(Luận văn thạc sĩ) nghiên cứu so sánh khả năng giải phóng thuốc của vật liệu cellulose nạp neomycin sufate tạo ra từ gluconacetobacter xilinus nuôi trong một số môi trường

Việc sử dụng không cần thiết hoặc lạm dụng bất kỳ kháng sinh nào có thể dẫn đến giảm hiệu quả của thuốc.” Cellulose vi khuẩn CVK được tạo thành từ Acetobacter xylinum có cấu trúc hóa học

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

TRONG MỘT SỐ MÔI TRƯỜNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Sinh lý học người và động vật

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

TRONG MỘT SỐ MÔI TRƯỜNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Sinh lý học người và động vật

Người hướng dẫn khoa học

ThS Hà Thị Minh Tâm

HÀ NỘI, 2019

Đồng thời em xin gửi lời cảm ơn đến Ban Giám Hiệu Trường ĐHSP Hà Nội

2, cùng thầy cô giáo làm việc tại Viện Nghiên cứu khoa học và Ứng dụng- Trường Đại học Sư Phạm Hà Nội 2, “các bạn sinh viên đã truyền đạt kiến thức và tạo điều kiện cho em để em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp của mình.”

Cuối cùng, em xin cảm ơn người thân và bạn bè đã giúp đỡ em trong quá trình học tập và nghiên cứu khoa học

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 5 năm 2019

Sinh viên

Trần Thị Thùy Trang

LỜI CAM ĐOAN

“Em xin cam đoan nội dung được trình bày trong khóa luận không sao chép hay trùng lặp ở đề tài khóa luận nào Kết quả, số liệu được nghiên cứu và thu được từ thực nghiệm được em xử lý thống kê, đảm bảo tính trung thực và chưa được công bố trong công trình khoa học hoặc tạo chí chuyên ngành hay các hội thảo khoa học, sách chuyên khảo,… nào khác Em có tham khảo một số tài liệu của các tác giả để hoàn thành đề tài khóa luận của mình.”

Nếu lời cam đoan sai em xin hoàn toàn chịu trách nhiệm

7 NCKH & CGCN Nghiên cứu khoa học và chuyển giao

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

1 Lí do chọn đề tài 1

2 Mục đích nghiên cứu 2

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 2

4 Mục đích nghiên cứu 2

5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 3

NỘI DUNG 4

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Gluconacetobacter xylinus 4

1.1.1 Vị trí phân loại 4

1.1.2 Đặc điểm vi khuẩn G.xylinus 4

1.1.3 Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn G xylinus 4

1.1.4 Môi trường nuôi cấy Gluconacetobacter xylinus 5

1.2 Neomycin Sulfate 6

1.3 Lịch sử nghiên cứu đề tài 7

1.3.1 Tình hình trong nước 7

1.3.2 Tình hình trên thế giới 8

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 9

2.1 Vật liệu nghiên cứu 9

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 9

2.1.2 Nguyên liệu và hóa chất 9

2.1.3 Thiết bị và dụng cụ 9

2.2 Phương pháp nghiên cứu 10

2.2.1 Chuẩn bị màng CVK 10

2.2.1.1 Lên men thu màng CVK thô 10

2.2.1.2 Tạo màng CVK tinh chế 11

2.2.1.3 Kiểm tra độ tinh khiết màng CVK tinh chế 11

2.2.1.4 Phương trình đường chuẩn NS trong PBS (pH = 7,4) 11

2.2.3 Phương pháp xác định khối lượng CVK tạo thành 12

2.2.4 Phương pháp xác định lượng thuốc hấp thụ vào màng CVK 12

2.2.5 Phương pháp pha môi trường đệm PBS 13

2.2.6 Phương pháp xác định lượng thuốc giải phóng thông qua hệ thống được thiết kế 14

2.2.7 Phương pháp xử lí thống kê 15

2.3 Địa điểm nghiên cứu 15

2.4 Cách bố trí thí nghiệm 15

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 16

3.1 Thu màng CVK và tinh chế màng 16

3.1.1 Thu màng CVK từ các môi trường lên men 16

3.1.2 Quá trình xử lý màng CVK trước khi hấp thu thuốc 17

3.1.3 Xác định điều kiện nuôi cấy để có độ dày màng CVK thích hợp 17

3.1.2 Tinh chế màng CVK 18

3.1.3 Xác định lượng thuốc giải phóng của các màng CVK 18

3.2 Tỷ lệ giải phóng thuốc của các màng CVK 19

3.2.1 Tỷ lệ giải phóng thuốc của màng cao nấm men 19

3.2.2 Tỷ lệ giải phóng thuốc của màng nước dừa già 23

3.2.3 Tỷ lệ giải phóng thuốc của màng nước vo gạo 25

3.3 So sánh tỉ lệ giải phóng thuốc ra các màng CVK ở các độ dày khác nhau trong cùng 24 giờ tại pH=6,8 27

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 30 TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ SƠ ĐỒ

Hình 2.1 Quy trình nuôi cấy thu nhận CVK 11

Hình 2.2 Phương trình đường chuẩn của NS trong môi trường PBS (pH=7,4) 12

Hình 3.1 Nuôi màng CVK tại Phòng thí nghiệm Trung tâm NCKH&CGCN trường ĐHSP Hà Nội 2 16

Hình 3.2 Môi trường dinh dưỡng lên men thu màng 16

Hình 3.3 Màng CVK xả dưới vòi nước 17

Hình 3.4 Màng CVK tinh chế 18

Hình 3.5 Mẫu được rút ra để đo quang phổ lúc 8 giờ 19

Hình 3.6 Biểu đồ biểu diễn tỉ lệ giải phóng thuốc của các màng chuẩn ở các pH và thời gian khác nhau 22

Hình 3.7 Biểu đồ biểu diễn tỉ lệ giải phóng thuốc của các màng nước dừa già ở các pH và thời gian khác nhau 24

Hình 3.8 Biểu đồ biểu diễn tỉ lệ giải phóng thuốc của các màng nước vo gạo ở các pH và thời gian khác nhau 27

Hình 3.9: Tỷ lệ (%) giải phóng thuốc từ các màng CVK ở các độ dày khác nhau cùng 24 giờ tại pH = 6,8 28

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Thành phần môi trường chuẩn 5

Bảng 1.2: Thành phần môi trường nước vo gạo 6

Bảng 1.3: Thành phần nước dừa già 6

Bảng 2.1 Thành phần các môi trường thu màng CVK 10

Bảng 2.2 Môi trường đệm với pH=2; pH=4,5; pH=6,8 13

Bảng 3.2 Mật độ quang phổ khi tiến hành giải phóng thuốc trong môi trường chuẩn pH khác nhau tại các thời điểm khác nhau (n = 3) 20

Bảng 3.3 Tỉ lệ (%) giải phóng thuốc Neomycin Sulfate từ màng CVK ở độ dày 0,3 cm và 0,5 cm trong môi trường chuẩn có pH và thời gian khác nhau (n=3) 21

Bảng 3.4 Mật độ quang phổ khi tiến hành giải phóng thuốc trong môi trường nước dừa già pH khác nhau tại các thời điểm khác nhau (n = 3) 23

Bảng 3.5 Tỉ lệ (%) giải phóng thuốc Neomycin Sulfate từ màng CVK ở độ dày 0,3 cm và 0,5 cm trong môi trường nước dừa già có pH và thời gian khác nhau (n=3) 24 Bảng 3.6 Mật độ quang phổ khi tiến hành giải phóng thuốc trong môi trường nước vo gạo pH khác nhau tại các thời điểm khác nhau (n = 3) 25

Bảng 3.7 Tỉ lệ (%) giải phóng thuốc Neomycin Sulfate từ màng CVK ở độ dày 0,3 cm và 0,5 cm trong môi trường nước vo gạo có pH và thời gian khác nhau (n=3) 26

Bảng 3.8 Tỷ lệ (%) giải phóng thuốc từ các màng CVK dày 0,3 cm và 0,5 cm trong cùng 24 giờ tại pH = 6,8 27

MỞ ĐẦU

1 Lí do chọn đề tài

“Neomycin là một kháng sinh aminoglycoside được tìm thấy trong nhiều loại thuốc bôi tại chỗ như kem, thuốc mỡ và thuốc nhỏ mắt Chúng được tìm thấy trong phòng thí nghiệm của nhà khoa học Selman Waksman vào năm 1945” Neomycin thuộc nhóm kháng sinh aminoglycoside chứa hai hoặc nhiều đường amino liên kết với nhau bằng liên kết glycosidic [1]

“Thuốc Neomycin thường được dùng dưới dạng thuốc bôi (Neosporin) Khi neomycin kết hợp với thuốc khác có thể được dùng để uống Neomycin không được hấp thụ qua đường tiêu hóa và được sử dụng dự phòng cho bệnh não gan và tăng cholesterol máu Bằng cách tiêu diệt vi khuẩn trong đường ruột, kháng sinh này giúp giữ mức amoniac thấp và ngăn ngừa bệnh não gan Chúng hoạt động để tiêu diệt vi khuẩn kháng streptomycin, kể cả trong trường hợp các vi khuẩn lao Thuốc này cũng

đã được sử dụng để điều trị sự phát triển quá mức của các vi khuẩn ruột non Chúng không được tiêm, vì neomycin cực kỳ độc thận (gây ra tổn thương thận), ngay cả khi

so sánh với các aminoglycosid khác” Ngoại lệ là khi neomycin được tích hợp, với lượng rất nhỏ, như một chất bảo quản trong một số vaccine-thường là 25 μg mỗi liều

Thuốc này được sử dụng để làm giảm nguy cơ nhiễm trùng sau khi phẫu thuật đường ruột Neomycin thuộc nhóm thuốc kháng sinh aminoglycoside Nó hoạt động bằng cách ngăn chặn sự tăng trưởng của vi khuẩn trong ruột Neomycin cũng có thể được sử dụng kết hợp với chế độ ăn uống đặc biệt để điều trị một vấn đề nghiêm trọng trong não (bệnh não gan) Tình trạng này được gây ra do sự tạo thành quá nhiều một vài chất tự nhiên (amoniac) Thông thường, gan sẽ đào thải amoniac, nhưng bệnh gan có thể tạo ra quá nhiều amoniac bện trong cơ thể Thuốc này giúp điều trị bệnh não bằng cách giết chết các vi khuẩn đường ruột nhất định tạo ra amoniac [5]

“Thuốc này chỉ điều trị chứng nhiễm khuẩn Thuốc sẽ không hiệu quả cho chứng nhiễm virus (như cảm lạnh thông thường, cúm) Việc sử dụng không cần thiết hoặc lạm dụng bất kỳ kháng sinh nào có thể dẫn đến giảm hiệu quả của thuốc.”

Cellulose vi khuẩn (CVK) được tạo thành từ Acetobacter xylinum có cấu trúc hóa học rất giống của cellulose thực vật nhưng có một số tính chất hóa lý đặc biệt như: độ bền cơ học, khả năng thấm hút nước cao, đường kính sợi nhỏ, độ tinh khiết cao, độ polymer hóa lớn, có khả năng phục hồi độ ẩm ban đầu, [7] Vì vậy, CVK

được ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực như: thực phẩm, y học, môi trường, mỹ phẩm, công nghiệp và nhiều lĩnh vực khác

“Nhờ những đặc tính độc đáo trên của CVK nhằm tăng khả năng hấp thụ thuốc

có kiểm soát, tăng khả dụng sinh học của thuốc neomycin sulfate trong điều trị bệnh, chúng tôi quyết định chọn đề tài: “Nghiên cứu so sánh khả năng giải phóng thuốc của vật liệu cellulose nạp neomycin sulfate tạo ra từ Gluconacetobacter xylinus trong một số môi trường”.”

“

2 Mục đích nghiên cứu

- Nghiên cứu quy trình chế tạo màng

- Nghiên cứu so sánh khả năng giải phóng thuốc của vật liệu Cellulose nạp Neomycin sufate tạo ra từ Gluconacetobacter xilinus nuôi trong một số môi trường.”

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

- Đối tượng: “So sánh khả năng giải phóng thuốc của vật liệu cellulose nạp neomycin sulfate tạo ra từ Gluconacetobacter xylinus trong một số môi trường.”

- Vật liệu nghiên cứu: Màng CVK từ môi trường chuẩn, nước dừa già, nước vo gạo

- Phạm vi nghiên cứu: Phòng Thí nghiệm Viện nghiên cứu khoa học và ứng dụng Trường ĐHSP Hà Nội 2

4 Nhiệm vụ nghiên cứu

- Tạo màng CVK từ một số môi trường: môi trường chuẩn, nước dừa già, nước vo gạo

- Thiết kế hệ thống giải phóng thuốc qua màng CVK

- Khảo sát, đánh giá khả năng giải phóng thuốc Neomycin sufate từ màng CVK đã nạp thuốc trong môi trường pH khác nhau

5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

5.1 Ý nghĩa khoa học

- Tăng thêm hiểu biết về ứng dụng của màng CVK

- Mong muốn khắc phục được một số tác dụng phụ của thuốc neomycin sulfate trong chữa bệnh, nâng cao tối đa hiệu quả của thuốc mà tiết kiệm được chi phí

- Bên cạnh đó ta cũng có thể tìm ra được những ưu nhược điểm của

màng CVK để từ đó có những hướng nghiên cứu làm tăng các đặc tính cả

màng CVK, hạn chế các yếu điểm của màng để ứng dụng màng trên nhiều các lĩnh vực khác nhau Nghiên cứu về màng CVK để tăng thêm hiểu biết về ứng dụng của màng CVK, tìm ra được môi trường tạo ra màng CVK có khả năng nạp thuốc và giải phóng kéo dài

5.2 Ý nghĩa thực tiễn

- Xây dựng được quy trình tạo màng CVK

- Từ màng CVK đã được tạo ra ở một số môi trường được dùng để so sánh khả năng giải phóng thuốc nhằm xây dựng hệ thống giải phóng thuốc kéo dài, có thể làm tăng khả dụng sinh học của thuốc

NỘI DUNG CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Gluconacetobacter xylinus

1.1.1 Vị trí phân loại

G.xylinus thuộc nhóm vi khuẩn Acetic, chi Acetobacter, họ Pseudomonadaceae

Là loại hiếu khí bắt buộc, có chu mao và sản xuất cellulose ngoại bào.[8]

Theo khóa phân loại của Bergey, G.xylinus thuộc:

• Lớp: Schizomycetes

• Bộ: Pseudomonadales

• Bộ phụ: Pseudomonadieae

• Họ: Pseudomonadaceae

1.1.2 Đặc điểm vi khuẩn G.xylinus

G.xylinus có dạng hình que, thẳng hay hơi cong, kích thước ngang khoảng 0,8 µm, dài khoảng 2-3 µm, vi khuẩn không sinh bào tử, gram âm, không di động, sắp xếp riêng rẽ đôi khi xếp thành chuỗi, nhưng khi tế bào già hay do điều kiện môi trường nuôi cấy, hình dạng có thể bị biến đổi: tế bào dài hơn, phình to ra, phân nhánh hoặc không phân nhánh[9]

0,6-“Trong môi trường nuôi cấy rắn, sau khoảng từ 3 – 7 ngày nuôi cấy, sẽ thu được khuẩn lạc nhỏ rồi lớn dần, đường kính hạt từ 2 – 5 mm, tròn, rìa mép trơn, có màu kem, hơi trong Nhưng sau một tuần khuẩn lạc to, đục, có màu cafe sữa rồi khô dần.”

1.1.3 Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn G xylinus

“G.xylinus là loài vi khuẩn hiếu khí Nhiệt độ tối ưu cho vi khuẩn phát triển

từ 25 – 300C Ở nhiệt độ 370C tế bào sẽ bị suy thoái hoàn toàn Nhiệt độ thích hợp nhất là 250 C Vi khuẩn tăng trưởng trong khoảng pH từ 3- 8, pH tối ưu để sản xuất cellulose là 5,5.”

G.xylinus sử dụng cacbon từ nhiều loại đường khác nhau, tùy thuộc vào chủng

mà lượng đường có thể thay đổi, nhưng đường hay được sử dụng và cho hiệu suất cao là: glucose, fructose, manitol, sorbitol, nguồn đường cho hiệu suất thấp hơn là glycerol, galactose, sucrose, maltose [8,9]

Khi nuôi cấy, để tránh nhiễm các loài vi khuẩn lạ, người ta thường bổ sung acid acetic vào môi trường

“Trong môi trường nuôi cấy lỏng, vi khuẩn sử dụng đường để chuyển hóa thành cellulose tạo lớp màng dày trên bề mặt của môi trường Sau 36 – 48 giờ lớp màng dày, trong và đạt đến độ dày nhất định sau 7 – 19 ngày.”

1.1.4 Môi trường nuôi cấy Gluconacetobacter xylinus

Môi trường nuôi cấy G.xylinus là môi trường tổng hợp từ các nguồn dinh dưỡng cần thiết như nguồn cacbon, nito, nguồn sulfur và phospho, các yếu tố tăng trưởng và các yếu tố vi lượng

Nhu cầu sử dụng đường của G.xylinus là rất lớn và giữ vai trò quan trọng trong quá trình tổng hợp CVK nên có rất nhiều nghiên cứu và đề nghị sử dụng các sản phẩm thứ cấp trong các ngành công nghiệp khác như: rỉ đường, nước dừa già, nước mía, nước vo gạo, để làm nguyên liệu trong nuôi cấy G.xylinus Trong đó có thể sử dụng

cả nước cất làm môi trường chuẩn và đây được xem là môi trường kinh điển trong nuôi cấy G.xylinus.[9]

Bảng 1.1 Thành phần môi trường chuẩn:

Bảng 1.2: Thành phần môi trường nước vo gạo

Tên quốc tế: Neomycin Sulfate

Loại thuốc: Là dạng muối sulfat của neomycin, một kháng sinh nhóm aminoglycoside Công thức hóa học: C23H46N6O13.XH2SO4

Neomycin là một kháng sinh aminoglycoside được tìm thấy trong nhiều loại

thuốc bôi tại chỗ như kem, thuốc mỡ và thuốc nhỏ mắt Neomycin được phát hiện từ năm 1949 Chúng được tìm thấy trong phòng thí nghiệm của nhà khoa học Selman Waksman Neomycin thuộc nhóm kháng sinh aminoglycoside có chứa hai hoặc nhiều đường amino liên kết với nhau bằng liên kết glycosidic [11]

Neomycin thường được sử dụng như dưới dạng thuốc bôi tại chỗ, chẳng hạn như Neosporin Chúng cũng có thể được uống, nếu dùng theo cách này thì neomycin thường được kết hợp với các thuốc kháng sinh khác Neomycin không được hấp thụ qua đường tiêu hóa và được sử dụng như một biện pháp dự phòng cho bệnh não gan

và tăng cholesterol máu Bằng cách tiêu diệt vi khuẩn trong đường ruột, kháng sinh này giúp giữ mức amoniac thấp và ngăn ngừa bệnh não gan, đặc biệt là trước khi phẫu thuật GI Chúng hoạt động để tiêu diệt vi khuẩn kháng streptomycin, kể cả trong trường hợp các vi khuẩn lao Thuốc này cũng đã được sử dụng để điều trị sự phát triển quá mức của các vi khuẩn ruột non Chúng không được tiêm, vì neomycin cực

kỳ độc thận (gây ra tổn thương thận), ngay cả khi so sánh với các aminoglycosid khác[12] Ngoại lệ là khi neomycin được tích hợp, với lượng rất nhỏ, như một chất bảo quản trong một số vaccine-thường là 25 μg mỗi liều

“Thuốc này được sử dụng để làm giảm nguy cơ nhiễm trùng sau khi phẫu thuật đường ruột Neomycin thuộc nhóm thuốc kháng sinh aminoglycoside Nó hoạt động bằng cách ngăn chặn sự tăng trưởng của vi khuẩn trong ruột Neomycin cũng có thể được sử dụng kết hợp với chế độ ăn uống đặc biệt để điều trị một vấn đề nghiêm trọng trong não (bệnh não gan) Tình trạng này được gây ra do sự tạo thành quá nhiều một vài chất tự nhiên (amoniac) Thông thường, gan sẽ đào thải amoniac, nhưng bệnh gan

có thể tạo ra quá nhiều amoniac bện trong cơ thể [11] Thuốc này giúp điều trị bệnh não bằng cách giết chết các vi khuẩn đường ruột nhất định tạo ra amoniac.”

“Thuốc này chỉ điều trị chứng nhiễm khuẩn Thuốc sẽ không hiệu quả cho chứng nhiễm virus (như cảm lạnh thông thường, cúm) Việc sử dụng không cần thiết hoặc lạm dụng bất kỳ kháng sinh nào có thể dẫn đến giảm hiệu quả của thuốc.”

1.3 Lịch sử nghiên cứu đề tài

1.3.1 Tình hình trong nước

Ở Việt Nam, việc nghiên cứu và ứng dụng màng VCK còn ở mức độ khiêm tốn, các nghiên cứu ứng dụng mới chỉ dừng lại bước đầu nghiên cứu Các kết quả ứng dụng của màng CVK hầu như mới chỉ dừng lại ở điều kiện thí nghiệm CVK là đối tượng nghiên cứu của nhiều nhà khoa học ở Việt Nam đòi hỏi sản xuất CVK với quy

mô công nghiệp, tạo CVK với độ bền chắc hơn, phát triển nhanh trong các loại môi trường khác nhau [13]

Tại Đại học Y dược thành phố Hồ Chí Minh, Nguyễn Văn Thanh cùng nhóm nghiên cứu đã thành công với đề tài “Nghiên cứu chế tạo màng cellulose trị bỏng từ Acetobacter xylinum” [14]

“Mong muốn khắc phục được một số tác dụng phụ của thuốc neomycin sulfate trong chữa bệnh, nâng cao tối đa hiệu quả của thuốc mà tiết kiệm được chi phí Màng CVK có thể tự sản xuất trong nước từ những nguồn nguyên liệu dễ kiếm và giá thành thấp, có những đặc tính phù hợp trong việc thiết kế, chế tạo hệ thống hấp thụ thuốc neomycin của màng cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường chuẩn.”

Neomycin sulfate có trong danh mục thuốc thiết yếu Việt Nam ban hành lần thứ 4 năm 1999 Neomycin sulfate được bào chế dạng kem, dung dịch pha chế với một sô hoạt chất khác Tuy nhiên hướng nghiên cứu sử dụng màng CVK để hấp thuốc Neomycin thì chưa có công trình nào nghiên cứu [14]

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Nghiên cứu so sánh khả năng giải phóng thuốc của vật liệu Cellulose nạp Neomycin sufate tạo ra từ Gluconacetobacter xilinus nuôi trong một số môi trường 2.1.2 Nguyên liệu và hóa chất

 Nguyên liệu: nước vo gạo, nước dừa già, thuốc neomycin sulfate

 Hóa chất:

Các hóa chất đặc biệt như cao nấm men, pepton

Các hóa chất thông thường: amoni sunfat, diamoni phosphat, acid acetic, NaOH, HCl, đường glucose

2.1.3 Thiết bị và dụng cụ

 Thiết bị:

- Nồi hấp khử trùng HV - 110/HIRAIAMA

- Máy đo quang phổ UV - 2450 (Shimadzu - Nhật Bản)

- Cân phân tích (Sartorius - Thụy Sĩ)

- Cân kỹ thuật - Sartorrius TE 3102 S

- Buồng cấy vô trùng (Haraeus)

- Tủ sấy, tủ ấm (Binder - Đức)

- Máy khuấy từ gia nhiệt (IKA - Đức)

- Máy nước cất 2 lần (Hamilton - Anh)

- Hộp nhựa và đĩa 24 giếng để lên men tạo vật liệu CVK có các kích thước:

10 x15 cm, 3 x 5 cm, 1,5 x 1,5 cm, bình tam giác, ống nghiệm và các dụng

cụ hóa sinh khác

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Chuẩn bị màng CVK

2.2.1.1 Lên men thu màng CVK thô

Môi trường lên men thu màng CVK

Bảng 2.1 Thành phần các môi trường thu màng CVK

Các bước lên men thu màng CVK từ một số môi trường

- Bước 1: Môi trường được chuẩn bị theo Bảng 2.1

- Bước 2: Các môi trường được hấp khử trùng ở 1130C trong 15 phút

- Bước 3: Các môi trường sau khi lấy ra sẽ được khử trùng bằng tia UV trong

15 phút và để nguội môi trường

- Bước 4: Thêm 10% dịch giống và 2% acid acetic, lắc đều cho giống phân bố đều trong dung dịch

- Bước 5: Bịt miệng lọ bằng gạc vô trùng sau đó ủ tĩnh trong khoảng 6 – 8 ngày

ở 260C

- Bước 6: Thu màng CVK thô và rửa sạch dưới vòi nước

Chọn màng CVK có độ dày từ 0,3 - 0,5 cm làm hấp thụ và giải phóng thuốc 2.2.1.2 Tạo màng CVK tinh chế

- Sau khi màng được ủ tĩnh ở 26°C trong 6 - 14 ngày, đem màng CVK nhúng vào nước cất 2 ngày, sau đó lấy màng CVK đem tinh chế bằng cách rửa nhiều lần theo quy trình ở HÌNH 2.1:

Tách màng CVK thô

Ép loại nước Ngâm trong NaOH 3%

48 giờ, rửa và ép

Ngâm trong HCl 3%

48 giờ, rửa và ép Ngâm trong nước

48 giờ, kiểm tra tạp chất Thu CVK tinh chế

Hình 2.1 Quy trình nuôi cấy thu nhận CVK Trong màng CVK chứa một lượng lớn vi khuẩn, vì vậy, ta ngâm màng trong NaOH 3% giúp phá vỡ thành tế bào vi khuẩn và giải phóng nội độc tố tế bào vi khuẩn

Sau khi ngâm màng trong NaOH ta rửa nước rồi ép màng Sau đó để trung hòa hết NaOH ta ngâm HCl 3%

Màng sau khi ngâm HCl thì lấy ra rửa và ngâm nước để trung hòa hết acid thì thu được màng CVK tinh khiết

2.2.1.3 Kiểm tra độ tinh khiết màng CVK tinh chế

Kiểm tra độ tinh khiết của màng CVK đảm bảo màng sau khi xử lý đã được loại các tạp chất

2.2.1.4 Phương trình đường chuẩn NS trong PBS (pH = 7,4)

Đo mật độ quang của các nồng độ NS khác nhau bằng máy quang phổ UV_

2450 tại Phòng thí nghiệm Trung tâm NCKH&CGCN Trường ĐHSP Hà Nội 2, sau