(Đồ án tốt nghiệp) nghiên cứu khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng thủy phân sụn khớp chân gà với xúc tác enzyme flavour nhằm thu dịch acid amin thủy phân

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA HÓA ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGÀNH: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN PHẢN ỨNG THỦY PHÂN SỤN KHỚP CHÂN GÀ

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

KHOA HÓA

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGÀNH: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

ĐỀ TÀI:

NGHIÊN CỨU KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN PHẢN ỨNG THỦY PHÂN SỤN KHỚP CHÂN GÀ VỚI XÚC TÁC ENZYME FLAVOUR

NHẰM THU DỊCH ACID AMIN THỦY PHÂN

Người hướng dẫn: ThS BÙI VIẾT CƯỜNG Sinh viên thực hiện: NGUYỄN VĂN QUANG

Số thẻ sinh viên: 107140144 Lớp: 14H2B

Đà Nẵng, 2019

TÓM TẮT

Mục đích của nghiên cứu này sử dụng sụn khớp chân gà để sản xuất N-acid amin thủy phân bằng phản ứng thủy phân với xúc tác enzyme flavour Sụn khớp chân gà là nguyên liệu thích hợp để sản xuất N-acid amin thủy phân với hàm lượng protein (13,34 ± 0,075%) Điều kiện phản ứng thủy phân tối ưu tương ứng với từng yếu tố ảnh hưởng được xác định: Nhiệt độ phản ứng 500C ; nồng độ xúc tác 0,72%; thời gian phản ứng 20 phút; thể tích phản ứng 90 mL và PH bằng 4 Hiệu suất thu hồi N-acid amin đạt giá trị cực đại (60.46 ± 1,313%) ở điều kiện phản ứng thủy phân tối ưu Nghiên cứu đã cung cấp những thông tin quan trọng cho ứng dụng xúc tác enzyme flavour để thủy phân nguyên liệu và phụ phẩm nhằm thu nhận N-acid amin thủy phân Theo khảo sát, thủy phân sụn khớp chân gà với xúc tác enzyme flavour chưa được tiến hành trên thế giới và Việt Nam

Lớp: 14H2B Khoa: Hóa Ngành: Công nghệ thực phẩm

Tên đề tài đồ án: Nghiên cứu khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng thủy phân sụn khớp chân gà với xúc tác enzyme flavour nhằm thu dịch acid amin thủy phân

Đề tài thuộc diện: ☐ Có ký kết thỏa thuận sở hữu trí tuệ đối với kết quả thực hiện

1 Các số liệu và dữ liệu ban đầu:

2 Nội dung các phần thuyết minh và tính toán:

Lời mở đầu

Chương 1: Tổng quan

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương 3: Kết quả và thảo luận

Chương 4: Kết luận và kiến nghị

Tài liệu tham khảo

Phụ lục

3 Các bản vẽ, đồ thị ( Không )

4 Họ tên người hướng dẫn: ThS Bùi Viết Cường

5 Ngày giao nhiệm vụ đồ án:

6 Ngày hoàn thành đồ án:

Đà Nẵng, ngày … Tháng… năm 2019

LỜI MỞ ĐẦU

1 Lí do chọn đề tài

Sụn khớp chân gà là một phụ phẩm của ngành công nghiệp giết mổ gia cầm với trữ lượng lớn, ở Việt Nam hiện tại đang nhập sụn khớp chân gà Công nghiệp chế biến và giết mổ gà đóng vai trò quan trọng trong nền kinh tế của nhiều quốc gia trên thế giới

và sản lượng thịt gà được dự đoán đạt đến mức 97,8 triệu tấn trong năm 2019 Tuy nhiên, khoảng 63% khối lượng thịt gà được sử dụng làm thức ăn cho con người và phần còn lại được thải ra môi trường dưới dạng chất thải rắn như: chân gà, đầu, da, xương, máu và lông Trong đó, chân gà chiếm 3,9 - 5,3% khối lượng gà sản xuất và là một trong các phụ phẩm của công nghiệp chế biến gà Phụ phẩm này có giá trị dinh dưỡng thấp ở các nước Châu Âu phụ phẩm này thường được làm thức ăn cho gia súc hoặc loại bỏ Nếu phụ phẩm này không xử lý triệt để sẽ gây ra những vẫn đề về môi trường và lãng phí nguồn acid amin hữu cơ Vì vậy nghiên cứu thủy phân sụn khớp chân gà là cần thiết vừa tận dụng được nguồn phụ phẩm vừa tăng giá trị kinh tế cho phụ phẩm từ ngành công nghiệp giết mổ gà

Từ những thực tế đã nêu ra, đề tài “Nghiên cứu khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến

phản ứng thủy phân sụn khớp chân gà với xúc tác enzyme flavour nhằm thu dịch acid amin thủy phân”

2 Mục tiêu nghiên cứu

• Khảo sát thành phần hóa học của sụn khớp chân gà

• Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ, pH, nồng độ xúc tác, thời gian thủy phân và thể tích phản ứng đến quá trình thủy phân sụn khớp chân gà

• Đánh giá và lựa chọn các điều kiện tối ưu cho các yếu tố ảnh hưởng

• Tìm ra nghiệm tối ưu

3 Đối tượng nghiên cứu

Sụn khớp chân gà tên khoa học là “articular caritilage of the chicken” được cung cấp bởi công ty TNHH TM&DV HOÀNG PHÁT

4 Phương pháp nghiên cứu

Phương pháp thủy phân, phương pháp sấy, phương pháp tro hóa khô, phương pháp Kjeldahl, phương pháp chiết soxhlet, phương pháp đồng, xử

lý số liệu bằng phần mềm excel và minitab

5 Nội dung nghiên cứu

5.1 Xác định các thành phần hóa học cơ bản của sụn khớp chân gà

- Xác định hàm lượng ẩm, tro, protein, lipid

5.2 Nghiên cứu khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ, pH, nồng độ xúc tác, thời gian phản ứng, thể tích phản ứng

5.3 Đưa ra phương trình hồi quy và tìm nghiệm tối ưu cho phản ứng

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương 3: Kết quả và thảo luận

Chương 4: Kết luận và kiến nghị

Tài liệu tham khảo

Phụ lục

LỜI CẢM ƠN

Sau hơn 5 tháng nghiên cứu, được sự hướng dẫn tận tình của thầy Bùi Viết Cường,

cùng với sự giúp đỡ của các thầy cô và các bạn sinh viên trong phòng thí nghiệm, tôi

đã hoàn thành đồ án tốt nghiệp của mình

Đầu tiên, tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn sâu sắc tới thầy Bùi Viết Cường đã hết

lòng hướng dẫn tận tình, giúp đỡ tôi từ việc chọn đề tài cho đến khi hoàn thành đồ án

tốt nghiệp của mình Thầy đã cũng cấp cho tôi nhiều kiến thức bổ ích, luôn định

hướng, góp ý và sửa chửa, để từ đó giúp tôi nắm bắt kĩ lưỡng, chi tiết hơn về nội dung,

cũng như các vấn đề liên quan đến đồ án và hoàn thành đồ án một cách tốt nhất

Tôi chân thành cảm ơn thầy, cô giáo trong bộ môn Công nghệ Thực phẩm, các thầy,

cô ở phòng thí nghiệm và tất cả bạn bè đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho

tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp của mình Và xin tỏ lòng biết ơn sâu

sắc đến gia đình, bạn bè đã quan tâm, chia sẻ và động viên để tôi hoàn thành công

việc

Cuối cùng cho tôi được cảm ơn các thầy cô trong hội đồng bảo vệ tốt nghiệp đã

dành thời gian quý báu của mình để đọc và nhận xét cho đồ án của tôi Với điều kiện

thời gian cũng như kinh nghiệm còn hạn chế của một sinh viên, nghiên cứu này không

thể tránh được những thiếu sót Tôi rất mong nhận được sự hướng dẫn, đóng góp ý

kiến thêm của các thầy cô để tôi có điều kiện bổ sung, nâng cao kiến thức của mình,

phục vụ tốt hơn công tác thực tế sau này

Trân trọng cảm ơn!

Đà Nẵng, ngày tháng năm 2019 Sinh viên thực hiện

Nguyễn Văn Quang

Formatted: Justified, Line spacing: Multiple 1,15 li

Formatted: Justified, Line spacing: Multiple 1,15 li

CAM ĐOAN

Với danh dự và trách nhiệm cá nhân, tôi xin cam đoan đồ án “Nghiên cứu khảo sát

các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng thủy phân sụn khớp chân gàvới xúc tác enzyme

flavour để thu dịch acid amin thủy phân” dưới sự hướng dẫn của thầy Bùi Viết Cường

là công trình nghiên cứu độc lập được thực hiện bởi bản thân tôi Việc hoàn thành đồ

án tốt nghiệp được soạn thảo một cách độc lập sáng tạo không sao chép từ các đề tài

khác Các kết quả số liệu thu được trong bài đều trung thực, khách quan không có

chỉnh sửa, sao chép Tài liệu tham khảo sử dụng trong đồ án chính xác có độ tin cậy

cao, được trích dẫn đầy đủ đúng quy định

Đà Nẵng, ngày tháng năm 2019 Sinh Viên

Nguyễn Văn Quang

Formatted: Justified, Line spacing: Multiple 1,15 li

MỤC LỤC

LỜI MỞ ĐẦU 4

1 Lí do chọn đề tài 4

2 Mục tiêu nghiên cứu 4

3 Đối tượng nghiên cứu 4

4 Phương pháp nghiên cứu 4

5 Nội dung nghiên cứu 4

5.1 Xác định các thành phần hóa học cơ bản của sụn khớp chân gà 4

5.2 Nghiên cứu khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ, pH, nồng độ xúc tác, thời gian phản ứng, thể tích phản ứng 4

5.3 Đưa ra phương trình hồi quy và tìm nghiệm tối ưu cho phản ứng 4

6 Cấu trúc đồ án tốt nghiệp 5

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1

1.1 Giới thiệu về sụn khớp chân gà 1

1.1.1 Tình hình sản xuất gà trên thế giới 1

1.1.2 Sụn khớp chân gà 2

1.1.3 Thành phần hóa học của sụn khớp chân gà 2

1.1.4 Ứng dụng của sụn khớp chân gà 4

1.1.5 Ảnh hưởng của nguyên liệu đến môi trường 4

1.2 Phản ứng thủy phân 5

1.2.1 Định nghĩa 5

1.2.2 Chất xúc tác trong thủy phân 5

1.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân protein trong sụn khớp chân gà bằng enzyme 5

1.3 Axit amin 6

1.3.1 Giới thiệu về axit amin 6

1.3.2 Giá trị sinh học của một số axit amin chính có trong sụn khớp chân gà8 1.3.3 Khả năng tiêu hóa protein và axit amin trong thực phẩm của con người [19] 9

1.3.4 Các ứng dụng thương mại của axit amin có trong sụn chân gà 11

1.4 Tối ưu hóa bằng phương pháp bề mặt 12

1.4.1 Nguyên tắc của phương pháp bề mặt đáp ứng 12

1.4.2 Ứng dụng của RSM 12

1.4.3 Các mô hình xây dựng ma trận thí nghiệm trong RSM 13

1.5 Tình hình nghiên cứu chiết protein từ sụn khớp gà 14

1.4.1 Tình hình nghiên cứu thế giới 14

1.4.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam 15

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 Đối tượng nghiên cứu 16

2.1.1 Nguyên liệu 16

2.1.2 Hóa chất 16

2.1.3 Chất xúc tác 16

2.2 Phương pháp nghiên cứu 17

2.2.1 Phản ứng thủy phân sụn khớp chân gà 17

2.2.2 So sánh đánh giá quá trình xử lý nhiệt và không xử lý nhiệt 17

2.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của PH đến quá trình thủy phân sụn khớp chân gà 18 2.2.4 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến phản ứng thủy phân 17

2.2.5 Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ enzyme đến phản ứng thủy phân 18

2.2.6 Khảo sát ảnh hưởng thời gian phản ứng đến quá trình thủy phân sụn khớp chân gà 18

2.2.7 Khảo sát ảnh hưởng của thể tích đến quá trình thủy phân sụn khớp chân gà 18 2.2.8 Tối ưu hóa các yếu tố 19

2.3 Các phương pháp phân tích 22

2.3.1 Xác định thành phần hóa học tương đối của sụn khớp chân gà 22

2.3.2 Xác định hiệu suất thủy phân 22

2.3.3 Xác định hàm lượng acid amin 22

2.3.4 Phương pháp tính toán và phân tích số liệu 23

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 24

3.1 Thành phần sụn khớp chân gà 24

3.2 Đánh giá ảnh hưởng của quá trình xử lý nhiệt và không xử lý nhiệt nguyên liệu đối với phản ứng thủy phân 25

3.3 Kết quả xác định các thông số tối ưu cho quá trình thủy phân sụn khớp chân gà 25

3.3.1 Kết quả xác định ảnh hưởng của nhiệt độ 25

3.3.2 Kết quả xác định ảnh hưởng của PH 27

3.3.3 Kết quả xác định ảnh hưởng của nồng độ enzyme flavour đến quá trình thủy phân sụn khớp chân gà 28

3.3.4 Kết quả xác định ảnh hưởng của thời gian thủy phân 29

3.3.5 Kết quả xác định ảnh hưởng của thể tích phản ứng 30

3.4 Kết quả và thảo luận 32

3.4.1 Kết quả thí nghiệm 32

3.4.2 Phương trình hồi qui 35

3.4.3 Phác đồ đường viền 2D và phác đồ bề mặt 3D 36

3.4.4 Tìm nghiệm tối ưu 40

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41

4.1 Kết luận 42

4.2 Kiến nghị 42

TÀI LIỆU THAM KHẢO 43

Tiếng Việt 43

Tiếng Anh Error! Bookmark not defined PHỤ LỤC 1 44

1.1 Nguyên tắc 45

1.2 Các bước tiến hành 45

1.2.1 Dựng đường chuẩn Tyrosin 45

1.3 Xác định hoạt tính enzyme flavour 45

1.4 Tính toán 46

1.5 Kết Quả 46

PHỤ LỤC 2 46

PHỤ LỤC 3 49

3.1 Pha môi trường đệm 49

PHỤ LỤC 4 50

PHỤ LỤC 5 52

PHỤ LỤC 6 52

PHỤ LỤC 7 54

PHỤ LỤC 8 55

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu về sụn khớp chân gà

1.1.1 Tình hình sản xuất gà trên thế giới

Theo báo cáo tháng 10/2018 của Bộ Nông Nghiệp Hoa Kì (USDA) dự báo, sản

lượng thịt gia cầm toàn cầu trong năm 2019 sẽ tăng lên 2% so với năm 2018, đạt mức

97,8 triệu tấn Mỹ tiếp tục là nước sản xuất thịt gà lớn nhất thế giới với gần 19,7 triệu

tấn tăng 2% vào năm 2019 Tiếp đến là Brazil, Liên Minh Châu Âu và Trung Quốc lần

lượt là 13,8 triệu tấn, 12,47 triệu tấn và 12,0 triệu tấn [1]

Về xuất nhập khẩu, xuất khẩu toàn cầu được dự báo sẽ tăng mạnh 4% trong năm

2019, đạt mức 11,6 triệu tấn Mặt dù không phải quốc gia sản xuất thịt gà lớn nhất thế

giới nhưng Brazil là nước xuất khẩu thịt gà lớn nhất thế giới năm 2019 với 3,8 triệu

tấn thịt Trong năm 2019, Nhật Bản tiếp tục là thị trường nhập khẩu thịt gà lớn nhất thế

giới với hơn 1,18 triệu tấn, tiếp theo là đến Mexico và Liên minh Châu Âu với lượng

nhập khẩu lần lượt đạt 850 nghìn tấn và 680 nghìn tấn thịt Qua đó việc tiêu thụ các

sản phẩm từ gà ngày càng tăng trên toàn thế giới [1]

Bảng1.1: Sản xuất và thương mại thịt gà toàn cầu năm 2015 – 2019(nghìn tấn) [1]

Ở Việt Nam, theo số liệu từ điều tra chăn nuôi của Tổng cục thống kê ngày 1/10/2017

thì nhu cầu tiêu thụ có chiều hướng gia tăng trong khi nguồn cung cấp gà ra thị trường

không đáp ứng được nhu cầu Sản lượng gà xuất chuồng năm 2015, 2016, 2017 lần

lượt là 700,9 ngàn tấn, 740,7 ngàn tấn, 786,4 ngàn tấn và vẫn đang tiếp tục tăng mạnh

qua từng năm [2]

Trong quá trình chế biến gà, một lượng lớn các phụ phẩm hữu cơ dưới dạng nội

tạng, chân gà, đầu, xương, máu,… Các phụ phẩm này thường được dùng làm thức ăn

chăn nuôi hoặc chế biến thành các sản phẩm có giá trị khác như: các sản phẩm thủ

công mỹ nghệ từ lông gà như (hổi lông gà, quả cầu đá) Theo thống kê lượng phụ

phẩm chiếm khoảng 37% khối lượng của gà được thải ra ngoài với một lượng rất lớn

dẫn đến tình trạng thừa cung thiếu cầu Trong đó, chân gà chiếm 3,9 – 5,3% khối

lượng gà đưa vào quá trình giết mổ

Chính vì vậy, việc chế biến, xử lý các phụ phẩm từ gà nhằm thu được protein,

acid amin, lipid có giá trị thương mại cao hơn đồng thời tránh các vấn đề về môi

Formatted: Justified, Line spacing: Multiple 1,15 li

Formatted: Justified, Line spacing: Multiple 1,15 li

trường đang được quan tâm nghiên cứu Trong đó việc thủy phân bằng enzyme để thu

nhận protein và acid amin là một cách tiếp cận hiệu quả và đang được nghiên cứu

nhiều, đặc biệt là sụn khớp chân gà

Ở Châu Âu, phụ phẩm này có giá trị dinh dưỡng thấp và chỉ được sử dụng làm

phân bón, thức ăn chăn nuôi Nhưng các nước châu Á nói chung và Việt Nam nói

riêng các phụ phẩm từ nội tạng của gà và đặc biệt là chân gà được coi là một món

ngon, giàu dinh dưỡng và được tiêu thụ với số lượng khá lớn Trong chân gà chứa một

lượng lớn thịt, sụn và các mô liên kết, do đó nó trở thành một nguồn protein, lipit tốt,

ứng dụng tốt vào nhiều ngành công nghiệp khác nhau [3]

1.1.2 Sụn khớp chân gà

Sụn khớp chân gà là phụ phẩm được lấy ra từ chân gà khi giết mổ Cùng với

lượng chân gà thải ra trong quá trình sản xuất thì lượng sụn khớp chân gà cũng chiếm

tỉ trọng không nhỏ Bản chất của sụn khớp chân gà là những sợi collagen liên kết chặt

chẽ với nhau thành một mạng lưới, có bề mặt mịn màng, trơn bóng [4]

Sụn khớp chân gà được xem là một loại thức ăn bổ dưỡng vì chứa nhiều thành

phần có giá trị dinh dưỡng cao và tốt đối với sức khỏe về xương khớp, chữa bệnh đau

lưng, thoát vị đĩa đệm do thoái hóa cột sống Ngoài ra, các nghiên cứu chỉ ra collagen

thu nhận từ sụn gà có tác dụng xóa nếp nhăn trên da, cho làn da trơn mượt, chống lão

hóa [5]

1.1.3 Thành phần hóa học của sụn khớp chân gà

Sụn khớp chân gà có độ ẩm khá cao chiếm đến (82,85 ± 1,42) tiếp đến là protein

(11,78 ± 0,21%) Thành phần hóa học của sụn khớp chân gà được thể hiện ở bảng 1.2

Formatted: Justified, Indent: First line: 1 cm, Line

spacing: Multiple 1,15 li, Tab stops: Not at 0,75 cm

Formatted: Justified, Line spacing: Multiple 1,15 li

Formatted: Justified, Line spacing: Multiple 1,15 li

Protein có trong sụn khớp chân gà có các acid amin có giá trị dinh dưỡng cao đối với

con người và động vật Đặc biệt là glycine chiếm tỉ lệ cao nhất khoảng 30%, tiếp đó là

proline và alanine lần lượt là 10,5% và 9,8%

Bảng 1.3: Trình bày thành phần các acid amin có trọng sụn khớp chân gà ở các tuổi

khác nhau [8]

Bảng1.3: Thành phần axit amin của sụn khớp của gà

(g axit amin/1000g axit amin tổng số, lấy trung bình của 3 mẫu phân tích) [8]

Axit amin Tuổi, tuần

Hydroxyproline 86 88 86 Axit aspartic 52 51 54

Theo bảng trên cho thấy sụn khớp chân gà được thu nhận từ nhiều độ tuổi khác nhau

nhưng thành phần vẫn có nhiều loại acid amin thiết yếu Các acid amin này được ứng

dụng nhiều trong các lĩnh vực như thực phẩm, dược phẩm và hóa chất

1.1.4 Ứng dụng của sụn khớp chân gà

1.1.4.1 Trong lĩnh vực thực phẩm

Protein và lipit thu nhận từ sụn khớp chân gà là các thành phần quan trọng trong

công thức và là phần không thể thiếu trong dây chuyền sản xuất thức ăn chăn nuôi,

đóng vai trò quan trọng trong qui trình sản xuất thức ăn gia súc Nó là loại nguyên liệu

có giá trị được các nhà dinh dưỡng đánh giá cao, tạo được độ ngon miệng, sản phẩm

có khả năng tiêu hóa cao, không chứa chất kích thích tăng trọng và an toàn khi sử dụng

làm thức ăn chăn nuôi [3]

Protein được chứng minh là có chức năng cải thiện tính chất như độ hòa tan, hấp

thụ chất béo, ổn định bọt và đặc tính nhũ hóa Peptide và axit amin được công nhận là

tiền chất hương vị quan trọng, và ngành chế biến phụ phẩm này được xem như một

phần của ngành công nghiệp hương vị, cung cấp giá rẻ và phong phú tạo sự đa dạng

hương vị trong hệ thống thực phẩm [9]

1.1.5 Ảnh hưởng của nguyên liệu đến môi trường

Ngành công nghiệp chế biến phụ phẩm đóng vai trò quan trọng đối với ngành công

nghiệp giết mổ gia súc gia cầm vì phụ phẩm của ngành công nghiệp giết mổ gia súc

gia cầm nếu không sử dụng triệt để sẽ bị chôn lấp ở các bãi rác công cộng, hố phân vi

sinh, khu chôn lấp, lò thiêu, hoặc những bãi rác thải bất hợp pháp gây nên những mối

nguy tiềm ẩn cho sức khỏe cộng đồng Những phương pháp nêu trên đều có những hạn

chế về khả năng tiêu hủy phụ phẩm và xác chết động vật [3]

Chính vì vậy, các phụ phẩm này sẽ phân hủy và gây ô nhiễm nhanh chóng bởi vi sinh

vật và giải phóng một loạt các hợp chất, nguyên tố hoặc các chất bay hơi có mùi như

hydro sulphide (H2S), ammoniac (NH3), ketone (R-CO-R) và aldehydes (R-CHO)…

vào môi trường vàhiện nay việc kiểm soát được lượng chất bay hơi này còn rất hạn

chế Phương pháp chôn lấp (tiêu hủy) ở cấc bãi rác làm ảnh hưởng đến môi trường

sống, đến sức khỏe của con người và vật nuôi và nền nông nghiệp đặc biệt là các mầm

bệnh sẽ dễ dàng lây nhiễm theo nhiều con đường khác nhau sang người và động vật

[9] Bên cạnh đó, các nguồn tài nguyên sinh học hữu ích như protein, enzyme và lipid,

hoàn toàn có thể ứng dụng và có thể thương mại hóa nhưng lại bị mất đi một cách lãng

phí

Ngoài phương pháp truyền thống sử dụng làm thức ăn chăn nuôi gia súc và phân hữu

cơ, sụnkhớp chân gà được sử dụng phổ biến như là nguyên liệu để thu nhận protein

thủy phân, bằng việc sử dụng các chất xúc tác, kiềm hoặc axit, enzyme với chế độ thủy

phân thích hợp Protein hòa tan được kết tủa và sấy khô để có được protein thủy phân,

hoặc hỗn hợp các peptide hoặc các axit amin tự do

Formatted: Justified, Indent: First line: 0 cm, Line

spacing: Multiple 1,15 li

Formatted: Justified, Line spacing: Multiple 1,15 li

Formatted: Justified, Indent: First line: 0 cm, Line

spacing: Multiple 1,15 li

1.2 Phản ứng thủy phân

1.2.1 Định nghĩa

Quá trình thủy phân là quá trình phân cắt hợp chất cao phân tử thành các phân tử

đơn giản hơn dưới tác dụng của chất xúc tác và có sự tham gia của nước[10]

Hình 1.3: Phương trình phản ứng thủy phân

Bản chất của quá trình thủy phân protein là quá trình cắt mạch các phân tử

protein ở các liên kết peptid tạo ra các phân tử có kích thước nhỏ hơn như: peptone,

polypeptide, peptide và các acid amin [11] Trong quá trình thủy phân protein, các liên

kết peptid bị cắt đứt theo trình tự như sau:

Protein → polypeptide → pepton → peptide → acid amin

Vậy, sản phẩm của quá trình thủy phân protein là các polypeptide, pepton,

peptide và các acid amin Hầu hết các acid amin tạo thành chủ yếu là các L-α amino

acid [11]

1.2.2 Chất xúc tác trong thủy phân

Có hai loại chất xúc tác thường dùng là chất xúc tác phi enzyme (thường là acid

hữu cơ hoặc vô cơ) hoặc chất xúc tác enzyme

Chất xúc tác phi enzyme có phổ xúc tác rất rộng, có thể xúc tác được rất nhiều

loại cơ chất với thời gian thủy phân nhanh, năng suất lớn Tuy nhiên, chúng thường

xúc tác phản ứng thủy phân ở nhiệt độ khá cao (thường lớn hơn 100°C), dễ làm biến

đổi tính chất hóa học của thực phẩm, gây ra nhiều sản phẩm phụ, khó kiểm soát phản

ứng thủy phân trong quá trình chế biến [10]

Chất xúc tác enzyme là những chất xúc tác sinh học được hình thành trong tế bào và

pcó bản chất là protein Các enzyme xúc tác cho hầu hết các phản ứng hóa học xảy ra

trong cơ thể sống, đảm bảo cho các quá trình chuyển hóa các chất trong cơ thể sống

tiến hành với tốc độ nhịp nhàng có trật tự theo những chiều hướng xác định với tốc độ

nhanh

Chất xúc tác sử dụng trong nghiên cứu này là enzyme flavour thương mại bản chất là

enzyme proteaza Các tối ưu cho Flavour là ở nhiệt độ tối ưu từ 50 - 600C, pH tối thích

từ 5 - 6 Nhiệt độ bảo quản tốt nhất của Flavour là 0 ÷ 50C Enzyme này có hoạt lực

là 2285,7UI/g

1.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân protein trong sụn khớp chân

gà bằng enzyme

1.2.3.1 Hàm lượng cơ chất

Khi lượng cơ chất ban đầu thấp, phản ứng thủy phân xảy ra triệt để, hiệu suất

thủy phân tăng, tiết kiệm được thời gian thủy phân nhưng hàm lượng sản phẩm lại

thấp, không kinh tế Ngược lại, khi lượng cơ chất cao, cùng với một lượng chất xúc tác

Formatted: Justified, Line spacing: Multiple 1,15 li

Formatted: Justified, Line spacing: Multiple 1,15 li

nhất định thì năng suất sản phẩm được nâng cao, giảm được chi phí năng lượng đáng

kể

Lượng cơ chất quá cao dẫn đến cơ chất không bị thủy phân triệt để, hiệu suất thủy phân không cao.Do đó, lượng cơ chất được xác định bằng thực nghiệm, tránh những tổn thất không đáng có và tiết kiệm tối đachi phí cho quá trình sản xuất

1.2.3.3 Nhiệt độ phản ứng thủy phân

Enzyme hoạt động tốt nhất ở vùng nhiệt độ tối thích nhất định Khi nhiệt độ thủy phân khác so với nhiệt độ tối thích của enzyme và tốc độ phản ứng thủy phân sẽ giảm Nhiệt độ làm cho động năng của enzyme và cơ chất tăng, chúng chuyển động nhanh hơn dẫn đến tần suất tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất tăng Các phức chất emzyme-cơ chất hình thành nhiều hơn, phản ứng thủy phân xảy ra nhanh hơn Tuy nhiên nếu nhiệt

độ quá cao, enzyme bị biến tính, làm giảm hoạt tính xúc tác hoặc mất hoạt tính dẫn đến tốc độ thủy phân giảm hoặc dừng

1.2.3.5 Thời gian thủy phân

Khi thời gian thủy phân dài, phản ứng thủy phân sẽ diễn ra một cách triệt để, tuy nhiên chí phí năng lượng lúc này tăng lên, cùng với đó là sự tăng lên của các sản phẩm phụ không kiểm soát được Khi phản ứng thủy phân đạt trạng thái cân bằng sẽ không có ảnh hưởng của thời gian phản ứng, nên thời gian thủy phân được tối ưu hóa bằng thực nghiệm và chọn ra thời gian thích hợp để thực hiện phản ứng được tối ưu nhất

1.2.3.6 pH của môi trường phản ứng

Enzyme rất nhạy với sự thay đổi pH của môi trường Mỗi hệ enzyme chỉ hoạt động mạnh nhất ở vùng pH xác định gọi là pH tối thích của enzyme Vì vậy phải xác định được khoảng pH tối thích của enzyme để nâng cao hiệu suất phản ứng

1.3 Axit amin

1.3.1 Giới thiệu về acid amin

Axit amin là đơn vị cấu tạo nên phân tử protein Bản chất protein là những đại phân

tử được cấu tạo theo nguyên tắc đa phân mà các đơn phân là axit amin Chúng kết hợp với nhau thành một mạch dài nhờ các liên kết peptide (gọi là chuỗi polypeptide) Các

chuỗi này có thể xoắn cuộn hoặc gấp theo nhiều cách để tạo thành các bậc cấu trúc

không gian khác nhau của protein Axit amin được cấu tạo bởi ba thành phần: một là

nhóm amine (-NH2), hai là nhóm cacboxyl (-COOH) và cuối cùng là nguyên tử

cacbon trung tâm đính với 1 nguyên tử hyđro và nhóm biến đổi R quyết định tính chất

của axit amin

Do kết hợp với nhau trong những liên kết khác nhau, chúng tạo thành các phân tử

khác nhau về thành phần và tính chất Giá trị dinh dưỡng của protein được quyết định

bởi số lượng và chất lượng của các axit amin Nhờ quá trình tiêu hoá protein được thủy

phân thành axit amin Các axit amin được hấp thụ ở ruột vào máu và tới các tế bào, tại

đây chúng được sử dụng để tổng hợp protein đặc hiệu cho cơ thể [13]

Các acid amin cấu thành nên protein thành hai loại chính là các axit amin thay

thế và các acid amin không thay thế Những axit amin thay thế hoặc không cần thiết có

thể tổng hợp được trong cơ thể Do đó khi thiếu chúng trong cơ thể, cơ thể có thểtự

tổng hợp Một số axit amin có vị ngọt của đường (alanin, valine) Acid glutamic có vị

ngọt đậm được sử dụng làm gia vị Còn các axit amin được gọi là các axit amin cần

thiết hay không thể thay thế được vì chúng không thể tự tổng hợp trong cơ thể hoặc

tổng hợp với tốc độ không thể đáp ứng được nhu cầu của cơ thể mà chúng phải được

đưa vào đầy đủ trong khẩu phần thức ăn

Bảng1.4: Các axit amin cần thiết và không cần thiết[13]

Axit amin cần thiết Acid amin không cần thiết

Các acid amin không cần thiết (có thể thay thế được) chiếm tỷ lệ lớn trong thành

phần protein thức ăn Cơ thể có thể tổng hợp được nhưng quá trình tổng hợp bên trong

chỉ đáp ứng được nhu cầu tối thiểu của cơ thể Do đó cần bổ sung hợp lý các acid amin

này vào thành phần protein của thức ăn [14]

Formatted: Justified, Line spacing: Multiple 1,15 li

Formatted: Justified, Line spacing: Multiple 1,15 li

❖ Vai trò quan trọng của axit amin [15]

- Xây dựng cấu trúc của protein, các chuỗi polypepide trong cơ thể

- Là chất nền sinh năng lượng chính cho ruột non (glutamine, glutamate,

aspartate) và tế bào miễn dịch (glutamine)

- Điều hòa quá trình chuyển hóa chất dinh dưỡng Như là, glutamate được bổ

sung qua chế độ ăn uống sẽ kích hoạt con đường truyền tín hiệu trong đường tiêu hóa

thông qua trục não – ruột, do đó góp phần tiêu hóa hiệu quả các chất dinh dưỡng đa

lượng và hấp thu thức ăn tốt Alanine có rất nhiều trong huyết tương, ức chế pyruvate

kinase, do đó điều hòa gluconeogenis và glycolysis để đảm bảo sản sinh glucose của tế

bào gan trong thời kì thiếu thức ăn

- Điều chỉnh biểu hiện gen và tín hiệu của tế bào Một số axit amin như

glutamine và arginine có thể ảnh hưởng đến sự biểu hiện của gen ở ruột non, cơ xương

và tế bào nhau thai để cải thiện phản ứng chống oxy hóa và DNA

1.3.2 Giá trị sinh học của một số axit amin chính có trong sụn khớp chân gà

1.3.2.1 Glycine

Glycine là thành phần chính của collagen và gelatin, là những protein phong phú

nhất trong cơ thể Glycine cũng là tiền chất của các chất chuyển hóa quan trọng có

trọng lượng phân tư thấp như porphyrin, purin, glutathione, creatin…

Là một chất dẫn truyền thần kinh ức chế trong hệ thống thần kinh trung ương và

là một chất chống oxy hóa, glycine có tác dụng điều hòa miễn dịch, tế bào chất trong

cả mô thần kinh và ngoại biên Giống như nhiều axit amin không cần thiết khác

glycine cũng có vai trò trong việc điều hòa biểu sinh Như trong các loài họ chim,

chúng tích cực sản xuất acid uric thông qua con đường phụ thuộc glycine, nhưng cũng

không thể tổng hợp đủ glycine để đáp ứng nhu cầu trao đổi chất nên glycine phải được

đưa vào chế độ ăn uống để hỗ trợ tối đa sự tăng trưởng và phát triển [15]

1.3.2.2 Proline

Proline là một thành phần thiết yếu của collagen, rất quan trọng đối với hoạt

động của khớp và gân Bên cạnh đó, axit amin này giúp duy trì và tăng cường cơ

tim Vì proline là một axit amin không thiết yếu, có thể thu được từ axit glutamic, nên

không cần thiết phải bổ sung thêm từ các nguồn thực phẩm khác Nói cách khác, cơ

thể con người có thể sản xuất đủ proline để sử dụng

Proline được công nhận là có lợi bởi vì hai lý do Thứ nhất, protein chịu đóng vai

trò cấu tạo nên collagen, và thứ hai là nó giúp làm giảm xơ cứng động mạch Đối với

chứng xơ vữa động mạch, proline ngăn chặn sự xuất hiện của chứng xơ vữa động

mạch theo cách sau: mỗi khi tim đập, các động mạch giãn ra và co lại trừ khi một số

chất béo được tích tụ trên thành của các động mạch, tình trạng này được gọi là xơ vữa

động mạch Trong trường hợp này, proline có thể giúp động mạch của có thể kéo dài

hiệu quả và trở lại kích thước và hình dạng bình thường Khả năng này của axit amin

là rất cần thiết để duy trì mức áp suất phù hợp trên toàn cơ thể, cũng như cho việc vận

chuyển máu đường dài xung quanh hệ thống tuần hoàn [16]

Formatted: Justified, Indent: Left: 0 cm, Line spacing:

Multiple 1,15 li

Formatted: Justified, Line spacing: Multiple 1,15 li

Formatted: Justified, Line spacing: Multiple 1,15 li

Ngoài ra, trong sụn chân gà có một lượng khá lớn hydroxylproline, là một thành phần chính trong collagen của mô liên kết được tổng hợp từ proline [13]

1.3.2.3 Alanine

Alanin là một axit amin không thiết yếu đôi khi được tìm thấy nhiều ở trạng thái

tự do trong huyết tương của con người Axit amin này được tổng hợp bằng cách khử pyruvate, và tham gia vào quá trình chuyển hóa đường và axit Nó cũng được biết đến với việc tăng khả năng miễn dịch và cung cấp năng lượng cho não và hệ thần kinh trung ương Ngoài ra, alanine đóng vai trò trung tâm trong chu trình glucose-alanine diễn ra giữa các mô và gan

Tóm lại, alanine giúp cơ thể chuyển đổi loại đường đơn giản gọi là glucose thành năng lượng cần thiết cho cơ thể, đồng thời loại bỏ độc tố dư thừa ở ganm, alanine cũng có trong danh sách giúp bảo vệ các tế bào khỏi bị hư hại trong hoạt động thể chất cường độ cao Sau đó, do chất lỏng trong tuyến tiền liệt có chứa axit amin nàydo đó alanine có thể giúp điều trị tăng sản tuyến tiền liệt lành tính, đó là tình trạng tuyến tiền liệt mở rộng [17]

1.3.2.4 Axit glutamic

Trong cơ thể người, axit glutamic tồn tài nhiều cơ quan và mô như mô cơ, mô não, thận, gan, lá lách Trong đó, axit glutamic cũng là một chất tạo vị Umami – vị ngọt thịt, vị ngọt của nước dùng Trong cơ thể người và sinh vật, có nhiều chức năng khác nhau như [18]:

- Cấu thành nên protein trong cơ thể sinh vật nhờ liên kết với các axit amin khác Axit glutamic chiếm khoảng 20% tổng số của các axit amin cấu thành protein

- Tham gia vào quá trình trao đổi chất nội bào như chuyển hóa axit amin, tạo chất trung gian cho các quá trình trao đổi chất hoặc loại N dư thừa ra khỏi cơ thể

- Là chất dẫn truyền thần kinh não bộ phổ biến nhất ở hệ thần kinh trung ương của động vật có vú

Ngoài ra, Glutamate là dạng tồn tại khi axit glutamic liên kết với một gốc khoáng chất Natri và kali là các khoáng chất phổ biến nhất trong thực phẩm tự nhiên Điều này có nghĩa glutamate trong thực phẩm tự nhiên chủ yếu tồn tại dưới dạng mononatri

và monokali Glutamate thúc đẩy quá trình tiêu hóa diễn ra nhanh và dễ dàng Glutamate tham gia vào nhiều con đường tổng hợp và oxy hóa ở động vật như kích hoạt các thụ thể vị giác trong đường tiêu hóa, tăng cường sinh nhiệt trong các mô mỡ giảm lắng đọng chất béo, điều chỉnh giải phóng một số hormone[15]

1.3.3 Khả năng tiêu hóa protein và axit amin trong thực phẩm của con người [19]

Theo các chuyên gia Nông lương thế giới (FAO) về đánh giá chất lượng protein trong dinh dưỡng của con người, tỉ lệ tiêu hóa protein và axit amin ở người được xác định tại điểm cuối ruột non, như là một phép đo sự biến mất axit amin giữa lượng được sử dụng và lượng axit amin ở điểm cuối ruột non

Cụ thể là các protein nạp vào cơ thể trước tiên phải được mô tả trên cơ sở lượng axit amin tiêu hóa của chúng, với mỗi axit amin được coi là một chất dinh dưỡng riêng

biệt Hơn nữa, không phải toàn bộ protein chuyển vào cơ thể có thể chuyển thành axit amin có thể tiêu hóa được, cũng có một lượng nhỏ axit amin không thể tiêu hóa Rõ ràng có sự khác biệt đáng kể về mặt thực tế giữa khả năng tiêu hóa protein thô và của các axit amin cụ thể Tỷ lệ tiêu hóa axit amin nên được sử dụng để ước tính chất lượng protein trong chế độ ăn uống

Bảng1.5: Khả năng tiêu hóa khi bổ sung protein dưới dạng thực phẩm và các axit amin được chiết tách từ thực phẩm[19] (%)

Axit amin Sữa tách béo Hạthướng dương Protein từ thịt

- Sự tiêu hóa và hấp thu không hoàn toàn

- Sự có mặt của một số chất ức chế các men tiêu hóa ở một số thức ăn

- Sự biến chất protein và các axit amin (lysine, axit amin chứa lưu huỳnh) do nhiệt hoặc do tác dụng khác

Tỷ lệ hấp thu các axit amin rất cao ở phần lớn các protein động vật nhưng ở protein thực vật thường kém hơn Ở chế độ nếu ăn hoàn toàn thực phẩm có nguồn gốc thục vật, lượng nito của phân lên tới 20% lượng nito ăn vào hoặc hơn Khi chưa bị nhiệt làm giảm hoạt tính, các chất ức chế đặc hiệu các men tiêu hóa cũng làm giảm tiên hóa và hấp thu protein Tác dụng này hay gặp nhất ở thức ăn giàu glucid [19]

1.3.4 Các ứng dụng thương mại của axit amin có trong sụn chân gà

1.3.4.1 Trong công nghiệp thực phẩm [21]

Axit amin được sử dụng một mình hoặc kết hợp, như chất tăng cường hương vị Bột ngọt là loại thường được sử dụng nhất trong ngành thực phẩm Glycine và alanine cũng tăng cường hương vị

Tryptophan, kết hợp với histidine, hoạt động như một chất chống oxy hóa để bảo quản sữa bột Để bảo quản nước ép trái cây, cystein phục vụ như một chất chống oxy hóa

Aspartame, một dipeptide (aspartyl – phenylalaninr methy ester) được sản xuất bởi sự kết hợp của axit aspartic va phenylalanine, ngọt hơn sucrose khoảng 200 lần

Nó được sử dụng như một chất làm ngọt nhân tạo có hàm lượng calo thấp trong ngành công nghiệp nước giải khát

Ngoài những ưu điểm về dinh dưỡng của axit amin so với protein thô về khả năng hấp thụ, khả năng tiêu hóa tốt hơn thì cảm quan của axit amin cũng có phần nổi bật Các amino axit thường không màu, vị đặc trưng của thực phẩm liên quan chặt chẽ đến thành phần của thực phẩm, vị đặc trưng của mỗi axit amin thường được duy trì và không đổi khi nồng độ chúng thay đổi Nhiều loại có vị ngọt kiểu như đường (glysine, alanine, valine, histidine, tryptophan, một số loại có vị đắng như isoleusine, arginine hoặc không có vị như leusine Bột ngọt hay còn gọi là mì chính là muối của natri với axit glutamic có vị umami

Axit amin được sử dụng rộng rãi trong chế biến thực phẩm dưới dạng là gia vị ngoài việc để tăng dinh dường thì còn tạo hương thơm và màu nâu trong thực phẩm Mùi thơm được chủ yếu hình thành trong quá trình chế biến hay nấu do phản ứng mailard giữa axit amin và đường khử

1.3.4.2 Trong công nghiệp dược phẩm

Các axit amin có thể được sử dụng làm thuốc, các acid amin được truyền vào để nuôi cơ thể bệnh nhân trong những trường hợp không thể cung cấp protein cho cơ thể bằng con đường ăn uống Một số amino acid được sử dụng giải độc amoniac trong máu, điều trị suy tim, loét dạ dày và vô sinh ở nam giới Một số axit amin khác được

sử dụng làm tiền chất trung gian trong quá trình sản xuất kháng sinh [28]

Một số axit amin hay sử dụng là arginine, valine, cystidine, tyrosine…

1.3.4.3 Trong công nghiệp hóa chất

Axit amin đóng vai trò là nguyên liệu ban đầu để sản xuất một số hợp chất Glycine được sử dụng làm tiền chất để tổng hợp glyphosate, một loại thuốc diệt cỏ Trong khi đó, threonine là nguyên lieu ban đầu để sản xuất azthreonam, cũng là thuốc diệt cỏ

Poly – methyl glutamate được sử dụng để sản xuất da tổng hợp, một số axit amin

ở dạng dẫn xuất N- axyl rất hữu ích cho việc điều chế mỹ phẩm Các acid amin còn đóng vai trò quan trọng trong ngành công nghiệp phụ gia như: Methionine,

Threonine… [21]

1.4 Tối ưu hóa bằng phương pháp bề mặt

Phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) là một phương pháp thống kê sử dụng các

dữ liệu định lượng từ thực nghiệm để xây dựng phương trình toán học mô tả mối quan

hệ giữa các yếu tố ảnh hưởng và hàm mục tiêu Phương pháp này đã được giới thiệu bởi G.E.P Box và K.B Willson năm 1951 Box và Willson đã sử dụng một mô hình toán học bậc hai Mô hình này ước lượng được hàm mục tiêu, nhưng lại tương đối dễ

áp dụng

1.4.1 Nguyên tắc của phương pháp bề mặt đáp ứng

Sự thay đổi giá trị của các biến đầu vào Xi sẽ dẫn đến sự thay đổi giá trị của hàm mục tiêu Yi tương ứng Việc lựa chọn các biến đầu vào, xác định khoảng biến thiên cho từng biến và tính toán sai số được chú trọng khi xây dựng mô hình thí nghiệm cho RSM Những biến đầu vào Xi(i=1, ,n) được gọi là những biến cơ sở Những biến này được đặc trưng bởi một loạt các thông tin thống kê µj(j = 1,2,…,p) có chức năng phân phối độc lập hoặc tương quan, … Trong trường hợp chung, những biến Xi là những biến thay đổi theo không gian – thời gian Sự chuyển đổi của các biến đầu vào Xi được thể hiện ở hình 1.20

Hình 1.4 Sơ đồ chức năng chuyển đổi

Hình thức của chức năng chuyển đổi này phụ thuộc vào các biến đầu vào Xi và không được thể hiện rõ ràng, vì vậy, việc nghiên cứu về chức năng chuyển đổi rất cần thiết Thông thường, chức năng chuyển đổi này thường là tuyến tính hoặc phi tuyến tính và được đặc trưng bởi những thông số Xk(k=1,2, ,m) một cách ngẫu nhiên hay xác định Việc điều chỉnh mục tiêu phải dựa trên cơ sở của những số liệu thực nghiệm và việc tính toán các sai số cho phép tìm được được các biến Xk Sự biểu diễn hình học của chức năng đáp ứng dưới dạng một đường cong hoặc một mặt phẳng lồi gọi là bề mặt đáp ứng Để xây dựng một bề mặt đáp ứng cần phải có:

- 𝑋 = {𝑋1, 𝑋2, … }: Biến đầu vào,

- µ = {µ1, µ2, … }: Thông tin thống kê theo vector X (chức năng phân phối độc lập hoặc tương quan, …),

- ψ(X/µ): Tính xấp xỉ của hàm mục tiêu Y, được biểu diễn là hàm số phụ thuộc theo biến X

1.4.2 Ứng dụng của RSM

RSM được dùng để khảo sát mối quan hệ giữa hai hay nhiều biến và hàm mục tiêu Phương pháp này thường được áp dụng sau khi đã xác định được các yếu tố quan trọng có thể kiểm soát được và muốn tìm các giá trị tối ưu các yếu tố để có thể đáp ứng hàm mục tiêu đạt giá trị cực đại hoặc cực tiểu

RSM được dùng để xác định các mức yếu tố thỏa mãn đồng thời các thông số kĩ thuật mong muốn, kết hợp tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng để tìm được các giá trị của các yếu tố ảnh hưởng đáp ứng giá trị cụ thể của hàm mục tiêu hoặc các giá trị tối ưu

của các yếu tố ảnh hưởng đáp ứng giá trị cực đại/cực tiểu của hàm mục tiêu, đồng thời

mô tả kết quả tối ưu đó Ngoài ra, RSM còn giúp xác định được những điều kiện mới nhằm đáp ứng yêu cầu của hàm mục tiêu so với những điều kiện hiện tại và mô hình hóa mối quan hệ giữa các yếu tố định lượng với mục tiêu mong muốn

RSM có ưu điểm mang tính thực tế vì số liệu được thu nhận từ thực nghiệm Phương pháp này có thể áp dụng cho tất cả hệ thống đáp ứng yêu cầu có biến đầu vào

và mục tiêu đầu ra Đồng thời, cũng đánh giá được tác động của các yếu tố ảnh hưởng đến hàm mục tiêu và thực hiện dễ dàng, nhanh chóng Tuy nhiên, phương pháp này chỉ mang tính gần đúng, phạm vi ứng dụng bị giới hạn, hàm mục tiêu sẽ không chính xác đối với những khoảng biến thiên khác ngoài khoảng biến thiên các yếu tố ảnh hưởng đang thực hiện

1.4.3 Các mô hình xây dựng ma trận thí nghiệm trong RSM

1 Mô hình Box-Behnken

Mô hình Box-Behnken có ít điểm khảo sát hơn so với phương án cấu trúc có tâm quay (CCD) Do đó, số lượng thí nghiệm và chi phí thực hiện thí nghiệm ít hơn so với CCD và có thể ước lượng được các hệ số bậc một, bậc hai Tuy nhiên, mô hình này không phù hợp với các thí nghiệm theo trật tự Hình 1.21 mô tả mô hình Box-Behnken

có 3 yếu tố, các điểm trên hình tượng trưng cho các thí nghiệm được thực hiện

Hình 1.5 a) Mô hình Box-Behnken cho 3 biến đầu vào dưới dạng hình học

(khối lập phương) và b) Thiết kế kết hợp 2 2 giai thừa

2 Phương án cấu trúc có tâm quay (CCD)

CCD đặc biệt hữu ích trong các thí nghiệm theo trật tự vì nó có thể kết hợp thông tin từ thực nghiệm nhân tố, xây dựng các thực nghiệm dựa vào kết quả của các thực nghiệm trước bằng cách thêm các điểm trục và trung tâm CCD là một trường hợp đặc biệt trong nhóm các mô hình quy hoạch thực nghiệm Nó được cấu thành từ 3 thành phần:

• Nhân là một phương án tuyến tính với 2k đỉnh của một hình khối đều trong không gian k chiều Nếu k > 5 có thể giảm bớt số thí nghiệm bằng cách sử dụng phương án yếu tố từng phần 2k-1

• 2k điểm sao (*) nằm trên các trục tọa độ của không gian yếu tố Các tọa độ của các điểm sao là (±α, 0, 0,…0), (0,±α, 0,…0), (0, 0 ,…,0, ±α), α là khoảng cách

từ tâm phương án đến điểm sao được gọi là cánh tay đòn sao Các điểm sao cần

thiết để mở rộng không gian khảo sát tác động của 1 yếu tố ảnh hưởng để có thể tìm được các ước lượng của hệ số bjj trong phương trình hồi quy bậc 2

• Nghiệm phương trình ở tâm phương án dùng để tìm phương sai tái hiện Cánh tay đòn sao α và số thí nghiệm ở tâm được chọn phụ thuộc vào tiêu chuẩn tối

ưu, thường là phuơng án trực giao hay phương án quay

Hình 1.6 CCD cho các biến đầu vào dưới dạng hình học

Đối với CCD giá trị α rất quan trọng, vì nó có thể xác định vị trí của các điểm trong miền khảo sát Giá trị α được tính theo công thức: α = (2k)0,25 Mối quan hệ giữa hàm mục tiêu và các biến độc lập được thể hiện qua phương trình bậc hai CCD là thiết

kế thí nghiệm mà trong đó mỗi yếu tố ảnh hưởng được xác định ở 5 mức: cộng alpha (+α), trừ alpha (-α), cộng một (+1), trừ một (-1) và điểm trung tâm (0) Nếu yếu tố phân loại được thêm vào, thiết kế trung tâm tổng hợp sẽ nhân đôi cho mỗi sự kết hợp của các cấp yếu tố phânloại CCD với 2 yếu tố được trình bày trong hình 1.22 Các điểm trên biểu đồ tượng trưng cho các thí nghiệm được thực hiện

1.5 Tình hình nghiên cứu chiết protein từ sụn khớp gà

1.4.1 Tình hình nghiên cứu thế giới

Hiện nay trên thế giới có rất nhiều nghiên cứu về sụn khớp chân gà, về việc chiết tách một lượng lớn các chất dinh dưỡng có trong nguyên liệu bằng rất nhiều các phương pháp, tối ưu hóa bằng các enzyme khác nhau như papain, pepsine, alcalase Những công trình nghiên cứu trên nguồn nguyên liệu này đã được nghiên cứu và phát triển trên thế giới từ lâu Một số công trình như:

Năm 1994, T Nakano, Sim Sim, “Một số nghiên cứu về thành phần hóa học của

sụn khớp và đĩa đệm của gà thịt” Nghiên cứu này được thực hiện để phân tích thành

phần hóa học của sụn khớp và sụn đĩa đệm từ gà như hàm lượng chất khô, collagen và glycosaminoglycan sunfat nhờ enzyme papain trong vòng 30 phút để thủy phân mẫu Sau đó, bằng những phương pháp phân tích hóa học để xác định hàm lượng của chúng

có trong mẫu Nghiên cứu chỉ ra Hàm lượng chất khô và collagen và tỷ lệ keratan

sulfate so với glycosaminoglycan (GAG) sunfat cao hơn, và tổng axit uric GAG, chondroitin sulfate, axit hyaluronic và axit sialic axit thấp hơn trong axit sụn khớp [22].

Năm 1974, J.M.Seyer, D.M Brickley, M.J.Glimcher, “Xác định hai loại collagen của sụn khớp của gà sau sinh” Nghiên cứu này phân tích axit amin của các mẫu được thu nhận của sụn khớp của gà sau sinh cho thấy sự hiện diện của một lượng đáng kể collagen Nghiên cứu đã tìm ra các giải pháp LiC1 9 M ưu tiên trích xuất các thành phần của collagen I khi được xác định bằng sắc ký trao đổi ion v Collagen loại II là về

cơ bản không hòa tan trong các dung dịch LiC1 9 M, nhưng có thể được hòa tan trong

4 M CaC12 sau đó thủy phân sụn bằng pepsin trong môi trường pH điều chỉnh thành 2,0 với axit formic và được thủy phân trong 16 giờ ở 4 với 0,1% pepsin [8]

1.4.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam

Đề tài này vẫn còn khá mới mẻ ở Việt Nam, chưa có nhiều bài nghiên cứu về nguyên liệu này Nhưng cũng có vài bài nghiên cứu tương tự về sản phẩm sụn khớp chân gà

Năm 2018, Trương Ngọc Thảo và các cộng sự, “Chiết chondroitin sulfate từ sụn

gà bằng kết hợp ứng dụng xử lí sóng siêu âm và thủy phân bằng alcalase” Nghiên

cứu của đã được thực hiện để trích xuất chondroitin Sunfate (CS) từ sụn gà keel bằng ứng dụng kết hợp điều trị siêu âm và thủy phân nhờ alcalase Nghiên cứu sử dụng phần mềm quy hoạch thực nghiệm Modde 5.0 Tối ưu các giá trị cho quá trình này đã được tìm thấy ở pH 9, tỷ lệ vật liệu so với đệm 1: 9 (w nguyên liệu / v đệm), nhiệt độ 47,34° C và thời gian trong vòng 9,2 phút Sau khi điều trị siêu âm, thủy phân sử dụng Enzym Alcalase được thực hiện trong các điều kiện sau: enzyme tỷ lệ với cơ chất 4% (v / w), nhiệt độ 55°C và thời gian 60 phút Phân tích HPLC cho thấy bột sản phẩm chứa 80,45% CS, năng suất tổng thể của CS là 24,29% trọng lượng khô tuyệt đối và 61,02% tổng sản lượng hàm lượng carbohydrate của vật liệu [24]

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Nguyên liệu

Sụn khớp chân gà được cung cấp bởi công ty TNHH TM & DV HOÀNG PHÁT Nguyên liệu được xay nhỏ (bằng máy xay thịt Đài Loan ATS TS-102AL) có đường kính lưới sàng là 6mm Sau đó được chia nhỏ thành từng khối (500gram/ khối) và lưu trữ ở -200C – -20C cho các thí nghiệm

Na 3 PO 4 12H 2 O Xilong Scientific – Trung Quốc ≥98

Na 2 S 2 O 3 5H 2 O Xilong Scientific – Trung Quốc ≥99

NaOH Xilong Scientific – Trung Quốc ≥99

CH 3 COOH Hóa Chất Đức Giang –Việt Nam ≥99,5

Cồn 96° Hóa Chất Đức Giang –Việt Nam

Thimolphtalein HiMedia Laboratories - Ấn Độ

C 6 H 8 O 7 H 2 O Xilong Scientific – Trung Quốc ≥99

C 6 H 5 O 7 Na 3 2H 2 O Xilong Scientific – Trung Quốc ≥99,5

H 3 PO 4 Xilong Scientific – Trung Quốc ≥85

Tinh bột Xilong Scientific – Trung Quốc

2.1.3 Chất xúc tác

Ở đây chất xúc tác được sử dụng là enzyme flavor Các tối ưu cho Flavour là ở nhiệt

độ tối ưu từ 50 - 600C, pH tối thích từ 5 - 6 Nhiệt độ bảo quản tốt nhất của Flavour là

0 ÷ 50C Enzyme này có hoạt lực là 2285,7UI/g theo phụ lục 1

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phản ứng thủy phân sụn khớp chân gà

Sụn khớp chân gà được hòa trộn đều với nước ở thể tích nhất định trong bình tam giác kín và được gia nhiệt ở 600C trong khoảng thời gian 15 phút trước khi thực hiện phản ứng thủy phân Quá trình thủy phân được thực hiện trong tủ ấm Memmert (Đức) và tủ sấy Ketong (Trung Quốc) Sau khi kết thúc thời gian thủy phân emzyme bị bất hoạt bằng cách đun cách thủy ở 900C trong vòng 5 phút, sản phẩm thô thu được sau phản ứng thủy phân được làm nguội đến nhiệt độ phòng và lọc qua giấy lọc (Whatman No.1) Lượng chất rắn còn sót lại được sấy khô đến khối lượng không đổi

ở 1000C dùng để xác định hiệu suất thủy phân Dịch lỏng qua giấy lọc được bảo quản

ở 40C dùng cho các phân tích tiếp theo

2.2.2 So sánh đánh giá quá trình xử lý nhiệt và không xử lý nhiệt

Thủy phân không xử lý nhiệt

Cho 5g sụn khớp chân gà vào bình tam giác 250 mL được trộn với 50 mL nước cất rồi cho flavour enzyme với tỉ lệ gồm 0,28%; 0,32%; 0,34% vào bình và thực hiện phản ứng thủy phân ở 300C và thời gian thủy phân là 20 phút Sau khi kết thúc thời gian thủy thủy phân ta vô hoạt enzyme bằng cách đun cách thủy bình phản ứng ở

900C, sản phẩm thu được sau phản ứng thủy phân được lọc qua giấy lọc (Whatman No.1) Lượng chất rắn còn sót lại được sấy khô đến khối lượng không đổi ở 1000C dùng để xác định hiệu suất thủy phân Dịch lỏng qua giấy lọc được bảo quản ở 40C dùng cho các phân tích tiếp theo

Thủy phân xử lý nhiệt

Cho 5g sụn khớp chân gà vào bình tam giác 250 mL được trộn với 50 mL nước cất rồi gia nhiệt ở nhiệt độ 600C trong vòng 15 phút và lấy ra để về nhiệt độ phòng Sau đó ta cho flavour enzyme với tỉ lệ gồm 0,28%; 0,32%; 0,34% so với cơ chất vào bình Phản ứng thủy phân được thực hiện ở 300C và thời gian thủy phân là 20 phút Sau khi kết thúc thời gian thủy thủy phân ta vô hoạt enzyme bằng cách đun cách thủy bình phản ứng ở 900C, sản phẩm thu được sau phản ứng thủy phân được lọc qua giấy lọc (Whatman No.1) Lượng chất rắn còn sót lại được sấy khô đến khối lượng không đổi ở 1000C dùng để xác định hiệu suất thủy phân Dịch lỏng qua giấy lọc được bảo quản ở 40C dùng cho các phân tích tiếp theo

Từ đó ta sẽ so sánh hiệu suất của 2 phương pháp và chọn phương pháp tối ưu Sau khi khảo sát chúng ta chọn xử lý nhiệt ở 600C trong vòng 15 phút vì ở nhiệt độ này chuỗi protein sẽ tháo xoắn làm lộ ra các liên kết peptid giúp cho enzyme dễ dàng phân cắt hơn

2.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến phản ứng thủy phân

Sụn khớp chân gà với khối lượng 5g được trộn đều với 50 mL nước cất rồi gia nhiệt

ở 600C trong 15 phút Phản ứng thủy phân được thực hiện ở các nhiệt độ 300C; 400C;

500C; 600C; 700C; 800C và thời gian thủy phân là 20 phút, nồng độ enzyme là 0,32%, thể tích phản ứng là 50mL, pH tự nhiên Sau quá trình thủy phân, lọc lấy phần dịch rồi đem phần rắn còn sót lại đi sấy rồi cân cân và phân tích để xác định mức độ thủy phân

Từ đó đánh giá để chọn nhiệt độ tối ưu cho các thí nghiệm tiếp theo

2.2.4 Khảo sát ảnh hưởng của pH đến quá trình thủy phân sụn khớp chân gà

Sụn khớp chân gà với khối lượng 5g được trộn đều với 50 mL dd đệm có các mức

pH từ 3 đến 9 khoảng cách giữa 2 điểm khảo sát là 1, sau đó được gia nhiệt ở 600C trong 15 phút Tiếp theo ta cho flavour enzyme với tỉ lệ 0,32% so với cơ chất vào bình Phản ứng thủy phân được thực hiện ở các nhiệt độ tối ưu và thời gian thủy phân là 20 phút Khi kết thúc phản ứng, sản phẩm được đem đi lọc để thu phần dịch rồi đem phần rắn còn sót lại đi sấy rồi cân cân và phân tích để xác định mức độ thủy phân Sau đó tiến hành phân tích mẫu để chọn được điểm pH tối ưu cho các nghiên cứu tiếp theo

2.2.5 Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ enzyme đến phản ứng thủy phân

Sụn khớp chân gà với khối lượng 5g được trộn đều với 50 mL dd đệm có pH tối ưu sau đó ta dùng paraphin và giấy nhôm bọc lại Rồi đem đi gia nhiệt ở 600C trong vòng

15 phút Tiếp theo ta cho flavour enzyme với các tỉ lệ 0,32% đến 0,92% chênh lệch giữa hai điểm khảo sát là 0.1% so với cơ chất vào bình Phản ứng thủy phân được thực hiện ở các nhiệt độ tối ưu và thời gian thủy phân là 20 phút Khi kết thúc phản ứng, sản phẩm được đem đi lọc để thu phần dịch rồi đem phần rắn còn sót lại đi sấy rồi cân cân Sau đó tiến hành phân tích mẫu để chọn được tỉ lệ tối ưu cho các nghiên cứu tiếp theo

2.2.6 Khảo sát ảnh hưởng thời gian phản ứng đến quá trình thủy phân sụn khớp chân gà

Sụn khớp chân gà với khối lượng 5g được trộn đều với 50ml dd đệm có pH tối ưu sau đó ta dùng paraphin và giấy nhôm bọc lại Rồi đem đi hấp ở nhiệt độ 600C trong vòng 15 phút Tiếp theo ta cho flavour enzyme với tỉ lệ tối ưu Phản ứng thủy phân được thực hiện ở các nhiệt độ tối ưu và thời gian thủy phân từ 10 đến 80 phút chênh lệch giữa 2 điểm khảo sát là 10 phút Khi kết thúc phản ứng, sản phẩm được đem đi lọc để thu phần dịch rồi đem phần rắn còn sót lại đi sấy rồi cân cân Sau đó tiến hành

đo và phân tích mẫu để chọn được thời gian tối ưu cho các nghiên cứu tiếp theo

2.2.7 Khảo sát ảnh hưởng của thể tích đến quá trình thủy phân sụn khớp chân gà

Sụn khớp chân gà với khối lượng 5g được trộn đều với thể tích từ 30 mL đến 130

mL dd đệm có pH tối ưu, bước nhảy giữa 2 điểm khảo sát là 20 mL sau đó ta dùng paraphin và giấy nhôm bọc lại Rồi đem đi hấp ở nhiệt độ 600C trong vòng 15 phút và lấy ra để về nhiệt độ phòng Tiếp theo ta cho flavour enzyme với tỉ lệ tối ưu Phản ứng thủy phân được thực hiện ở các nhiệt độ, thời gian tối ưu Khi kết thúc phản ứng, sản

phẩm được đem đi lọc để thu phần dịch Sau đó tiến hành đo và phân tích mẫu để chọn được thể tích tối ưu

2.2.8 Tối ưu hóa các yếu tố

Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố riêng lẻ đến phản ứng thủy phân sụn khớp chân

gà với xúc tác enzyme flavour thương mại nhằm thu dịch acid amin đã được tiến hành với nhiệt độ thủy phân, pH, nồng độ xúc tác, thời gian thủy phân và thể tích phản ứng tối ưu Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng thủy phân sụn khớp chân gà xúc tác bởi enzyme flavour thương mại (nhiệt độ thủy phân, pH, nồng độ xúc tác, thời gian thủy phân, thể tích phản ứng) được khảo sát ở nghiên cứu trước mang tính rời rạc, không có

sự tương tác giữa các yếu tố ảnh hưởng, do đó vùng tối ưu cho phản ứng thủy phân sụn khớp chân gà với xúc tác enzyme flavour thương mại không được xác định rõ ràng

Phương pháp bề mặt gần đây được ứng dụng nhiều để tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng đến các phản ứng hóa học và hóa sinh, do đó, nghiên cứu được tiến hành nhằm tối ưu hóa năm yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng thủy phân sụn khớp chân gà với xúc tác enzyme flavour thương mại nhằm mục đích xác định được phương trình hồi qui và tìm được nghiệm tối ưu Ta sử dụng phần mềm Minitab 16 (Version 16, Minitab Inc, Pennsylvania State, USA) để xây dựng mô hình toán học bậc 2 từ năm yếu tố ảnh hưởng (nhiệt độ thủy phân, pH, tỉ lệ enzyme, thời gian thủy phân, thể tích phản ứng) rồi từ đó xây dựng ma trận thí nghiệm Từ kết quả của các thí nghiệm ta sẽ đưa ra phương trình hồi quy và từ đó lặp luận đưa ra các mức tối ưu cho từng yếu tố

2.2.8.1 Các yếu tố, mức, khoảng biến thiên

Dựa vào kết quả sơ bộ nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố (nhiệt độ thủy phân,

pH, nồng độ xúc tác, thời gian thủy phân, thể tích phản ứng) đối với phản ứng thủy phân sụn khớp chân gà với xúc tác enzyme flavour thương mại Các mức đối với các yếu tố được thể hiện ở Bảng 1

Bảng 2.2 Mức của các yếu tố ảnh hưởng đối với phản ứng thủy phân sụn khớp chân

gà với xúc tác enzyme flavour thương mại

2.2.8.2 Xây dựng mô tả toán học

Mô hình toán học được sử dụng để tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng (nhiệt độ thủy phân, pH, nồng độ xúc tác, thời gian thủy phân, thể tích phản ứng) đối với phản ứng thủy phân sụn khớp chân gà với xúc tác enzyme flavour thương mại nhằm thu nhận N-acid amin, hàm mục tiêu là hiệu suất thu nhận N-acid amin (H)

bi (i=1,2,3,4,5): Hệ số trong phương trình hồi qui ứng với tương tác của các yếu tố (nhiệt

độ thủy phân, pH, nồng độ xúc tác, thời gian thủy phân, thể tích phản ứng) đối với mức độ thủy phân,

bij(i=1,2,3,4,5; j=1,2,3,4,5): Hệ số trong phương trình hồi qui ứng với sự tương tác của các cặp yếu tố với nhau (nhiệt độ thủy phân và pH, nhiệt độ thủy phân và nồng độ xúc tác, nhiệt độ thủy phân và thời gian thủy phân, nhiệt độ thủy phân và thể tích phản ứng, pH

và nồng độ xúc tác, pH và thời gian thủy phân, pH và thể tích phản ứng, nồng độ xúc tác và thời gian thủy phân, nồng độ xúc tác và thể tích phản ứng, thời gian thủy phân

và thể tích phản ứng) đối với mức độ thủy phân,

bjj (j=1,2,3): Hệ số trong phương trình hồi qui ứng với tương tác bậc 2 của các yếu tố (nhiệt độ thủy phân×nhiệt độ thủy phân, pH×pH, nồng độ xúc tác×nồng độ xúc tác, thời gian thủy phân×thời gian thủy phân và thể tích phản ứng×thể tích phản ứng) đối với mức độ thủy phân

2.2.8.3 Xây dựng ma trận thí nghiệm

Phần mềm Minitab 16 (Version 16, Minitab Inc., Pennsylvania State, USA) được

sử dụng để xây dựng ma trận thực nghiệm cho mô hình toán học bậc 2 bằng phương pháp bề mặt

Bảng 2.3 Ma trận thí nghiệm cho mô hình toán học

Thời gian thủy phân (phút)

Thể tích phản ứng (mL)

Thời gian thủy phân (phút)

Thể tích phản ứng (mL)

Thời gian thủy phân (phút)

Thể tích phản ứng (mL)

2.3.1 Xác định thành phần hóa học tương đối của sụn khớp chân gà

2.3.1.1 Xác định hàm lượng ni-tơ tổng số và protein thô sụn khớp chân gà

Hàm lượng protein tổng số trong mẫu được xác định bằng phương pháp Kjeldahl Quy trình được tiến hành theo tiêu chuẩn AOAC ở mục 2.1 phụ lục 2

2.3.1.2 Xác định hàm lượng chất béo sụn khớp chân gà

Hàm lượng chất béo được xác định dựa theo phương pháp chiết Soxhlet theo tiêu chuẩn AOAC ở mục 2.2 phụ lục 2

2.3.1.3 Xác định hàm lượng tro tổng số sụn khớp chân gà

Lượng tro được xác định theo phương pháp tro hóa

Quy trình được tiến hành theo tiêu chuẩn AOAC ở mục 2.3 phụ lục 2

2.3.1.4 Xác định hàm lượng ẩm sụn khớp chân gà

Lượng ẩm được xác định theo phương pháp sấy

Quy trình được tiến hành theo tiêu chuẩn AOAC ở mục 2.4 phụ lục 2

2.3.2 Xác định hiệu suất thủy phân

Hiệu suất thủy phân được tính theo công thức:

𝐻% = 𝑚1 − 𝑚2

Trong đó:

m1: khối lượng chất khô của sụn khớp chân gà trước khi phản ứng

m2: khối lượng chất khô của sụn khớp chân gà sau khi phản ứng

2.3.3 Xác định hàm lượng acid amin

Hàm lượng acid amin được xác định bằng phương pháp đồng [26]