hòa tan, tính dẻo, tính hút ẩm, tính tạo nhũ tương, tính kết dính, tính co giãn và tính tạo bọt trong thực phẩm Trong phân tử collagen, những nhóm chức acid và bazơ của sợi collagen chi phối tính chất hóa lý cũng như quyết định mức độ hydrate hóa của collagen Mức độ hydrate hóa của collagen chịu ảnh hưởng của độ pH và hàm lượng muối trong môi trường

Ở pH < 3 độ hòa tan, khả năng kết hợp với nước của collagen tăng theo mức độ gia tăng của pH; ở pH > 3 khi gia tăng pH các đặc tính trên có xu hướng giảm dần Ở pH rất thấp (pH = 1) một số biến tính protein có thể xảy ra làm giảm tính chất chức năng của collagen Khi pH xa điểm đẳng điện, các amino acid tích điện cùng dấu làm gia tăng lực đẩy lẫn nhau trong phân tử protein (thuận lợi cho sự hòa tan), dẫn đến sự mở rộng chuỗi protein (thuận lợi cho khả năng kết hợp với nước) [49], [50] Ở pH > 4, do gần vùng đẳng điện nên điện tích protein rất nhỏ đồng thời xảy ra hiện tượng đối kháng làm cho tính chất chức năng của collagen giảm [50], [51], [52] Ở pH = 7 khi gia nhiệt da cá gây

ra sự đứt gãy các liên kết cố định và vì thế sự gelatin hóa xảy ra làm gia tăng đáng kể khả năng hydrate hóa [53]

Khả năng hòa tan của collagen trong dung dịch muối phụ thuộc vào tương tác giữa nước, muối và các nhóm ngoại của amino acid trong chuỗi collagen Ở nồng độ muối NaCl thấp (0 - 0,1 mol/L) khả năng hòa tan của collagen tăng do tương tác cùng dấu giữa các ion muối và các nhóm ngoại trên chuỗi collagen giúp mở rộng mạng lưới collagen Tuy nhiên khi nồng độ muối NaCl cao (0,1 - 0,3 mol/L), tương tác muối – nước chiếm ưu thế làm giảm tương tác muối – collagen làm cho các phân tử collagen có xu hướng kết

tụ với nhau dẫn đến khả năng hòa tan của collagen giảm [54] Mức độ tương tác giữa collagen với các ion của các loại muối khác nhau được sắp xếp theo mức độ tăng dần

14

như sau: F- < SO42- < acetate < Cl- < Br- < NO3- < I- < SCN- và K+ < Mg++ < Na+ < Cs+

< Li+ < Ca++ [55]

1.1.4.2 Độ nhớt của dung dịch collagen

Độ nhớt của dung dịch collagen phụ thuộc vào nồng độ, nhiệt độ, trọng lượng phân tử

và vai trò của tương tác nội phân tử trong collagen Đối với chất đa điện phân linh động,

sự giảm cường độ ion có thể dẫn đến sự mở xoắn và làm gia tăng độ nhớt của dung dịch [56] Collagen có dạng xoắn ốc bộ ba, khi mức độ thay đổi cấu trúc xoắn của collagen trong dung dịch không đáng kể thì tương tác tĩnh điện nội phân tử có thể là yếu tố duy nhất làm gia tăng độ nhớt Collagen là một polymer sinh học lưỡng tính điển hình vì nó chứa cả điện tích âm và dương của các nhóm chức có mặt trong chuỗi collagen Nhìn chung, collagen tích điện dương trong môi trường acetic acid Khi đó, tương tác tĩnh điện giữa nhóm amin tích điện dương có vai trò quan trọng đến sự hình thành cấu trúc

và sự kết tụ của phân tử collagen Điện trường có thể kích thích sự hình thành sợi collagen trong chất điện phân acid, trong khi các phân tử collagen không kết tụ được ưu tiên hấp thu lên bề mặt tích điện của chính nó [57] Khi hàm lượng collagen trong dung dịch không đáng kể < 0,1 mg/ml: ở nồng độ muối < 0,1 M độ nhớt của dung dịch giảm rất nhanh, với nồng độ muối > 0,1 M độ nhớt dung dịch tăng mạnh Khi hàm lượng collagen trong dung dịch > 0,2 mg/ml: độ nhớt dung dịch collagen tăng dần theo sự gia tăng hàm lượng collagen Ở cùng hàm lượng collagen, độ nhớt dung dịch giảm dần theo

sự gia tăng hàm lượng muối Độ nhớt không thay đổi ở nồng độ muối 0,1 M khi tăng dần hàm lượng collagen trong dung dịch được giải thích như sau: sự sắp xếp của đại phân tử collagen trong dung dịch loãng bị tác động dễ dàng bởi tương tác tĩnh điện nội phân tử Tương tác này được bảo đảm nhờ muối và dung dịch collagen thể hiện tính nhớt của chất cao phân tử khi nồng độ muối gia tăng đến giá trị nhất định (0,1 M) Nguyên nhân của sự giảm độ nhớt ở nồng độ muối 0,5 M trong khoảng hàm lượng collagen từ 0,1-0,2 mg/ml thể là do sự kết tủa của các phân tử collagen [56] Tác động của nhiệt độ đến độ nhớt cho thấy, độ nhớt của dung dịch collagen tăng theo sự gia tăng nhiệt độ [56], [58] Hiện tượng này là do phân tử collagen trong dung dịch loãng có khuynh hướng liên kết với nhau ở nhiệt độ cao dẫn đến sự gia tăng các tương tác kỵ

độ mềm mịn cho da,…Trong lĩnh vực vật liệu sinh học, collagen nguyên thể (triple helix) được ứng dụng làm màng phủ vết thương; chế tạo các bộ phân nhân tạo như: sụn, van tim, tai,…

1.1.5.1 Ứng dụng của collagen trong thực phẩm

Collagen tinh sạch có thể được sử dụng trong các sản phẩm thịt chế biến sẵn nhằm cải thiện tính chất chức năng của protein qua việc cố định nước tự do, tăng độ ổn định của thành phẩm [63] Collagen tách chiết từ da lợn được dùng làm phụ gia trong sản xuất chả bò nhằm gia tăng tính bền của sản phẩm Trường hợp sử dụng 10 % thịt heo để phối chế sẽ làm giảm tính kết dính, tính giữ nước ban đầu và do đó làm giảm độ rắn chắc của sản phẩm [64] Collagen được sử dụng trong sản xuất giăm bông nhằm gia tăng khả năng giữ nước và gia tăng các tính chất chức năng của sản phẩm [65] Việc bổ sung collagen lợn ở hàm lượng trên 1 % làm gia tăng độ bền nhiệt của sản phẩm xúc xích Đức nhưng không hiệu quả với thịt giăm bông [63] Sử dụng collagen như chất kết dính

và chất trương nở trong xúc xích và giăm bông nhằm hỗ trợ cho sự hấp thụ và liên kết

ẩm, do đó sự tổn thất của của quá trình xử lý nhiệt được giảm thiểu [63] Ảnh hưởng của nguyên liệu và phụ gia collagen đến tính chất chức năng của lườn gà nướng sản xuất

từ 100 % thịt với lườn gà nướng sản xuất từ thịt bổ sung 0 % đến 1,5 % collagen đã

Collagen biến tính bởi nhiệt dưới dạng gelatin được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp

Ở Mỹ, 65 % tổng số gelatin sản xuất hàng năm (khoảng 25 tấn) được tiêu thụ trong các sản phẩm thực phẩm như bánh ngọt, kẹo dẻo, nước dùng, bánh nướng, thịt đông, kem

và các sản phẩm khác, 20 % được sử dụng trong phim ảnh và 10 % trong vỏ bao dược phẩm, thuốc mỡ, mỹ phẩm, màng bao và nhũ tương [68]

1.1.5.2 Ứng dụng của collagen trong lĩnh vực vật liệu sinh học

Tiềm năng của collagen trong ứng dụng y sinh là do collagen có thể hình thành dạng sợi

cơ với tính bền vững và độ ổn định cao nhờ khả năng tự tập hợp và tạo liên kết ngang [69] Trong các loại collagen đã nghiên cứu, collagen loại I, III và V được ứng dụng rộng rãi trong y sinh vì chúng có khả năng thích ứng sinh học cao và khả năng kích thích sinh ra đáp ứng miễn dịch thấp [70] Collagen được sử dụng làm chỉ khâu phẫu thuật, chất cầm máu và trong kỹ thuật mô (gồm chất nền tế bào, sản phẩm thay thế cho mạch máu và van tim nhân tạo) [69] Collagen là thành phần của mô tự nhiên được sử dụng trong sản xuất van tim sinh học, màng sinh học phủ vết thương [71] Chất đồng trùng hợp giữa collagen và chondroitin 6- sunfate được xem như một loại polymer sinh học

có chức năng tái tạo sụn khớp Collagen kết hợp với glycosaminoglycan có thể thúc đẩy

sự tổng hợp lớp trung bì trên vết thương rộng ở chuột thí nghiệm [72] Nghiên cứu phủ màng collagen tách chiết từ da bò lên người bị phỏng nặng cho thấy sau thời gian một năm, vùng da bị tổn thương đã liền sẹo, da láng mịn [73] Năm 2004, Taguchi và cộng

sự đã tạo ra một vật liệu kết dính mô bào từ collagen loại I và dẫn xuất của acid citric

17

Chất kết dính sinh học này có thể phân hủy dưới da chuột thí nghiệm trong vòng bảy ngày sau khi tiêm dưới da [74] Vật liệu tổng hợp dưới dạng màng phủ được sử dụng chủ yếu trong điều trị vết thương bề mặt để ngăn cản sự thất thoát nhiệt và ẩm trên da cũng như để tránh sự xâm nhập của vi trùng từ môi trường [72] Màng collagen kháng khuẩn được sản xuất từ collagen bổ sung povidone - iodine hoặc chlorhexidine glycerin

và đóng gói trong màng nhôm vẫn giữ được tính vô trùng trong thời gian 8 tuần Sau khi cấy dưới da chuột, tấm phủ không gây viêm sưng Tấm phủ này có thể dùng để điều trị vết loét, vết bỏng bề mặt và vết thương kết hạt mãn tính [70]

Việc ứng dụng collagen làm vật liệu sinh học ngày càng phổ biến vì nguồn nguyên liệu

để sản xuất collagen khá dồi dào, công nghệ sản xuất collagen ngày càng phát triển và

có thể sản xuất ra sản phẩm collagen có độ sạch cao, đáp ứng được yêu cầu ứng dụng trong y sinh Collagen có khả năng khôi phục lại cấu trúc để trở thành dạng có độ bền cao, có giá trị trong phẫu thuật [72] Collagen loại I điển hình dùng làm vật liệu sinh học

có đặc điểm trình bày như bảng 1.3

Bảng 1.3: Đặc tính collagen loại I dạng sợi của Công ty Collagen Solutions [75]

(SDS-PAGE)

≥ 90 % collagen ở dạng chuỗi α, β, γ

≤ 10 % collagen có phân tử lượng nhỏ

hơn chuỗi α

1.1.5.3 Ứng dụng của collagen trong dược phẩm

Collagen có nguồn gốc từ bò đã được Cơ quan Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ chấp nhận từ năm 1982, khi đó nó được sử dụng chủ yếu dưới dạng chất làm đầy trong việc điều trị sẹo lõm [76] Sự ra đời của collagen có nguồn gốc từ nguyên bào sợi ở người làm phong phú thêm các sản phẩm thuốc tiêm Việc ghép collagen tự thân và một vài loại collagen khác đã được thử nghiệm lâm sàng ở Mỹ và một số nước khác [76] Những

18

tiến bộ trong công nghệ sản xuất collagen có thể cung cấp các sản phẩm có hạn sử dụng dài hơn và tiện lợi hơn Sự phân giải collagen protein hay collagen thủy phân trong cơ thể sống tạo ra các peptide hữu ích cho quá trình sinh tổng hợp hữu cơ [77] Vì thế, việc

sử dụng thực phẩm giàu collagen có thể có ích cho sự phát triển xương Một số tính chất chức năng của sản phẩm collagen thủy phân đã được nghiên cứu trong điều trị viêm khớp mãn tính và được xem là yếu tố kích thích sự gia tăng tổng hợp các đại phân tử chất nền ngoại bào từ chondrocyte [78], [77] Collagen peptide có thể tạo ra tác động có ích cho quá trình chuyển hóa xương ở chuột, đặc biệt ở điều kiện thiếu hụt can- xi và chưa thấy dấu hiệu tác động ngoài ý muốn [79] Khi thử nghiệm trên phụ nữ loãng xương với chế độ ăn giàu collagen thủy phân (10 g/ngày) cho thấy hooc môn tăng can –xi theo chế độ ăn này có ảnh hưởng lớn trong việc ức chế sự phân giải collagen trong xương hơn là chế độ ăn không bổ sung collagen [80] Việc sử dụng collagen thủy phân kích thích sự tăng cường tổng hợp các đại phân tử chất nền ngoại bào từ chondrocyte Kết quả này giúp ích cho việc điều trị bệnh nhân bị bệnh viêm khớp mãn tính Nguyên lý cơ bản về việc sử dụng collagen thủy phân cho bệnh nhân viêm khớp mãn tính đã được trình bày trong nhiều tài liệu [78] Đặc điểm về sinh học tế bào của collagen, gelatin và collagen thủy phân (< 15.000 Da) đã được nghiên cứu trên chuột [81] Các thí nghiệm nuôi cấy tế bào sừng cho thấy chỉ có collagen có ảnh hưởng đáng kể đến sự kết dính và

sự tăng trưởng của tế bào, trong khi thí nghiệm nuôi cấy tế bào trên gelatin và collagen thủy phân cho thấy tốc độ kết dính và tăng trưởng của tế bào tương tự như nuôi cấy trên nhựa làm đối chứng Điều đó cho thấy rằng collagen có tác động sinh học tốt hơn gelatin

và collagen thủy phân khi sử dụng làm nguyên liệu sản xuất mỹ phẩm chăm sóc da [81] Ngoài ra, collagen được xem là chất mang tuyệt vời trong sản xuất dược phẩm Các ứng dụng chính của collagen trong dược phẩm là tạo màng giác mạc trong nhãn khoa, gạc băng bó vết thương, vết bỏng, chất mang protein trong các dạng thuốc viên, tạo gel khi kết hợp với liposome để hỗ trợ quá trình vận chuyển thuốc trong cơ thể [69] Atelocollagen thu được bằng cách khử hai đầu telopeptide trên chuỗi collagen bằng enzyme pepsin, nó được sử dụng làm chất mang dược phẩm và chất mang gene [69], [82], [83]

19

1.2 Đặc điểm của cá tra

Cá tra (Pangasius hypophthalmus Sauvage, 1878) là loài cá nuôi truyền thống trong ao

đất ở vùng Đồng Bằng Sông Cửu Long Cá tra được xếp vào nhóm cá da trơn và được phân loại theo hệ thống như sau: giống Pangasiidae, họ Pangasius, bộ Siluriformes, lớp Actinopterygii, ngành Chordata, giới Animalia [84]

Về hình thái, Cá tra có thân dài, không có vẩy, đầu dẹp, lưng bụng và đuôi dẹp bên, chiều dài thân không kể đuôi gấp 4,5- 5 lần chiều cao thân và chiều dài đầu Răng lá mía, miệng rộng, có hai đôi râu dài, màu xám tro, lứng sẫm, bụng hơi bạc Vây lưng cao

có một tia gai cứng, vây ngực cũng có một tia gai cứng, có vây mỡ nhỏ, vây hậu môn dài, vây đuôi chẻ sâu nhỏ Cá sống chủ yếu ở nước ngọt, vẫn có thể sinh trưởng được ở vùng nước lợ (10- 14‰), có thể chịu dựng ở môi trường nước với pH = 4 (pH< 4 cá bỏ ăn), giới hạn chịu đựng về nhiệt độ trong khoảng15- 39oC [85]

Hình 1.4 Cá tra (Pangasius hypophthalmus Sauvage, 1878)

Ở nước ta hiện nay, cá Tra được coi là loại cá nuôi có năng suất cao nhất trong nghề nuôi trồng thủy sản, năng suất trung bình khoảng 209-212 tấn/ha [84]

1.3 Các phương pháp tách chiết collagen từ da cá

1.3.1 Tình hình nghiên cứu tách chiết collagen từ da cá trong nước và trên thế giới

Tại Việt Nam, đến nay đã có một số nghiên cứu thu nhận collagen và gelatin từ da cá như: Nghiên cứu thu nhận collagen từ da cá basa của Lê Thị Hồng Nhan đăng trên tạp chí Khoa học và Công nghệ, 2009 [86]; trích ly collagen từ da cá tra bằng phương pháp hóa học của Trần Thị Huyền, 2012 [87] và nhiều nghiên cứu tách chiết gelatin ở cấp độ luận văn tốt nghiệp của sinh viên Đại học Bách Khoa TP.HCM, Bách Khoa Hà Nội, Đại học Cần Thơ, Đại học Nha Trang, Viện Nuôi trồng Thủy sản II,… Nhìn chung, các

20

nghiên cứu thực hiện ở Đại học Cần Thơ và Viện Nuôi trồng Thủy sản II theo hướng tách chiết gelatin từ da và vảy các loài cá tra, cá mối, cá lau kiếng, cá lóc, cá rô đồng, cá ngừ hay từ bong bóng cá tra Nghiên cứu tách chiết collagen từ da cá tra bằng phương pháp hóa học của tác giả Trần Thị Huyền và cộng sự ở Đại học Nha Trang đạt hiệu suất trích ly 76,9 % Nghiên cứu tách chiết collagen từ da cá tra bằng phương pháp enzyme của tác giả Đỗ Cao Cường ở Đại học Bách Khoa Hà Nội trên bốn loại enzyme cho thấy enzyme pepsin cho hiệu suất trích ly cao nhất (12,07 %) Về mặt công nghệ sản xuất collagen, trước năm 2015 chưa có doanh nghiệp nào tại Việt Nam sản xuất collagen; đến năm 2015, công ty Vĩnh Hoàn ở Đồng Tháp đã đầu tư lắp đặt dây chuyền công nghệ sản xuất collagen thủy phân và gelatin với công suất 2000 tấn/năm và hiện đang trong giai đoạn chạy thử nghiệm

Trên thế giới, trước năm 1990 nguồn nguyên liệu chính để tách chiết collagen là da và xương của trâu, bò, lợn; sau năm 1990 mới có một vài nghiên cứu về tách chiết collagen

từ các nguồn nguyên liệu khác (da mực, da ếch, da cá,…) Tuy nhiên, kể từ năm 2000 đến nay, hướng nghiên cứu tách chiết collagen tập trung vào đối tượng da cá như: nghiên cứu tinh chế collagen từ da cá biển để làm vật liệu nha khoa [6]; nghiên cứu tính chất hóa sinh của dịch chiết collagen từ các loài cá có giá trị kinh tế thấp [7]; tinh chế collagen

từ da cá nóc bạc (Lagocephalus gloveri) [8]; tinh chế collagen từ da cá đuối gai (Raja

kenojei) [9]; nghiên cứu tính chất của collagen trích ly từ da cá nóc (Takifugu rubripes)

[10]; nghiên cứu cấu trúc của collagen trích ly từ da cá [11]; nghiên cứu xác định đặc tính của collagen tách chiết từ da và xương cá hồng (bigeye snapper) [12]; nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình trích ly collagen loại I tách từ da cá đuối

(Pomadasys kaakan) [13],…

Các nghiên cứu tách chiết collagen từ da cá đã có sự phát triển đáng chú ý về quy trình công nghệ, bên cạnh đó một số nghiên cứu cho biết những thông tin có giá trị liên quan đến bản chất và tính chất của collagen Nhìn chung, các kết quả đạt được có thể tóm lược như sau: