Ứng dụng chỉ thị phân tử pcr và dòng bac để xác định gen mùi thơn trên cây lúa oryza sative l

2.Mục tiêu nghiên cứu - Ứng dụng chỉ thị phân tử DNA liên kết chặt với gen qui định mùi thơm “fgr” trên các dòng giống làm bố mẹ và quần thể con lai nhằm xác định những dòng con lai có

VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam Độc lập – Tự Do – Hạnh Phúc

-

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu:”Ứng dụng chỉ thị phân tử PCR

và dòng BAC để xác định gen mùi thơm trên cây lúa (Oryza sativa L.)” này là

của riêng tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được

ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tác giả luận án

Châu Tấn Phát

LỜI CẢM TẠ Xin chân thành biết ơn các Thầy, các Cô hướng dẫn khoa học:

- GS.TS Nguyễn Thị Lang, đã hết lòng chỉ dẫn những nội dung cần thiết

thực hiện các môn học, các thí nghiệm và nội dung nghiên cứu để hoàn thành luận án

- GS.TS Bùi Chí Bửu, đã tận tình chỉ bảo và hướng dẫn các nội dung,

phương pháp và kế hoạch triển khai thành công các môn học, thực hiện

các thí nghiệm

- Các thầy cô tham gia giảng dạy lớp nghiên cứu sinh khóa 1 của cơ sở đào tạo Viện Lúa đồng bằng sông Cửu Long

Không thể hoàn thành luận án nếu không có sự giúp đở hướng dẫn khoa học

và động viên của Cô và Thầy

Xin chân thành biết ơn Hội đồng đánh giá luận án cấp Cơ Sở: đã dành nhiều

thời gian để đọc và đóng góp nhiều ý kiến qúi báu cho luận án được hoàn thiện

Xin chân thành cảm ơn:

- Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam

- Ban giám đốc Viện Lúa đồng bằng sông Cửu Long, đã giúp đỡ tạo điều

kiện cho tôi trong học tập và thực hiện đề tài

- Ban giám hiệu Trường Đại Học Cần Thơ

- Ban giám hiệu và tập thể thầy cô giáo trường đại học Nộng Nghiệp I -

Trâu Quỳ - Gia Lâm - Hà Nội đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi rất nhiều trong suốt thời gian tôi theo học chương trình cao học tại đây

- Phòng Khoa học và Hợp tác quốc tế - Viện Lúa đồng bằng sông Cửu

Long, đã theo dõi, động viên tôi trong suốt quá trình học tập cũng như thực hiện đề tài tốt nghiệp

- Bộ môn Di Truyền và Chọn Giống – Viện Lúa đồng bằng sông Cửu

Long, đã giúp đỡ về trang thiết bị cũng như hướng dẫn chuyên môn trong suốt quá trình thực hiện đề tài tốt nghiệp

- Bộ môn Công Nghệ Hạt Giống - Viện Lúa đồng bằng sông Cửu Long, đã

động viên và tạo điều kiện về thời gian giúp tôi có thể hoàn thành luận án trong thời gian qui định

- TS Bùi Thị Thanh Tâm, TS Phạm Trung Nghĩa đã đóng góp nhiều ý

kiến quí báu để hoàn thiện cho các môn học chuyên đề và luận án

- Sau cùng, xin cảm thông sự hy sinh, chia sẽ và động viên của cha mẹ, em

gái, vợ và người thân trong gia đình, bạn bè, đồng nghiệp góp phần không nhỏ vào sự thành công của luận án

Tác giả luận án

Châu Tấn Phát

MỞ ĐẦU

1.Tính cấp thiết của đề tài

Cây lúa (Oryza sativa L.) là một trong những loại cây lương thực chính nuôi

sống hơn 50 % dân số thế giới [62] Trước đây, với điều kiện vật chất còn thiếu thốn, lương thực không đủ ăn người ta chỉ có nhu cầu là ăn no Nhưng ngày nay do mức sống của người dân ngày càng nâng cao thì nhu cầu ăn no đã thay đổi, việc ăn ngon, có dinh dưỡng cao dần dần trở thành nhu cầu quan trọng không thể thiếu đối với con người Mặt khác, ngày nay nước ta đã qua thời kỳ thiếu lương thực chuyển sang thời kỳ sản xuất phải có lời và đang xuất hiện những mô hình sản xuất vừa có lời, vừa bền vững trong môi trường sinh thái trong lành Một trong những mô hình này là làm lúa thơm đặc sản, do đó chất lượng gạo được xem như là một trong những mục tiêu hàng đầu, trong đó mùi thơm được đánh giá rất cao trên thị trường xuất khẩu gạo của thế giới Sản lượng gạo thơm từ các giống lúa thơm cổ truyền như: Tám Thơm, Nàng Thơm Chợ Đào, Séng Cù, Nếp Cái Hoa Vàng, Khao Dawk Mali, Basmati, thì có rất ít không đủ đáp ứng nhu cầu thị trường và khó mở rộng diện tích Do đó các nhà chọn giống đã liên tục nghiên cứu và lai tạo ra những giống lúa mới có chất lượng cao và giữ được mùi thơm đặc trưng của giống

Trong những năm gần đây, với sự tiến bộ của ngành công nghệ sinh học đã ứng dụng những kỹ thuật trong sinh học phân tử như tái tổ hợp DNA, giải mã chuỗi trình tự gen Ứng dụng thư viện nhiễm sắc thể nhân tạo của vi khuẩn (BAC - Bacterial Artificial Chromosome) như là một công cụ có sức thuyết phục mạnh mẽ nhất để xây dựng thư viện bộ gen cho cây lúa, thành lập bản đồ vật lý có chất lượng cao và dùng để hợp nhất bản đồ vật lý với bản đồ di truyền Bên cạnh đó, việc sử dụng chỉ thị phân tử PCR và dòng BAC để xác định gen mùi thơm trên cây lúa cũng

là một trong những ứng dụng từ thư viện BAC

Xuất phát từ những cấp thiết trên, đề tài: ”Ứng dụng chỉ thị phân tử PCR và

dòng BAC để xác định gen mùi thơm trên cây lúa (Oryza sativa L.)” được thực

hiện

2.Mục tiêu nghiên cứu

- Ứng dụng chỉ thị phân tử DNA liên kết chặt với gen qui định mùi thơm “fgr”

trên các dòng giống làm bố mẹ và quần thể con lai nhằm xác định những dòng con lai có chứa gen mùi thơm

- Khai thác thư viện BAC để hổ trợ tìm kiếm những chỉ thị liên kết với tính trạng mùi thơm trên cây lúa

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

3.1 Ý nghĩa khoa học

- Xác định những dấu chuẩn phân tử riêng biệt liên kết với gen “fgr” trên cây

lúa giúp cho việc chọn dòng con lai hiệu quả hơn

- Xác định những dòng BAC DNA để tạo các chỉ thị mới liên kết với gen qui

định mùi thơm khai thác từ nguồn dòng BAC để hiểu rõ hơn về kỹ thuật dòng hóa

gen mục tiêu, phục vụ nghiên cứu sâu hơn về chức năng gen này

3.2 Ý nghĩa thực tiễn

- Đề tài đã góp phần bổ sung những dòng lúa có triển vọng biểu thị mùi thơm

thông qua ứng dụng những dấu chuẩn phân tử riêng biệt liên kết chặt với gen “fgr”

phục vụ cho việc phát triển những giống lúa thơm cao sản ở ĐBSCL

- Với những kết quả đạt được từ việc khai thác thư viện BAC, đề tài đã tìm

và phân tích chỉ thị mới từ đó chuyển sang chỉ thị chứa đoạn gen mùi thơm phục vụ cho chọn giống lúa

4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

- Nghiên cứu trên các đối tượng là các giống lúa mùa và các giống lúa cao

sản hiện đang được duy trì và nhân giống

- Khai thác thư viện BAC DNA để xác định những dòng BAC chứa gen mùi

thơm

- Phạm vi nghiên cứu:

+ Chỉ xác định nội dung có liên quan đến các chỉ thị phân tử liên kết

với gen “fgr” trên nhiễm sắc thể số 8 và ứng dụng kết quả trên để chọn giống lúa

cao sản có gen mục tiêu

+ Phân lập được đoạn phân tử mang gen mục tiêu

+ Chưa phân tích phổ chức năng (gene profile)

+ Chưa nghiên cứu được điều kiện để gen thể hiện (gene expression)

ở các qui mô khác nhau

CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI

1.1 Cơ sở khoa học của đề tài

1.1.1 Hợp chất tạo mùi thơm, gen thơm và một số yếu tố môi trường ảnh hưởng đến việc hình thành mùi thơm trên lúa

1.1.1.1 Hợp chất tạo mùi thơm và sự thể hiện của chúng trên các bộ phận của cây lúa

Mùi thơm của hạt gạo được xác định do nhóm formaldehyde, ammonia và hydrogen sulfide tạo nên Một vài nghiên cứu còn ghi nhận mùi thơm là do sự tăng của propanol, pentanol và hexanol trong quá trình tồn trữ Ngày nay bằng phương pháp hiện đại đã xác định mùi thơm được tạo thành bởi hàng trăm lọai hydrocacbon, alcohol, aldehyde, keton, acid, phenol, pyridine và những hợp chất khác đã được ghi nhận trong cơm [3], [70]

Tác giả Kim [64] báo cáo rằng các hợp phần hydrocacbon không khác nhau

có ý nghĩa giữa lúa thơm và không thơm, tuy nhiên lúa thơm có mức độ cao hơn về alcohol, aldehyde, keton, acid; trong đó lúa thơm có nồng độ 2-acetyl-1-pyrroline cao gấp 15 lần so với lúa không thơm

Lorieux và ctv [76] đã phân tích mẫu gạo của 2 giống lúa Azucena (thơm) và IR64 (không thơm), kết quả không tìm thấy chất 2-acetyl-1-pyrroline ở IR64 (không thơm), trong khi đó giống lúa thơm Azucena có hàm lượng cao về chất này Trong số 89 hợp chất phân tích, xử lý thống kê cho thấy các chất sau có sự khác biệt giữa giống lúa thơm và không thơm đó là: pentanol, 2-acetyl-1-pyrroline, benzaldehyde, octanol, pentadecan-2-1,6,10,14-imethylpentadecan-2-1 và hexanol

Tác giả Buttery và ctv [39] đề nghị rằng sự khác nhau giữa lúa thơm và không thơm không chỉ ở sự hiện diện hay vắng mặt của chất 2-acetyl-1-pyrroline

mà còn trong sự khác nhau về số lượng của hoạt chất có trong lúa gạo Nhiều alen

của một gen thơm có thể tạo ra sự biến đổi nhỏ trong cùng một enzyme kết quả là dẫn đến tính thơm khác nhau

Tác giả Buttery và ctv [40] đã phân tích và xác định 2-acetyl-1-pyrroline AP) như là một thành phần quan trọng đóng góp vào mùi thơm của các giống lúa thơm Theo đánh giá về chất lượng mùi thơm của 2-acetyl-1-pyrroline được mô tả giống như mùi của ngô nổ Xác định nồng độ mùi thơm của 10 giống lúa, khoảng nồng độ từ 6 ppb đến 90ppb với lúa chà trắng Lúa chưa chà trắng nồng độ 2-acetyl-1-pyrroline là 100-200ppb Vì thế có thể nghĩ rằng bề mặt lớp aloron của hạt gạo giữ một vai trò quan trọng trong việc hình thành mùi thơm của cơm khi nấu Mũi của người có thể phát hiện được hợp chất thơm 2-acetyl-1-pyrroline ở nồng độ 0,007ppm Do đó, đánh giá bằng cảm quan trong điều kiện nhất định và với những người có khứu giác bình thường kết quả có thể tin tưởng được.[47]

(2-Các tác giả Ahmed và ctv [31], Lin và ctv [74] đã khẳng định lại báo cáo của Buttery và ctv [40], Paule và ctv [84] rằng 2-acetyl-1-pyrroline là hợp chất chính tạo nên mùi đặc trưng cho các giống lúa thơm

Bên cạnh đó, Buttery và ctv [38] đã phân tích lá của cây lá dứa (Pandabases amaryllifolius) nhận thấy rằng thành phần bay hơi chính cũng là 2-acetyl-1-

pyrroline (2AP) và có một sự liên hệ rất mật thiết giữa chất 2-acetyl-1-pyrroline trong lá của cây lá dứa và lúa thơm Nồng độ của chất 2-acetyl-1-pyrroline trong lá của cây lá dứa cao hơn gấp 10 lần trong lúa thơm và cao hơn gấp 100 lần trong lúa không thơm

Tóm lại, hiện nay có hai quan điểm về thành phần chất thơm của lúa gạo Quan điểm thứ nhất cho rằng chất thơm được tạo ra từ các hợp chất aldehyde (CHO) và keton (C=O) và các hợp chất với lưu hùynh Quan điểm thứ hai cho rằng chất thơm lúa gạo, do vòng ryrrol kiểm sóat tính thơm của chất 2-acetyl-1-pyrroline [34] Tác giả Kader và Delseny [59] cho rằng có sự khác nhau trong việc thể hiện mùi thơm trên các bộ phận của cây lúa, hợp chất 2AP được thể hiện một cách tự nhiên từ giai đoạn mạ cho đến khi chín và đặc biệt là trong giai đoạn hạt trưởng thành trên các bộ phận của cây lúa ngoại trừ rễ, mùi thơm được tích lũy nhiều nhất

trên bộ phận hạt lúa Bên cạnh đó, các tác giả Chen và ctv [42], Vanavichit và ctv [102] cũng khẳng định mùi thơm không thể hiện hoặc thể hiện rất thấp không đáng

kể trên bộ phận rễ lúa

1.1.1.2 Gen thơm

Li và Gu [71] cũng nghiên cứu về sự di truyền và vị trí của gen thơm trên lúa Sự lai thuận nghịch giữa các giống lúa thơm đã cho thấy rằng các gen của chúng có alen với nhau

Tác giả Bradbury và ctv [78] đã phân tích mùi thơm của lúa Basmati và

Jasmine với sự thể hiện của 2-acetyl-1-pyrroline Một gen lặn fgr trên NST số 8 của

lúa qui định sự thể hiện tính trạng quan trọng này và có một gen tương ứng mã hóa protein có tên gọi là Betaine Aldehyde Dehydrogenase (BAD) thể hiện sự đa hình

có ý nghĩa trong vùng chứa gen thơm Gen fgr có sự tương đồng với gen mã hóa BAD2 trong lúa và có thể xem gen fgr là một dạng đột biến của gen mã hóa BAD2

Ngược lại, gen mã hóa BAD1 định vị trên nhiễm sắc thể số 4 Gen mã hóa BAD liên kết với gen kháng stress trong cây trồng

Tác giả Shi và ctv [107] cũng kết luận gen fgr là gen lặn nằm trên NST số 8 liên quan đến mùi thơm của lúa Gen này có một alen lặn mất chức năng bad2 và alen trội BAD2 mã hóa protein BAD2 làm cho lúa không thơm Tổng số 34 giống

lúa thơm và không thơm đã được nghiên cứu và giải trình tự đoạn phân tử

BAD2/bad2 Trong số 24 giống lúa thơm có 12 giống chứa alen bad2 (bad2-E7), với sự kiện mất đi 8 cặp bazơ và 3 SNPs trên exon số 7, số còn lại có một alen bad2 mới (bad2-E2) - chuỗi trình tự tương đồng với bad2-E7 nhưng đã mất đi 7 cặp bazơ

trên exon số 2 Cả hai alen này đều qui định mùi thơm của lúa Dựa trên chuỗi trình

tự khác nhau giữa BAD2 và 2 alen lặn bad2 đã phát triển những chỉ thị phân tử giúp

cho việc xác định dòng lúa thơm, phân biệt rõ dòng không thơm và thơm xét về kiểu gen Tuy nhiên, kiểu hình biểu thị ra bên ngoài vô cùng phức tạp điều này có thể do điều kiện môi trường qui định sự ức chế hoặc kích hoạt promoter để gen thể hiện mùi thơm

Bên cạnh đó, tác giả Fitzgerald và ctv [80] cũng đã có nhận xét tương tự với tác giả Shi và ctv [107]: 2-acetyl-1-pyrroline là hợp chất chính tạo nên mùi thơm

trong lúa và được tích lũy do bởi sự mất đi 8 cặp bazơ trong một alen ở locus “fgr”

Trong nghiên cứu này, 2-acetyl-1-pyrroline được định lượng Sự thể hiện hay vắng

mặt của alen fgr đã được xác định trong 464 mẫu của các giống lúa truyền thống

của Trung Tâm Ngân Hàng Gen IRRI mang tên T.T.Chang Kết quả cho thấy rằng nhiều giống lúa thơm, đặc biệt từ Nam và Đông Nam Á, không biểu thị sự mất đi 8 cặp bazơ, nhưng sản phẩm 2-acetyl-1-pyrroline vẫn được xác định trong cả dạng

gạo và dạng cơm của những giống này Sự mất đi 8 cặp bazơ trong locus fgr không

chỉ là nguyên nhân qui định mùi thơm mà còn có một đột biến khác đã điều khiển

sự tích lũy sản phẩm 2-acetyl-1-pyrroline Protein tổng số 2-acetyl-1-pyrroline được

mã hóa bởi những gen đồng dạng fgr không biểu thị khác biệt có ý nghĩa so với kiểu gen n-fgr Một vài kiểu gen fgr, đặc biệt từ Nam Á mã hóa protein này với sự

tích lũy số lượng lớn 1-pyrroline như Basmati Sự đột biến tạo ra

2-acetyl-1-pyrroline trong các giống lúa thơm n-fgr có thể được tạo ra một vài lần trong quá trình thuần hóa và tiến hóa Gen fgr và các alen khác liên quan tới 2-acetyl-1-

pyrroline đã qui tụ lại trong các giống lúa thơm ở Nam Á tạo ra các giống lúa đặc sản cổ truyền có mùi thơm cao Sự xác định nhiều đột biến đối với 2-acetyl-1-pyrroline có thể xảy ra trong các chương trình chọn giống lúa để đa dạng nguồn di truyền của 2-acetyl-1-pyrroline nhằm phát triển giống lúa có mùi thơm cao và chất lượng tốt

1.1.1.3 Một số yếu tố môi trường ảnh hưởng đến việc hình thành mùi thơm trên lúa

+ Nhiệt độ

Theo tác giả Juliano [57b] việc hình thành mùi thơm trong hạt tăng lên ở nhiệt độ thấp trong suốt giai đoạn vào chắc của hạt Giống lúa Basmati yêu cầu nhiệt độ thấp (25oC ban ngày, 21oC ban đêm trong suốt quá trình trưởng thành) thì tốt cho việc hình thành mùi thơm

+ Đất

Nhân tố đất cũng ảnh hưởng đến mùi thơm và các tính trạng chất lượng khác thông qua dinh dưỡng cây trồng và mối quan hệ tương tác của các chất dinh dưỡng bay hơi với các thành phần bay hơi có liên quan đến mùi thơm Singh và ctv [94] nhận thấy có sự khác nhau một cách có ý nghĩa về mùi thơm của lúa ở hai thửa ruộng liền kề nhau mặc dù là cùng một giống Điều kiện đất tơi xốp và đất vùng cao cũng giúp hình thành mùi thơm được tốt hơn

Bên cạnh đó, Bocchi và ctv [36] đã đánh giá sự ảnh hưởng của các đặc tính đất trên chất lượng mùi thơm của lúa trên ruộng thử nghiệm ở Pavia, Italy và kết luận rằng hàm lượng cao nhất của các chất bay hơi trong hạt có liên quan đến các loại đất có hàm lượng sét thấp và hàm lượng cát cao Ảnh hưởng của tương tác kiểu gen và đất trên chất lượng hạt lúa của lúa Japonica thì cũng được báo cáo bởi Lee

và ctv [68]

+ Tập quán canh tác

Theo Singh và ctv [94] lúa sẽ có mùi thơm hơn khi cây lúa được sạ trực tiếp

so với khi được cấy Bên cạnh đó thời gian thu hoạch là một nhân tố khác có ảnh hưởng đến mùi thơm và những tính trạng chất lượng khác ở lúa Việc trì hoản thu hoạch sau khi chín có thể làm giảm mùi thơm Cả năng suất và phẩm chất hạt sẽ giảm đi nếu việc thu họach vượt quá thời gian này Sự tác động của việc trì hoãn thu họach trên phẩm chất lúa gạo thông qua sự giảm hay thay đổi trong các thành phần

hạt do bởi nhiệt độ, ẩm độ, côn trùng dịch hại và các vi sinh vật khác

+ Độ thuần giống

Theo Singh và Singh [93] trong hầu hết các vùng trồng lúa thơm bản địa ở

Ấn Độ, người nông dân thường sử dụng hạt của các thế hệ trước Không có chương trình cải thiện năng suất cho các giống lúa này Kết quả là hạt không thuần dẫn đến việc giảm đi mùi thơm

Tóm lại, các thành phần di truyền, tập quán canh tác, môi trường và các nhân

tố khác có ảnh hưởng đến sự thể hiện của mùi thơm và các tính trạng chất lượng trên lúa thơm Cùng một giống được trồng ở các nơi khác nhau có thể không sản

xuất hạt có chất lượng như nhau Tính trạng chất lượng của các giống này được thể

hiện tốt nhất trong các vùng bản địa của chúng khi được trồng

1.1.2 Nguyên lý và yêu cầu trong chọn giống bằng MAS

Chọn tạo giống nhờ chỉ thị phân tử MAS là kỹ thuật chọn tạo giống kết hợp giữa phương pháp truyền thống với phương pháp công nghệ sinh học hiện đại Để làm được việc này cần xác định được cặp bố mẹ mang những đặc tính mong muốn

và các gen qui định các đặc tính đó đã được lập bản đồ và có những chỉ thị phân tử liên kết chặt với các đặc tính đó Tiêu chuẩn quan trọng nhất trong lựa chọn bố mẹ phải có sự tương phản rất lớn về tính trạng mục tiêu có trong bố mẹ và sự di truyền của tính trạng này ở bố mẹ Xét về mức độ đa hình giữa bố mẹ, tính chất này càng lớn kết quả càng tốt [2] Bên cạnh đó, nguyên lý cơ bản trong chọn giống bằng MAS là sử dụng phương pháp lai truyền thống và phương pháp lai hồi giao (Backcross-BC) nhiều lần cho đến khi đạt được thế hệ BC mong muốn Trong qúa trình này sẽ sử dụng các chỉ thị phân tử để chọn các cá thể có kiểu gen mong muốn Cuối cùng đến một thế hệ nào đó sẽ chọn ra cá thể cho tự thụ để tạo dòng thuần có mang kiểu gen mong muốn cần cải tạo Phương pháp chọn tạo giống này vừa chính xác vừa có thể rút ngắn thời gian chọn lọc, diện tích triển khai do có thể phân tích

và chọn được các giống mang gen ngay ở giai đoạn sớm, thí dụ như cây gieo từ hạt sau 7-10 ngày mà không cần chờ đến khi thu họach [20]

1.1.3 Nhiễm sắc thể nhân tạo của vi khuẩn BAC (Bacterial Artificial Chromosome)

1.1.3.1 Khái niệm BAC DNA và BAC contigs

BAC (Bacterial Artificial Chromosome)- nhiễm sắc thể nhân tạo vi khuẩn BAC DNA là các vòng plasmid BAC chứa đọan DNA ngoại lai được chèn vào vị trí mục tiêu trên nhiễm sắc thể này Các plasmid BAC có khả năng tự nhân lên độc lập với sự phân chia tế bào vi khuẩn Plasmid BAC có thể tồn tại từ một đến hàng trăm phiên bản trong một tế bào vi khuẩn

BAC contigs hay BAC “contiguous sequence” là một đoạn dài của chuỗi trình tự được xây dựng bởi một số các trình tự ngắn, chuỗi trình tự này có các đoạn phân tử chồng lấp lên nhau [3]

1.1.3.2 Xây dựng BAC contig

Những dòng BAC có tính chồng lấp lên nhau được gọi với thuật ngữ là

“contig”, có thể được xây dựng thông qua:

+ Việc thanh lọc khuẩn lạc (colony)

+ Kỹ thuật “chromosome walking”

+ Kỹ thuật “DNA fingerprinting”

+ Chỉ thị STS (những chỉ thị được chuyển đổi từ RFLP)[3]

Theo tác giả Nguyễn Thị Lang và ctv [67] phân tích PCR với chỉ thị STS được

sử dụng để thanh lọc các dòng BAC có tính chất chồng lấp và hình thành những

“contig” của kho lưu trữ BAC từ DNA của quần thể đơn bội kép giống lúa IR64/Azucena Kho lưu trữ này gồm có 18.432 dòng Thực hiện thanh lọc DNA của thư viện BAC với 120 mồi STS Tổng số dòng BAC đã được phân lập là 86 dòng trên 23 loci của 38 mồi STS Một vài contig đã được “neo” giữ trên những nhiễm sắc thể cây lúa trên cơ sở bản đồ dấu chuẩn phân tử STS của quần thể đơn bội kép

từ cặp lai IR64/Azucena Kết quả cho thấy phân tích PCR với mồi STS là một

phương tiện rất tốt để tìm ra những dòng BAC có tính chất chồng lấp để hình thành

contig Phương pháp này cũng đã xác định được các dòng BAC mang những đoạn

phân tử chuyên biệt như vậy

Theo tác giả Wang và ctv [105] trong nghiên cứu xây dựng một BAC contig

chứa Xa-4 locus trên nhiễm sắc thể số 11 Gen kháng vi khuẩn bạc lá Xa4 đã được

sử dụng một cách rộng rãi để khai thác gen kháng trong nhiều chương trình chọn giống lúa của Châu Á và được đề nghị là có tính kháng ổn định trong nhiều giống

lúa thương mại [81] Một phần của nhóm gen kháng bao gồm Xa3, Pi-1 (t), Pik, và Pi-f trên nhiễm sắc thể 11 [69]; [111] Tuy nhiên, các dòng lúa chồng gen Xa4 với

các gen kháng vi khuẩn bạc lá khác cho kết quả mức độ kháng cao hơn và thậm chí

là phổ kháng rộng hơn so với bệnh này chỉ với một gen kháng đơn gen [54] Vì vậy

mà, Xa4 đã được coi như là một mục tiêu cho tách dòng định vị Xa4 đã được xác

định lần đầu tiên bởi tác giả Yoshimura và ctv [117] trên nhiễm sắc thể 11 trên lúa gần với chỉ thị G181 (chỉ thị RFLP) Gần đây, một vài chuỗi trình tự tương đồng gen kháng (RGAs) khuếch đại từ DNA bộ gen cây lúa với các mồi chuyển đổi đã

được lập bản đồ trong vùng này [69] Thanh lọc RGAs cùng với locus Xa4, khai

thác theo kiểu tiếp cận dựa trên PCR [83]; [118] Một trong số những chuỗi tương đồng gen kháng là RSI3 với mức tương đồng cao với gen được biết là NBS-LRR đã

được tìm thấy cùng với Xa4 trong một quần thể F2 có nguồn gốc từ giống IR24 và quần thể NIL Xa4 (IRBB4); RSI3 nằm giữa hai chỉ thị RFLP là G181 và L1044

Chiến lược này có tên gọi là “Chromosome landing”, “Chromosome landing” có xu hướng chọn lọc phong phú các chỉ thị DNA trong phạm vi vùng cM phụ chung quanh gen mục tiêu [99] Vì vậy, RSI3 có thể được sử dụng để đánh dấu ở vị trí

Xa4 Để tách ly gen Xa4, một thư viện BAC bao gồm 55.296 dòng của IRBB56 đã

được xây dựng Các chỉ thị RSI3, G181, và L1044 được sử dụng để thanh lọc thư viện BAC Kết quả đã thanh lọc được 18, 13 và 106 dòng BAC theo thứ tự các chỉ thị như trên Trong số 18 dòng BAC đã được nhận biết bởi RSI3 có bốn dòng BAC (1F21, 26D24, 56M22 và 111E1) cũng đã được nhận biết bởi chỉ thị G181 và sáu dòng BAC (1F21, 33M8, 56M22, 61A13, 104B15 và 111E1) được nhận biết bởi chỉ

thị L1044 Trên cơ sở cắt hạn chế của enzyme HindIII, 12 trong số 18 dòng BAC đã được chọn lọc và cắt với enzyme cắt giới hạn HindIII phục vụ cho phân tích

Southern Sử dụng G181 làm đoạn dò kết quả đã nhận biết một băng sau khi phân tích Sounthern với các dòng BAC: 56M22, 111E1 và 26D24 Vì vậy, chỉ thị G181 coi như nằm trên phần trùng lắp của những dòng BAC này Sử dụng L1044 làm đoạn dò sau khi phân tích Sounthern kết quả đã nhận ra các băng trên 2 vị trí khác nhau: một băng cho các dòng BAC 56M22 và 111E1, cái còn lại cho các dòng BAC 104B15, 33M8 và 61A13 Ước tính khoảng cách di truyền giữa G181 và L1044 Chỉ thị L1044 nằm trong phần trùng lấp của 3 dòng BAC là 104B15, 33M8 và 61A13 Sử dụng RSI3 làm đoạn dò trong phân tích Southern kết quả đã nhận biết

từ 2 tới 5 băng trong mỗi nhóm ít nhất là 2 dòng BAC Mối quan hệ trùng lấp giữa

các dòng BAC đã được phân tích thêm thông qua phân tích Southern sử dụng đoạn

dò được thiết kế từ các dòng BAC trên với TAIL-PCR [75] Kích thước đoạn chèn của mỗi dòng BAC được xác định thông qua điện di CHEF sau khi cắt với enzyme

cắt giới hạn NotI Một BAC contig dài khoảng 420kb phủ trên vị trí gen Xa4 đã được xây dựng Trong số 339 cá thể từ quần thể F2 của những dòng đẳng gen Xa4,

mồi được thiết kế từ trình tự đầu cuối của đoạn chèn của các dòng BAC: 56M22F

đã nhận biết 3 tái tổ hợp, 26D24R nhận biết 5 tái tổ hợp và 104B15R nhận biết 6 tái

tổ hợp Các tái tổ hợp được nhận biết bởi 56M22F thì khác so với các tái tổ hợp

được nhận biết bởi 26D24R và 104B15R, Xa4 có thể coi là nằm trong vùng giữa

56M22F và 26D24R với chiều dài vật lý ước tính khoảng 90kb Chỉ thị RSI3 có mức độ tương đồng cao với vùng NBS của lớp gen NBS-LRR và đồng cách ly với

gen Xa4, có khả năng chỉ thị RSI3 là một phần của một thành viên trong họ gia đình gen Xa4 Chỉ thị RSI3 có thể nhận biết được 5 băng HindIII Trong số những dòng

BAC được nhận biết bởi chỉ thị RSI3 thông qua phân tích Southern, dòng BAC 106P13 có thể hiển thị tất cả những băng lai và bao bọc vùng giữa hai chỉ thị

56M22F và 26D24R Vì vậy, dòng BAC 106P13 có lẽ chứa alen Xa4 và đã được

chọn lọc cho những đánh giá sau này

Hình 1.1: Bản đồ vật lý của Xa4 locus

Ghi chú: Hàng đầu tiên là nhiễm sắc thể 11 Dưới là khoảng cách di truyền và khoảng cách vật lý Khoảng cách vật lý tương đương với kích thước đoạn DNA được dòng hóa và được đánh giá thông qua điện di CHEF Các dòng BAC trùng lấp được thể hiện bằng những thanh đen đậm Vùng giữa 56M22F và 26D24R thể hiện bằng đường gạch chấm thẳng đứng có thể chứa gen Xa4 ( Nguồn: Wang và ctv [105] )

1.1.3.3 Một số thông tin về BAC DNA

BAC vectơ được phóng thích từ “E.coli F factor plasmid”, bao gồm các gen

điều khiển số bản sao có tính giới hạn và sự tự tái bản DNA có tính đẳng hướng Cả hai tính chất này đều giúp cho plasmid được duy trì và ổn định Khả năng nhân dòng của BAC là 400kb Cấu trúc căn bản của BAC vectơ được phát triển từ plasmid F nội sinh Plasmid F bao gồm 4 vùng cần thiết có chức năng ổn định

plasmid và quyết định số bản sao đó là: ParA, ParB, OriS, RepE Cả hai ParA và ParB đều cần cho việc phân đoạn và ổn định plasmid Bên cạnh đó, ParB còn cần cho việc kết hợp với F factor khác OriS là nguồn tự tái bản DNA, có tính chất đồng hướng RepE mang tính hiệu của protein E, cần trong quá trình tự tái bản từ OriS và

cần trong quá trình kiểm soát bản sao Người ta cho vào gen kháng chloramphenicol, dùng để chọn lọc các thế hệ có tính chất kháng sinh [3]

Dòng E.coli được sử dụng phổ biến nhất cho kỹ thuật nhân dòng nhiễm sắc

thể nhân tạo trong vi khuẩn (BAC) là DH10B Hanahan [52] Đặc điểm chính của dòng này là có những đột biến ngăn trở:

(1) Phân cắt DNA lạ do hệ men nội sinh (hsd / RMS)

(2) Phân cắt DNA có gốc methyl (methylcytosine hoặc methyladenine,

5’-hydromethylcytosine) (mcrA, mcrB, mcrC, mrr)

(3) Sự tái tổ hợp (recA1)

Vì hệ thống BAC còn quá mới mẻ, do vậy chỉ có vài loài thực vật được thiết lập thư viện Thí dụ, thư viện trên lúa IR64 [115] Trên cao lương có 13.750 dòng BAC [109] Thư viện này ước khoảng 90% genome của cao lương và 14% bị tạp với trình tự của thể lạp

Tác giả Zhang và ctv [119] đã xây dựng thư viện BAC cho cây lúa thuộc

nhóm japonica và indica Kết quả ghi nhận tương tự như trên cao lương Những kết

quả đầu tiên này cho thấy BAC rất có triển vọng trong ứng dụng sinh học phân tử

để phân tích genome thực vật

Kho lưu trữ BAC trên lúa hiện nay có 18.432 dòng trên quần thể DH của tổ hợp lai IR64/Azucena [114]; [115] Khả năng chèn vào lớn nhất của BAC là 364kb

Có 75% dòng BAC có khả năng mang 76-135kb, trung bình là 107kb

Mỗi dòng BAC được ký hiệu theo số đĩa (plate) (X), số hàng (Y) và số cột (Z) Thí dụ, BAC trong trường hợp IR64/Azucena tại IRRI (Philippines) được theo dõi có 48 đĩa đánh số từ P1 đến P48 Có 16 hàng đánh thứ tự từ A đến P và có 24 cột đánh thứ tự từ C1 đến C24

1.1.3.4 Một số thư viện BAC trên thế giới và Việt Nam

Theo Khush và ctv [62] thư viện nhiễm sắc thể nhân tạo nấm men (YAC) trên lúa đã được công bố bởi RGRP (Rice Genome Research Program) và thư viện nhiễm sắc thể nhân tạo vi khuẩn (BAC) bởi Wang và ctv [104]

Wang và ctv [104] đã phát triển lần đầu tiên thư viện BAC phục vụ tích cực cho việc xây dựng bản đồ vật lý trên bộ genome cây lúa Thư viện BAC này chứa khoảng 11.000 dòng với kích thước đoạn chèn trung bình là 125kb Trong đó có 12

dòng đã được lai với 3 DNA chỉ thị liên kết gần với locus Xa21

Yang và ctv [115] đã phát triển thư viện BAC năng suất cao và phát triển

rộng rãi trên giống lúa indica IR64 Thư viện này có chứa 18.432 dòng với kích

thước đọan chèn trung bình 107kb Một vài dòng BAC trùng lấp đã được xác định thông qua lai colony với các chỉ thị RFLP trên nhiễm sắc thể số 4

Zhang và ctv [120] đã xây dựng 2 thư viện BAC trên lúa chứa 22.000 dòng với kích thước đọan chèn trung bình lần lượt là 130 và 150kb

Hiện nay, ở Việt Nam tại Viện Lúa đồng bằng sông Cửu Long đang ứng dụng thư viện BAC trên giống lúa IR64 trên gen rầy nâu bao gồm 18.432 dòng cho những nghiên cứu gần đây tại cơ sở [66]

Ngòai ra, ở Trung Quốc đã xây dựng một thư viện BAC với kích thước đọan chèn trung bình của dòng lúa hoang thông thường, YJCWR, thu thập từ Yuanjiang, tỉnh Yunnan Thư viện bao gồm 52.992 dòng với kích thước đoạn chèn trung bình 50kb [110]

Ở Mỹ, hiện nay có 2 thư viện BAC đã được công bố rộng rãi là Oryza sativa

TP164 (54 x 384 well plates) với kích thước đọan chèn trung bình là 140kb Thư

viện BAC trên Oryza rufipogon (56 x 384 well plates) với kích thuớc đọan chèn

trung bình 120kb [106]

1.2 Ứng dụng thành tựu di truyền

1.2.1 Nghiên cứu di truyền gen mùi thơm trên cây lúa

1.2.1.1 Mùi thơm trên lúa do một gen lặn kiểm soát

Tác giả Berner và ctv [35] tổng kết rằng tính thơm của giống Della được qui

định bởi một gen lặn trong nhân Gen này nằm trên nhiễm sắc thể số 8 và đã được xác định qua kỹ thuật RFLP [31] Các tác giả Ghose và Butany [50], Reddy và

Reddy [87], Sood và Siddiq [96] cũng đã đề nghị tính thơm được qui định bởi một gen lặn nằm trong nhân tế bào chi phối

Reddy và Reddy [87] đã báo cáo mùi thơm cũng được điều khiển bởi một

gen lặn và nhận thấy rằng có sự vắng mặt của một enzyme đồng đẳng riêng biệt thuộc loại ester đi kèm với sự hình thành tính thơm trên lúa

Trong quần thể phân ly F2 thơm và trong các dòng bố mẹ thơm, Huang và Zou [53] nhận thấy các cây F1 từ tất cả các cặp lai thuận nghịch đều không thơm điều này cho thấy rằng có một gen lặn điều khiển tính thơm Sự đánh giá mùi thơm của cây F2 cho tỉ lệ 3:1 (không thơm: thơm) sự phân ly đã khẳng định lại gen thơm

là một gen lặn trong lúa

Hai tác giả Katare và Jambhale [60] đã nghiên cứu về sự di truyền của mùi thơm trong 4 tổ hợp lai có liên quan trên các giống Kasturi, Ambemohar-197 (thơm) và Jaya, Mahsuri (không thơm) Trong tất cả các cặp lai cũng nhận thấy sự

di truyền được quản lý bởi một gen lặn

Song và ctv [95] đã lai 4 giống thơm lưỡng bội với ba giống không thơm, và hai tổ hợp lai tương tự nhau được làm tự tứ bội hóa Tất cả các cây F1 của 4 cặp lai thuận nghịch tự tứ bội hóa và 5 con lưỡng bội đều không thơm với tỉ lệ không thơm

và thơm ở F2 là 35:1 và 3:1 Kết quả này cho thấy rằng sự di truyền của mùi thơm được điều khiển bởi một gen lặn

Berner và Hoff [35] đã báo cáo về sự di truyền gen lặn đơn của tính thơm và

đề nghị rằng mùi thơm có thể được nhận biết trong phần hạt không chứa phôi nhũ của hạt đơn bằng cách nhai phần này nhằm tiết kiệm phần hạt chứa phôi nhũ

Trong nghiên cứu của Pinson [85] về sự di truyền của mùi thơm trên 6 giống lúa nhận thấy sự mất đi mùi thơm của lá trong con lai F1 (thơm x không thơm) cho thấy tính lặn của mùi thơm trong tất cả các giống nghiên cứu Tỉ lệ phân ly F2 từ hai giống, Jasmine 85 và PI457917, mỗi giống chứa một gen đơn về mùi thơm, và tính thơm của các lá F1 từ các tổ hợp lai với nhau và với A-310, Delta-X cho thấy rằng gen thơm trong 4 giống là có alen với nhau Tuy nhiên, Amber và Dragon Eyeball-

100 mỗi giống đều chứa hai gen thơm và một gen mới sẽ thêm vào một alen cho các gen trong A-310, Delta-X, Jasmine 85 và P457917

Sadhukhan và ctv [90] báo cáo rằng mùi thơm trên các giống thơm Govindobhog và Kataribhog có alen với nhau và được điều khiển bởi một gen lặn

Dựa vào nghiên cứu của 50 dòng tái tổ hợp lai F8 (single-seed descent) phát triển từ tổ hợp lai BG1 x Koshihikari, sự di truyền của mùi thơm và một vài tính trạng nông học khác đi kèm với nó đã được tìm ra bởi Kato và Itani [61] Kiểm tra cảm quan về sự phân ly mùi thơm hạt cho thấy rằng sự khác nhau về mùi thơm giữa BG1 và Koshihikari được điều khiển bởi một gen lặn, có nguồn gốc từ các giống

lúa indica thơm của Trung Quốc, Chang Hsian Tao, một bố mẹ của BG1

Berner và Hoff [35] báo cáo rằng khi các hạt độc lập từ cây F1 được nhai và đánh giá tính thơm và không thơm, kết quả cho thấy hạt của cây F1 phân ly theo tỉ

lệ 3:1 (không thơm: thơm) Mùi thơm thể hiện trong lá cũng giống như trong hạt, mùi thơm là lặn, chỉ những cây đồng hợp lặn mới thơm

Sood và Siddiq [96] nghiên cứu di truyền tính thơm của 7 tổ hợp lai giữa giống thơm và không thơm Kết quả, cây F1 không thơm và sự phân ly theo tỉ lệ 3(không thơm) : 1 (thơm) ở thế hệ F2 cho thấy tính thơm được kiểm sóat bởi một gen lặn

IRRI [55] cũng nhắc lại kết quả tương tự của Benner và Hoff [36] về tổ hợp lai giữa giống Della (thơm)/Dawn (không thơm) với tỉ lệ 3(không thơm): 1(thơm) ở thế hệ F2

Li và ctv [73] cũng nhận thấy rằng tính thơm của mô lá hoặc hạt cũng được điều khiển bởi một gen lặn

Tóm lại, đã có nhiều nghiên cứu cho thấy rằng sự di truyền mùi thơm trên cây lúa có liên quan đến một gen lặn kiểm soát tính trạng này [33], [35], [37], [71], [72], [90], [91], [97]

1.2.1.2 Mùi thơm trên cây lúa do một gen trội kiểm soát

Kết quả nghiên cứu của 2 tác giả Kadam và Patankar [58] cho rằng gen thơm

là một gen trội Bên cạnh đó, một gen trội cũng đã được báo cáo là điều khiển mùi thơm trên lúa bởi Jodon và ctv [57a]

1.2.1.3 Mùi thơm trên cây lúa do đa gen kiểm soát

Từ kết quả phân ly với tỉ lệ 13 (không thơm) : 3 (thơm) ở F2 giữa 2 giống thơm/không thơm, Charkravaty [41] kết luận có một gen ức chế liên quan đến tính thơm của lúa trong số 2 gen lặn được phát hiện

Một số nghiên cứu khác thì cho rằng tính thơm do: hai gen lặn họat động lặp đọan (tỉ lệ 1:15 ở F2) [44]; ba gen lặn (tỉ lệ 27:37 ở F2) [58], [82], [86]

Vivekanandan và Giridharan [103] đã báo cáo có hai gen lặn điều khiển mùi thơm phụ thuộc vào kiểu gen sử dụng trong việc lai tạo trong nghiên cứu

Hai tác giả Tripathi và Rao [100] cho rằng mùi thơm được điều khiển bởi hai

gen trội bổ sung (SK1và SK2), các gen này độc lập với các gen điều khiển màu lá và

màu vỏ chín Sử dụng tổ hợp lai Pankaj (lúa thường)/Kalabhat (lúa thơm), kết quả cho tỉ lệ phân ly 9 (thơm) : 7 (không thơm) ở thế hệ F2

Geetha [48] cũng báo cáo có hai gen lặn thay cho một gen điều khiển mùi thơm trên lúa

Tsuzuki và Shimokawa [101] quan sát tỉ lệ 13:3 (không thơm: thơm) trong F2 cho thấy rằng một gen cho mùi thơm và một gen đi kèm theo có khả năng để phát triển mùi thơm

IRRI [55] đã liệt kê kết luận của nhiều tác giả cho rằng ba gen trội bổ sung kiểm soát tính thơm [82], [86] Đồng ý với các quan điểm trên, Nagaraju và ctv [82] cũng nhận thấy rằng mùi thơm được điều khiển bởi sự họat động của ba gen trội bổ sung và đề nghị phân tích lá coi như là phương pháp đơn giản và tốt nhất để phân tích mùi thơm

Hai khoa học gia Ấn Độ Kadam và Patankar [58] đã nghiên cứu quần thể lai giữa giống Kolamba (lúa thường) và giống lúa Sukhadasi (lúa thơm), sử dụng phương pháp đun nóng gạo lứt trong ống nghiệm với nước lọc Kết quả cho thấy các cá thể F1 đều thơm và tỉ lệ phân ly ở thế hệ F2 là 27(thơm) : 37(không thơm);

giả thuyết rằng có 3 gen trội bổ sung kiểm soát tính thơm: Oa, Ob, Oc họat động

Reddy và Sathyanarayanaiah kết luận rằng mùi thơm được qui định bởi 3 gen lặn bổ sung [86]

Tuy nhiên, tác giả Dhulappanavar [43] lại cho rằng mùi thơm được qui định bởi 4 gen lặn bổ sung Dhulappanavar đã sử dụng phương pháp cảm quan để nghiên cứu tính thơm con lai của giống T-141(không thơm)/ Kagisali 44-1(thơm) Theo giả thuyết có 4 gen bổ sung từ thế hệ F2 với 81(thơm) : 175(không thơm)

Sự di truyền đa gen cũng đã được đề nghị cho mùi thơm trên lúa bởi Richharia và ctv [88]

Siddiq [92] đã báo cáo có 3 gen lặn, 2 trong số chúng rất quan trọng cho việc biểu hiện mùi thơm

Khush và Dela Cruz [63] đã đề nghị rằng mùi thơm là một tính trạng số lượng khi các con phân ly thể hiện mức độ khác nhau về mùi thơm được quan sát trong các tổ hợp lai giữa lúa thơm và không thơm Cũng có khả năng một gen chính

về mùi thơm và một vài gen bổ sung hay QTLs Tuy vậy, cũng không loại trừ ảnh hưởng của tương tác GxE trong sự thể hiện mùi thơm

Bên cạnh đó, hai tác giả Kader và Delseny [59] cũng kết luận mùi thơm là QTLs, mùi thơm được điều khiển bởi một gen chính trên nhiễm sắc thể số 8 và hai gen phụ trên nhiễm sắc thể số 4 và số 12

Tác giả Pinson [85] cho rằng một trong số những lý do dẫn đến sự nhầm lẫn

về gen thơm đó là do sự phân tích các giống lúa khác nhau, tập trung vào 6 giống để đánh giá kiểu gen thơm có liên quan và đã nhận thấy rằng Jasmine 85, A-310, Della-X và PI45917 mỗi giống đều chứa một gen đơn về mùi thơm và có alen với nhau Giống Amber và Dragon Eyeball 100 mỗi giống đều chứa 2 gen thơm, một gen mới thêm vào một alen cho gen trong A-310, Della-X, Jasmine 85 và PI457917

Tóm lại, đã có nhiều quan điểm khác nhau về sự di truyền gen qui định mùi thơm trên cây lúa điều này có thể do sự phân tích các giống lúa khác nhau hay nền tảng về di truyền khác nhau của các vật liệu được sử dụng trong nghiên cứu [59], vì thế phải có những khu vực xác định cho việc canh tác các giống lúa có mùi thơm nơi các tính trạng số lượng của chúng được thể hiện một cách tốt nhất

Ở thời điểm hiện tại, mặt dù các kiểm tra cũng khá nhạy đối với việc có hay không có mùi thơm, nhưng nó vẫn không đủ phân biệt được các mức độ khác nhau của mùi thơm Không có phương pháp về số lượng nào để nhận biết mùi thơm Có

lẽ là do sự ảnh hưởng của môi trường (tính thơm có hệ số di truyền rất thấp [18]) trên sự biểu hiện mùi thơm và sự thiếu phương pháp đánh giá về số lượng cho các mức độ khác nhau của mùi thơm

1.2.2 Một số nghiên cứu trong và ngoài nước ứng dụng PCR trong chọn lọc gen mùi thơm

1.2.2.1 Một số nghiên cứu trong nước ứng dụng PCR trong chọn lọc gen mùi thơm

Bản đồ fine mapping về gen mùi thơm trên nhiễm sắc thể số 8 được tác giả Nguyễn Thị Lang và ctv [3] thiết kế thông qua ứng dụng SSR (microsatellite) với

khoảng cách di truyền giữa gen fgr với chỉ thị RM223 là 1,8cM và với chỉ thị

RG28FL-RB (được thiết kế lại từ trình tự của chỉ thị RG28) là 1,6cM, được xem là

có liên kết chặt với gen fgr Hai chỉ thị RG28FL-RB và RM223 có thể sử dụng

trong chương trình chọn giống nhờ chỉ thị phân tử [67]

RG28FL: 5’-GATCTCACTCCAAGTAAACTCTGAC-3’

RG28RB: 5’-ACTGCCATTGCTTCTGTTCTC-3’

(Nguồn: Nguyễn Thị Lang và Bùi Chí Bửu [65])

RM223F: 5’-GAGTGAGCTTGGGCTGAAAC-3’

RM223R: 5’-GAAGGCAAGTCTTGGCACTG-3’

(Nguồn: Nguyễn Thị Lang và Nguyễn Thúy Liễu [17])

Bên cạnh đó, chỉ thị RM223 có sự liên kết với gen chống chịu mặn với khoảng cách di truyền là 6,3cM trên nhiễm sắc thể số 8 ở giai đoạn mạ [11]

Đề tài ứng dụng đánh dấu vi vệ tinh trong chọn giống lúa (Oryza sativa L.)

có mùi thơm đã được tác giả Bùi Thị Dương Khuyều thực hiện vào năm 2004 [7] trên bộ giống lúa mùa địa phương (193 giống) với kết quả có 4 alen liên kết với chỉ thị RM223

Tác giả Nguyễn Thị Lang và ctv [12]; [13] thực hiện đề tài nghiên cứu về mùi thơm ứng dụng dấu chuẩn phân tử thông qua các kỹ thuật SSR và STS thử nghiệm trên nhiều chỉ thị khác nhau Kết quả chỉ có 12 chỉ thị SSR nằm trên nhiễm sắc thể số 8 là RM134, RM118, OSR34, RM38, RM25, RM310, RM344, RM42, RM223, RM284, RM308 có biểu hiện đa hình trong cặp lai OM1490/Khao Dawk Mali 105 Đối với chỉ thị STS, đa hình trong cặp lai OM1490/Khao Dawk Mali 105 trên chỉ thị RG28 biểu thị khá rõ

Theo tác giả Nguyễn Thị Lang [9] đánh giá mùi thơm thông qua kiểu gen, sản phẩm PCR trên gel agarose 3% với chỉ thị RM223 cho thấy có sự đa hình trên các giống: Thơm Sớm, Nếp Sương Găng, Nhỏ Thơm, Nếp Sáp, Trắng Hòa Bình, Khao Dawk Mali 105, Nàng Thơm Chợ Đào, Nàng Thơm Muộn, Nàng Thơm Thanh Trà, Bông Cu Tím, Cổ Na, Nàng Hương [15] Các giống này là những giống đặc sản địa phương có chứa gen thơm được phát hiện thông qua sử dụng chỉ thị phân tử RM223 Dùng phần mềm PopGen phân nhóm và phân tích khoảng cách di truyền bằng chỉ thị phân tử trên cơ sở biểu hiện đa hình, kết hợp với phần mềm NTSYS phân tích nhanh giản đồ phân nhóm di truyền dựa trên xếp nhóm bằng phương pháp SAHN, sắp xếp các giống thành những cụm nhóm khác nhau trên cơ

sở mức độ di truyền NTSYS phân nhóm 46 mẫu lúa mùa địa phương tại 8 loci khác nhau Từ kết quả phân tích nhóm di truyền về mùi thơm cho thấy giống Hoa Lài

(thơm nhẹ) và Bông Hường (không thơm) có mức độ dung hợp nhỏ hơn 65% Hai giống được sử dụng làm bố mẹ này có khoảng cách di truyền liên kết với tính trạng mùi thơm trên 35% [14]

Đối với lúa mùa địa phương, tập trung nghiên cứu các mẫu lúa thu thập khác nhau từ giống lúa Nàng Thơm Chợ Đào Do vậy nhiều mẫu trong cùng một giống được chọn lựa và đánh giá về tính trạng mùi thơm Tuy nhiên, về mùi thơm trên các dòng này rất biến động [17]

Nghiên cứu đa dạng di truyền lúa Tám bằng chỉ thị microsatellite đã được tác giả Trần Danh Sửu và ctv [19] thực hiện Hai mươi hai (22) giống lúa thơm thuộc nhóm lúa Tám đã được đánh giá thông qua việc sử dụng 48 chỉ thị SSR trên 12 nhiễm sắc thể của bộ gen cây lúa Kết quả cho thấy rằng số lượng alen trung bình cho mỗi chỉ thị SSR là 3,37 alen Các alen dị hợp tử được coi như có tần suất cao trong lúa thơm Tất cả 22 giống lúa thơm trong nghiên cứu này thuộc nhóm

japonica Hai giống có tên gọi là Tám Nghĩa Lạc (acc No.5122) và Tám Ấp Bẹ (acc

No.5126) được coi như là cùng một giống nhưng với tên gọi khác nhau

Đề tài nghiên cứu cấp bộ về chọn tạo giống lúa năng suất cao, phẩm chất tốt phục vụ xuất khẩu đã được tác giả Bùi Chí Bửu [1] thực hiện và báo cáo Trong đó

đề tài nhánh là công trình nghiên cứu chọn tạo giống lúa có phẩm chất gạo tốt ở ĐBSCL đã được tác giả Nguyễn Thị Lang và ctv [16] thực hiện thông qua ứng dụng

chỉ thị RG28FL-RB để phát hiện cá thể có gen fgr đối với giống Nàng Nhen Thơm

của tỉnh An Giang Ứng dụng chỉ thị này để đánh giá 1000 cá thể giống lúa Nàng Nhen Thơm cho thấy mức độ biến động của những cá thể chọn lọc rất lớn Nhóm 1 (không thơm) chiếm 60%, nhóm 2 (thơm nhẹ) chiếm 37%, nhóm 3 (thơm trung bình) chiếm 3% và nhóm 4 (rất thơm) chiếm 0,001%

Đánh giá về kiểu hình và kiểu gen cho mùi thơm trên lúa đã được hai tác giả Nguyễn Thị Lang và Bùi Chí Bửu [4] thực hiện và báo cáo trong đề tài chọn giống phẩm chất cho ĐBSCL Đối với lúa cao sản, phân tích trên 46 giống lúa cải tiến, ngắn ngày có năng suất cao Dùng IR64 làm giống đối chứng không thơm và giống thơm là Jasmine 85 Phân tích mùi thơm trên lá, thân, trên gạo trắng và gạo lức Kết

quả ghi nhận các giống có mức độ mùi thơm khác nhau Chọn lựa các giống đại diện cho các giống lúa mùa và lúa cao sản, tiến hành chạy PCR trên mùi thơm bằng phương pháp microsatellite Dùng chỉ thị RM223 ghi nhận sự khuếch đại trên các giống chiếm 93,8% Sản phẩm chỉ thị đa hình tách rất rõ cho hai alen Alen A có sản phẩm PCR dài 140 cặp bazơ và alen B là 160 cặp bazơ (bp) Theo đánh giá các

alen trội của IR64 có độ lớn phân tử 160 cặp bazơ và alen lặn điều khiển gen fgr của

DS-20 có độ lớn phân tử là 140 cặp bazơ Các giống có alen với độ lớn phân tử 140 cặp bazơ sẽ mang gen thơm Phân tích STS đối với chỉ thị RG28FL-RB Ghi nhận

sự khuếch đại trên các giống chiếm 93,8% Ghi nhận sự đa hình và tách các gen cho giống và dòng lúa mùa và cao sản với hai alen, alen B với kích thước phân tử là

1200 cặp bazơ và alen A là 1100 cặp bazơ Theo kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thị Lang và ctv [18] thì các giống có alen với độ lớn 1200 cặp bazơ sẽ mang gen thơm

Tóm lại, hai chỉ thị phân tử RM223 và RG28FL-RB có thể được xem là liên kết chặt với gen qui định mùi thơm trên cây lúa và cũng là hai chỉ thị tiêu biểu đã được sử dụng rất hiệu quả trong chọn lọc gen mùi thơm thông qua các nghiên cứu trên

1.2.2.2 Một số nghiên cứu ngoài nước ứng dụng PCR trong chọn lọc gen mùi thơm

Theo các tác giả Ahn và ctv [32], Li và ctv [73] báo cáo rằng chỉ thị phân tử

RG28 trên nhiễm sắc thể số 8 có liên kết chặt với gen thơm fgr với khoảng cách di

truyền 4,5cM và đề nghị chỉ thị phân tử này có thể được sử dụng để chọn lọc dòng con lai có sự thể hiện hay vắng mặt của gen qui định mùi thơm

Theo Lorieux và ctv [76] có 4 loại chỉ thị phân tử (RFLPs, RAPDs, STSs, isozymes) được sử dụng lập bản đồ chỉ thị phân tử cho gen thơm Kết quả xác định

có nhiều chỉ thị phân tử trên nhiễm sắc thể số 8 liên kết rất chặt với gen điều khiển

sự hiện diện của 2-acetyl-1-pyrroline (2AP) một hợp chất chính tạo mùi thơm của lúa Có một gen chính và hai loci tính trạng số lượng điều khiển tính trạng mùi thơm cây lúa Gen chính điều khiển mùi thơm được định vị và liên kết giữa hai chỉ

thị RG1 và RG28 trên nhiễm sắc thể số 8 Hai loci điều khiển tính trạng số lượng tác động đến mức độ thơm của các giống lúa

Tác giả Jin và ctv [56] dùng 300 mồi RAPD thanh lọc xác định tính trạng thơm của con lai từ giống bố mẹ Khao Dawk Mali 105 (thơm) và CT9993 (không thơm) Số phần trăm mồi thể hiện đa hình khá cao (64,1%) giữa hai giống Khao

Dawk Mali 105 và CT9993 Tuy nhiên, chỉ có một mồi Jas1.5

(5’-GAACGGACTC-3’) cho một băng đa hình giữa cá thể thơm và không thơm, băng 1,5kb chỉ tìm thấy ở giống không thơm Kết quả cho thấy đoạn này có sự kết nối với alen trội không thơm Dựa vào sự hiện diện của alen trội không thơm để loại trừ các

cá thể không có mùi thơm, chỉ thị Jas1.5 liên kết với gen thơm trên nhiễm sắc thể

số 8 với khoảng cách di truyền 13,9cM

Ngoài ra, tác giả Yoshihashi [116] đã thành công khi dùng SSR đánh dấu với mồi RM17 để xác định giống gạo thơm Khao Dawk Mali 105 với các giống khác cũng mang cùng tên trên thị trường thông qua DNA được ly trích từ hạt gạo xay chà

Hai tác giả Stephen Garland và Robert Henry [98] mô tả sự phát triển và ứng

dụng 3 chỉ thị có ích cho gen fgr nằm trong một chương trình chọn giống lúa của

Úc Xuất phát từ ý tưởng của các tác giả đi trước đã báo cáo về sự đa hình của các

đoạn dò RFLP lúa và STS là các tác giả Fuknoka và ctv [46], Ghareyazie và ctv

[49], Williams và ctv [108], Xu và ctv [113] Từ đó đã chuyển các đoạn dò RFLP

và những chỉ thị khác thành các chỉ thị phân tử PCR Phương pháp được áp dụng trong nghiên cứu này dựa trên các báo cáo về mức độ liên kết giữa RG28 trên NST

số 8 với gen qui định mùi thơm với khoảng cách di truyền 4,5cM của Ahn và ctv [32]

Bên cạnh đó, Lorieux và ctv [76] đã báo cáo mức độ liên kết giữa RG28 và

gen fgr là 5,8cM Thanh lọc về sự đa hình trong những vùng khuếch đại PCR tương đồng với các RFLP clone có liên kết với fgr để phát triển những chỉ thị phân tử

Thêm vào đó, những chỉ thị SSR đã được lập bản đồ trước đây trong những vùng

lân cận của gen fgr cũng được đánh giá về thông tin đa hình để cung cấp những chỉ

thị tốt cho mùi thơm Khỏang cách về di truyền giữa gen fgr và các chỉ thị liên kết

được xác định là phần trăm trao đổi chéo Thông qua thí nghiệm đã xác định được 3 chỉ thị có triển vọng là SCU-Rice-SSR-1, RM223 và RM42 với:

SCU-Rice-SSR-1.F: 5’-GATCTCACTCCAAGTAAACTCTGAC-3’

SCU-Rice-SSR-1.R: 5’-ACTGCCATTGCTTCTGTTCTC-3’

Chỉ thị RSP04 đã được lập bản đồ trong quần thể F2 của tổ hợp lai Doongara (không thơm)/Kyeema (thơm) khoảng 50 cá thể và tổ hợp lai Gulfmont (không thơm)/Kyeema (thơm) khoảng 163 cá thể Việc lập bản đồ đệ trình kết quả mùi thơm từ một gen lặn và đã phát hiện RSP04 có liên kết với gen thơm với khỏang cách di truyền là 2cM RSP04 đã được đánh giá trên nhiều giống Tất cả các giống thơm có “C“ ở vị trí SNP trong khi các giống không thơm có một sự trộn lẫn giữa

“C“ và “T“ ở vị trí SNP

Một số nghiên cứu gần đây của tác giả Giovanni và ctv [51] đã kết luận thành phần hóa học 2-acetyl-1-pyrroline được coi như là thành phần quan trọng nhất của mùi thơm trong lúa thơm kiểu Jasmine và Basmati và xác định một đọan SSR – (AT)40 cho mùi thơm và các alen không thơm của gen fgr

Tác giả Mandy Christopher và ctv [79] đã báo cáo về một chỉ thị SSR và một chỉ thị SNP mới cho mùi thơm Xuất phát từ SCU-Rice-SSR-1 dựa trên sự phân biệt khác nhau cặp bazơ đơn trong một lặp lại (T)n giữa các giống thơm và không thơm Tuy nhiên, khi sử dụng hệ thống phân tách DNA ít nhạy cảm hơn như là agarose gel, chỉ thị này không thành công trong việc phân tách giữa các loại giống

Vì vậy, một số tổ hợp bố mẹ quan trọng không có đa hình đối với chỉ thị này Từ

cơ sở dữ liệu SSR lúa của Monsanto được công bố, phát triển chỉ thị SCU015RM như là một chỉ thị phân tử triển vọng cho gen thơm Khỏang cách từ gen thơm đến SCU015RM ước tính khỏang 2cM

Từ báo cáo của Louis M và ctv [78] hai tác giả Robert Henry và Daniel Waters [89] nhận thấy bản chất của sự mất đoạn và các đột biến chính là nguyên nhân dẫn đến mùi thơm và đã thiết kế các cặp mồi chuyên biệt cho gen mùi thơm Cặp mồi ESP (External Sense Primer) – EAP (External Antisense Primer) khuếch

đại đoạn 577 cặp bazơ trong lúa thơm và 585 cặp bazơ ở lúa không thơm Bên cạnh

đó, một mồi nhân đoạn nucleotide bên trong gen mùi thơm là IFAP (Internal Fragrant Antisense Primer) kết hợp với mồi ESP (External Sense Primer), được thiết kế kết hợp để khuếch đại đoạn 257 cặp bazơ đặc trưng cho lúa thơm Ngoài ra EAP (External Antisense Primer) sẽ được kết hợp với một mồi nhân đoạn nucleotide bên trong gen không mùi thơm là INSP (Internal Non-fragrant Sense Primer) để khuếch đại một đoạn 355 cặp bazơ đặc trưng cho lúa không thơm Đánh giá được kiểm tra trên quần thể 168 cây từ tổ hợp lai Kyeema (thơm)/Gulfmont (không thơm) với sự phân ly mùi thơm

Tác giả Fjellstrom và ctv [45] đã báo cáo gen fgr trên NST số 8 có liên quan tới sự hiện diện của mùi thơm trong lúa Sự khuyết 8 bazơ trong gen fgr được tìm

thấy bởi Louis M và ctv [77], với đột biến lặn này là nguyên nhân mất đi chức năng của Betaine Aldehyde Dehydrogenase 2 (BAD2), kết quả là có sự tích lũy hợp chất thơm 2-acetyl-1-pyrroline

Tóm lại, ngoài những chỉ thị phân tử STS hay SSR đã được sử dụng rất hiệu quả trong nghiên cứu về gen mùi thơm, các nhà nghiên cứu còn sử dụng những chỉ thị phân tử khác cũng rất có hiệu quả trong chọn lọc gen thơm như RFLP, RAPD hay SNP để phục vụ trong nghiên cứu về gen qui định mùi thơm trên cây lúa

1.2.3 Một số nghiên cứu trong và ngoài nước về ứng dụng BAC DNA trong chọn giống lúa

1.2.3.1 Các nghiên cứu trong nước về ứng dụng BAC DNA trong chọn giống lúa

Thí nghiệm chọn giống lúa có gen kháng bệnh đạo ôn nhờ chỉ thị phân tử đã đựơc hai tác giả Nguyễn Thị Lang và Bùi Chí Bửu [10] thực hiện trên việc phân tích đánh giá quần thể F2 của tổ hợp lai OM1308/Tẻ Tép và OM997/Sóc Nâu Hai chỉ thị RG64 và LPO 111-112 được dùng để thanh lọc những dòng BAC có nguồn gốc từ thư viện BAC của IRRI trên cơ sở bộ gen của IR64 Thư viện DNA của IR64 được lưu trữ với 18.432 dòng Các dòng BAC được ly trích DNA và các BAC DNA

này được phân cắt hạn chế bởi HindIII Trong lần đầu thanh lọc DNA từ tất cả các

dòng BAC, các băng biểu thị rõ khi so sánh với 2 giống đối chứng là IR64 và Azucena Đối chiếu sự khác nhau của các dòng BAC, các vị trí băng chỉ biểu thị trong trường hợp chỉ thị LPO 111-112 Đối với chỉ thị RG64, không có biểu hiện tách được các dòng riêng biệt Đối với chỉ thị LPO 111-112, có 7 dòng BAC biểu hiện với kích thước sản phẩm PCR dài 450 cặp bazơ đó là: 23D09, 23D06, 23H03,

23I13, 23D05, 23J13, 23H09 Dựa trên sự phân cắt giới hạn bởi HindIII, 7 dòng

BAC này được chọn thông qua kỹ thuật thấm Southern Cả 7 dòng BAC này được phân lập từ một vị trí Định hướng các dòng BAC này dựa trên cơ sở lai với đoạn dò cho thấy chỉ thị LPO 111-112 có khoảng cách di truyền khá xa so với RG64 Kết

quả nghiên cứu sự chồng dòng BAC của gen Pi-2 và Pi-Cl sẽ giúp cho việc xây

dựng bản đồ vật lý sau này

Lập bản đồ di truyền và bản đồ vật lý gen kháng rầy nâu Bph-10 đã được hai

tác giả Nguyễn Thị Lang và Bùi Chí Bửu [66] thực hiện Hai quần thể F2 của tổ

hợp lai IR54742/IR31917 và PTB33/TN1 được dùng để đánh giá kiểu gen kháng rầy nâu Chỉ thị RG457 định vị trên nhiễm sắc thể số 12 được dùng để thiết kế chuỗi trình tự của mồi STS và ứng dụng phương pháp PCR nhằm phát hiện gen kháng rầy

nâu Bph-10 trong quần thể con lai của PTB33/TN1 Kỹ thuật dòng hóa được thực

hiện thông qua vectơ BAC Kết quả chỉ thị RG457 đã phân lập được 2 dòng BAC với ký hiệu số đĩa, hàng và cột là 07I2 và 16C14 với kích thước đoạn chèn là 1200 cặp bazơ Bên cạnh đó, việc thực hiện bản đồ chi tiết phục vụ chọn giống (fine mapping) được thực hiện trên quần thể RIL thuộc tổ hợp lai IR54742/IR31917 Hai cặp mồi được thiết kế từ RG457 và những chỉ thị SSR sau đây đã được khuyến cáo

sử dụng trong qui trình MAS: RM227 và RM260

1.2.3.2 Các nghiên cứu ngoài nước về ứng dụng BAC DNA trong chọn giống lúa

Tác giả Xu và ctv [112] đã sử dụng phân tích PCR với các mồi ngẫu nhiên (AP-PCR) để thanh lọc các dòng BAC trùng lấp và nhóm các contig Hai mươi hai (22) mồi ngẫu nhiên được sử dụng để thanh lọc BAC DNA Khoảng 245 dòng BAC được xác định là có trùng lấp bằng AP-PCR và đã được kiểm tra lại thông qua lai

DNA-DNA Hai trăm bốn mươi lăm (245) dòng BAC sau đó được nhóm thành 80 đảo (contigs) Kết quả cho thấy phân tích PCR với các mồi ngẫu nhiên là công cụ mạnh mẻ cho việc thanh lọc các dòng BAC chồng lấp với mật độ cao và hiệu quả Việc ứng dụng phân tích AP-PCR giúp đẩy nhanh tốc độ xây dựng bản đồ vật lý của bộ gen trên cây trồng cũng giống như trên bộ gen của cây lúa

Trong nghiên cứu về gen cho mùi thơm trên lúa tác giả Louis M và ctv [77] cho rằng mùi thơm của giống lúa Basmati và giống lúa Jasmine có sự thể hiện của

2-acetyl-1-pyrroline Một gen lặn (fgr) trên nhiễm sắc thể số 8 của lúa đã được liên

kết với tính trạng quan trọng này Thông qua kết quả thí nghiệm bản đồ di truyền của các chỉ thị phân tử và kiểu hình mùi thơm cho thấy rằng chỉ thị phân tử RM515

và SSRJ07 liên kết với gen mùi thơm Khoảng cách vật lý giữa RM515 và SSRJ07

là 386.519 cặp bazơ Dữ liệu cho thấy rằng gen fgr gần với RM515 hơn SSRJ07

Qua kiểm tra dữ liệu lập bản đồ cho thấy một dòng BAC (Bacterial Artificial Chromosome) (AP004463) có chứa gần trọn gen mùi thơm

CHƯƠNG 2

NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Địa điểm nghiên cứu

Đề tài được tiến hành trong nhà lưới và phòng thí nghiệm thuộc bộ môn Di truyền và Chọn giống – Viện Lúa đồng bằng sông Cửu Long, huyện Thới Lai, thành phố Cần Thơ

2.2 Thời gian thực hiện

Đề tài được thực hiện từ tháng 7/2008 đến 7/2011

2.3 Vật liệu nghiên cứu

Một trăm lẻ ba (103) giống lúa mùa địa phương và 109 giống lúa cao sản

ngắn ngày được dùng để đánh giá kiểu hình (Phụ lục 3.1 và 3.2)

Vật liệu được sử dụng để tiến hành lai là các giống lúa được lấy từ ngân hàng gen (Phụ lục 2.1): giống làm bố: Jasmine dòng 1 [26], OM4900, OM3536, OM6161, OM6162; giống làm mẹ: OM2514, OM2517, OMCS2000, OMCS2009; giống đối chứng: KDM 105, IR64 ([25]; [27])

Một số chỉ thị phân tử được sử dụng trong đề tài: RM223, RG28FL-RB, SP6

Bảng 2.1: Các chỉ thị phân tử đã sử dụng để nghiên cứu trong đề tài luận án và trình

tự mồi tương ứng

Chỉ thị Kiểu trình tự

lặp lại (Motif)

Trình tự mồi (F-Forward: mồi xuôi,

R-Reverse: mồi ngược)

2.4 Nội dung nghiên cứu

+ Nội dung 1: Khảo sát đặc tính thơm và không thơm trên các giống lúa mùa

và lúa cao sản hiện đang được duy trì và nhân giống

+ Nội dung 2: Đánh giá kiểu hình và kiểu gen mùi thơm trên các giống sử

dụng làm vật liệu lai và quần thể con lai sau khi được lai tạo

+ Nội dung 3: Khai thác thư viện BAC nhằm dòng hóa vùng chứa gen qui

định mùi thơm

2.5 Phương pháp nghiên cứu

2.5.1 Phương pháp lai tạo

2.5.1.1 Chuẩn bị nguồn vật liệu

Sử dụng các giống và dòng lúa trong Bảng 2.2 và Bảng 2.3 làm vật liệu ban đầu phục vụ lai tạo

Bảng 2.2: Nguồn gốc và một số đặc điểm của các giống lúa được sử dụng làm bố

Jasmine dòng 1

/ Khao Dawk Mali 105

Bảng 2.3: Nguồn gốc và một số đặc điểm của các giống lúa được sử dụng làm mẹ

Thời gian sinh

Ngâm hạt giống đã được gói giấy báo trong dung dịch acid nitric (HNO3) loãng (1‰) khoảng 36 giờ

Ngâm hạt xong tiến hành rửa chua, cắt vát các góc báo để ráo nước và ủ bằng khăn sạch trong 36 giờ

Khi thấy xuất hiện rễ mầm, tiến hành gieo hạt vào các chậu đã được làm đất và bón lót

Cây mạ sau 15 ngày có thể tiến hành cấy ra các chậu khác để đảm bảo không gian phát triển và tối ưu hóa khả năng đẻ nhánh của giống

Các chậu lúa sau khoảng 2 tháng trồng sẽ bắt đầu xuất hiện đòng có thể chuẩn

bị thao tác lai Tuy nhiên do mỗi giống có thời gian sinh trưởng khác nhau nên lựa chọn thời gian để gieo trồng là khâu quan trọng, đảm bảo cho các giống trổ cùng thời điểm để dễ tiến hành lai Phương pháp được sử dụng là trồng các cây vật liệu 3

lần, mỗi lần cách nhau 5 ngày sẽ đảm bảo được các giống trổ bông cùng thời điểm tạo thuận lợi cho công việc lai tạo

Khi cây lúa trổ, chọn bông lúa phù hợp để tiến hành lai với các cặp lai như sau:

Các bước thực hiện:

- Chọn cây mẹ tốt

- Chọn bông phải trổ ra khỏi bẹ 50-60% Cẩn thận tách bông được chọn khỏi các bông xung quanh để dễ làm

- Dùng kéo cắt bỏ tất cả hoa đã nở từ chóp bông và hoa còn non ở cuối bông

- Dùng kéo cắt xiên từ 1/3 đến 1/2 vỏ trấu để lộ ra những túi phấn

- Dùng pen ấn nhẹ các túi phấn vào vỏ trấu và vít chúng ra ngoài

- Sau khi tất cả các hoa đã được khử đực, dùng giấy bóng mờ bao cả bông lúa lại Xếp túm phần miệng bao lại và kẹp ở gần cổ bông để giữ bao cho chặt

- Ghi ngày khử đực và tên giống lúa lên bao

2.5.1.3 Phương pháp thụ phấn

Bông lúa đã khử đực phải được tung phấn vào ngày hôm sau

Chọn những bông từ những cây bố tươi tốt, có nhiều hoa đã nở và hoa ở chóp bông đã tung phấn Cắt bông lúa ở một độ dài thuận tiện và cắt bỏ lá cờ

Mở miệng bao giấy ở bông cây mẹ Nhẹ nhàng lấy một bông cho phấn đang

nở hoa và rắc phấn lên bông cây mẹ đã được khử đực rồi

Sau khi thụ phấn xong, bao giấy lại như cũ, gắn thẻ lai, ghi rõ bố mẹ, ngày thụ phấn

Một tuần sau khi lai có thể tiến hành kiểm tra xem bông có được thụ hay không

Hình 2.1: Thao tác khử đực bông lúa được thực

hiện vào buổi chiều trong nhà lưới

2.5.2 Phương pháp phòng thí nghiệm

2.5.2.1 Phương pháp đánh giá mùi thơm bằng cảm quan

+ Đánh giá mùi thơm trên bộ phận lá và thân

Phương pháp đánh giá mùi thơm trên bộ phận lá và thân ở các giống lúa mùa, lúa cao sản và các tổ hợp lai được thực hiện là phương pháp xét nghiệm alkali (Sood và Siddiq) [97]

Bước sau cùng là mở nắp ống nghiệm đánh giá cảm quan bằng cách ngửi và cho điểm theo thang điểm:

Điểm 0 = không thơm

Hình 2.2c: Hạt lai thu được sau

khi bông lúa đã được thụ phấn thành công

+ Đánh giá mùi thơm trên hạt (phương pháp xét nghiệm alkali của Sood

và Siddiq) [96]

Mười hạt của mỗi giống được bóc vỏ trấu và nghiền bằng tay Lấy bột gạo của mỗi giống cho vào từng ống nghiệm hoặc đĩa petri Cho 5 ml KOH 1,7% vào mỗi đĩa và đậy lại Mẫu đã xử lý được đặt trong điều kiện nhiệt độ của phòng thí nghiệm trong 30 phút Các đĩa được mở ra từng cái theo thứ tự, rồi đánh giá mùi thơm bằng phương pháp ngửi theo 3 cấp như trên

Hình 2.5: Đánh giá mùi thơm trên hạt Hình 2.3: Đánh giá mùi thơm trên lá Hình 2.4: Đánh giá mùi thơm trên thân

2.5.2.2 Phương pháp đánh giá mùi thơm bằng chỉ thị phân tử

+ Kỹ thuật ly trích DNA trên lúa (Mini scale DNA) [8]

Để ly trích DNA từ cây lúa cần chuẩn bị: ngâm mẫu khoảng 24 giờ, ủ đến khi nảy mầm thì gieo những cây lúa vào trong các đĩa petri Cây lúa còn non, mô lúa được nghiền bằng cối với dung dịch ly trích để phá vỡ thành tế bào của lá

Cách tiến hành:

- Chọn và thu mẫu lá non, khỏe (khoảng 2 cm) cho vào ống Eppendorf, ghi nhãn và đậy nắp rồi đặt vào thùng trữ lạnh

- Cắt nhỏ lá cho vào cối nghiền

- Cho vào 400l dung dịch ly trích DNA (extraction buffer), nghiền mẫu lá đến khi nào dịch trích có màu xanh

- Cho thêm 400l dung dịch ly trích DNA, trộn đều và dùng micropipet rút chuyển 400l sang ống Eppendorf mới (thể tích 1,5 ml) đã được ghi nhãn

- Cho thêm 400l chloroform, trộn cẩn thận và đặt vào máy ly tâm, chạy ly tâm khoảng 30 giây, tốc độ 13000 vòng/phút ở nhiệt độ phòng, chuyển phần dung dịch bên trên sang ống Eppendorf 1,5ml khác đã ghi nhãn Giai đoạn này cẩn thận, tránh sự trộn lẫn dung dịch nằm phía dưới

- Thêm 400l cồn 100% và trộn kỹ, ly tâm trong thời gian 3-5 phút Bỏ hết phần dung dịch bên trên

- Rửa viên tủa (pellet) với cồn 70% và phơi DNA ở nhiệt độ phòng trong khoảng 1 giờ

- Hòa tan DNA trong 50l TE, bảo quản mẫu ở nhiệt độ -20 0C

Chú ý : Để đảm bảo không có sự tạp nhiễm, toàn bộ dụng cụ phải được hấp khử trùng trước khi sử dụng, đeo găng tay và sát trùng khu vực làm việc

+ Kỹ thuật kiểm tra chất lượng và số lượng DNA thông qua chạy điện di trên agarose gel TAE 1X 0,9% [8]

Chuẩn bị agarose gel để chạy điện di: dùng gel lớn với kích thước bảng gel

20-30cm Mẫu có 24-36 giếng Tùy theo tính chất của thí nghiệm mà pha nồng độ gel sao cho hợp lý Đối với nội dung kiểm tra chất lượng DNA nồng độ gel chỉ cần

0,9% Đối với kiểm tra STS nồng độ gel cần 1-1,2% Đối với kiểm tra SSR nồng độ gel cần 3-5% (tùy theo chất lượng agarose) [8]

Bảng 2.4: Trọng lượng agarose theo nồng độ và đối tượng thí nghiệm

- Để agarose nguội khoảng 65oC

- Đổ gel vào khay đựng gel Cẩn thận tránh bọt khí Đặt lược trước khi đổ gel vào khay Để cho gel nguội khoảng một giờ

- Di chuyển hai đầu (tape) ra khỏi gel

- Đặt khay gel vào trong hộp điện di và đổ đầy TAE 1X ngập gel

- Cẩn thận rút lược ra khỏi gel Tránh làm bể gel và hư giếng.

Chạy điện di

- Lấy mẫu giấy parafilm, nhỏ 3l giọt loading buffer lên sau đó cho thêm 7l

DNA lên mỗi giọt loading buffer và trộn đều, hút hỗn hợp DNA cho vào giếng của khay điện di

- Mở dòng điện 100V, 100mA và định thời gian cho gel chạy (thời gian chạy

cho điện di nằm là 90 phút)

- Nhuộm với ethidium bromide và mang gel đi chụp ảnh dưới tia UV: nếu

DNA có chất lượng tốt thì giống băng lamda phage chuẩn, nếu DNA lẫn tạp sẽ thấy

có vệt trắng kéo dài trên gel

+ Kỹ thuật chạy PCR với chỉ thị SSR: các bước thực hiện theo phương pháp của Nguyễn Thị Lang [8]

- Các thành phần dung dịch thường đặt trong tủ lạnh -20oC và -80oC