Nghiên cứu phân lập, tuyển chọn nấm men ở một số loại trái cây để sử dụng trong quá trình lên men rượu vang từ quả thanh trà

TÓM TẮT Tên đề tài: Nghiên cứu phân lập, tuyển chọn nấm men ở một số loại trái cây để sử dụng trong quá trình lên men rượu vang từ quả thanh trà.. Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Huyền

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

KHOA HÓA

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN NẤM MEN Ở MỘT

SỐ LOẠI TRÁI CÂY ĐỂ SỬ DỤNG TRONG QUÁ TRÌNH LÊN

MEN RƯỢU VANG TỪ QUẢ THANH TRÀ

Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Huyền Nhi

Số thẻ sinh viên: 107150164

Lớp: 15H2B

Đà Nẵng – Năm 2019

TÓM TẮT

Tên đề tài: Nghiên cứu phân lập, tuyển chọn nấm men ở một số loại trái cây để

sử dụng trong quá trình lên men rượu vang từ quả thanh trà

Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Huyền Nhi

MSSV: 107150164

Lớp: 15H2B

Nghiên cứu này nhằm tìm ra chủng nấm men có khả năng lên men rượu tốt nhất

để tạo ra một loại rượu vang từ dịch quả thanh trà không những có chất lượng tốt mà còn có hương thơm đặc trưng Từ một số loại quả như thanh trà, ổi, mận, cóc, dứa, cà chua đã phân lập được 6 chủng nấm men Các chủng nấm men sau khi phân lập được kiểm tra khả năng lên men các loại đường glucose, fructose, saccharose dựa trên lượng khí CO2 sinh ra trong quá trình lên men rượu Kết quả thử hoạt tính với 3 loại đường cho thấy chủng M cho hoạt lực lên men tốt nhất Sau khảo sát lượng giống và độ Bx thì tỷ lệ giống nấm men là 2% và độ Bx là 230 cần thiết cho quá trình lên men để dịch lên men từ quả thanh trà có độ rượu đạt giá trị cực đại là 17% Nghiên cứu cũng cho thấy rằng các thành phần của quả thanh trà phù hợp cho quá trình lên men rượu với hàm lượng nước chiếm 89.49% và lượng đường tổng chiếm 7.08% Kết quả nghiên cứu của đề tài đưa ra được quy trình lên men rượu vang thanh trà cho chất lượng cồn

và cảm quan tốt thông qua việc tuyển chọn giống nấm men, kiểm soát tỷ lệ nấm men

và hàm lượng đường

Nội dung đồ án tốt nghiệp gồm 4 chương:

Chương 1 Tổng quan tài liệu

Chương 2 Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương 3 Kết quả và thảo luận

Chương 4 Kết luận và kiến nghị

1 Tên đề tài đồ án: Nghiên cứu phân lập, tuyển chọn nấm men ở một số loại trái

cây để sử dụng trong quá trình lên men rượu vang từ quả thanh trà

2 Đề tài thuộc diện: ☐ Có ký kết thỏa thuận sở hữu trí tuệ đối với kết quả thực

hiện

3 Các số liệu và dữ liệu ban đầu:

4 Nội dung các phần thuyết minh và tính toán:

- Mở đầu

- Chương 1 Tổng quan tài liệu

- Chương 2 Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

- Chương3 Kết quả và thảo luận

- Chương 4 Kết luận và kiến nghị

- Tài liệu tham khảo

- Phụ lục

5 Các bản vẽ, đồ thị ( ghi rõ các loại và kích thước bản vẽ ): Không

6 Họ tên người hướng dẫn: TS Nguyễn Thị Đông Phương

7 Ngày giao nhiệm vụ đồ án:

8 Ngày hoàn thành đồ án:

Đà Nẵng, ngày tháng năm 2019

Trưởng bộ môn Người hướng dẫn

PGS.TS Đặng Minh Nhật TS Nguyễn Thị Đông Phương

LỜI NÓI ĐẦU

Sau gần 5 tháng thực hiện đề tài “Nghiên cứu phân lập, tuyển chọn nấm men ở

một số loại trái cây để sử dụng trong quá trình lên men rượu vang từ quả thanh trà”,

với sự hướng dẫn của cô Nguyễn Thị Đông Phương, tôi đã hoàn thành xong đồ án tốt nghiệp của mình

Để đạt kết quả như vậy, tôi xin gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô khoa Hóa trường Đại học Bách Khoa – Đại học Đà Nẵng nói chung, Bộ môn Công nghệ thực phẩm nói riêng đã truyền đạt cho tôi kiến thức trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu Đó là hành trang quý báu giúp tôi không chỉ thực hiện tốt đề tài tốt nghiệp mà còn giúp tôi tự tin vững bước trên con đường sự nghiệp sắp tới

Bên cạnh đó, tôi xin gửi lời biết ơn sâu sắc đên cô Nguyễn Thị Đông Phương,

cô đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, khích lệ và động viên tôi trong suốt thời gian làm đề tài Nhờ những kiến thức cô truyền đạt, hướng dẫn đã giúp tôi tránh khỏi rất nhiều bỡ ngỡ trong quá trình thực hiện để làm đề tài

Đồng thời, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô phòng thí nghiệm khoa Hóa trường Đại học Bách khoa Đà Nẵng đã tạo điều kiện cho tôi về trang thiết bị, phòng thí nghiệm, giúp tôi hoàn thành đề tài thuận lợi và đúng tiến độ

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô trong hội đồng bảo vệ tốt nghiệp đã dành thời gian quý báu của mình để đọc và nhận xét đồ án của tôi

Đà Nẵng, ngày 30 tháng 05 năm 2018

Nguyễn Thị Huyền Nhi

CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu sử dụng phân tích trong luận văn có nguồn gốc rõ ràng, đã công bố theo đúng quy định Các kết quả nghiên cứu trong đồ án do tôi tự thực hiện, phân tích một cách trung thực, khách quan và phù hợp với thực tiễn của Việt Nam Các kết quả này chưa từng được công bố trong bất kỳ nghiên cứu nào khác

Sinh viên thực

Nguyễn Thị Huyền Nhi

MỤC LỤC

TÓM TẮT i

NHIỆM VỤ ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP .iii

LỜI NÓI ĐẦU iv

CAM ĐOAN v

MỤC LỤC .Error! Bookmark not defined DANH SÁCH CÁC BẢNG, HÌNH VẼ ix

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN VỀ TÀI LIỆU 3

1.1 Thanh trà 3

1.1.1 Giới thiệu 3

1.1.2 Thành phần hóa học 4

1.1.3 Công dụng của thanh trà 4

1.2 Rượu vang quả 5

1.1.1 Phân loại rượu vang 6

1.2.1 Thành phần và giá trị dinh dưỡng của rượu vang 8

1.2.2 Công dụng của rượu vang 9

1.3 Nấm men 10

1.3.1 Đặc điểm 10

1.3.2 Hình thái và kích thước 10

1.3.3 Một số loại nấm men thường dùng trong rượu vang 11

1.3.4 Ảnh hưởng của những yếu tố lý, hóa lên hoạt động của nấm men vang 12

1.1.4 Tình hình nghiên cứu sản xuất rượu vang trên thế giới và tại Việt Nam 13

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1 Đối tượng 15

2.1.1 Nguồn phân lập nấm men 15

2.1.2 Quả thanh trà (Citrus grandis Osbeck) 15

2.2 Môi trường, hóa chất, dụng cụ và thiết bị 15

2.2.1 Môi trường và hóa chất 15

2.2.2 Dụng cụ và thiết bị 16

2.3 Phương pháp xác định thành phần của quả thanh trà 16

2.3.1 Xác định hàm lượng nước 16

2.3.2 Xác định hàm lượng axit toàn phần 17

2.3.3 Xác định hàm lượng vitamin C 18

2.3.4 Xác định hàm lượng đường tổng và đường khử 18

2.4 Phương pháp nghiên cứu 20

2.4.1 Phân lập nấm men từ các nguồn khác nhau 20

2.4.2 Quan sát hình thái tế bào nấm men dưới kính hiểm vi 21

2.4.3 Tuyển chọn nấm men có khả năng lên men rượu mạnh 21

2.5 Phương pháp lên men rượu 21

2.5.1 Phương pháp lấy mẫu 21

2.5.2 Khảo sát quá trình lên men rượu 22

2.5.3 Lên men với tỷ lệ giống và Bx sau khảo sát 22

2.5.4 Phương pháp xác định độ cồn 24

2.5.5 Đánh giá chất lượng cảm quan thành phẩm 24

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 26

3.1.2 Hàm lượng axit toàn phần 26

3.1.3 Hàm lượng vitamin C 27

3.2 Phân lập và tuyển chọn nấm men có khả năng lên men rượu mạnh 29

3.2.1 Phân lập nấm men từ 6 loại vỏ khác nhau 29

3.1.2 Tuyển chọn nấm men có khả năng lên men rượu mạnh 31

3.3 Khảo sát quá trình lên men rượu 40

3.3.1 Khảo sát lượng giống thích hợp cho quá trình lên men 40

3.3.2 Khảo sát hàm lượng Bx thích hợp cho quá trình lên men 41

3.4 So sánh khả năng lên men rượu thanh trà của chủng nấm men phân lập được với

mẫu bánh men có trên thị trường 43

3.6 Kiểm tra sản phẩm rượu 43

3.7 Kết quả đánh giá chất lượng cảm quan sản phẩm rượu vang thanh trà 44

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45

4.1 Kết luận 45

4.2 Kiến nghị 45

TÀI LIỆU THAM KHẢO 46

PHỤ LỤC 1

DANH SÁCH CÁC BẢNG, HÌNH VẼ

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 1 1 Thành phần hóa học của mỗi quả thanh trà ở các vùng 4

Bảng 1 2 Thành phần vitamin của nước nho tươi và của rượu vang nho (Theo Lafon-Lafourcade, 1975) 9

Bảng 3 1 Hàm lượng nước trong múi thanh trà 26

Bảng 3 2 Hàm lượng axit toàn phần 27

Bảng 3 3 Hàm lượng vitamin C trong múi thanh trà 27

Bảng 3 4 Hàm lượng đường khử và đường tổng trong múi thanh trà 28

Bảng 3 5 Bảng tổng kết thành phần 28

Bảng 3 6 Chiều cao cột khí CO2 (cm) trong ống durham của các loại nấm men được phân lập trong môi trường chứa đường glucose 32

Bảng 3 7 Chiều cao cột khí CO2 (cm) trong ống durham của các loại nấm men được phân lập trong môi trường chứa đường fructose 32

Bảng 3 8 Chiều cao cột khí CO2 (cm) trong ống durham của các loại nấm men được phân lập trong môi trường chứa đường sacarose 33

Bảng 3 9 Khảo sát lượng giống nấm men trong quá trình lên men rượu 41

Bảng 3 10 Khảo sát hàm lượng Bx cho quá trình lên men 42

Bảng 3 11 So sánh khả năng lên men rượu của chủng TT phân lập được và mẫu bánh men rượu thị trường 43

Bảng 3 12 Chỉ tiêu rượu thành phẩm 44

Bảng 3 13 Điểm đánh giá cảm quan thị hiếu người tiêu dùng 44

DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 1 1 Lễ hội “Thanh trà - Hương vị xứ Huế” 4

Hình 1 2 Rượu vang phân loại theo màu sắc 7

Hình 1 3 Hình thái của một số loài nấm men 11

Hình 2 1 Quả thanh trà re 15

Hình 2 2 Quy trình lên men rượu thanh trà 25

Hình 3 1 Các chủng nghi ngờ là nấm men 30

Hình 3 2 Các chủng nấm men thuần 30

Hình 3 3 Tế bào nấm men quan sát ở vật kính( x40 ) 31

Hình 3 4 Quan sát ống durham sau 6 giờ lên men 34

Hình 3 5 Quan sát ống durham sau 12 giờ lên men 35

Hình 3 6 Quan sát ống durham sau 18 giờ lên men 36

Hình 3 7 Quan sát ống durham sau 24 giờ lên men 37

Hình 3 8 Quan sát ống durham sau 30 giờ lên men 38

Hình 3 9 Quan sát ống durham sau 36 giờ lên men 38

Hình 3 10 Quan sát ống durham sau 42 giờ lên men 39

Hình 3 11 Quan sát ống durham sau 48 giờ lên men 39

Hình 3 12 Quan sát ống durham sau 54 giờ và 60 giờ lên men 40

MỞ ĐẦU

Hiện nay, nhu cầu sử dụng rượu vang ngày càng tăng, tuy nhiên rượu vang hiện tại chỉ được tạo ra chủ yếu từ quả nho hoặc một số loại quả khác như: dâu tây, táo, mận Chính vì vậy, nhu cầu tạo ra sản phẩm rượu vang mới là rất lớn để đáp ứng được nhu cầu thị hiếu

Thanh trà là sản phẩm đặc sản của địa phương Thường ra quả vào tháng 5 và

cứ vào độ tháng 7, 8 là mùa thanh trà chín đẹp Mùa thu hoạch thanh trà kéo dài khoảng 2 tháng và chỉ có duy nhất một mùa trong năm [38] Thanh trà thơm ngon đặc biệt, hương vị ngọt thanh, giữ lại rất lâu trong miệng sau khi thưởng thức Thanh trà không chỉ thơm ở những múi ruột của trái, mà thơm từ vỏ, từ lá Ngoài được ăn tươi như một thứ quả giải khát Thanh trà còn được người Huế dùng làm gỏi mực khô, gỏi tôm, [39] Việc tạo ra sản phẩm rượu vang từ quả thanh trà hiện nay vẫn chưa được nghiên cứu

Những nghiên cứu trong và ngoài nước còn cho thấy việc phân lập nấm men từ các loại quả tạo ra các chủng nấm men có hoạt lực lên men mạnh cho độ cồn cao và mùi hương tốt hơn so với nấm men thị trường Năm 2011, Paola Domizio và cộng sự

đã nghiên cứu kết hợp giữa 55 loại nấm men thuộc chi Hanseniaspora, Pichia,

Saccharomycodes và Zygosaccharomyces từ bộ sưu tập nuôi cấy nấm men của Khoa

Công nghệ sinh học nông nghiệp (Đại học của Florence, Ý) để xác định tỷ lệ giống thích hợp khi bổ sung vào quá trình lên men [27] Năm 2018, Nguyễn Thị Niềm và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu phân lập, tuyển chọn nấm men có hoạt tính lên men cao từ quả cà na [1]

Qua những thực tế trên, tôi đã tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu phân lập,

tuyển chọn nấm men ở một số loại trái cây để sử dụng trong quá trình lên men rượu vang từ quả thanh trà” Với mục đích tạo sản phẩm mới có nồng độ cồn cao và mùi

hương đặc trưng, tăng thêm thu nhập và có thể quảng bá được đặc sản của địa phương

Mục tiêu nghiên cứu:

Xác định thành phần hóa học của múi thanh trà

Phân lập, tuyển chọn được chủng nấm men có hoạt hoạt lực lên men mạnh từ các loại vỏ của 6 loại trái cây như thanh trà, cóc, ổi, mận, dứa, cà chua

Chọn được điều kiện lên men thích hợp để thực hiện quá trình lên men tạo độ cồn cao và chất lượng tốt

Đối tượng, phạm vi nghiên cứu:

Sản phẩm rượu vang thanh trà được sản xuất từ quả thanh trà thu mua tại làng Lại Bằng, Hương Vân, Hương Trà, Thừa Thiên Huế Nấm men được phân lập từ vỏ các loại quả: thanh trà, dứa, cóc, mận, ổi, cà chua

Các nghiên cứu được thực hiện tại các địa điểm như sau: Phòng thí nghiệm xưởng Công nghệ Thực phẩm, phòng thực hành thí nghiệm cảm quan, phòng thí nghiệm vi sinh thực phẩm, Khoa Hóa, Trường Đại Học Bách Khoa Đà Nẵng

Phương pháp nghiên cứu: Phương pháp hóa học, phương pháp vi sinh,

phương pháp đánh giá cảm quan, phương pháp xử lý số liệu: Excel

Cấu trúc của đồ án: gồm 4 chương

Chương 1 Tổng quan

Chương 2 Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN VỀ TÀI LIỆU

1.1 Thanh trà

1.1.1 Giới thiệu

Thanh trà là cây thuộc họ Cam quýt (Rutaceae) có tên khoa học là Citrus

grandis Osbeck Theo sử sách triều Nguyễn hơn 200 năm trước, trong nhiều của ngon

vật lạ tiến cung triều Nguyễn, cùng với gạo An Cựu, nhãn Kim Long, chè Tuần , thanh trà của làng Nguyệt Biều đã góp mặt như là đặc sản vườn nổi tiếng của vùng đất Phú Xuân [40]

Thanh trà được trồng ở các vùng đất phù sa do các sông Hương, sông Lâu bồi đắp, vì vậy mà có năng suất khá cao, hương vị lại thơm ngon Được trồng nhiều ở một

số huyện như Hương Trà, Phú Vang, Phong Điền, TP Huế,… [41]

Cây thanh trà trồng sau 5 năm sẽ cho quả bói, sang năm thứ sáu cho quả đại trà Theo các nhà vườn thì năm cho quả đầu tiên trung bình 40 đến 50 quả, các năm sau cho năng suất gấp hai đến ba lần Tuổi thọ tối thiểu của cây thanh trà từ 30 đến 40 năm Bình quân, mỗi ha thanh trà cho thu nhập từ 90 đến 100 triệu đồng, so với trồng lúa và hoa màu thì trồng thanh trà cho giá trị cao gấp hơn 5 lần Trong những năm qua, thanh trà đã trở thành cây xóa đói giảm nghèo, vươn lên làm giàu của hàng ngàn hộ nông dân ở Thừa Thiên Huế [39]

Nhìn bên ngoài trái thanh trà khác với các loại bưởi khác, thanh trà nhỏ hơn, có hình quả lê, đầu cuống không nhọn như bưởi Năm Roi, da màu vàng nắng chứ không xanh, từ trên cuống xuống tận cùng to dần lên rất hài hòa Đặc biệt, ruột quả thanh trà

và bưởi thì khác nhau, nhất là mùi vị Bưởi có nhiều màu ruột: đỏ, vàng, trắng Thanh trà thì chỉ có 1 màu là trắng vàng, tép dài và trong Bưởi ăn có vị chua ngọt, có quả hơi đắng, cũng ngon nhưng không ngon như thanh trà Thanh trà ăn vào cảm giác rất thanh

và ngon, ăn nhiều không có hậu đắng trong cổ họng như một số loại bưởi khác… Nhờ

ít nước nên thanh trà Huế có thể để dành ăn vài ba tháng, để càng lâu càng ngọt, mỗi năm chỉ một mùa

Hàng năm, ở Thừa Thiên Huế đều tổ chức lễ hội “Thanh trà - Hương vị xứ Huế”, lễ hội là dịp để người trồng thanh trà trên toàn tỉnh Thừa Thiên - Huế quảng bá đặc sản tiến vua đến du khách [42]

Năm 2014, tổ chức kỷ lục Việt Nam đã xác lập kỷ lục, đặc sản “Thanh trà” của tỉnh Thừa Thiên Huế được công nhận vào top 50 đặc sản trái cây nổi tiếng Việt Nam Được biết, thanh trà Huế là 1 trong 11 một đặc sản của Huế (gồm bún bò Huế, kẹo mè

xửng Thiên Hương, tôm chua và mắm ruốc ) được Tổ chức Kỷ lục châu Á trao bằng xác nhận Giá trị ẩm thực châu Á [39]

Hình 1 1 Lễ hội “Thanh trà - Hương vị xứ Huế” [42]

1.1.2 Thành phần hóa học

Bảng 1 1 Thành phần hóa học của mỗi quả thanh trà ở các vùng [2]

Quả thanh trà chứa hàm lượng vitamin C tương đối cao Ngoài ra, thanh trà còn

có một số thành phần khác như đường, axit hữu cơ, protein rất tốt cho sức khỏe của con người [2]

1.1.3 Công dụng của thanh trà

Về tác dụng đối với sức khỏe, đông y cho rằng mỗi bộ phận của quả Thanh trà đều có tác dụng riêng Cơm thanh trà có vị ngọt, tính mát, không độc, có tác dụng kiện

hóa đàm, trị ho, lý khí, giảm đau Ngoài ra, chúng có tác dụng hỗ trợ tiêu hóa và trị cảm cúm, có tác dụng bảo vệ thành mao mạch, giảm tính thấm, giúp cho mao mạch đàn hồi và bền vững hơn Từ đó giúp ngăn ngừa những tai biến do vỡ các mao mạch, gián tiếp giúp hạ huyết áp Một số người còn dùng vỏ ngoài quả Thanh trà xoa lên da đầu để kích thích lỗ chân lông phòng trị bệnh hói đầu hay rụng tóc Hạt thanh trà có vị đắng, tính ấm, chứa chất béo, có tác dụng trị đau thoát vị bẹn, sa đì Lá có vị đắng, the, mùi thơm, tính ấm, có tác dụng tán hàn, tán khí, thông kinh lạc, giải cảm, trừ đờm, tiêu thực, hoại huyết, tiêu sưng, tiêu viêm [39, 40]

Theo y học hiện đại, nước của trái thanh trà có chứa thành phần tựa như insulin giúp hạ đường huyết, có tác dụng hỗ trợ đối với bệnh nhân tiểu đường, cao huyết áp Kiểm chứng thực tế cho thấy ăn thanh trà đều đặn sẽ giúp giảm cân và phòng chống được tiểu đường Thanh trà cũng có công dụng làm giảm insulin làm cho cơ thể không cảm thấy đói vì lượng insulin cao sẽ kích thích vùng não gây cảm giác đói Riêng những bệnh nhân đang trong quá trình uống thuốc hạ huyết áp hay thuốc giảm đau, nếu ăn Thanh trà sẽ giúp làm tăng công dụng trị bệnh của thuốc [40]

1.2 Rượu vang quả

Rượu vang quả được dùng để chỉ loại rượu lên men từ dịch ép trái cây (nho, dâu, thơm, lê…) của một số chủng nấm men Rượu vang thu được không qua chưng cất, có hương vị thơm ngon của trái cây tự nhiên, có độ cồn nhẹ [3]

Rượu vang là một trong những thức uống được tiêu thụ mạnh nhất trên thế giới

và có lịch sử hàng nghìn năm Trước đây, rượu vang được coi là đồ uống sang trọng chỉ dùng cho những dịp đặc biệt, và chỉ phù hợp với các món ăn "kiểu Tây" Tuy nhiên nhiều năm trở lại đây, nhờ giao lưu văn hóa, ẩm thực và giao thương phát triển mà rượu vang ngày càng phổ biến trên thị trường Việt Nam Hiện nay, rượu vang không những trở thành một đồ uống không thể thiếu trong các bữa tiệc cưới, tiệc sinh nhật hay khai trương, mà còn được sử dụng hàng ngày để cải thiện sức khỏe, chữa bệnh hay làm đẹp Rượu vang cũng được bày bán ở nhiều nơi như siêu thị, cửa hàng tạp hóa hay các nhà hàng

Việt Nam từ năm 2010 trở lại đây gia tăng đều đặn, trung bình tăng 10%/năm Trong

đó, các nhãn rượu vang Pháp được nhập khẩu nhiều nhất, kế đến là rượu vang Chile, vang Ý, vang Tây Ban Nha và vang Mỹ, Năm 2012, rượu vang Pháp nhập khẩu chiếm 14.3% tổng lượng rượu nhập khẩu của nước ta Năm 2012, tổng giá trị rượu vang Chile xuất khẩu sang nước ta là 10 triệu USD [43]

Việt Nam thuộc khu vực nhiệt đới nên các loại cây ăn quả rất đa dạng và phong phú, thuận lợi cho việc sản xuất rượu vang trái cây Theo số liệu từ Hiệp hội Rượu bia

và Nước giải khát của Việt Nam, hiện nay trong nước có trên 15 doanh nghiệp chuyên

về sản xuất và đóng chai rượu vang, với sản lượng mỗi năm tăng khoảng 12-13 triệu lít Một số thương hiệu rượu vang ở nước ta: vang Đà Lạt, vang Thăng Long, vang Thành Long, vang Viết Nghi

Tuy nhiên, việc sản xuất rượu vang ở nước ta chỉ có quy mô nhỏ và chất lượng vẫn chưa có thể cạnh tranh với các loại rượu nhập khẩu trên thị trường [44] Do đó, thị trường rượu vang ở nước ta đã bị chiếm giữ bởi rượu vang nhập khẩu từ các nước khác

1.1.1 Phân loại rượu vang

Rượu vang ban đầu được làm chủ yếu từ nguyên liệu là quả nho dựa vào những tính chất khác nhau, có rất nhiều cách phân loại rượu vang

1.1.3.1 Dựa vào màu sắc

Rượu vang đỏ: Đây là loại vang được làm từ nho đen Hương vị của vang có thể dao động từ vị rất chát đến ngọt Một số loại nho thường được dùng để làm vang

đỏ nổi tiếng chính là: Merlot, Cabernet Sauvignon (loại nho đỏ được lai ghép giữ Cabernet Franc (dòng Bố) và Sauvignon Blanc (dòng Mẹ)), Cabernet Franc, Shyraz, Pinot Meunier, Pinot Noir, [45]

Rượu vang trắng: là loại vang phổ biến và đa dạng Vang trắng có nồng độ cồn nhẹ rất đặc trưng Hầu hết vang trắng đều được làm từ các giống nho trắng (hoặc nho xanh) khác nhau như Riesling, Sauvignon Blanc, Chardonnay,… Màu của rượu trắng không hoàn toàn là màu trắng mà còn có màu vàng, vàng rơm, v.v vì màu sắc của rượu trắng phụ thuộc vào màu của vỏ nho Một số dòng vang trắng mà người thưởng thức vang yêu thích phải ghi nhớ chính là: Chardonnay, Sauvignon Blanc, Chenin blanc, Muscat, Riesling, Viognier, Sémillon, [45, 46]

Rượu vang hồng: Loại vang này cũng được làm từ nho đen nhưng quả nho sẽ được làm sạch vỏ trước khi ủ thành rượu Tuy nhiên, cũng có thể là sản phẩm của việc pha trộn các loại vang trắng và vang đỏ Rượu vang hồng có tất cả các hương vị đặc trưng từ chát đến ngọt [46]

Hình 1 2 Rượu vang phân loại theo màu sắc [46]

1.1.3.2 Dựa vào hàm lượng CO 2

Vang không có gas bao gồm:

Vang phổ thông: hàm lượng cồn trong sản phẩm là do quá trình lên men tạo ra

và thường dao động trong khoảng 10-13% Dựa vào hàm lượng đường sót, người ta phân loại tiếp thành vang khô (không quá 0.3% đường), vang bán khô (1 - 3% đường), bán ngọt (5 - 8% đường)

Vang nặng: hàm lượng cồn trong sản phẩm lên tới 16 - 18% Một phần cồn trong sản phẩm là do quá trình lên men ethanol từ nước trái cây, một phần cồn được bổ sung vào dưới dạng cồn tinh luyện

Vang hương: sản phẩm này tương tự như rượu mùi với hàm lượng cồn 14 - 16% và có thể lên đến 25% [4]

Rượu vang phổ thông được đem đi bão hòa khí CO2

Rượu vang phổ thông được bổ sung syrup và cấy giống nấm men để len men lần hai

Ngoài ra, rượu vang còn được phân loại theo quá trình lên men: rượu vang tự nhiên, rượu vang cao độ Phân loại theo nơi sản xuất: rượu vang Pháp, rượu vang Úc, rượu vang Tây Ban Nha [4]

Ngày nay, cùng với sự tiến bộ của con người và sự phát triển của khoa học kỹ thuật con người dần dần nghiên cứu tạo ra các sản phẩm rượu vang từ các loại trái cây khác nhau: táo, lê và dâu tây, anh đào, mận, chuối, dứa, cam, dưa chuột, dưa hấu và ổi

và được phân loại dựa vào tên của từng loại quả [ 8, 9, 28]

1.2.1 Thành phần và giá trị dinh dưỡng của rượu vang

1.1.1.1 Thành phần chủ yếu của rượu vang

Ethanol – là một thành phần quan trọng nhất của rượu vang Đối với rượu vang

đỏ khô, hàm lượng cồn có thể dao động từ 12% cồn đến 16% Rượu vang trắng khô, mức độ rượu rất đa dạng, tùy thuộc vào giống nho và vùng nơi sản xuất rượu vang Rượu vang trắng khô được sản xuất từ nho như Chardonnay hoặc Sauvignon Blanc, tỷ lệ rượu thường dao động từ 13% đến 15% [3]

Với rượu vang khô làm từ Riesling, mức độ rượu thuộc loại thấp nhất ở mức gần 8% đến 9% Rượu Champagne, lượng rượu dao động từ 12% đến 14% Còn rượu vang trắng, ngọt, mức độ cồn khác nhau đáng kể, tùy thuộc vào loại nho và nơi sản xuất rượu vang dao động từ 12.5% đến 14% Tuy nhiên, một số loại rượu vang ngọt thấp hơn đáng kể, ví dụ: Essencia từ Tokaji nơi có hầu hết các loại rượu được lên men Trong trường hợp đó, rượu sẽ có độ cồn thấp hơn, nhưng lượng calo cao hơn nhiều [47]

Đường trong rượu vang khoảng 62 – 132 g/l, chủ yếu là đường fructose, glucose và một ít galactose Khi cho thêm đường saccharose vào dịch quả trước khi lên men thì toàn bộ đường này sẽ bị phân hủy thành đường khử Tùy vào lượng đường khử còn lại trong rượu vang sau lên men xong, người ta phân biệt: rượu vang khô (dưới 10g /lít), nửa khô (20 – 30g/lít), nửa ngọt (45g/lít) và rượu ngọt (80 – 110g/lít) [3, 47]

Trong rượu vang còn chứa các axit vô cơ và hữu cơ như axit tatric, axit malic, axit oxalic… Vì vậy rượu vang là thường có vị chua, độ pH của rượu vang là 2.9 – 3.9 Tuy có độ chua cao nhưng rượu vang vẫn dễ uống do được cân đối với vị ngọt của đường, cồn, glycerol, vị chát của tanin [3]

Trong rượu vang có chứa một lượng phong phú các loại muối với hàm lượng rất thấp như: P, S, K, Na, Ca, Fe, Cu,… Khi phân tích, một lít rượu vang chỉ chứa 1.5 – 3g tro nhưng chất muối trong rượu giữ vai trò rất quan trọng làm tăng hương vị rượu

và làm tăng giá trị dinh dưỡng cung cấp nguồn vi lượng cho cơ thể [3]

1.1.1.2 Giá trị dinh dưỡng

Mỗi ly rượu vang đỏ cung cấp trung bình các nhu cầu dinh dưỡng hàng ngày của bạn: 1% Thiamin, 2% Niacin, 3% Riboflavin và 4% vitamin K Một lượng khoáng chất cũng được tìm thấy trong rượu vang

Mỗi ly rượu vang cung cấp gần với tỷ lệ phần trăm sau đây về nhu cầu khoáng chất của người trưởng thành hàng ngày của bạn: 1% canxi, 1% đồng, 1% kẽm, 3% phospho, 4% sắt, 4% magie, 5% kali và 10% mangan [47]

Các số liệu thống kê tương tự, nhưng khác nhau cho rượu vang trắng Rượu vang trắng có lượng carbohydrate thấp hơn, trung bình chỉ có 2,6 carbohydrate mỗi khẩu phần Rượu vang trắng cung cấp cho nhu cầu dinh dưỡng hàng ngày của bạn 3% magie, 3% vitamin B6, 3% vitamin B2 và 3% niacin, 1% riboflavin cùng với các nguyên tố vi lượng của sắt, canxi, kali, phospho và kẽm [47, 48]

Bảng 1 2 Thành phần vitamin của nước nho tươi và của rượu vang nho (Theo

Lafon-Lafourcade, 1975) [3]

1.2.2 Công dụng của rượu vang

Rượu vang đỏ cũng là một nguồn chất chống oxy hóa: flavonoid, polyphenol và resveratrol

Flavonoid, còn được gọi là bioflavonoid, là một hóa chất tự nhiên được tìm thấy trong thực vật Do quá trình lên men, các enzyme chọn lọc được tạo ra giúp loại bỏ một số chất gây ung thư và có thể giúp ức chế sự phát triển của khối u [48]

Resveratrol giúp ngăn ngừa tổn thương mạch máu, giảm cholesterol xấu và ngăn ngừa cục máu đông Trong các thử nghiệm gần đây nhất, bằng chứng mới đã được tìm thấy cho thấy resveratrol ức chế các enzyme làm suy giảm và phá vỡ các tế bào [47, 48]

Polyphenol giúp phủ và bảo vệ lớp lót quan trọng của các mạch máu trong tim bạn

Một nghiên cứu của Thụy Điển đã báo cáo vào năm 2012 cho thấy các tính chất trong rượu vang đỏ có thể chống lại sự phát triển của viêm khớp dạng thấp bằng cách điều chỉnh các phản ứng tự miễn dịch [47]

Rượu vang đỏ cũng có thể mang lại những lợi ích sức khỏe độc đáo cho phụ

nữ Trong một nghiên cứu được thực hiện bởi Trung tâm y tế Cedar Sinai, nằm ở Los Angeles, California, vỏ và hạt nho đỏ được sử dụng để sản xuất rượu vang đỏ, sở hữu các đặc tính hóa học được cho là làm giảm nồng độ estrogen ở phụ nữ Estrogen là hooc môn có thể gây tăng trưởng tế bào ung thư ở một số phụ nữ tiền mãn kinh [47]

Phân bố rộng rãi trong thiên nhiên nhất là trong đất, đặt biệt là trên bề mặt của rất nhiều loại lá cây, các loại quả hay các cây lương thực, thực phẩm khác [5]

1.3.2 Hình thái và kích thước

1.3.2.1 Hình thái

Nấm men có nhiều dạng khác nhau, nấm men có dạng hình tròn, hình trứng như

Saccharomyces cerevisiae, hình elip như Saccharomyces ellipsoidues, hình quả chanh

như Saccharomyces apiculatus, đôi khi có hình chai như Saccharomyces ludwigii hoặc hình ống dài như Pichia

Hình dáng của cùng một loại cũng có thể thay đổi theo điều kiện môi trường, điều kiện nuôi cấy và tuổi của tế bào [5]

một số loại men phổ biến hơn Các loại nấm men, chẳng hạn như Saccharomyces

cerevisiae là nấm đơn bào, có đường kính 5-10μm Nấm men nhỏ vừa chớm nở có

đường kính 2-5μm [50]

1.3.3 Một số loại nấm men thường dùng trong rượu vang

1.3.3.1 Saccharomyces ellipsoidues

Trước đây người ta gọi là S vini merey hay S ellipsoideus, theo Lorder là S

cerevisea hansen Nấm men này chiếm tới 80% trong tổng số Saccharomyces có trong

quá trình lên men nước quả

Nguồn dinh dưỡng cacbon chính của loại này là đường, cồn và axit hữu cơ, những tác nhân sinh trưởng là axit pantonic, biotin, mezoinoit, tiamin và piridoxin

Đa số các tế bào của loài này là hình ovan S vini có khả năng sinh enzym

invectase có khả năng khử đường saccharose thành glucose và fructose Hàm lượng rượu được tạo thành đạt 8 - 10% so với thể tích [5]

1.3.3.2 Saccharomyces oviformic

Nó thường lẫn với S vini Giống thuần chủng phát triển tốt trong nước nho và

các loại nước quả khác, có khả năng chịu được độ đường cao, cồn cao, lên men hết đường và tạo độ cồn tới 18 độ [6]

1.3.3.3 Một số loại nấm men hoang dại

Nấm men hoang dã trên bề mặt của các loại trái cây khác nhau bao gồm cả nho

đã được khảo sát để thu được các chủng nấm men phù hợp cho quá trình lên men một loại rượu mới lạ có nồng độ cồn cao hơn và có mùi vị thơm ngon hơn [28]

S ludwigii phân lập từ quả dứa có thể tạo ra nồng độ cồn cuối cùng lên tới

12.3% (v / v) và Hanseniaspora phân lập từ quá trình lên men tự phát của nước ép

dứa, nồng độ cồn cuối cùng trong nước ép dứa chỉ ở mức 6.0% (v / v) [29]

Quả kiwi phân lập được các chủng Wickerhamomyces anomalus và Pichia

anomala, và một chủng S cerevisiae

Các chủng đã được phân lập từ đào và Rubus coreanus Miquel (bokbunja), và

tất cả được xác định là chủng Aureobasidium pullulans

Gần đây, Pichia anomala là một trong những loại men rượu không phải là

saccharomyces được chọn và được sử dụng để tăng cường rượu thơm [28]

1.3.3.4 Yêu cầu của nấm men rượu vang

Có khả năng lên men tốt trên môi trường có hàm lượng đường cao, sinh ra nhiều cồn Có khả năng lên men được nhiều loại đường khác nhau Chịu được độ cồn

và độ acid cao, cũng như chất sát trùng Chịu được nhiệt độ thấp 4-100C hoặc cao

>350C Tốc độ phát triển nhanh, chu kì lên men ngắn Tạo rượu có hương thơm ngon

Dễ lắng trong [6]

1.3.4 Ảnh hưởng của những yếu tố lý, hóa lên hoạt động của nấm men vang

Ảnh hưởng của oxy: Nấm men vang được coi là vi sinh vật sống hiếu khí tùy tiện Trong điều kiện hiếu khí thì hoạt động sinh sản của nấm men mạnh mẽ hơn nên sinh khối tăng nhanh trở thành sản phẩm chủ yếu trong quá trình lên men Trong điều kiện kị khí, nấm men chuyển từ hoạt động hô hấp sang lên men kỵ khí, khi đó sản phẩm trong môi trường lên men là ethanol sẽ trở thành chủ yếu [6, 7]

Ảnh hưởng của nhiệt độ: Nấm men khá bền vững trong nhiệt độ thấp, nó có thể sống trong băng nhiều tháng Nấm men rất nhạy cảm với nhiệt độ cao, trong môi trường lỏng ở nhiệt độ 40 - 500C nấm men hầu như ngưng trệ hoạt động, sau 1h30p sẽ

bị chết, nhiệt độ 60 - 650C chúng sẽ chết ngay sau 5p Nhiệt độ tối ưu cho nấm men vang là 25 - 280C [7]

Ảnh hưởng của ánh sáng: Ánh sáng là yếu tố kìm hãm hoạt động của nấm men vang Đặt biệt các tia cực tím trong ánh sáng sẽ giết chết các tế bào nấm men, vì vậy quá trình lên men phụ thuộc trực tiếp vào từng mùa [7]

Ảnh hưởng của các axit hữu cơ: Nấm men có thể hoạt động tốt trong môi trường có 8 - 10g/l axit ( môi trường này thì hầu như các loài vi khuẩn bị ức chế ) môi trường nước nho càng chua thì càng hạn chế được hoạt động của nhiều loại vi khuẩn [7]

Ảnh hưởng của thế oxy hóa khử: Nấm men vang có thể hoạt động tốt trong môi trường có thế oxy hóa khử từ 10 - 27.5 [7]

Ảnh hưởng của hàm lượng đường: Hàm lượng đường từ 10 - 25% quá trình lrrn men vẫn bình thường Hàm lượng đường lớn hơn 25% thì quá trình lên men bắt đầu bị chậm, khó khăn [6, 7]

Ảnh hưởng của ethanol: Sản phẩm chủ yếu của quá trình lên men kị khí là ethanol Ethanol kìm hãm hoạt động sống của tế bào nấm men, tuy nhiên mức độ kìm hãm khác nhau đối với từng loại [6, 7]

Ảnh hưởng của CO2: Hàm lượng CO2 hình thành trong quá trình lên men thường hạn chế sự sinh sản của nấm men Theo nghiên cứu của Miulor Thurrau khi : hàm lượng CO2 đạt đến 0.25% trọng lượng thì việc sinh sản của nấm men đình trệ, đạt đến 1.5% thì nấm men không sinh sản được nữa Với hàm lượng như trên, ở nhiệt độ

150C sẽ có áp suất 7.7 atm, nấm men vẫn sống và tiếp tục lên men kị khí [6]

1.1.4 Tình hình nghiên cứu sản xuất rượu vang trên thế giới và tại Việt Nam

1.1.4.1 Trên thế giới

Rượu vang là một trong những thức uống được tiêu thụ mạnh nhất trên thế giới

và có lịch sử hàng nghìn năm Cùng với sự ưa chuộng ngày càng tăng cao, một số dòng rượu vang hiện nay còn được làm từ một số loại trái cây Chính vì vậy, các nghiên cứu về sản phẩm rượu vang rất đa dạng về nguồn nguyên liệu và quy trình chế biến để đáp ứng nhu cầu của người tiêu dùng

Năm 2011, Yeon-Ju Lee và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu phân lập các

chủng nấm men từ các loại quả: nho, táo, mơ, dâu, kiwi để lên men Kết quả đã phân

lập được 113 chủng và các chủng này chủ yếu thuộc các chi: Pichia anomala là phổ biến nhất (41.7%), tiếp theo là Wickerhamomyces anomalus (19.2%), P guilliermondii (15%), Candida spp (5.8%), Kodamaea ohmeri (2.5%) và Metschnikowia spp (2.5%)

[28]

Năm 2012, On-ong Chanprasartsuk và cộng sự đã nghiên cứu về khả năng kết hợp các chủng nấm men phân lập được từ vỏ dứa để lên men rượu vang dứa Kết quả

cho thấy khi kết hợp giữa các chủng S cerevisiae và S ludwigii; S cerevisiae và

Hanseniaspora phân lập I và S cerevisiae; S ludwigii và Hanseniaspora có thể tạo ra

nồng độ cồn trong ngày cuối cùng của quá trình lên men lần lượt là 12.0%, 12.0% và 14.0% (v / v) [30]

Năm 2016, Michra đã nghiên cứu sản xuất rượu vang trái cây từ một số loại quả như chuối, cam, vải, cam, nho, xoài Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng đối với mỗi loại quả khác nhau cho chất lượng cồn khác nhau: rượu chuối 15.49% ,rượu cam 8.65% , rượu nho 9.4% , rượu vải 11.4% , rượu xoài 7.4% [31]

1.1.4.2 Tại Việt Nam

Năm 2011, Ngô Thị Phương Dung, Lý Huỳnh Liên Hương và Huỳnh Xuân Phong đã nghiên cứu quy trình sản xuất rượu vang dưa hấu Kết quả cho thấy rằng quy trình lên men rượu vang dưa hấu cho độ cồn cao, có giá trị cảm quan tốt và đạt tiêu

chuẩn về rượu TCVN 7045:2002 được tiến hành với dòng nấm men Saccharomyces

cerevisiae với mật số nấm men trong dịch lên men là 107 tế bào/ml, dịch lên men được

bổ sung đường saccharose đạt 30°Bx và lên men rượu ủ ở 25°C trong thời gian 10 ngày [8]

Năm 2011, Nguyễn Minh Thủy và cộng sự đã nghiên cứu hiệu quả lên men của

dòng nấm men Saccharomyces đã được phân lập và tuyển chọn từ nước thốt nốt so với

nấm men thương mại trong quá trình sản xuất rượu vang thốt nốt Sau 12 ngày lên

men, kết quả cho thấy dòng nấm men thuần chủng Saccharomyces đã có tất cả các đặc

tính mong muốn cho mục đích nghiên cứu này và rượu lên men tốt hơn so với nấm men thương mại Hàm lượng ethanol cao (13.67% v/v) và hàm lượng đường sót thấp (2.57%) [9]

Năm 2017, Tăng Thị Ánh Hồng, Nguyễn Thị Thu Sang đã nghiên cứu sản xuất rượu từ trái bình bát Thông qua các nghiên cứu thử nghiệm thu được rượu có nồng độ cồn 12% v/v, có điểm cảm quan theo thị hiếu chấp nhận được [10]

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng

2.1.1 Nguồn phân lập nấm men

Nấm men được phân lập từ những nguồn sau đây: cóc, ổi, mận, cà chua, dứa và thanh trà

2.1.2 Quả thanh trà (Citrus grandis Osbeck)

Quả thanh trà được thu mua tại làng Lại Bằng, Hương Vân, Hương Trà, Thừa Thiên Huế

Hình 2 1 Quả thanh trà [51]

2.2 Môi trường, hóa chất, dụng cụ và thiết bị

2.2.1 Môi trường và hóa chất

2.2.2 Dụng cụ và thiết bị

Đèn cồn, que cấy, micropipep, pipet, buret, cốc thủy tinh, đũa thủy tinh, ống đong, bình tam giác, phễu, bông, giấy lọc, ống nghiệm, đĩa petri, que cấy, màng bao thực phẩm, giấy bạc

Bể điều nhiệt, bình hút ẩm, buồng cấy vô trùng, cân điện tử, chiết quang kế, bộ chưng cất, nồi hấp, tủ sấy, cồn kế, tủ lạnh

2.3 Phương pháp xác định thành phần của quả thanh trà

2.3.1 Xác định hàm lượng nước

Cốc được sấy khô ở 1050C đến trọng lượng không đổi Để nguội trong bình hút

ẩm và đem đi cân cốc trên cân phân tích

Cân 3 - 5g tép thanh trà vào cốc đã sấy khô Cho cốc sấy đựng mẫu vào tủ sấy

và sấy ở nhiệt độ 1050C trong 2 giờ

Lấy cốc ra cho vào bình hút ẩm để nguội và đem cân Tiếp tục sấy cốc trong tủ

30 phút nữa, lấy ra để nguội ở bình hút ẩm và đem cân Làm như vậy cho đến khi kết quả của hai lần cân cuối không thay đổi Ghi kết quả và tính độ ẩm

Độ ẩm của mẫu được tính bằng % theo công thức:

w =m1− m2

𝑚1− m0 x 100%

Trong đó: mo : khối lượng cốc

m1 : khối lượng cốc và mẫu trước sấy

m2 : khối lượng cốc và mẫu sau sấy [11]

2.3.2 Xác định hàm lượng axit toàn phần

2.3.2.1 Nguyên tắc

Dựa trên phản ứng trung hòa các axit có trong mẫu bằng dung dịch kiềm NaOH 0.1N với chỉ thị phenolphtalein Từ lượng kiềm tiêu hao ta tính được lượng axit toàn phần có trong mẫu

2.3.2.2 Tiến hành

Cân 10g mẫu, nghiền nhỏ trong cối chày sứ, dùng nước cất chuyển toàn bộ lượng mẫu vào bình tam giác dung tích 250ml thêm nước cất đến khoảng 150ml, đun trên bếp cách thủy ở 800C trong 15 phút Làm nguội, chuyển toàn bộ vào bình định mức 250ml, thêm nước đến vạch, lắc kỹ, để lắng Lọc mẫu thu dịch lọc vào cốc Hút 25ml dịch lọc vào bình tam giác dung tích 100ml, thêm 3 giọt phenolphtalein 0.1%, chuẩn độ bằng natri hydroxit 0.1N đến màu hồng nhạt bền vững trong 30 giây

2.3.2.3 Tính toán

Hàm lượng axit tổng số (X) của các mẫu tính bằng % theo công thức:

X =V x K x V2 x 100

V1 x mTrong đó:

V : thể tích natrihydroxit 0.1N , ml V1 : thể tích dung dịch đã hút để chuẩn, ml V2 : dung tích bình định mức, ml

K : hệ số axit tương ứng ( K=0.0067 vì axit malic có nhiều trong rau quả)

2.3.3.3 Tính toán

Lượng vitamin C (mg/l) được tính theo công thức:

X = V x 0,88 x 1000

V1Trong đó:

V - số ml I2 0,01N tiêu tốn khi chuẩn độ

0.88 - số mg vitamin C tương ứng với 1 ml I2 0.01N

CH2OH-(CHOH)4-CHO + K3Fe(CN)6 + 2NaOH

CH2OH-(CHOH)4-COONa + NaK3Fe(CN)6 + H2O

Phương pháp này đơn giản hơn phương pháp dùng dung dịch kiểm của sulfat đồng do không tạo kết tủa và phản ứng kết thúc rõ ràng Kết quả tính toán không dựa vào phương trình lý thuyết, mà dùng công thức thực nghiệm Độ chính xác của kết quả phụ thuộc vào nhiều yếu tố, nhưng trình tự tiến hành và thao tác quan trong nhất

Tất cả monosaccarit và một số oligosacarit là đường khử Các oligosacarit và polysacarit dễ bị thủy phân thành monosacarit vì vậy có thể định lượng đường khử trước và sau thủy phân để tính hàm lượng của chúng

2.3.4.2 Dụng cụ và hóa chất

Dụng cụ

Bếp điện, kẹp, nồi cách thủy

Phễu, ống đong, bình định mức, burette, pipet

ly, lắc đều trong 10 phút , định mức tới vạch và đem lọc

Trong trường hợp khó nhận điểm chuyển màu có thể kiểm tra điểm kết thúc bằng cách nhỏ một giọt chỉ thị methylen blue và một giọt đường thừa đầu tiên sẽ làm mất màu xanh cho biết phản ứng đã kết thúc Kết quả lần chuẩn độ đầu tiên chỉ có giá trị tham khảo cho lần chuẩn độ thứ hai Lần này, sau khi đun sôi dung dịch ferrycyanure, xả nhanh lượng đường (theo kết quả lần chuẩn độ trước), chỉ để lại khoảng dưới 1 ml để chuẩn độ tiếp tìm chính xác điểm cuối Kết quả tính toán chỉ sử dụng từ lần chuẩn độ thứ hai trở đi Lặp lại thí nghiệm chuẩn độ trong 3 lần

Tính kết quả: Trong thí nghiệm, Vk ml dung dịch mẫu và Vg ml dung dịch glucose 0.5% cùng phản ứng với 1 dung dịch ferrycyanure ở một nồng độ xác định Như vậy Vk ml dung dịch mẫu tương ứng với Vg ml dung dịch glucose 0.5% có (0.5xVg)/100g glucose

Lượng đường khử được tính bằng công thức:

𝑋𝑘 = 0,5 x 𝑉𝑔 x V x 100

100 x 𝑉𝑘 x mTrong đó:

Xk - lượng đường khử, g/100g hay g/100ml

Vg - thể tích dung dịch glucose 0.5% cho chuẩn độ, ml

Vk - thể tích dung dịch đường khử cho chuẩn độ, ml

V - thể tích bình định mức, ml

m - lượng mẫu thí nghiệm, g hoặc ml

Định lượng đường tổng

Đường tổng bao gồm các gluxit hòa tan trích ly được trong nước

Sau khi lọc lấy chính xác 50ml dung dịch mẫu cho vào bình tam giác 250ml Thêm 20ml dung dịch HCl 5%, đem đun cách thủy trong 30 đến 45 phút Sau đó làm nguội nhanh và trung hòa hỗn hợp bằng dung dịch NaOH 2.5N hoặc dung dịch hoặc dung dịch Na2CO3 bão hòa với chỉ thị metyl đỏ Sau đó cho vào bình định mức 250ml

và định mức tới vạch

Tiến hành chuẩn độ tương tự như định lượng đường khử

Hàm lượng đường tổng được tính bằng công thức:

Xt = 0.5 x Vg x V1 x V2 x 100

100 x Vt x 50 x mTrong đó:

Xt - hàm lượng đường tổng, %

Vg - thể tích dung dịch glucose 5% cho chuẩn độ, ml

Vt - thể tích dung dịch đường tổng cho chuẩn độ, ml

V1 - thể tích bình định mức của dung dịch xác đinh đường khử, ml

V2 - thể tích bình định mức của dung dịch xác đinh đường tổng, ml

m - lượng mẫu cân thí nghiệm g hoặc ml

Định lượng glucose chuẩn 0.5% : Tiến hành thí nghiệm tương tự đối với đường

chuẩn là dung dịch glucose 0.5% Thay lượng đường khử trên burette bằng dung dịch

glucose chuẩn 0.5% và chuẩn độ tương tự như định lượng đường khử [11]

2.3.5 Xác định hàm lượng chất khô hòa tan

Sử dụng khúc xạ kế để đo trực tiếp dịch mẫu ở 200C [11]

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phân lập nấm men từ các nguồn khác nhau

Nghiền nhỏ 1g vỏ trái cây ( cóc, ổi, mận, cà chua, dứa và thanh trà) và hòa tan với 9ml dung dịch YPD Sau đó đem ly tâm trong 2 phút với tốc độ 1200 vòng/ phút

Cho vào dung dịch 0.1g chloramphenicol thu được dung dịch có nồng độ pha loãng

10-1 Tiếp tục pha loãng theo lũy thừa 10 sẽ có được dung dịch có nồng độ pha loãng cao hơn Hút 100μm dịch pha loãng cấy lên bề mặt môi trường PGA chứa trong đĩa peptri đã được vô trùng Đậy hộp peptri và gói lại đem nuôi ở nhiệt độ 28 - 300C trong

1 ngày, các khuẩn lạc nghi ngờ nấm men được cấy chuyền trên môi trường PGA để thu được khuẩn lạc đơn Các dòng thuần được cấy vào môi trường thạch nghiêng Hansen để giữ giống Sau đó các ống nghiệm được bảo quản lạnh [28]

Đồng thời tiến hành phân lập nấm men từ men rượu ngoài thị trường để làm mẫu đối chứng

2.4.2 Quan sát hình thái tế bào nấm men dưới kính hiểm vi

Làm tiêu bản nhuộm đơn nấm men với xanh metylen và quan sát hình thái

Tiến hành: Đầu tiên nhỏ 1 giọt nước cất vô trùng lên phiến kính Sau đó dùng que cấy chấm một ít vi sinh vật, loan đều giọt nước Nhỏ một giọt xanh metylen lên canh trường vi sinh vật Đậy lá kính lên giọt dịch, quan sát ở vật kính ( x10 ), ( x40 ) [12]

2.4.3 Tuyển chọn nấm men có khả năng lên men rượu mạnh

Các chủng nấm men sau khi phân lập được kiểm tra khả năng lên men các loại đường glucose, fructose và saccharose dựa trên lượng khí CO2 sinh ra trong quá trình lên men rượu

Tiến hành: Đầu tiên nấu môi trường Wickerham ( pepton 10 g/l, cao nấm men 5 g/l, bromthymol xanh 0.005 g/l, pH=7.2 ) và đun tan dịch đường Sau đó cho 9ml dung dịch Wickerham và 1ml dịch đường 20% cho vào ống nghiệm thả ống durham vào lắc đều cho dịch đường tràn đầy vào ống durham úp ngược sao cho không có bọt khí bên trong ống, bịt nút bông và bao giấy bạc kín rồi đem tiệt trùng Sau khi tiệt trùng ta bổ sung một lượng nấm men bằng nhau vào các ống Chiều cao cột khí CO2 sinh ra trong ống durham úp ngược được ghi nhận tại các thời điểm 6, 12, 18, 24, 30, 36, 42, 48, 54,

60 giờ Thí nghiệm được lặp lại 3 lần [28]

Thí nghiệm được tiến hành tương tự với mẫu đối chứng để so sánh

2.5 Phương pháp lên men rượu

2.5.1 Phương pháp lấy mẫu

Quả thanh trà sau khu thu hoạch ở tỉnh Thừa Thiên Huế thì được bảo quản và vận chuyển về nơi tiến hành làm thí nghiệm Được bảo quản ở nơi thoáng mát

2.5.2 Khảo sát quá trình lên men rượu

Sau khi tuyển chọn được chủng nấm men có khả năng lên men rượu mạnh thì tiến hành lên men Sử dụng dịch quả thanh trà để làm dịch tăng sinh nấm men, tăng sinh giống ở điều kiện nhiệt độ môi trường trong thời gian 36 giờ

Tiến hành lên men rượu thanh trà từ dịch ép của quả thanh trà Đầu tiên quả thanh trà được loại bỏ những phần không cần thiết như cuống, vỏ, hạt Phần múi bưởi được xay ép lấy dịch, dịch quả được điều chỉnh về pH=3.6 [13, 32], hạn chế sự phát triển của các vi sinh vật khác, bổ sung đường saccharose để điều chỉnh Bx

a Khảo sát hàm lượng Bx thích hợp cho quá trình lên men

Dịch quả được bổ sung đường để điều chỉnh về các giá trị Bx 17, 20, 23, 25 Trước khi cấy giống tăng sinh dịch quả được thanh trùng ở 900C trong thời gian 20 phút [14, 32] Sau 8 ngày lên men ở nhiệt độ thường lấy ra đo Bx và độ cồn

b Khảo sát lượng giống thích hợp cho quá trình lên men

Dịch quả được bổ sung đường để điều chỉnh về giá trị Bx thích hợp đã khảo sát Trước khi cấy giống tăng sinh dịch quả được thanh trùng ở 900C trong thời gian 20 phút Sau đó bổ sung giống tăng sinh vào với hàm lượng 1%, 2%, 3%, 4%, 5% Sau thời gian 8 ngày lên men ở nhiệt độ thường thì lấy ra đo Bx và độ cồn [14]

2.5.3 Lên men với tỷ lệ giống và Bx sau khảo sát

2.5.3.1 Quy trình dự kiến

Toàn bộ quy trình lên men rượu được minh họa ở hình 2.1

Đồng thời tiến hành lên men mẫu rượu đối chứng từ chủng nấm men phân lập

từ bánh men rượu ngoài thị trường Các bước tiến hành tương tự như quá trình khảo sát điều kiện thích hợp cho lên men

Khi xay nếu để lâu thì dịch thanh trà sẽ tiếp xúc với oxy không khí và bị oxy hóa, ngoài ra lượng vi sinh vật có cơ hội phát triển theo, ức chế nấm men trong quá trình lên men [52] Vì vậy, công đoạn này cần tiến hành càng nhanh càng tốt

Khi thiết bị vệ sinh không kỹ, lượng tạp chất còn sót lại sẽ ảnh hưởng đến rượu vang sau này

- Lọc: loại bỏ tối đa đến mức chấp nhận được các cặn, làm cho dịch trong hơn

Giống nấm men, tăng sinh

Giống nấm men sau khi phân lập được giữ ở nhiệt độ 40C Dịch quả thanh trà

đã thanh trùng sẽ được cấy giống nấm men có hoạt tính lên mạnh tạo điều kiện cho nấm men sinh trưởng, phát triển tăng sinh khối nấm men Dịch đã cáy giống được giữ

ở nhiệt độ phòng, đặt nơi khô thoáng và giữ trong 1 ngày [52]

Lên men

Chuyển hóa đường thành rượu và CO2, tăng giá trị cảm quan cho sản phẩm

Nấm men sau khi tăng sinh sẽ được hút vào dịch quả đã được thanh trùng với tỷ

lệ là 2% Đậy nút lại và theo dõi nồng độ chất khô, lượng cồn sinh ra trong 8, 16 ngày

Lọc

Dịch sau khi lên men chứa một lượng xác nấm men ở đáy bình, lọc để vang có

độ trong đạt yêu cầu cảm quan và loại bỏ một số chất keo lơ lững trong quá trình lên men

Ban đầu ta chuyển dịch sang một bình khác giữ lại cặn Sau đó, dùng phễu và bông lọc đã được hấp tiệc trùng lọc lại phần dịch Thời gian lọc càng ngắn càng tốt để giảm lượng cồn bị tổn thất do bay hơi ra ngoài không khí, đồng thời giảm được sự oxy hóa làm vang sẫm màu

Thanh trùng, làm lạnh nhanh