Tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết rễ mật nhân (eurycoma longifolia jack) bằng phương pháp chưng ninh trong dung môi ethanol và ứng dụng sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khoẻ

TÓM TẮT Tên đề tài: Tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết rễ mật nhân Eurycoma longifolia Jack bằng phương pháp chưng ninh trong dung môi ethanol và ứng dụng sản xuất thực

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

(EURYCOMA LONGIFOLIA JACK) BẰNG

PHƯƠNG PHÁP CHƯNG NINH TRONG DUNG MÔI ETHANOL VÀ ỨNG DỤNG SẢN XUẤT

THỰC PHẨM BẢO VỆ SỨC KHOẺ

Người hướng dẫn: PGS TS TRƯƠNG THỊ MINH HẠNH

Sinh viên thực hiện: HỒ THỊ DIỆU OANH

Số thẻ sinh viên: 107150105

Lớp: 15H2A

Đà Nẵng, 12/2019

TÓM TẮT

Tên đề tài: Tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết rễ mật nhân

(Eurycoma longifolia Jack) bằng phương pháp chưng ninh trong dung môi ethanol và

ứng dụng sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khoẻ

Sinh viên thực hiện: Hồ Thị Diệu Oanh

Số thẻ SV: 107150105 Lớp: 15H2A

Nội dung đồ án gồm 4 chương:

Mở đầu

Chương 1: Tổng quan

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương 3: Kết quả và thảo luận

Chương 4: Kết luận và kiến nghị

Tài liệu tham khảo

Phụ lục

Mật nhân (Eurycoma longifolia Jack) được biết đến là thảo dược quý bởi tất cả các

bộ phận của cây như vỏ cây, rễ cây, lá cây, quả đều được sử dụng để chữa bệnh Trong

đó, rễ cây mật nhân được sử dụng nhiều nhất do chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học có giá trị Mục đích của nghiên cứu này nhằm tối ưu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết rễ mật nhân bằng phương pháp chưng ninh trong dung môi ethanol Từ kết quả tối ưu, tiến hành ứng dụng dịch chiết rễ mật nhân vào sản phẩm thực phẩm bảo vệ sức khỏe Kết quả khảo sát đã tìm được phương trình hồi quy thể hiện mối quan hệ giữa hiệu suất chiết và các yếu tố ảnh hưởng như sau: Y = 6,119 + 0,541x1 + 0,149x3, trong

đó Y là hiệu suất chiết, x1 là nhiệt độ chiết (oC), x3 là thời gian chiết (giờ) Các điều kiện tối ưu cho hiệu suất chiết cao nhất thực hiện bằng phương pháp leo dốc và thu được kết quả như sau: nhiệt độ chiết là 83,2 oC và thời gian là 202,2 phút trong dung môi ethanol 80% và tỉ lệ giữa dung môi và nguyên liệu là 20/1 (ml/g) cho hiệu suất cao nhất là 7,2% Ngoài ra, với mục đích đa dạng hóa sản phẩm, thuận lợi cho người tiêu dùng sử dụng, tôi đã xây dựng được công thức sản phẩm thực phẩm bảo vệ sức khỏe nước rau má mật nhân với tỉ lệ bổ sung bột mật nhân là 0,8% (w/wck) đáp ứng được các chỉ tiêu, các yêu cầu của sản phẩm bảo vệ sức khỏe và có thời hạn sử dụng là hơn 12 ngày Sản phẩm được đánh giá cảm quan thị hiếu người tiêu dùng với đối tượng là sinh viên đại học Bách Khoa Đà Nẵng, kết quả cho thấy sản phẩm nước rau má mật nhân được đánh giá ở mức

độ hơi thích đến tương đối thích, có triển vọng khi đưa vào thị trường

Họ tên sinh viên: Hồ Thị Diệu Oanh Số thẻ sinh viên: 107150105

Lớp: 15H2A Khoa: Hóa Ngành: Công nghệ thực phẩm

1 Tên đề tài đồ án: Tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết rễ mật nhân (Eurycoma longifolia Jack) bằng phương pháp chưng ninh trong dung môi ethanol và

ứng dụng sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khoẻ

2 Đề tài thuộc diện: ☐ Có ký kết thỏa thuận sở hữu trí tuệ đối với kết quả thực hiện

3 Các số liệu và dữ liệu ban đầu:

4 Nội dung các phần thuyết minh và tính toán:

Mở đầu

Chương 1: Tổng quan

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương 3: Kết quả và thảo luận

Chương 4: Kết luận và kiến nghị

Tài liệu tham khảo

Phụ lục

5 Các bản vẽ, đồ thị (ghi rõ các loại và kích thước bản vẽ): Không

6 Họ tên người hướng dẫn: PGS.TS Trương Thị Minh Hạnh

7 Ngày giao nhiệm vụ đồ án: 15/8/2019

LỜI CẢM ƠN

Sau hơn 4 tháng thực hiện đề tài: “Tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình

chiết rễ mật nhân (Eurycoma longifolia Jack) bằng phương pháp chưng ninh trong dung

môi ethanol và ứng dụng sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe”, dưới sự hướng dẫn của

cô Trương Thị Minh Hạnh, em đã hoàn thành xong đồ án tốt nghiệp của mình

Đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô Khoa Hóa - Trường Đại học Bách Khoa Đà Nẵng nói chung, bộ môn Công nghệ thực phẩm nói riêng, đã tận tâm truyền đạt những kiến thức nền tảng, nhiệt tình giúp đỡ chỉ bảo trong quá trình học tập, nghiên cứu để em có thể hoàn thành chương trình học tập đúng với tiến độ

Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc đến cô PGS.TS Trương Thị Minh Hạnh, trong quá trình thực hiện, dù bận nhiều công việc nhưng cô đã dành nhiều thời gian hướng dẫn, chỉ bảo tận tình từng bước, từ việc chọn đề tài, thực hiện đề tài và báo cáo đề tài Với những góp ý, sửa chữa của cô, đã giúp em nắm bắt chính xác hơn về những nội dung liên quan đến đồ án từ đó hoàn thành đồ án một cách tốt nhất có thể

Em cũng xin cảm ơn ThS NCS Võ Khánh Hà, trưởng phòng Kỹ Thuật 2, các anh chị ở trung tâm Kỹ thuật - Tiêu chuẩn - Đo lường - Chất lượng 2 và các nghiên cứu sinh của Đại học Đà Nẵng đã đồng hành, giúp đỡ và hỗ trợ kinh phí nghiên cứu trong suốt quá trình thực hiện đề tài này

Bên cạnh đó, em cũng xin gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô ở phòng thí nghiệm tại trường Đại học Bách Khoa, Đại học Sư Phạm - Đại học Đà Nẵng, thầy Đặng Thanh Long và Viện Công nghệ Sinh học, Đại học Huế, đã giúp đỡ, tạo mọi điều kiện thuận lợi, khích lệ và động viên em trong suốt thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp của mình

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình cùng tất cả bạn bè đã luôn giúp đỡ, động viên, khích lệ và là chỗ dựa vững chắc cho em trong suốt thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp và cũng như 5 năm học tại trường

Cuối cùng, em xin được gửi lời cảm ơn đến các thầy cô trong Hội đồng bảo vệ đồ

án tốt nghiệp đã dành thời gian quý báu của mình để đọc và đưa ra ý kiến đóng góp cho

đồ án tốt nghiệp của em Vì kiến thức bản thân còn hạn chế, trong quá trình hoàn thiện

đồ án không tránh khỏi sai sót, kính mong nhận được những ý kiến đóng góp từ thầy cô

để đồ án tốt nghiệp của em được hoàn thiện hơn

Đà Nẵng, ngày … tháng … năm 2019

Sinh viên thực hiện

Hồ Thị Diệu Oanh

CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu sử dụng phân tích trong luận văn có nguồn gốc rõ ràng, đã công bố theo đúng quy định Các kết quả nghiên cứu trong đồ án do tôi tự thực hiện, phân tích một cách trung thực, khách quan Các kết quả này chưa từng được công bố trong bất kỳ nghiên cứu nào khác

Tác giả

Hồ Thị Diệu Oanh

MỤC LỤC

TÓM TẮT ii

NHIỆM VỤ ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP iii

LỜI CẢM ƠN iv

CAM ĐOAN v

MỤC LỤC vi

DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ BẢNG ix

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU xi

MỞ ĐẦU 1

1 Lý do chọn đề tài 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 1

3 Đối tượng nghiên cứu 2

4 Phạm vi nghiên cứu 2

5 Phương pháp nghiên cứu 2

6 Nội dung nghiên cứu 2

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về cây mật nhân 3

1.1.1 Giới thiệu chung về cây mật nhân 3

1.1.2 Đặc điểm thực vật của cây mật nhân 3

1.1.3 Thành phần hóa học của cây mật nhân 4

1.1.4 Tác dụng dược lý của mật nhân 7

1.2 Tổng quan về phương pháp trích ly 10

1.2.1 Khái niệm 10

1.2.2 Yêu cầu của dung môi sử dụng để trích ly trong công nghệ thực phẩm 11

1.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly 11

1.2.3 Các phương pháp chiết mật nhân 13

1.3 Tổng quan về thực phẩm bảo vệ sức khỏe 14

1.3.1 Khái niệm 14

1.3.2 Lợi ích 14

1.3.3 Yêu cầu đối với thực phẩm bảo vệ sức khỏe 15

1.3.4 Một số sản phẩm thực phẩm chức năng của mật nhân trên thị trường 16

1.4 Tổng quan về cây rau má 18

1.4.1 Tên gọi và phân loại 18

1.4.2 Đặc điểm của cây rau má 19

1.4.3 Thành phần hoá học 19

1.4.4 Tác dụng dược lý 20

1.5 Tổng quan về các nghiên cứu trong và ngoài nước 21

1.5.1 Các nghiên cứu trong nước 21

1.5.2 Các nghiên cứu ngoài nước 23

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.1 Đối tượng nghiên cứu 25

2.1.1 Mật nhân 25

2.1.2 Lá rau má 26

2.2 Hóa chất, dụng cụ và thiết bị thí nghiệm 26

2.2.1 Hóa chất 26

2.2.2 Dụng cụ thí nghiệm 26

2.2.3 Thiết bị thí nghiệm 26

2.3 Phương pháp nghiên cứu 27

2.3.1 Phương pháp phân tích vật lý 27

2.3.2 Phương pháp phân tích hóa lý 28

2.3.3 Phương pháp phân tích hóa học 28

2.3.4 Phương pháp vi sinh 28

2.3.5 Phương pháp khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết rễ mật nhân bằng phương pháp chưng ninh trong dung môi ethanol 29

2.3.6 Tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết rễ mật nhân bằng phương pháp chưng ninh trong dung môi ethanol 30

2.3.7 Phương pháp nghiên cứu để sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe 31

2.3.8 Phương pháp khảo sát thời gian bảo quản của sản phẩm 32

2.3.9 Phương pháp đánh giá cảm quan 33

2.3.10 Phương pháp xử lý số liệu 33

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 34

3.1 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết rễ mật nhân bằng quy hoạch thực nghiệm yếu tố toàn phần với 2 mức và 3 yếu tố ảnh hưởng (TYT23) 34

3.2 Tối ưu hóa thực nghiệm bằng phương pháp leo dốc trên mặt mục tiêu 40

3.3 Sản xuất bột chiết mật nhân để ứng dụng vào sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe 43

3.3.1 Sản xuất cao chiết mật nhân bằng thiết bị cô quay chân không 44

3.3.2 Sấy khô cao chiết sau khi cô đặc chân không 45

3.3.3 Sấy bột mật nhân có bổ sung chất trợ sấy maltodextrin 46

3.4 Ứng dụng sản xuất sản phẩm bảo vệ sức khỏe - “Nước rau má mật nhân” 48

3.4.1 Đề xuất quy trình công nghệ sản xuất nước rau má mật nhân 48

3.4.2 Khảo sát hàm lượng bổ sung bột mật nhân 50

3.4.3 Khảo sát tỉ lệ bổ sung chất trợ lắng 51

3.4.4 Thực đơn hoàn thiện của nước rau má mật nhân 53

3.4.5 Đánh giá cảm quan 54

3.4.6 Kiểm tra chất lượng sản phẩm 55

3.4.7 Nhãn dán và cách thức bao gói 56

3.4.8 Khảo sát thời gian bảo quản 58

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 59

4.1 Kết luận 59

4.2 Kiến nghị 59

TÀI LIỆU THAM KHẢO 61

PHỤ LỤC 1 68

PHỤ LỤC 2 70

DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ BẢNG

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Cây mật nhân 3

Hình 1.2: Lá, quả, hoa của cây mật nhân 4

Hình 1.3: Các sản phẩm thực phẩm chức năng trên thị trường 18

Hình 1.4: Rau má 18

Hình 2.1: Rễ mật nhân đã xử lý 25

Hình 2.2: Rau má 26

Hình 2.3: Quy trình xác định hiệu suất chiết rễ mật nhân 30

Hình 3.1: Sự ảnh hưởng đồng thời của nhiệt độ chiết và thời gian chiết đến hiệu suất chiết rễ cây mật nhân trong dung môi ethanol 40

Hình 3.2: Biểu đồ biểu diễn hàm mục tiêu theo thí nghiệm leo dốc 42

Hình 3.3 Dịch chiết mật nhân sau lọc 44

Hình 3.4 Dịch chiết mật nhân Bx < 8 44

Hình 3.5: Dịch chiết mật nhân Bx > 8 44

Hình 3.6: Dịch mật nhân sau khi sấy 45

Hình 3.7: Quy trình sản xuất bột mật nhân 47

Hình 3.8: Bột mật nhân khi bổ sung maltodextrin 48

Hình 3.9: Quy trình công nghệ sản xuất nước rau má mật nhân 49

Hình 3.10: Sự biến đổi chiều cao cột lắng theo thời gian 53

Hình 3.11: Biểu đồ mạng nhện thể hiện mức độ ưa thích đối với sản phẩm nước rau má mật nhân 54

Hình 3.12: Bao bì thủy tinh 57

Hình 3.13: Nhãn dán sản phẩm “Nước rau má mật nhân” 57

No table of figures entries found

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Thành phần hóa học tìm được trong các nghiên cứu trước đây 5

Bảng 1.2: Thành phần hóa học của rau má 20

Bảng 2.1: Thành phần hóa học của rễ mật nhân ở huyện Ia-Grai, tỉnh Gia Lai 25

Bảng 3.1: Khoảng biến thiên các yếu tố thực nghiệm 34

Bảng 3.2: Ma trận thí nghiệm và kết quả thí nghiệm 35

Bảng 3.3: Giá trị hệ số b trong phương trình hồi qui 36

Bảng 3.4: Hệ số tj ứng với hệ số bj 37

Bảng 3.5: Kết quả tổng bình phương độ lệch giữa giá trị thực nghiệm và PTHQ 38

Bảng 3.6: Bảng xác định |⋏ 𝑗𝑏𝑗|max 41

Bảng 3.7: Thực nghiệm theo hướng dốc đứng và kết quả thí nghiệm 42

Bảng 3.8: Ma trận thí nghiệm 52

Bảng 3.9: Chiều cao cột lắng qua mỗi ngày theo từng nồng độ pectin khác nhau 52

Bảng 3.10: Điểm đánh giá cảm quan thị hiếu người tiêu dùng 54

Bảng 3.11: Kết quả kiểm tra chất lượng mẫu nước rau má mật nhân 55

Bảng 3.12: Sự thay đổi các chỉ tiêu qua thời gian bảo quản 58

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU

EL - Eurycoma longifolia

BYT - Bộ Y tế

FAO/WHO - Food and Agriculture Organization of the United

Nations/ World Health Organization

CMC - Carboxymethyl Cellulose

h - giờ

s - giây

TCVN - Tiêu chuẩn Quốc gia

QCVN - Quy chuẩn Quốc gia

FDA - Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ

IC50 - Inhibitory concentration 50%

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Cây mật nhân có tên khoa học là Eurycoma longifolia Jack, thuộc họ Thanh thất

(Simaroubaceae) [1] Cây thường mọc ở vùng nhiệt đới Đông Nam Á và Nam Á, trong

đó có các tỉnh trung du và miền núi của Việt Nam [1] Cây mật nhân được biết đến là thảo dược quý bởi tất cả các bộ phận của cây như vỏ cây, rễ cây, lá, quả đều có tác dụng chữa bệnh tuyệt vời trong dân gian như chữa khí hư, huyết kém, ăn uống không tiêu, trong ngực có cục tích, gân đờ, xương yếu, chân tay tê đau, nôn mửa, tả lỵ; ngoài

ra thường dùng rễ chữa sốt, sốt rét, chữa ngộ độc và say rượu; tẩy giun, trị ghẻ lở , trong đó rễ mật nhân chứa các hợp chất hóa học có giá trị nhất [2],[3] Trên thế giới và

cả ở Việt Nam đã có nhiều công trình nghiên cứu về thành phần hóa học và tác dụng dược lý của rễ mật nhân, cho thấy chiết xuất từ rễ mật nhân được sử dụng với nhiều mục đích khác nhau như tăng cường sinh lực [4], lưu thông máu, ngoài ra có những nghiên cứu cho rằng có chứa các hoạt chất chống các dòng ung thư ở người như ung thư phổi, ung thư đại tràng, ung thư vú [5]–[7], khả năng kháng oxy hóa, kháng viêm [8], [9], [10], chống tiểu đường [11], chống loãng xương [12] Do vậy, việc sử dụng mật nhân

và các sản phẩm từ mật nhân hiện đang được xem là một phương pháp bảo vệ sức khỏe cho mọi người

Với những công dụng tuyệt vời nêu trên thì mật nhân được ví như một loại thảo dược chữa được bách bệnh và được ưa chuộng ở nhiều nơi khu vực Đông Nam Á Các công trình nghiên cứu ngoài nước về mật nhân được thực hiện khá nhiều và thu được nhiều kết quả khả quan Tuy nhiên, ở Việt Nam mật nhân chỉ mới được sử dụng trong các bài thuốc cổ truyền, công nghệ chiết xuất và ứng dụng các chiết xuất của nó chưa được phổ biến rộng rãi, còn sơ sài, chưa kiểm soát chặt chẽ các thông số kỹ thuật và an toàn thực phẩm Hơn nữa việc sử dụng mật nhân trực tiếp là rất khó khăn do bản chất của nó có vị đắng gắt, hậu vị khó chịu Với những tác dụng to lớn của thảo dược quý này, để tăng được hiệu quả chiết xuất dược liệu, đồng thời nhằm đa dạng hóa sản phẩm, nâng cao giá trị sử dụng của rễ mật nhân và giải quyết các vấn đề bất cập trên đã thúc đẩy tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình

chiết rễ mật nhân (Eurycoma longifolia Jack) bằng phương pháp chưng ninh trong dung

môi ethanol và ứng dụng sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe”

2 Mục tiêu nghiên cứu

- Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chưng ninh rễ mật nhân trong dung môi ethanol bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm

- Tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết rễ mật nhân bằng phương pháp chưng ninh trong dung môi ethanol

- Ứng dụng sản xuất sản phẩm thực phẩm bảo vệ sức khỏe: nước rau má mật nhân

3 Đối tượng nghiên cứu

Rễ mật nhân (mật nhân - tên khoa học là Eurycoma longifolia Jack) có nguồn gốc ở

huyện Ia-Grai, tỉnh Gia Lai Nguyên liệu được thu mua và được chuyển về phòng thí nghiệm của Đại học Bách Khoa - Đại học Đà Nẵng

4 Phạm vi nghiên cứu

Nghiên cứu này sử dụng vùng nguyên liệu mật nhân ở huyện Ia-Grai, tỉnh Gia Lai với phương pháp chiết rễ mật nhân bằng chưng ninh trong dung môi ethanol

5 Phương pháp nghiên cứu

Phương pháp vật lý, phương pháp hóa lý, phương pháp hóa học, phương pháp vi sinh, phương pháp phân tích cảm quan và các phần mềm xử lý số liệu như Excel Microsoft 2013, Minitab 16.1, Matlab R2016a

6 Nội dung nghiên cứu

- Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chưng ninh rễ mật nhân trong dung môi ethanol bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm

- Tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết rễ mật nhân bằng phương pháp chưng ninh trong dung môi ethanol

- Sản xuất bột chiết mật nhân để ứng dụng vào công nghệ thực phẩm

- Ứng dụng sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe - “Nước rau má mật nhân”

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về cây mật nhân

1.1.1 Giới thiệu chung về cây mật nhân

Mật nhân có tên khoa học là Eurycoma longifolia Jack, thuộc họ Thanh thất

Cây mật nhân phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới Đông Nam Á và Nam Á, ở Đông Nam Á phân bố rộng rãi hầu như khắp các nước như Indonesia, Malaysia, Lào, Campuchia, Philippines Ngoài ra còn xuất hiện ở một số nước khác như Nam Trung Quốc, Ấn Độ và một số nước khác [1] Ở Việt Nam, bách bệnh phân bố rải rác ở các tỉnh vùng núi thấp (dưới 1000m) và trung du Các tỉnh Tây Nguyên và miền Trung gặp nhiều hơn các tỉnh phía Bắc [1], [2]

1.1.2 Đặc điểm thực vật của cây mật nhân

Cây mật nhân thuộc họ Thanh thất, do đó nó mang những hình thái đặc trưng của

họ Thanh thất như cây nhỡ, cao 2 – 8 m, lá kép, lông chim lẻ gồm 21 - 25 lá chét không cuống, mọc đối, hình mác hoặc bầu dục, mặt trên xanh bóng, mặt dưới trắng xóa, cuống

lá màu nâu đỏ

Cụm hoa hình chùm kép hoặc chùm tán mọc ở ngọn, cuống có lông màu gỉ sắt Hoa màu đỏ nâu, đài hoa chia thành 5 thùy hình tam giác có tuyến ở lưng, tràng hoa 5 cánh hình thoi cũng có tuyến, nhị 5 có lông dày và hai vảy ở gốc; bầu có 5 noãn, hơi dính nhau ở gốc, đầu nhụy rời

Quả hạch, hình trứng hơi dẹt, có rãnh giữa, khi chín màu vàng đỏ, chứa một hạt, trên mặt hạt có nhiều lông ngắn [1]

Hình 1.2: Lá, quả, hoa của cây mật nhân [15]–[17]

1.1.3 Thành phần hóa học của cây mật nhân

Qua kết quả từ nhiều nguồn tài liệu khác nhau trong và ngoài nước đã được công bố tính đến năm 2019 thì đã phân lập được hơn 69 chất các loại từ các bộ phận của cây mật nhân như rễ, thân cây và lá [13] Thành phần hóa học của mật nhân vô cùng đa dạng, mỗi bộ phận của cây thì có các thành phần khác nhau bao gồm những hợp chất như hợp chất của nhóm triterpenoid với ba khung sườn quassinoid, squallan và tirucallan Ngoài

ra còn có alkaloid (các dẫn chất có khung cơ bản canthin-6-on và β-carbolin), steroid, coumarin, axit axetic, axit benzoic, menthol… Trong đó, quassinoid và alkaloid đóng

vai trò quan trọng và là hoạt chất chủ yếu của các cây họ Thanh thất (Simaroubaceae)

nói chung và cây mật nhân nói riêng

Dưới đây là bảng tóm tắt thành phần hóa học của cây mật nhân được tổng hợp qua nhiều nghiên cứu trong và ngoài nước [2], [13], [18], [19]

Bảng 1.1: Thành phần hóa học tìm được trong các nghiên cứu trước đây [13]

số chất ở trạng thái lỏng như nicotin dễ tan trong nước Alkaloid tan tốt trong các dung môi hữu cơ như cồn, benzen, toluen, diclometan Ngược lại muối của nó với các axit hữu cơ và vô cơ dễ tan trong nước và một số dung môi hữu cơ phân cực và không tan trong dung môi hữu cơ không phân cực Các dung môi hữu cơ ít phân cực như ethanol

và methanol có thể hòa tan được cả alkaloid dạng muối và dạng base [22] Còn quassinoid là những hợp chất hầu như tan trong nước Từ những phân tích nêu trên, ta

có thể thấy rằng, hầu hết các hoạt chất chống ung thư đều thuộc nhóm alkaloid và muốn chiết tách được các hợp chất này, cần phải dùng dung môi ít phân cực như ethanol và methanol

Nói tóm lại, để chiết được triệt để các chất có trong rễ mật nhân, ta cần một dung môi vừa phân cực mạnh như nước, vừa có dung môi ít phân cực như methanol và ethanol Để có thể ứng dụng trong sản xuất thực phẩm thì dung môi ethanol là một lựa chọn an toàn và phù hợp, do đó tôi lựa chọn nghiên cứu quá trình chiết rễ mật nhân trong dung môi ethanol

1.1.4 Tác dụng dược lý của mật nhân

Eurycoma longifolia là một loại thuốc thảo dược đã được chứng minh rõ ràng trên

phương diện khoa học và đã được công bố rộng rãi do các tác dụng dược lý linh hoạt của nó bao gồm chống ung thư, chống sốt rét, kháng khuẩn, chống oxy hóa, kích thích tình dục, chống viêm, chống loét, chống đái tháo đường

1.1.4.1 Ngăn ngừa ung thư

Trong số các hợp chất có hoạt tính dược lý được phân lập từ các bộ phận khác nhau (rễ, thân, vỏ và lá) của cây mật nhân, có nhiều hợp chất đã được nghiên cứu là có khả năng chống tăng sinh và chống ung thư

Năm 2004, tác giả Ping C.Kuo và cộng sự [5]đã định danh được khoảng 65 hợp chất từ rễ cây mật nhân có tiềm năng kháng sốt rét, kháng khối u, gây độc tế bào và kháng HIV trên các thử nghiệm in vitro

Năm 2018, tác giả Thu Hnin E và cộng sự đã công bố [6], eurycomanone là một

trong những hợp chất dược liệu tích cực nhất của Eurycoma longifolia, đã thể hiện được

hiệu quả cao trong việc chống ung thư biểu mô phổi (tế bào A-549) và ung thư vú (tế bào MCF-7) và cho thấy hiệu quả trung bình chống lại ung thư dạ dày (tế bào MGC-803) và ung thư biểu mô đường ruột (tế bào HT-29)

Năm 2018, tác giả Chunxin Zou và cộng sự đã công bố [23], tám hợp chất trong E

longifolia thuộc các dẫn xuất squalene, biphenyl, neolignans và alkaloids được dự đoán

là có tiềm năng hoạt động ức chế ung thư gan

1.1.4.2 Chống oxi hóa, chống viêm

Khả năng kháng oxy hóa của một chất đó là khả năng làm ức chế quá trình oxy hóa của các phân tử khác Oxy hóa là một phản ứng hóa học có thể tạo ra các gốc tự do, dẫn đến các phản ứng khác có thể làm hỏng các tế bào Các chất kháng oxy hóa như thiolis hay Vitamin C có thể chấm dứt các phản ứng dây chuyền này để ngăn cản quá trình oxy hóa xảy ra

Năm 2013, C.P Varghese và cộng sự [24] đã nghiên cứu về hoạt tính chống oxy hóa và kết luận rằng dịch chiết mật nhân trong cồn thể hiện hoạt động chống oxy hóa ở tất cả các nồng độ (10, 25, 50, 100 và 250 μg/ml) Tính chất chống oxy hóa của chiết xuất này được so sánh với các giá trị của axit ascorbic Phương pháp phân nhóm RBC

ở người (HRBC) được sử dụng để đánh giá hoạt tính chống viêm trong ống nghiệm của dịch chiết Dịch chiết cho thấy một khả năng kháng viêm đáng kể ở tất cả các nồng độ được kiểm tra (25, 50, 100, 250, 500 và 1000 μg/ml) và hoạt tính tăng lên khi tăng nồng độ

Năm 2019, nhóm nghiên cứu Đào Thanh Hiền và Trần Phi Long [9] cùng cộng sự của mình cũng đã công bố rằng: chiết xuất alkaloid từ rễ cây mật nhân đã cho thấy tác

dụng chống viêm đáng kể ở cả mẫu in vitro và in vivo Chiết xuất này thể hiện hoạt động chống viêm thông qua việc ức chế các chất trung gian gây viêm như NO, iNOS và COX-

2 và bảo vệ chuột khỏi tử vong do LPS gây ra trong mô hình sốc nhiễm trùng

Theo phát hiện của nhóm nghiên cứu Hulol Saleh Alruhaimi, Ahmed K Allow, Zunariah Buyong, Muhammed Naser và Shaikh Mizanur (2019) ở Malaysia cho thấy

Eurycoma longifolia có thể có tác dụng bảo vệ thần kinh đối với giảm máu đến não mãn

tính (chronic cerebral hypoperfusion) bằng cách tăng cường khả năng chống oxy hóa và giảm peroxid hóa và viêm, có thể cải thiện chức năng nhận thức ở chuột [10]

1.1.4.3 Khả năng kích thích sinh dục

Eurycoma longifolia (EL) đã được công nhận là một chất tăng cường sức khỏe tình

dục ở nam giới Trong vài thập kỷ qua, nhiều nghiên cứu trên động vật in vivo và các thử nghiệm lâm sàng ở người đã được thực hiện trên toàn cầu để khám phá vai trò đầy tiềm năng của EL trong việc kiểm soát các rối loạn tình dục nam khác nhau, bao gồm rối loạn cương dương, vô sinh nam, ham muốn thấp và kích thích sản sinh testosterone Theo báo cáo của nhóm tác giả M I B M Tambi, M K Imran, R R Henkel [4],

76 trong số 320 bệnh nhân mắc chứng suy sinh dục khởi phát muộn (LOH) đã được cung cấp 200 mg nước chiết mật nhân tiêu chuẩn trong 1 tháng Các triệu chứng lão hóa nam giới (AMS) theo thang đánh giá tiêu chuẩn và nồng độ testosterone trong huyết thanh đã được theo dõi Kết quả cho thấy điều trị bệnh nhân LOH với chiết xuất mật nhân này (P <0,0001) đã cải thiện điểm AMS cũng như nồng độ testosterone trong huyết thanh, trước khi điều trị chỉ có 10,5% bệnh nhân dấu hiệu lão hóa ở nam giới và 35,5%

có mức testosterone bình thường, sau khi hoàn thành thử nghiệm đã tăng lên 71,7% và 90,8% bệnh nhân cho thấy giá trị bình thường tương ứng

1.1.4.4 Chống tiểu đường

Bệnh đái đường (hay tiểu đường) là một bệnh mãn tính, do rối loạn chuyển hoá hydrat cacbon vì thiếu insulin ở các mức độ khác nhau, do đó gây tăng đường huyết và nếu vượt quá ngưỡng thì có đường niệu (nước tiểu có đường) Bệnh tiểu đường là một trong những nguyên nhân chính của nhiều bệnh hiểm nghèo, điển hình là bệnh tim mạch vành, tai biến mạch máu não, mù mắt, suy thận, liệt dương, hoại thư, [25]

Năm 2004, Husen và cộng sự đã nghiên cứu dịch chiết trong nước của rễ E

longifolia ở liều (50, 100 và 150 mg/kg) theo mô hình Streptozotocin trên chuột bình

thường và chuột có đường huyết cao Kết quả cho thấy ở nồng độ 150 mg/kg cao nước

có khả năng làm hạ đường huyết [11] Năm 2005, một báo cáo khác đã báo cáo về quá

trình nghiên cứu ảnh hưởng của dịch chiết trong nước tiêu chuẩn của E longifolia trên

sức khỏe nam giới Sàng lọc bệnh tiểu đường trên các bệnh nhân viên mắc bệnh tiểu đường loại 2 cho thấy ảnh hưởng đáng kể đến việc hạ thấp mức đường huyết [26]

1.1.4.5 Khả năng kháng khuẩn

Hoạt tính kháng khuẩn là một hoạt tính sinh học cho thấy khả năng tiêu diệt hoặc

ức chế sự phát triển của vi sinh vật Hầu như các loại vi sinh vật gây độc đối với sức khỏe con người thường được sử dụng trong việc nghiên cứu về hoạt tính kháng khuẩn

của thực vật như là: tụ cầu vàng (S aureus), E coli, Salmonella, P aeruginosa…

Năm 2013, theo báo cáo của nhóm tác giả thuộc đại học Malaysia cho thấy chiết xuất từ rễ và thân cây mật nhân đều có hoạt tính kháng khuẩn đối với vi khuẩn gram

dương Tuy nhiên, chiết xuất từ thân cây mạnh hơn chiết xuất từ rễ đối với Bacillus

cereus và Staphylococcus aureus Chiết xuất ethyl acetate của thân cây cho thấy tác

động vừa phải khi chống lại vi khuẩn gram âm Pseudomonas aeruginosa và hoạt tính tác động cao khi chống lại nấm Aspergillus niger [27]

Năm 2018, nhóm tác giả Hnin Ei Thu và cộng sự cũng đã công bố rằng các loại chiết xuất khác nhau (methanolic, ethyl acetate và n-butanolic) từ các bộ phận khác nhau

(rễ, thân và lá) của E longifolia cho thấy phản ứng kháng khuẩn, chống nhiễm trùng và kháng nấm phụ thuộc vào liều Tuy nhiên chiết xuất từ rễ của E longifolia lại thể hiện

hiệu quả kháng khuẩn cao nhất so với các bộ phận khác của cây [3]

1.1.4.6 Chống sốt rét

Năm 2007, một nghiên cứu của nhóm tác giả Mohd Ridzuan và cộng sự đã báo cáo

kết quả nghiên cứu các đặc tính chống sốt rét của E longifolia chiết xuất tiêu chuẩn (từ

rễ) (TA164) đơn lẻ và khi kết hợp với artemisinin in vivo Điều trị kết hợp chiết xuất tiêu chuẩn (TA164) với artemisinin bị ức chế nhiễm Plasmodium yoelii ở chuột thí nghiệm Thử nghiệm ức chế 4 ngày cho thấy TA-164 ức chế ký sinh trùng của chuột bị nhiễm Plasmodium yoelii bằng cách điều trị bằng đường uống và tiêm dưới da [28] Một nghiên cứu khác vào năm 2013 của H Yusuf cùng cộng sự đã sử dụng bốn hợp

chất được phân lập từ chiết xuất của rễ cây E longifolia là β-carboline-propionic acid,

eurycomanone, 18-dehydro-6α-hydroxyeurycomalactone và eurycomanol để xét nghiệm hoạt tính kháng sốt rét in vitro Kết quả cho thấy cả bốn hợp chất phân lập từ

chiết xuất của E.longifolia đều có hoạt tính chống sốt rét [29]

1.1.4.7 Chống loãng xương

Loãng xương ở nam giới cao tuổi hiện đang trở thành một vấn đề sức khỏe đáng báo động do mối liên hệ với tỷ lệ tử vong cao hơn so với loãng xương ở phụ nữ Thiếu hụt androgen (hypogonadism) là một trong những yếu tố chính gây loãng xương nam và nó

có thể được điều trị bằng liệu pháp thay thế testosterone

Theo một báo cáo vào năm 2012, Eurycoma longifolia có thể được sử dụng như một

phương pháp điều trị thay thế để ngăn ngừa và điều trị loãng xương nam mà không gây

ra tác dụng phụ liên quan đến testosterone E longifolia phát huy tác dụng chống quá

trình tạo mạch máu giúp tăng cường mức độ testosterone, cũng như kích thích tăng sinh nguyên bào xương và chất ức chế phân hủy xương Điều này sẽ duy trì hoạt động phục

hồi xương và giảm phân hủy xương Thành phần hóa học của E longifolia cũng có thể ngăn ngừa loãng xương thông qua đặc tính chống oxy hóa của nó Do đó, E longifolia

có tiềm năng như là một điều trị bổ sung cho bệnh loãng xương nam [30]

Năm 2017, nhóm tác giả Hnin Ei Thu đã công bố kết quả đánh giá tác động của E

longifolia và testosterone đối với sự tăng sinh tuần tự theo thời gian, sự khác biệt và điều

chế hình thái trong các nguyên bào xương Họ cho biết so với testosterone, E longifolia

có tiềm năng lớn hơn trong việc thúc đẩy sự tăng sinh và biệt hóa tế bào của các tế bào MC3T3-E1 để ngăn ngừa loãng xương nam [12]

1.1.4.9 Giảm cholesterol xấu

Có hai loại cholesterol trong máu: LDL và HDL LDL là lipoprotein tỷ trọng thấp còn HDL là lipoprotein tỷ trọng cao Trong đó, LDL hay cholesterol “xấu” có thể tích

tụ và làm tắc mạch máu Loại này có thể gây đau tim hoặc đột quỵ HDL hay cholesterol

“tốt” giúp loại bỏ cholesterol “xấu” ra khỏi mạch máu [31]

Năm 2017, nhóm nghiên cứu F Al-Joufi và cộng sự đã nghiên cứu tác dụng của

Eurycoma longifolia (EL) về hàm lượng chất béo và thay đổi sinh hóa của chất béo và

độ dày trung bình của màng trong (Intima Media Thickness-IMT) ở chuột ăn chế độ ăn nhiều chất béo Hai mươi con chuột đực Sprague-Dawley (SD) trưởng thành, trẻ tuổi được nuôi trong 12 tuần Sau một tuần thích nghi, chúng được chia ngẫu nhiên thành 4 nhóm và điều trị trong 12 tuần như sau: Nhóm ND chỉ được cho ăn kiêng bình thường, nhóm NDEL được cho ăn kiêng bình thường và chiết xuất EL (15mg/kg) hòa tan trong nước cất, nhóm HFD chỉ được cung cấp chế độ ăn nhiều chất béo và nhóm HFDEL được cho ăn chế độ ăn nhiều chất béo và chiết xuất EL (15mg/kg) Kết quả cho thấy: có sự giảm đáng kể hàm lượng triglyceride (TG) trong nhóm HFDEL so với nhóm HFD Các phần mô học của động mạch chủ cho thấy sự giảm đáng kể IMT trong nhóm HFDEL so với nhóm HFD Những phát hiện này cho thấy EL là một tác nhân bảo vệ đầy hứa hẹn chống lại chứng xơ vữa động mạch gây ra bởi chế độ ăn nhiều chất béo [32]

+ Trích ly lỏng- trích các chất hòa tan trong chất lỏng;

+ Trích ly rắn- trích các chất hòa tan có trong chất rắn

❖ Đặc điểm của quá trình trích ly:

Quá trình trích ly dựa trên cơ sở độ hòa tan đồng nhất của các chất có trong hỗn hợp dung môi này hay một dung môi khác Trích ly là quá trình khuếch tán, hiệu số nồng độ các chất hòa tan ở hai pha tiếp xúc với nhau là động lực của quá trình trích ly Chất tan chuyển dời về phía nồng độ nhỏ từ pha này sang pha kia (từ pha lỏng này sang pha lỏng khác, từ pha rắn sang pha lỏng)

Trích ly ở nhiệt độ thường không có đảo trộn thì xảy ra do khuếch tán phân tử, còn khi đun nóng hoặc khuấy trộn gọi là khuếch tán đối lưu

Quá trình trích ly được thực hiện hay không do sự cân bằng phân bố các chất giữa hỗn hợp cần tách với dung môi hoặc giữa hai pha không trộn lẫn vào nhau Theo định luật phân bố cân bằng thì tỉ số nồng độ các chất được phân chia giữa dung môi và chất lỏng khởi đầu ở nhiệt độ đã cho có giá trị không đổi [33]

1.2.2 Yêu cầu của dung môi sử dụng để trích ly trong công nghệ thực phẩm

Việc lựa chọn dung môi chiết có ảnh hưởng đến quá trình chiết, do đó, dung môi được chọn cần thỏa mãn được một số yêu cầu sau đây:

- Có tính hòa tan chọn lọc, chỉ hòa tan các thành phần cần tách ra khỏi hỗn hợp với hiệu suất cao nhất;

- Có khối lượng riêng của dung môi khác xa khối lượng riêng của dung dịch, nhằm tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình trích ly lỏng lỏng;

- Không gây tác dụng hóa học đối với các thành phần có trong nguyên liệu;

- Không phá hủy các thành phần của của sản phẩm trong quá trình bảo quản;

- Dung môi phải dễ tách ra (sau khi trích ly) và không để lại mùi vị sau khi tách;

- Không phá hủy thiết bị, không độc khi thao tác;

- Rẻ tiền và dễ kiếm [33]

Trong thực tế thì không có dung môi nào thỏa mãn đầy đủ hết các yếu tố nêu trên,

do đó để lựa chọn được loại dung môi thì còn phụ thuộc vào thành phần và tính chất của nguyên liệu cũng như là yêu cầu đầu ra của dịch chiết, điều kiện kinh tế… Từ những phân tích ở phần 1.1.3 tôi đã chọn dung môi chiết là ethanol Ngoài ra, cùng với các kết quả khảo sát dung môi của nhóm tác giả Trần Ý Đoan Trang (2015), Mai Hưng Trấn (2017), Võ Khánh Hà (2017) [18], [19], [34] cho thấy, khi chiết rễ mật nhân trong ethanol thì cho hiệu suất thu hồi khá cao, không độc khi dùng trong thực phẩm, dễ tách

ra sau khi trích ly Đồng thời, theo báo cáo của nhóm tác giả Trương Thị Minh Hạnh và Nguyễn Thị Hồng Hương (2018) [35] thì dịch chiết từ rễ mật nhân trong dung môi ethanol ở Gia Lai có khả năng kháng các loại tế bào ung thư mà dịch chiết trong nước không thể hiện được Từ những cơ sở lý luận nêu trên, dung môi ethanol 80% là dung môi được sử dụng trong suốt quá trình nghiên cứu này

1.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly

1.2.2.1 Những yếu tố thuộc về thành phần, cấu tạo của dược liệu

❖ Màng tế bào dược liệu

❖ Chất nguyên sinh

❖ Một số tạp chất có thể có trong dược liệu

Những yếu tố này thì không thể thay đổi được trong quá trình sản xuất, mà phụ thuộc vào nguyên vật liệu mà chúng ta sử dụng, chúng ta không thể thay đổi được chúng,

do vậy trong phạm vi này chúng ta không nghiên cứu sâu về nó

1.2.2.2 Những yếu tố thuộc về dung môi

❖ Độ phân cực của dung môi

Nói chung dung môi ít phân cực thì dễ hòa tan các chất không phân cực và khó hòa tan các chất có nhiều nhóm phân cực Ngược lại, dung môi phân cực mạnh thì hòa tan các chất có nhiều nhóm phân cực và khó hòa tan các chất ít phân cực [22]

❖ Độ nhớt, sức căng bề mặt của dung môi

Nhìn chung, dung môi có độ nhớt càng thấp hoặc có sức căng bề mặt càng nhỏ thì dung môi càng dễ thấm vào dược liệu, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình chiết xuất

và ngược lại [22]

1.2.2.3 Những yếu tố về kỹ thuật

Yếu tố về kỹ thuật là những yếu tố có thể thay đổi được bằng các biện pháp kỹ thuật khác nhau, nhằm tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình chiết xuất Đó có thể là những yếu tố như nhiệt độ, thời gian, độ mịn của dược liệu, khuấy trộn, siêu âm

❖ Sự chênh lệch nồng độ giữa hai pha

Trong quá trình trích ly, sự chênh lệch nồng độ giữa hai pha là động học của quá trình trích ly, do đó sự chênh nồng độ giữa hai pha càng lớn thì quá trình trích ly diễn

ra càng nhanh và thuận lợi Chính vì thế, trong quá trình trích ly người ta luôn tìm mọi cách để tăng sự chênh lệch nồng độ giữa hai pha: trích ly ngược chiều, tuần hoàn dung môi, bổ sung dung môi trong quá trình trích ly, thay mới dung môi cuối quá trình trích

ly [33]

❖ Nhiệt độ chiết

Theo công thức tính hệ số khuếch tán của Einstein, khi nhiệt độ tăng thì hệ số khuếch tán cũng tăng, do đó theo định luật Fick, lượng chất khuếch tán cũng tăng lên Hơn nữa khi nhiệt độ tăng thì độ nhớt của dung môi giảm nên tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình chiết Tuy nhiên, khi nhiệt độ tăng sẽ gây ra bất lợi cho những hợp chất kém bền ở nhiệt độ cao, gây phá hủy một số hoạt chất như vitamin, glycosid, alcaloid, Một số bất lợi khác có thể kể đến như khi nhiệt độ tăng làm tăng độ hòa tan của tạp chất, dung môi dễ bị hao hụt và đối với một số chất đặc biệt có quá trình hòa tan tỏa nhiệt, độ hòa

tan của chúng giảm khi nhiệt độ tăng Vì vậy tùy trường hợp cụ thể mà cần lựa chọn nhiệt độ sao cho phù hợp [22]

❖ Thời gian chiết

Khi bắt đầu chiết, các chất có phân tử lượng nhỏ sẽ được hòa tan và khuếch tán vào dung môi trước, sau đó mới đến các chất có phân tử lượng lớn Do đó nếu thời gian chiết quá ngắn sẽ không chiết được hết các hoạt chất trong dược liệu Nếu thời gian chiết quá dài, dịch chiết sẽ bị lẫn nhiều tạp chất, gây bất lợi cho quá trình tinh chế và bảo quản Nhưng đến một giới hạn nào đó thì quá trình chiết sẽ đến trạng thái cân bằng dù có kéo dài thời gian thì quá trình trích ly cũng không diễn ra nữa Cho nên chúng ta cần phải lựa chọn thời gian chiết sao cho phù hợp với thành phần dược liệu, dung môi và phương pháp chiết [22]

Ngoài những yếu tố kể trên còn nhiều yếu tố khác cũng gây ảnh hưởng đến quá trình chiết như độ mịn, khuấy trộn, áp suất, pH môi trường, chấn động cơ học, dòng điện cao áp, [22]

Những yếu tố về kỹ thuật là những yếu tố có thể thay đổi được bằng các biện pháp

kỹ thuật khác nhau, thay đổi các yếu tố này trong quá trình sản xuất là dễ dàng thực hiện Vì vậy trong nghiên cứu này chúng tôi đã lựa chọn ba yếu tố của quá trình chiết xuất là tỉ lệ giữa dung môi và nguyên liệu, nhiệt độ chiết và thời gian chiết để tiến hành quá trình khảo sát các yếu tố ảnh hưởng bằng quy hoạch thực nghiệm và tối ưu hóa quá trình chiết rễ mật nhân trong dung môi ethanol bằng phương pháp chưng ninh

1.2.3 Các phương pháp chiết mật nhân

Trong phạm vi công nghệ thì có rất nhiều phương pháp chiết khác nhau từ phương pháp gián đoạn đến phương pháp liên tục, từ phương pháp đơn giản đến phức tạp, từ phương pháp truyền thống đến hiện đại với các loại dung môi khác nhau Tuy nhiên, trong phạm vi nghiên cứu ở phòng thí nghiệm thì chúng ta chỉ có thể chiết bằng các phương pháp khá đơn giản như: ngâm chiết, ngâm lắc, chưng ninh, chiết soxhlet, chiết siêu âm…

Phương pháp ngâm chiết: sau khi chuẩn bị dược liệu, đổ dung môi cho ngập dược liệu trong bình chiết xuất Sau một thời gian ngâm nhất định, rút lấy dịch chiết (lọc hoặc gạn) và rửa dược liệu bằng một lượng dung môi thích hợp [22]

Phương pháp chưng ninh: phương pháp này thực hiện khá giống với phương pháp ngấm kiệt, chỉ có điều là để tăng cường hiệu quả chiết người ta thường thực hiện trong điều kiện nhiệt độ cao Thiết bị thì có hệ thống ống sinh hàn để hồi lưu dung môi Phương pháp chiết Soxhlet: dược liệu được cho vào một ống giấy lọc rồi đặt vào ngăn chiết Dung môi mới được cho vào bình cầu và đun hồi lưu Dung môi bốc hơi lên được ngưng tụ xuống ngăn chiết và khi tràn sẽ chảy qua ống xi phông xuống bình cầu

bên dưới, mang theo các chất hòa tan từ dược liệu Ở bình cất, chất tan được giữ lại, dung môi bốc hơi lên được ngưng tụ xuống bình chiết và đi qua lớp dược liệu để hòa tan các chất tan còn lại Cứ như vậy cho đến khi dược liệu được chiết kiệt

Ưu điểm của các phương pháp này là đơn giản, dễ thực hiện, thiết bị đơn giản, rẻ tiền, thích hợp khi thực hiện trong phòng thí nghiệm Tuy nhiên vẫn tồn tại những nhược điểm như năng suất thấp, thao tác thủ công

Theo báo cáo của các tác giả Mai Hưng Trấn (2017), Võ Khánh Hà (2018), Trần Ý Đoan Trang [18], [19], [34] trong số các phương pháp trên thì phương pháp chưng ninh

là phương pháp chiết có thời gian thực hiện nhanh hơn và hiệu suất chiết cũng cao hơn

so với phương pháp ngâm chiết và phương pháp chiết Soxhlet nên trong bài nghiên cứu này, tôi sử dụng phương pháp chưng ninh trong dung môi ethanol để tối ưu hóa 3 yếu

tố ảnh hưởng đến quá trình chiết rễ mật nhân

1.3 Tổng quan về thực phẩm bảo vệ sức khỏe

1.3.1 Khái niệm

Thực phẩm bảo vệ sức khỏe (Health Supplement, Dietary Supplement) theo nghị định số 15/2018/NĐ-CP [36] đã định nghĩa như sau: là sản phẩm được dùng để bổ sung thêm vào chế độ ăn uống hàng ngày nhằm duy trì, tăng cường, cải thiện các chức năng của cơ thể con người, giảm nguy cơ mắc bệnh Thực phẩm bảo vệ sức khỏe chứa một hoặc nhiều chất hoặc hỗn hợp các chất sau:

a) Vitamin, khoáng chất, axit amin, axit béo, enzym, probiotic và chất có hoạt tính sinh học khác;

b) Hoạt chất sinh học có nguồn gốc tự nhiên từ động vật, chất khoáng và nguồn gốc thực vật ở các dạng như chiết xuất, phân lập, cô đặc và chuyển hóa;

c) Các nguồn tổng hợp từ những thành phần đề cập tại điểm a và điểm b trên đây

1.3.2 Lợi ích

Cuộc sống ngày càng phát triển, con người luôn bận rộn với nhiều công việc, gia đình dẫn đến việc dần mất đi thói quen chăm sóc sức khỏe, làm đẹp làm cho cơ thể không được cung cấp đầy đủ những dưỡng chất cần thiết quan trọng Cho nên việc sử dụng thực phẩm bảo vệ sức khỏe hàng ngày có thể giúp:

- Thực phẩm bảo vệ sức khỏe có công dụng giúp bổ sung nhanh chóng chất dinh dưỡng và các chất có tác dụng cần thiết cho cơ thể và những chức năng được chỉ định

mà cơ thể không thể tự sản sinh hoặc được cung cấp trong chế độ ăn uống hàng ngày nhưng không đầy đủ

- Có nhiều loại thực phẩm bảo vệ sức khỏe có thể tạm thời thay thế bữa ăn, giúp cơ thể không mất đi chất dinh dưỡng khi gặp phải các tình trạng thiếu thốn thực phẩm hoặc không có điều kiện ăn uống bình thường như lúc bị bệnh…

- Thực phẩm bảo vệ sức khỏe không phải là thuốc nên có thể dễ dàng sử dụng cho bất kỳ đối tượng nào nếu phù hợp Theo dạng tinh chế nên rất dễ bảo quản và mang theo bên người mọi lúc

- Tùy thuộc theo từng nhu cầu và đối tượng sử dụng, người tiêu dùng có thể lựa chọn sản phẩm phù hợp với tình trạng cơ thể từng người

- Được sử dụng như một dạng sản phẩm bổ sung tăng dinh dưỡng và sức khỏe, nên

có thể nói thực phẩm bảo vệ sức khỏe chính là tiền đề giúp người sử dụng ý thức chăm

lo cho cơ thể, thay đổi thói quen sinh hoạt hàng ngày để có chế độ ăn uống hợp lý và tạo cho mình một lối sống lành mạnh có lợi cho sức khoẻ hơn [37]

1.3.3 Yêu cầu đối với thực phẩm bảo vệ sức khỏe

Theo điều 10 và điều 11 của thông tư 43/2014/TT-BYT [38], đã yêu cầu như sau:

1.3.3.1 Công bố về hàm lượng:

a) Thành phần chính tạo nên công dụng của sản phẩm phải được liệt kê trước cùng tên đầy đủ và hàm lượng Các thành phần khác được liệt kê tiếp sau theo thứ tự giảm dần về khối lượng;

b) Hàm lượng của vitamin, khoáng chất có trong thực phẩm tính theo liều khuyên dùng hằng ngày của nhà sản xuất phải đạt được tối thiểu 15% RNI được quy định tại Phụ lục số 01 ban hành kèm theo Thông tư này;

c) Hàm lượng tối đa của vitamin, khoáng chất có trong thực phẩm tính theo liều khuyên dùng hằng ngày của nhà sản xuất không được vượt quá ngưỡng dung nạp tối đa của các vitamin và khoáng chất được quy định tại Phụ lục số 02 ban hành kèm theo Thông tư này;

d) Hàm lượng vitamin và khoáng chất có trong sản phẩm phải được ghi trên nhãn bằng số và phải được công bố dưới dạng tỉ lệ phần trăm (%) tính theo RNI, dựa trên liều khuyên dùng hằng ngày của sản phẩm hoặc dựa trên một đơn vị sử dụng (serving size) Trong trường hợp Việt Nam chưa có mức RNI và ngưỡng dung nạp tối đa thì áp dụng theo quy định của CODEX hoặc các tổ chức quốc tế có liên quan

1.3.3.2 Công bố khuyến cáo về sức khỏe (Health claims):

a) Công bố khuyến cáo về sức khỏe phải đúng bản chất của sản phẩm, chỉ công bố công dụng của thành phần cấu tạo có công dụng chính hoặc công bố công dụng hợp thành của những thành phần cấu tạo khi có bằng chứng khoa học chứng minh và không công bố công dụng theo cách liệt kê công dụng của các thành phần;

b) Công bố khuyến cáo về sức khỏe, liều lượng, đối tượng sử dụng và cách dùng phù hợp phải thống nhất và phù hợp với các tài liệu tại hồ sơ;

c) Khi hàm lượng vitamin, khoáng chất, các hoạt chất sinh học nhỏ hơn mức trong các tài liệu khoa học chứng minh thì không được công bố công dụng sản phẩm;

d) Khi hàm lượng vitamin, khoáng chất, các hoạt chất sinh học đạt như trong tài liệu khoa học khuyến cáo thì được công bố công dụng nhưng phải chỉ ra đối tượng, liều dùng phù hợp;

đ) Khi hàm lượng các thành phần cấu tạo chưa có mức RNI thì phải cung cấp tài liệu khoa học chứng minh về công dụng của thành phần đó cùng khuyến cáo liều dùng khi công bố

1.3.3.3 Đối tượng sử dụng:

a) Đối tượng phải phù hợp với công dụng đã công bố và được cơ quan nhà nước có thẩm quyền chấp nhận thông qua bản Xác nhận công bố phù hợp quy định an toàn thực phẩm;

b) Phải cảnh báo đối tượng không được sử dụng (nếu có)

1.3.3.4 Yêu cầu về ghi nhãn tiếng Việt

Ngoài việc phải đáp ứng các yêu cầu tại Điều 6 của Thông tư này, nhãn thực phẩm bảo vệ sức khỏe phải đáp ứng các quy định sau đây:

1 Ghi cụm từ thể hiện tên nhóm thực phẩm: “Thực phẩm bảo vệ sức khỏe” trên phần chính của nhãn để phân biệt với thực phẩm thông thường và thuốc

2 Khi lấy thành phần chính tạo nên công dụng của sản phẩm làm tên sản phẩm thì phải ghi rõ ở bên cạnh hoặc dưới tên sản phẩm trên phần nhãn chính và trong thành phần cấu tạo ở nhãn sản phẩm nội dung sau:

a) Hàm lượng hoạt chất trong thành phần đó nếu định lượng được; hoặc

b) Hàm lượng thành phần đó nếu không định lượng được hoạt chất trong thành phần

3 Không ghi cơ chế tác dụng trên nhãn sản phẩm

4 Phải ghi cụm từ “Chú ý: Sản phẩm này không phải là thuốc và không có tác dụng thay thế thuốc chữa bệnh” ngay sau phần ghi nhãn về công dụng của sản phẩm hoặc cùng chỗ với các khuyến cáo khác nếu có Cụm từ này phải có màu tương phản với màu nền của nhãn và chiều cao chữ không được thấp hơn 1,2 mm, đối với trường hợp một mặt của bao gói dùng để ghi nhãn nhỏ hơn 80 cm2 thì chiều cao chữ không được thấp hơn 0,9 mm

1.3.4 Một số sản phẩm thực phẩm chức năng của mật nhân trên thị trường

Với hàng loạt các hoạt tính sinh học có lợi của mật nhân, nó đã có mặt trong thành phần của nhiều sản phẩm trên thị trường và theo thông tin của Quyết định 3657/QĐ - BYT 2009 của Bộ Y tế, mật nhân là một trong các chất nằm danh mục 100 dược liệu có giá trị y tế và kinh tế cao [39] Dưới đây là một số sản phẩm chứa mật nhân trong thành phần nguyên liệu:

- Viên giải độc gan Tuệ Linh với thành phần có chứa 250 mg cao mật nhân kết hợp với cao cà gai leo, là sản phẩm giúp hỗ trợ điều trị viêm gan siêu vi nhất là viêm gan

siêu vi B mãn tính thể hoạt động, hỗ trợ điều trị men gan tăng cao, làm thuyên giảm các triệu chứng của bệnh gan như đau tức hạ sườn, vàng da, mệt mỏi [40]

- Sâm Alipas có nguồn gốc 100% từ thiên nhiên với 160mg tinh chất thảo dược quý mật nhân Sản phẩm có công dụng kích thích quá trình sản sinh nội tiết tố nam testosterone một cách tự nhiên, tăng cường sức khỏe sinh lý ở nam giới, hỗ trợ lợi mật, tăng cường chức năng gan và điều hòa đường huyết ở người mắc bệnh tiểu đường [41]

- Rocket 1h giúp tăng sinh testosterone, giúp bổ thận dương, tăng cường sinh lực, sức bền sinh lý, giúp làm chậm quá trình mãn dục ở nam giới như: người mệt mỏi, đau lưng, mỏi gối, rối loạn cương dương, xuất tinh sớm Trong mỗi viên chứa 121 mg tinh chất mật nhân [42]

-Viên hộ gan Kingphar với thành phần mỗi viên chứa cao cà gai leo: 300mg, cao mật nhân: 120mg, cao diệp hạ châu: 100mg, cao xuyên tâm liên: 50mg, là sản phẩm tối

ưu cho những trường hợp cần hỗ trợ điều trị các bệnh lý về gan, giúp tăng cường chức năng giải độc gan và bảo vệ tế bào gan [43]

- PQA Mật nhân có chứa 400 mg mật nhân mỗi viên có tác dụng bổ thận, tráng dương, dưỡng khí huyết, mạnh gân cốt; hỗ trợ điều trị bệnh yếu sinh lý, giúp tăng cường sinh lực cho phái mạnh; cải thiện trí lực, giúp cho đầu óc luôn minh mẫn và bớt căng thẳng [44]

-Viên uống Tongkat Ali Swanson Passion 400mg có khả năng điều trị rối loạn chức năng cương dương (ED), cải thiện khả năng tình dục, hỗ trị vô sinh ở nam giới, tăng khả năng vận động ở nam giới, nâng cao khả năng miễn dịch và giảm mỡ cơ thể Ngoài ra, tác dụng của cây mật nhân còn thể hiện qua việc giúp làm hạ sốt, sốt rét, viêm loét, giảm huyết áp, hỗ trợ bệnh lao, đau xương khớp, ho, tiêu chảy, đau đầu, giang mai [45] Dưới đây là hình ảnh một số sản phẩm có chứa mật nhân trên thị trường hiện nay

(a) Viên giải độc gan Tuệ Linh [40] (b) Sâm Alipas [41]

(c) Rocket 1h [42] (d) PQA Mật nhân [44]

(d) Viên hộ gan KingPhar [43] (e) Tongkat Ali Swanson Passion [45]

Hình 1.Error! No text of specified style in document.3: Các sản phẩm thực phẩm

chức năng trên thị trường

1.4 Tổng quan về cây rau má

1.4.1 Tên gọi và phân loại

❖ Tên gọi

- Tên thường gọi: rau má

- Tên trong y học: tích huyết thảo, lôi công thảo

- Các nước khác: pennywort, gotu kola, marsh

penny, white rot, thick-leaved, hydrocotyle,

- Rau má lá rau muống:

Tên khoa học: Emilia sonchifolia (Linn) DC, thuộc họ cúc

Tên khoa học: Gymnotheca involucrata Péi, thuộc họ lá gấp [46]

Trong đó, người ta sử dụng rau má thường để dùng làm thực phẩm, rau má thường thuộc ngành cây có hoa, lớp dicotyledons, bộ apiales, họ hoa tán, chi centella, loài lá hình thuổng

❖ Rau má thường có 3 loại chính:

- Loại lá lớn dùng để nấu canh, ăn sống hay đem ép lấy nước uống;

- Loại sắc tím, lá nhỏ;

- Loại lá nhỏ, sắc xanh đậm

Trong bài nghiên cứu này, tôi sử dụng loại rau má thường lá lớn để sản xuất nước rau má mật nhân

1.4.2 Đặc điểm của cây rau má

Mô tả: Cây thảo, mọc bò, phân nhánh nhiều trên mặt đất Rễ mọc từ các mấu của thân Lá có cuống dài, phiến hình thận hoặc gân tròn, mép khía tai bèo Cụm hoa hình tán đơn mọc ở nách lá gồm 1 - 5 hoa nhỏ không cuống màu trắng hoặc phớt đỏ Quả dẹt,

Bảng 1.2: Thành phần hóa học của rau má [48]

1.4.4 Tác dụng dược lý

Theo đông y, rau má là loại rau tương đối phổ biến thường thu hái cả lá và dây Nó được dùng như thực phẩm và thuốc trong dân gian Rau má có vị hơi đắng, ngọt, tính hơi mát, có tác dụng thanh nhiệt giải độc, tán ứ chỉ thống, lương huyết sinh tân, lợi niệu [46] Rau má thường dùng để làm thuốc bổ dưỡng, sát trùng, chữa thổ huyết, tả lỵ, khí

hư, bạch đới, mụn nhọt, rôm sẩy

Y học hiện đại bắt đầu nghiên cứu về rau má từ những năm 60 của thế kỷ trước Những nghiên cứu lâm sàng về tác dụng chữa bệnh của dịch chiết rau má và các hợp chất trong rau má được chứng minh và công bố Rau má có tác dụng tốt đối với thần kinh, tim mạch, da và bệnh ung thư

❖ Giúp vết thương nhanh lành:

Trong rau má có alkaloid là hydrocotulin và các glycosid, asiaticoside và centellosid, có tác dụng tới các mô liên kết, giúp cho các mô tái tạo nhanh chóng, do đó làm các vết thương mau lành và lên da non [46] Saponin toàn phần của rau má đã được nghiên cứu thấy có tác dụng tăng tổng hợp collagen và fibronectin Tác dụng này có thể giải thích được tác dụng chóng làm lành vết thương của rau má

❖ Chống ung thư:

Năm 2009, Frederico Pittella và cộng sự đã công bố rằng dịch chiết rau má có hoạt động đáng kể chống lại khối u ác tính ở chuột (B16F1), ung thư vú ở người (MDA MB-231) và các dòng tế bào chuột glioma (C6), với các giá trị IC50 lần lượt là 698, 648 và

1000 g/mL [49] Năm 2011, nhóm nghiên cứu Trần Văn Lộc, Trần Văn Sung và cộng

sự đã thử hoạt tính của axit asiatic cũng như các dẫn xuất tổng hợp được gây độc tế bào ung thư trên 3 dòng tế bào BK (tế bào ung thư biểu mô), Hep-G2 (tế bào ung thư gan)

và Lu (tế bào ung thư phổi) và hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định Kết quả cho thấy tất cả các chất đều có hoạt tính mạnh ức chế hai dòng tế bào ung thư thử nghiệm BK và Hep-G2

❖ Đối với thần kinh

Người ta nhận thấy rằng, một số hóa chất trong rau má có tác dụng lên hoạt động của hệ thần kinh trung ương, tăng cường các chất chuyển hóa làm giảm căng thẳng, tâm

lý, khả năng tập trung tư tưởng và giúp cải thiện trí nhớ của người già Wattanathor Jintanaporn và cộng sự (2009) đã chứng minh rằng với hàm lượng 250 mg, 500 mg và

750 mg dịch chiết rau má mỗi ngày, trong 2 tháng, đã cải thiện rõ rệt khả năng nhớ và trạng thái tinh thần của những người già được nghiên cứu [50] Theo một thống kê vào năm 2016, các nghiên cứu in vivo đã chỉ ra rằng toàn bộ chiết xuất và cả các hợp chất

riêng lẻ của C asiatica có tác dụng bảo vệ chống lại các bệnh thần kinh khác nhau Hầu

hết các nghiên cứu in vivo về tác dụng bảo vệ thần kinh đã tập trung vào bệnh Alzheimer, bệnh Parkinson, tăng cường học tập và trí nhớ, nhiễm độc thần kinh và các bệnh tâm thần khác như trầm cảm và lo âu và động kinh [51]

❖ Đối với tim mạch

Năm 2001, các nhà khoa học đã tiến hành một nghiên cứu chứng minh công dụng của rau má đối với những người bị các bệnh liên quan đến tĩnh mạch [52] Người bệnh được cho dùng giả dược hay rau má và được theo dõi trong 4 tuần Kết quả cho thấy, các triệu chứng như chuột rút, đau nhức, mệt mỏi, sưng, phù chân giảm rõ rệt ở những đối tượng uống rau má Ngoài ra, các nhà nghiên cứu cũng ghi nhận rằng dùng rau má khoảng 180 mg một ngày có hiệu quả trong việc giảm các triệu chứng liên quan đến cao huyết áp

Vì rau má có vị hơi đắng nên khi bổ sung mật nhân vào sản phẩm nước rau má thì

có thể giảm được vị đắng của mật nhân Rau má cũng có nhiều hoạt tính sinh học đáng quý đối với sức khỏe con người, đồng thời trên thị trường hiện nay sản phẩm nước ép

từ rau củ cũng chưa phổ biến nên việc nghiên cứu sản phẩm từ rau má bổ sung mật nhân

là phù hợp với nhu cầu của người tiêu dùng

1.5 Tổng quan về các nghiên cứu trong và ngoài nước

1.5.1 Các nghiên cứu trong nước

Năm 2007, nhóm tác giả Trần Anh Tuấn, Trần Thị Thu Hương, Trần Hồng Quang, Nguyễn Tiến Hùng, Phan Văn Kiệm và Châu Văn Minh đã nghiên cứu thành phần hoá học cây mật nhân và đã cô lập được 6 hợp chất là: 9-hydroxycanthin- 6-on, 13,18-dihydroeurycomanon, kaempferol-3-0-α-rhamnpyrannoisid, eurycomanon, eurylen, 9-methoxylcanthin-6-on [53]

Năm 2015, nhóm tác giả Trương Thị Minh Hạnh và Trần Ý Đoan Trang đã nghiên

cứu thành phần hóa học, hoạt tính sinh học của dịch chiết rễ cây mật nhân (Eurycoma

longifolia) ở Thừa Thiên Huế bằng phương pháp sắc kỷ lỏng ghép khối phổ LC-MS đã

tìm thấy một số thành phần hóa học của dịch chiết mật nhân có khả năng chống khối u, chống ung thư, chống sốt rét và có hoạt tính tăng cường sinh lý ở nam giới Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng dịch chiết nước từ rễ cây mật nhân không có hoạt tính kháng oxi hoá,

không có khả năng kháng E coli và St aureous, nhưng đảm bảo tính an toàn thực phẩm

và từ đó ứng dụng sản xuất cà phê mật nhân [19]

Năm 2016, nhóm tác giả Trần Thu Trang, Phạm Bích Ngọc, Chu Nhật Huy, Hoàng Thị Thu Hằng, Nguyễn Trung Nam và Chu Hoàng Hà đã tiến hành khảo sát một số hoạt

tính sinh học trong cao chiết methanol từ rễ tơ và rễ tự nhiên cây bá bệnh (Eurycoma

longifolia) Kết quả cho thấy cao chiết methanol từ rễ tơ và rễ tự nhiên có hoạt tính gây

độc tế bào ung thư ở mức trung bình trên các dòng tế bào HepG2, LU-1, MCF-7 [54] Năm 2016, nhóm tác giả Võ Châu Tuấn, Trần Quang Dần và Bùi Thị Thơ đã khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng lên sự cảm ứng và tăng sinh khối tế bào callus của cây mật nhân Kết quả cho thấy, môi trường MS bổ sung 2,0 mg/l 2,4-D và 0,5 mg/ml Kinetin là thích hợp nhất để cảm ứng callus từ rễ của cây mật nhân in vitro sau khoảng 12-14 ngày nuôi cấy Sự tích lũy sinh khối tế bào callus tốt nhất, đạt 32,03g/ 50ml tươi tương ứng với 3,6g/50ml khô trên môi trường MS lỏng bổ sung 1,5 mg/l NAA sau 14 ngày nuôi cấy, cao gấp 10 lần so với lượng sinh khối ban đầu (3g/50ml) Dịch chiết ethanol thô từ sinh khối tế bào callus nuôi cấy huyền phù đã cho thấy khả

nǎng ức chế sự sinh trưởng của vi khuẩn Bacillus cereus ở nồng độ 100 mg/ml, với

đường kính vòng vô khuẩn đạt 32,1 mm [55]

Năm 2017, một nghiên cứu khác đã khảo sát quá trình chiết rễ cây mật nhân

(Eurycoma longifolia) ở Quảng Nam, Gia Lai bằng phương pháp soxhlet và định danh

các cấu tử trong dịch chiết bằng phương pháp GC-MS, kết quả khảo sát hai phương pháp ngâm lắc và chiết soxhlet cho thấy phương pháp chiết soxhlet cho hiệu suất chiết cao hơn Tiếp tục khảo sát quá trình chiết soxhlet với 3 dung môi methanol, ethanol, etyl axetat đã chọn dung môi ethanol 80% là dung môi phù hợp Kết quả quy hoạch thực nghiệm và tối ưu hóa trên dịch chiết ethanol với hai yếu tố: tỉ lệ dung môi/nguyên liệu

và thời gian chiết cho thấy điều kiện chiết tốt nhất là tỉ lệ dung môi/nguyên liệu (ml/g) 10/1, thời gian chiết 14 giờ [34]

Năm 2018, tác giả Đoàn Mạnh Dũng và cộng sự đã phân lập và xác định hàm lượng

Eurycomanone trong cây mật nhân (Eurycoma longifolia J.) bằng sắc ký lỏng ghép nối

khối phổ (LC-MS/MS) Bằng các phương pháp sắc ký, nhóm tác giả đã phân lập được

hợp chất eurycomanone từ cây mật nhân (E longifolia J.) Cấu trúc của hợp chất này

được xác định bằng các phương pháp phổ 1H-NMR, 13C-NMR và ESI-MS Hợp chất này được tinh sạch (độ tinh khiết trên 99,5%) bằng hệ thống sắc ký lỏng điều chế và được sử dụng để làm chất chuẩn để phân tích hàm lượng eurycomanone trong các mẫu dược liệu mật nhân bằng sắc ký lỏng ghép nối khối phổ (LC-MS/MS) Nhóm tác giả cũng đã xây dựng được chương trình sắc ký sử dụng hệ thống LC-MS/MS Kết quả cho thấy hàm lượng eurycomanone cao nhất khi thu hái ở Bắc Giang (3,1336 ± 0,0005 mg/g), thấp nhất ở Đắk Nông (0,1716 ± 0,0001 mg/g) [56]

Năm 2018, nhóm tác giả Lê Thanh Liêm, Đào Thị Thanh Hiền và cộng sự [9] đã

khảo sát hoạt tính kháng viêm in vitro các hợp chất alkaloid từ rễ cây bá bệnh (Eurycoma

longifolia Jack) được thu hái tại Kỳ Sơn, Nghệ An Từ cặn chiết giàu alkaloid của rễ cây

bá bệnh, đã phân lập và xác định được bốn hợp chất alkaloid thuộc khung canthin-6-on gồm có: 9-hydroxycathin-6-on (1), 9-metoxycanthin-6-on (2), 9,10 dimetoxycanthin-6-

on (3) và 5-metoxycanthin-6-on (4) Đây là lần đầu tiên các alkaloid (3) và (4) được phân lập từ rễ bá bệnh tự nhiên ở Việt Nam Hợp chất (3) thể hiện hoạt tính kháng viêm thông qua hoạt động ức chế sản sinh NO trên dòng tế bào đại thực bào chuột RAW264.7

1.5.2 Các nghiên cứu ngoài nước

Từ những năm 1950-1990, cây mật nhân đã bắt đầu được nghiên cứu trên thế giới

về thành phần hóa học và một số tác dụng dược lý của nó như: tăng cường sinh lực hay phòng chống sốt rét, tuy nhiên những nghiên cứu này vẫn còn đơn giản và mang tính tổng quát, chưa được đặc biệt chú trọng

Những năm sau đó, có hàng trăm công trình khoa học trên thế giới đã nghiên cứu

về cây mật nhân, các nghiên cứu về cách phân lập các chất có trong rễ mật nhân cũng như là hoạt động của dịch chiết mật nhân đối với khả năng kháng khuẩn, kháng oxi hóa, chống ung thư cũng như là cải thiện sức khỏe tình dục ở nam giới

Tác giả Ping C.Kuo và cộng sự (2004)đã định danh được khoảng 65 hợp chất từ rễ cây mật nhân có tiềm năng kháng sốt rét, kháng khối u, gây độc tế bào và kháng HIV trên các thử nghiệm in vitro [5] Theo công bố của Kardono (2010) [57], Thu Hnin E (2018) [6], Chunxin Zou (2018) [7] và các cộng sự của mình đã kết luận rằng: các chất

có trong dịch chiết của rễ cây Eurycoma longifolia, đã thể hiện được hiệu quả trong việc

chống ung thư biểu mô phổi (tế bào A-549) và ung thư vú (tế bào MCF-7), ung thư dạ

dày (tế bào MGC-803), ung thư biểu mô đường ruột (tế bào HT-29), có tiềm năng hoạt động ức chế ung thư gan

Pei-Jean Lim, Chye-Sheng Gan, Ashril Yusof (2019) đã nghiên cứu tác dụng hạ

lipid của chiết xuất rễ cây Eurycoma longifolia Jack trong tế bào gan, kết quả là dịch

chiết rễ mật nhân đã làm giảm axit béo nội bào tích tụ trong gan tới ~ 72% trên các tế bào được điều trị khi so sánh với các tế bào đối chứng không được điều trị [58]

Shahira M Ezzat và cộng sự (2019) đã nghiên cứu tác dụng của dịch chiết mật nhân đến tác dụng kích thích sinh dục ở chuột, kết quả cho thấy nó đã làm giảm đáng kể việc xuất tinh muộn, tăng chỉ số cương dương vật, tăng tổng trọng lượng cơ thể và trọng lượng tương đối của túi tinh và tuyến tiền liệt [59] Putri Ayu Jayusman (2018) công bố

rằng chiết xuất Eurycoma longifolia giàu quassinoid có hiệu quả trong việc làm giảm sự

suy giảm của xương trong mô hình chuột bị thiếu xương do androgen [60]

Năm 2019, nhóm nghiên cứu của A George đã sử dụng chiết xuất tiêu chuẩn của

Eurycoma longifolia (EL) để được thử nghiệm về hoạt tính chống virut sau khi hấp thụ

virus ở dòng tế bào Vero Năng suất virus được đo bằng qRT-PCR trong bốn loại huyết thanh của virus sốt xuất huyết Hoạt động chống vi-rút được nghiên cứu thêm trên mô hình chuột in vivo AG129 được cho ăn 100 mg/kg chiết xuất EL hai lần mỗi ngày Sự nhân lên của virus sốt xuất huyết (DENV) giảm đáng kể và tiểu cầu cao hơn Từ đó cho

thấy chiết xuất của Eurycoma longifolia có khả năng chống sốt xuất huyết với việc cải

thiện số lượng tiểu cầu [61]

Từ những thống kê trên cho chúng ta thấy rằng: trên thế giới các nghiên cứu về mật nhân rất đa dạng, phong phú và được quan tâm rộng rãi, có rất nhiều phương pháp chiết

rễ mật nhân khác nhau, nhiều hoạt tính sinh học có giá trị đã được tìm thấy Ở Việt Nam, nghiên cứu chiết tách dịch chiết mật nhân đã được chú ý nhiều hơn nhưng vẫn còn rất hạn chế Đa phần là nghiên cứu phân lập các chất có mặt trong dịch chiết của rễ mật nhân và một số hoạt tính sinh học của nó, mật nhân chỉ mới được sử dụng trong các bài thuốc cổ truyền, công nghệ chiết xuất và ứng dụng các chiết xuất của nó chưa được phổ biến rộng rãi Vì vậy, nghiên cứu tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết rễ

mật nhân (Eurycoma longifolia Jack) bằng phương pháp chưng ninh trong dung môi

ethanol và ứng dụng sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe là phù hợp với thực trạng của ngành công nghiệp thực phẩm Việt Nam hiện nay Nội dung nghiên cứu bao gồm những phần sau: khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chưng ninh rễ mật nhân trong dung môi ethanol bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm; tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết rễ mật nhân bằng phương pháp chưng ninh trong dung môi ethanol; sản xuất bột chiết mật nhân để ứng dụng vào công nghệ thực phẩm; ứng dụng sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe - “nước rau má mật nhân”

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Mật nhân

+ Rễ mật nhân (mật nhân - tên khoa học là Eurycoma longifolia Jack) có nguồn gốc

ở huyện Ia-Grai, tỉnh Gia Lai Nguyên liệu được thu mua và tập trung sau đó được chuyển về phòng thí nghiệm của Đại học Bách Khoa Đà Nẵng

+ Rễ mật nhân sau khi đem về phòng thí nghiệm được xử lý như sau:

- Rễ mật nhân được rửa sạch để loại bỏ tạp chất, bụi bẩn sau đó phơi khô tự nhiên

- Chẻ nhỏ rễ mật nhân thành lát mỏng và sấy ở nhiệt độ 50 oC trong khoảng 48h

- Xay nhỏ đến kích cỡ 0,5 - 1cm, rồi cho vào túi nilon để bảo quản ở điều kiện thường

Hình 2.1: Rễ mật nhân đã xử lý Bảng 2.1: Thành phần hóa học của rễ mật nhân ở huyệnIa-Grai, tỉnh Gia Lai [34]

Dựa vào số liệu ở bảng 2.1 chúng ta có thể kết luận rằng, rễ mật nhân ở huyện Grai, tỉnh Gia Lai đạt các chỉ tiêu về an toàn thực phẩm, không chứa các kim loại nặng độc hại, có thể sử dụng để bổ sung vào thực phẩm

Ia-2.1.2 Lá rau má

Sử dụng lá rau má tươi, lá rau má được mua ở hệ thống siêu thị Vinmart+, khu vực Hòa Khánh, Đà Nẵng Chọn lá rau má vừa mới hái, còn tươi, màu xanh lá cây nhạt đến đậm, không bị héo úa, dập nát hay bị sâu bọ

Hình 2.2: Rau má

2.2 Hóa chất, dụng cụ và thiết bị thí nghiệm

2.2.1 Hóa chất

+ Ethanol 96o - cồn thực phẩm (Phúc Đạt, Việt Nam);

+ Maltodextrin (Trung Quốc);

+ Đường tinh luyện (Vinmart Good, Việt Nam);

Các thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu này:

+ Hệ thống chưng ninh hồi lưu: gồm bình cầu, bếp cách thủy, ống sinh hàn;

+ Chiết quang kế cầm tay (Atago, Nhật);

+ Cân điện tử (Ohaus, Mỹ);

+ Cân phân tích (Marcus, Đức);

+ Bể ổn định nhiệt (Wisd, Trung Quốc);

+ Tủ sấy (Memmert, Đức);

+ Thiết bị cô quay chân không (Heidolph, Đức);

+ Máy xay sinh tố (Sunhouse, Trung Quốc);

+ Bếp điện (HP-2100, Trung Quốc);

+ Thiết bị lọc hút chân không;

Các thiết bị và dụng cụ có liên quan trong quá trình nghiên cứu được liệt kê ở trên được sử dụng tại Phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ Thực phẩm của trường Đại học Bách Khoa - Đại học Đà Nẵng, trường Đại học Sư Phạm – Đại học Đà Nẵng, Viện Công nghệ Sinh học, Đại học Huế

2.3 Phương pháp nghiên cứu

Tiến hành: được trình bày tại phụ lục 1

Tính kết quả: độ ẩm (hàm lượng nước) của thực phẩm được tính theo công thức như sau:

1 2 1

+ X: độ ẩm (hàm lượng nước) của thực phẩm (%);

+ G1: khối lượng cốc sấy và mẫu thử trước sấy (g);

+ G2: khối lượng cốc sấy và mẫu thử sau sấy (g);

+ G: khối lượng cốc sấy (g)

2.3.1.2 Phương pháp xác định hàm lượng tro

Hàm lượng tro trong nguyên liệu và nước rau má mật mật nhân được xác định bằng phương pháp nung sử dụng thiết bị lò nung (Barnstead Thermolyne 48000 Furnace, Mỹ) [62]

Nguyên tắc: dùng sức nóng (550 ÷ 600 oC) nung nóng hoàn toàn các chất hữu cơ, phần còn lại đem cân và tính ra hàm lượng tro toàn phần trong thực phẩm

Tiến hành: được trình bày tại phụ lục 1

Tính kết quả: hàm lượng tro toàn phần theo phần trăm tính bằng công thức:

1 2 1

+ G1: khối lượng cốc nung và mẫu (g);

+ G: khối lượng cốc nung (g);

+ G2: khối lượng cốc nung và tro trắng (g)

2.3.2 Phương pháp phân tích hóa lý

Tiến hành: được trình bày tại phụ lục 1

2.3.2.2 Phương pháp xác định nồng độ chất khô hòa tan

Nồng độ chất khô hòa tan của dịch nước rau má được xác định bằng Brix cầm tay (Atago, Nhật)

Nguyên tắc: hàm lượng chất khô hòa tan của dịch được đo trực tiếp Brix kế cầm tay

có giới hạn Brix 0 – 32% theo TCVN 7771:2007

Tiến hành: được trình bày tại phụ lục 1

Tính kết quả: nếu dịch đo ở 20 oC thì kết quả hiển thị trên Brix kế chính là hàm lượng chất khô của dịch Nếu dịch đo ở nhiệt độ khác 20 oC thì kết quả đo phải được hiệu chỉnh về nhiệt độ 20 oC

2.3.3 Phương pháp phân tích hóa học

2.3.3.1 Phương pháp xác định hàm lượng kim loại nặng

Hàm lượng kim loại nặng của nước rau má mật nhân được xác định bằng phương pháp ASS, đo bằng máy đo quang phổ hấp phụ nguyên tử ASS- NovAA (Analytik Jen, Đức) [62]

Nguyên tắc: phương pháp ASS dựa trên nguyên tắc, tất cả các nguyên tố khi ở trạng thái nguyên tử đều được hấp thụ bởi một bước sóng nhất định, cường độ hấp thụ thể hiện nồng độ của các nguyên tố đó trong mẫu Khi chiếu một chùm tia sáng có bước sóng xác định vào đám hơi nguyên tử thì các nguyên tử tự do sẽ hấp thụ các bức xạ có bước sóng tương ứng với những tia bức xạ mà nó phát ra được trong quá trình phát xạ Phương pháp này áp dụng với một số nguyên tố có khả năng nguyên tử hóa như Hg, As,

Cd, Pb

Tiến hành: được trình bày tại phụ lục 1

2.3.4 Phương pháp vi sinh

2.3.4.1 Xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí

Nguyên tắc: phương pháp này sử dụng các đĩa cấy chứa môi trường dinh dưỡng khô

và chất tạo đông tan được trong nước lạnh Cho các dung dịch huyền phù mẫu thử chưa pha loãng hoặc đã pha loãng vào các đĩa với lượng 1 ml mỗi đĩa Dàn đều dung dịch

huyền phù trên diện tích khoảng 20 cm2 Chất tạo đông có trong thành phần của đĩa sẽ làm môi trường dinh dưỡng trong đĩa đông lại Đĩa được ủ ấm ở 35 oC ± 1 oC trong 48

± 3 h rồi đếm khuẩn lạc [64]

Tiến hành thí nghiệm: tiến hành thí nghiệm theo tiêu chuẩn quốc gia TCVN 4884:2015 [64]

Kết quả thí nghiệm: số lượng vi sinh vật hiếu khí được tính theo công thức sau:

N(CFU / g hay CFU / ml) =

) 1

1

(n vd n i vd i

C

++

+ ni: số hộp petri cấy tại độ pha loãng thứ I;

+ di: hệ số pha loãng tương ứng;

+ v: thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào trong mỗi đĩa

2.3.4.3 Các phương pháp xác định vi sinh vật khác

Xác định các chỉ tiêu Coliforms, Staphylococcus aureus, Escherichia coli,

Clostridium perfringens, tổng số bào tử nấm men - mốc, Streptococci faecal, Pseudomonas aeruginosa theo TCVN 6848:2007(A), TCVN 4830-1:2005(A), TCVN

7924-2:2008(A), TCVN 4991:2005(A), TCVN 8275-1:2010(A), KT2.K2.TN-06/VS, KT2.K2.TN-05/VS

2.3.5 Phương pháp khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết rễ mật nhân bằng phương pháp chưng ninh trong dung môi ethanol

Quá trình chưng ninh hồi lưu rễ mật nhân được thực hiện như sơ đồ hình 2.3

Để nghiên cứu ảnh hưởng tương tác giữa các yếu tố công nghệ đến hiệu suất chiết của quá trình chiết rễ mật nhân bằng phương pháp chưng ninh trong dung môi ethanol,

ở đây tôi chọn phương pháp quy hoạch thực nghiệm trực giao cấp 1 - 2 mức với 3 yếu

tố ảnh hưởng Đây là một phương pháp đơn giản, ít thí nghiệm và được sử dụng khá phổ biến trong nghiên cứu về công nghệ thực phẩm

Phương trình hồi quy có dạng:

Y = b0 + b1x1 + b2x2 + b3x3+ b12x1x2 + b23x2x3+ b13x1x3+b123x1x2x3 (2.1) [65] Trong đó: - x1 : nhiệt độ chiết (oC);

- x2: tỉ lệ dung môi/ nguyên liệu (ml/g)

- x3: thời gian chiết (giờ);