Mục đích của nghiên cứu
Nghiên cứu việc sử dụng màng BC để hấp thụ thuốc Omeprazole natri, nhờ đó có thể giảm tối đa các hạn chế của thuốc
Tạo điều kiện cho chủng vi khuẩn G.xylinus phát triển trong môi trường nước vo gạo Từ đó thu được màng BC và tiến hành nạp thuốc vào màng
Tìm ra được điều kiện nào lượng thuốc hấp thu vào màng BC đạt hiệu quả cao nhất.
Nội dung nghiên cứu
Tạo màng BC và tinh chế màng trước khi tiến hành các thí nghiệm Tiến hành nạp thuốc vào màng BC
Khảo sát sự hấp thụ thuốc của màng BC để từ đó tìm ra điều kiện nào là tối ưu nhất.
Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
Các sản phẩm có nguồn gốc từ BC đem lại rất nhiều hiệu quả cho con người
Trong môi trường nuôi cấy tĩnh, khả năng hấp thụ thuốc Omeprazole natri của màng BC có thể được đánh giá, từ đó giúp giảm thiểu hạn chế của thuốc và nâng cao hiệu quả sử dụng.
Sau khi khảo sát được khả năng hấp thụ thuốc của màng BC trên thuốc omeprazole natri, có thể tiến hành nghiên cứu trên các loại thuốc khác
Nghiên cứu việc sử dụng màng BC trong phòng thí nghiệm để hấp thụ thuốc giúp giảm thiểu những hạn chế không cần thiết trong quá trình nghiên cứu Omeprazole natri dạng thương mại.
Sau khi tiến hành nghiên cứu, có thể giảm giá thành của vật liệu, giúp cho người nghèo vẫn có thể mua được.
Tính mới của đề tài
Cung cấp các thông số về khả năng hấp thụ thuốc Omeprazole natri của màng BC
Sau khi khảo sát được khả năng hấp thụ thuốc của màng BC trên thuốc Omeprazole natri, có thể tiến hành nghiên cứu trên các loại thuốc khác
TỔNG QUAN
Vị trí và đặc điểm phân loại của Gluconacetobacter xylinus trong sinh giới
1.1.1 Vị trí phân loại của Gluconacetobacter xylinus trong sinh giới
Theo hệ thống danh pháp quốc tế 1990, Acetobacter xylinum là tên gọi chính thức
Theo “Bergey’s manual of determinative bacteriology” (1957)
“Acetobacter xylinum được xếp vào chi Acetobacter, thuộc họ
Pseudomonadaceae, bộ Pseudomonadales, lớp Schizomycetes” [12] Đến năm 1974, theo “Bergey’s manual of determinative bacteriology”,
“Acetobacter xylinum lại được coi như là một loài phụ của Acetobacter aceti, thuộc chi Acetobacter và được nhóm vào những chi không rõ nguồn gốc”
Năm 1984 theo Bergey [2], Acetobacter xylinum được xếp vào chi Acetobacter, thuộc họ Acetobacteraceae Họ vi khuẩn này gồm 2 chi là Acetobacter và Gluconobacter
Theo Bergey (2005) [14], Acetobacter xylinum được đổi tên thành Gluconacetobacter xylinus và xếp vào chi Gluconacetobacter thuộc họ vi khuẩn Acetobacteraceae Họ này gồm 6 chi: Acetobacter, Acidomonas, Asaia,
1.1.2.1 Đặc điểm hình thái, tế bào học
G.xylinus có dạng hình que, thẳng hoặc hơi cong, có thể di động hoặc không Nhóm vi khuẩn này không có khả năng sinh bào tử, thường đứng riêng lẻ hoặc tập hợp với nhau thành một chuỗi Khi tế bào nhuộm Gram, các đặc điểm nhuộm có thể thay đổi Điều này có thể giải thích là do các tế bào của vi khuẩn già đi hay do sự thay đổi của môi trường
Khi môi trường nuôi cấy thiếu hụt chất dinh dưỡng, G.xylinus sẽ thay đổi hình thái để thích ứng Tuy nhiên, nếu tình trạng này kéo dài, các chủng vi khuẩn có thể bị thoái hóa và hoạt tính sinh học của chúng sẽ giảm đáng kể.
Khuẩn lạc của G.xylinus có kích thước nhỏ, bề mặt nhầy và trơn, với phần giữa lồi lên, dày hơn và sẫm màu hơn so với các phần xung quanh, trong khi rìa mép khuẩn lạc nhẵn.
1.1.2.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hoá
G.xylinus phát triển tốt nhất ở nhiệt độ từ 25-35°C và pH khoảng 4-6 Tuy nhiên, khi nhiệt độ vượt quá 37°C, các tế bào của vi khuẩn này sẽ bắt đầu suy thoái, ngay cả trong điều kiện môi trường thuận lợi.
Chủng G.xylinus là vi khuẩn chịu axit, do đó trong môi trường nuôi cấy thường bổ sung axit axetic Sự hiện diện của axit axetic giúp ngăn chặn khả năng nhiễm khuẩn trong các môi trường nuôi cấy, tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của vi khuẩn.
Có khả năng oxi hóa etanol thành axit axetic, CO2 và H2O
Tạo thành các bọt khí khi phản ứng với catalase
Có khả năng chuyển hóa đường glucozo thành axit gluconic, đồng thời giúp chuyển hóa các phân tử glyxerol thành dihidroaxeton
Không sinh sắc tố nâu
Sau một thời gian nuôi cấy trên môi trường thạch, khuẩn lạc G.xylinus sẽ hình thành với hai dạng chính: nhẵn và xù xì Rìa khuẩn lạc có thể gợn sóng hoặc bằng phẳng, với màu sắc trong suốt hoặc trắng Các khuẩn lạc này thường lồi trên bề mặt môi trường, giúp dễ dàng tách chúng ra khỏi môi trường nuôi cấy.
Khi nuôi cấy trong môi trường lỏng tĩnh, lớp màng sinh học (màng BC) sẽ hình thành trên bề mặt môi trường Ngược lại, khi nuôi cấy trong điều kiện lắc, cellulose sẽ được tạo ra dưới dạng hạt.
Cellulose có cấu trúc khác nhau tùy thuộc vào điều kiện môi trường, dẫn đến những đặc tính khác biệt trong từng hoàn cảnh Các kích thước của cellulose cũng đa dạng và phân tán trong môi trường, ảnh hưởng đến tính chất của chúng.
1.1.3 Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn Gluconacetobacter xylinus
Môi trường thích hợp để chủng vi khuẩn G.xylinus sinh trưởng, phát triển là môi trường tổng hợp có đầy đủ các chất dinh dưỡng thiết yếu như: C,
N, S, P, Ngoài ra, các nguyên tố vi lượng và các yếu tố tăng trưởng cũng tạo điều kiện cho quá trình sinh trưởng phát triển của vi khuẩn thuận lợi hơn
G.xylinus có nhu cầu sử dụng đường rất cao, vì vậy các sản phẩm như nước dừa già và rỉ đường đã được đề xuất làm nguyên liệu nuôi cấy cho vi khuẩn này.
Nước vo gạo là một sản phẩm tự nhiên, dễ tìm và có giá thành thấp Nó chứa nhiều dưỡng chất quý giá, bao gồm vitamin nhóm B và E, cùng với các khoáng chất có lợi như sắt (Fe).
Cu, Zn, các axit amin,… Do đó, nước vo gạo có thể coi là môi trường phát triển tương đối thuận lợi cho chủng vi khuẩn Gluconacetobacter xylinus
Không nên sử dụng nước vo gạo sau 3 giờ để tránh tình trạng nước bị chua và giảm hàm lượng chất dinh dưỡng.
Thành phần chất dinh dưỡng của nước vo gạo được thể hiện ở bảng 1.1
Bảng 1.1: Thành phần dinh dưỡng của nước vo gạo
Chất xơ tiêu hóa được 21g
Giới thiệu về màng BC
1.2.1 Đặc điểm cấu trúc của màng BC
Cellulose vi khuẩn được hình thành từ chuỗi polime glucopyranose liên kết với nhau bằng liên kết β-1,4-glucan, với cấu trúc thay đổi tùy theo điều kiện nuôi cấy Mặc dù có cùng thành phần cellulose, nhưng cellulose vi khuẩn khác biệt so với cellulose thực vật Cellulose vi khuẩn sở hữu nhiều đặc tính vượt trội, bao gồm khả năng thấm hút nước cao, chịu nhiệt tốt, độ bền cơ học cao, đường kính sợi nhỏ và độ tinh khiết cao hơn cellulose thực vật Ngoài ra, cellulose vi khuẩn còn an toàn, không độc hại và không gây dị ứng cho người sử dụng.
Năm 1886, Brown là nhà khoa học đầu tiên tạo ra màng BC từ vi khuẩn G.xylinus Ông phát hiện rằng màng BC được cấu tạo từ các sợi siêu nhỏ hemicellulose có đường kính 1.5nm Những sợi hemicellulose này tập hợp lại thành các bó, và các bó này kết hợp với nhau để tạo thành các dãy dài khoảng 100nm, với đường kính từ 3-8nm.
Hình 1.1: Cấu trúc của BC
1.2.2 Cấu trúc kết tinh màng BC
Hiện nay, cấu trúc của BC và dạng kết tinh của cellulose đã được xác định thông qua các kỹ thuật hiện đại như phổ hồng ngoại, phổ Raman và phổ cộng hưởng từ hạt nhân.
Màng BC bao gồm hai loại cấu trúc tinh thể chính là Iα và Iβ Nghiên cứu cho thấy cả hai cấu trúc tinh thể này đều xuất hiện trong sợi cellulose Trong cellulose thực vật, tinh thể Iβ chiếm ưu thế, trong khi tinh thể Iα lại ít hơn Cụ thể, các tinh thể Iα chiếm khoảng 64-71% trong cấu trúc của BC, so với chỉ khoảng 20% trong cellulose thực vật.
Cấu trúc tinh thể ảnh hưởng mạnh mẽ đến các tính chất của cellulose Mặc dù vậy, nghiên cứu về mối liên hệ giữa các đặc tính của cellulose và cấu trúc tinh thể vẫn còn hạn chế.
1.2.3 Tính chất của màng BC
- Màng BC trong suốt, khi sờ vào có cảm giác mềm mại, trơn nhẵn do có tỉ lệ Iα cao
- Sức căng, độ bền, độ dai của màng BC tốt, chịu được lực kéo cao
- Có khả năng hấp thụ nước, giữ nước cao gấp nhiều lần so với trọng lượng của chính nó
Màng sinh học BC hiện tại không chứa ligin và hemicellulose, do đó có khả năng phân hủy hoàn toàn.
- Khối lượng nhẹ, khả năng chịu nhiệt tốt [5]
- Quan sát màng BC trên kính hiển vi điện tử cho thấy màng có các sợi cellulose rất nhỏ, mảnh, đồng nhất, liên kết chặt chẽ với nhau [3]
1.2.4 Đặc tính của màng BC
Sau một thời gian nuôi cấy trong môi trường tĩnh, bề mặt môi trường sẽ hình thành một lớp màng mỏng Sau khi tinh chế và làm khô, lớp màng này sẽ tạo ra sản phẩm mỏng như giấy với độ dày từ 0.01 đến 0.5nm.
Màng BC sở hữu nhiều đặc tính nổi bật như độ đàn hồi tốt, khả năng hút và thấm nước cao, chịu nhiệt, và khả năng phân hủy bởi vi sinh vật Ngoài ra, màng BC không gây kích ứng hay độc hại cho con người, đặc biệt có khả năng cản khuẩn hiệu quả Chính nhờ những đặc điểm này, màng BC đã được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau.
Một số ứng dụng của màng BC như:
Sử dụng màng BC trong xử lý nước thải giúp đơn giản hóa quy trình và giảm thiểu hạn chế của một số loại thuốc khi tiến hành nạp thuốc vào màng.
Mặt nạ dưỡng da nhân tạo được chế tạo để điều trị các bệnh về tim mạch và thay thế tạm thời cho da bị bỏng Ngoài ra, màng BC còn có thể được sử dụng để tạo ra màng nano bọc thuốc hiệu quả.
Tổng quan về thuốc
1.3.1 Tên khoa học và cấu tạo
- Tên chung quốc tế: Omeprazole
- Tên theo danh pháp IUPAC: 5- methoxy- 2-[[(4 - methoxy - 3,5 - dimethyl – 2 - pyridinyl) methyl] sulfinyl] - 1H - benzimidazole
Hình 1.2 Công thức cấu tạo của Omeprazole
1.3.2 Loại thuốc và dạng thuốc
- Loại thuốc: thuộc nhóm thuốc có khả năng ức chế bơm proton, chống loét dạ dày, tá tràng
+ Viên nang đến ruột mới tan 1mg - 20mg
+ Lọ bột tiêm 40mg kèm ống dung môi 10ml
Thuốc có dạng bột màu nâu nhạt, khó tan trong nước nhưng dễ tan trong dung dịch dicloromethan và tan ít trong ethanol 96% cũng như methanol Nó tan nhiều trong kiềm loãng và có nhiệt độ nóng chảy khoảng 155°C, kèm theo sự phân huỷ.
Omeprazole là một hợp chất lưỡng tính, có khả năng hấp thụ mạnh bức xạ tử ngoại, và được ứng dụng trong định tính, định lượng cũng như bào chế thuốc Độ pH đóng vai trò quan trọng trong việc xác định sự ổn định của omeprazole; trong môi trường kiềm, hợp chất này khá bền vững, nhưng lại dễ dàng bị phân hủy trong môi trường axit.
1.3.4 Dược lý và cơ chế tác dụng
Omeprazole là một dẫn xuất của benzimidazole, không ức chế enzym trong môi trường trung tính Tuy nhiên, khi pH ≤ 5, nó được proton hóa thành hai dạng acid sulphenic và sulphenamic, giúp gắn kết với nhóm sulfohydryl của enzym H + - K + - ATPase trong tế bào thành, từ đó ức chế bài tiết acid kéo dài đến 48 giờ.
Omprazole natri ức chế sự tiết dịch vị của dạ dày nhờ khả năng ức chế các bơm proton Thuốc được hấp thụ tốt nhất ở ruột non sau khoảng 3-6 giờ, với sinh khả dụng đạt khoảng 35% sau liều đầu tiên và tăng lên trên 60% khi sử dụng nhiều liều.
Liều lượng sử dụng thuốc ảnh hưởng đến khả năng hấp thụ của thuốc Omeprazole natri có độ liên kết cao với protein huyết tương và phân bố đến các mô đặc biệt trong tế bào thành dạ dày Sau 40 phút sử dụng, nồng độ thuốc trong cơ thể giảm xuống một nửa Tuy nhiên, thuốc có tác dụng ức chế bài tiết kéo dài, vì vậy chỉ cần sử dụng một lần mỗi ngày.
Chất chuyển hóa chủ yếu được chuyển hóa tại gan và đào thải nhanh chóng qua nước tiểu (80%), trong khi phần còn lại được thải qua phân Một số chất chuyển hóa không có hoạt tính nhưng lại tương tác với nhiều loại thuốc khác do ức chế enzyme của cytocrom P450 trong tế bào gan.
Đối với người già hoặc những người có chức năng thận suy giảm, các dược động học thường không có ý nghĩa Trong trường hợp người có chức năng gan suy giảm, sinh khả dụng của thuốc có xu hướng tăng, trong khi thời gian bán thải của thuốc giảm đáng kể, nhưng không ghi nhận sự tích lũy thuốc trong cơ thể.
- Điều trị bệnh loét dạ dày – tá tràng
- Chữa lành các tổn thương dạ dày và tá tràng do axit gây nên
- Điều trị hội chứng Zollinger - Ellison
1.3.7 Tác dụng phụ của thuốc
Các tác dụng phụ phổ biến bao gồm buồn ngủ, đau đầu, chóng mặt và rối loạn tiêu hóa Trong những trường hợp nghiêm trọng hơn, người dùng có thể gặp phải tình trạng phát ban, ngứa, rụng tóc và mất ngủ Nặng nhất, các tác dụng phụ có thể dẫn đến co thắt phế quản, rối loạn thần kinh và các vấn đề nghiêm trọng khác.
12 về thị giác, đau cơ, đau khớp,…
Giới thiệu tổng quan về tình hình nghiên cứu
1.4.1 Tình hình nghiên cứu màng BC
Vào năm 1989, Brown đã sử dụng màng BC làm môi trường phân tách trong xử lý nước và làm chất mang cho pin cũng như năng lượng tế bào, đồng thời chế tạo vải đặc biệt Các nghiên cứu của Jonas và Farad (1998) cho thấy màng BC có khả năng biến đổi độ nhớt, được ứng dụng trong sản xuất sợi truyền quang và làm môi trường cơ chất trong sinh học, thực phẩm, hoặc thay thế thực phẩm Ngoài ra, Nogiet và cộng sự (2005), cùng với Jonas và Farad (1998) cũng như Soloknicki và các đồng nghiệp (2006), đã ứng dụng màng BC để sản xuất giấy chất lượng cao và làm cơ chất để cố định protein hoặc trong sắc kí.
Màng BC không chỉ được ứng dụng trong y tế mà còn trong lĩnh vực làm đẹp Nghiên cứu của Hamlyn và cộng sự (1997), Cienchanska (2004), Legeza và cộng sự (2004), Wan và Millon (2005), cùng với Czaja và cộng sự (2006) cho thấy màng BC có hiệu quả cao khi được sử dụng để điều trị các vết thương hở và bỏng Đặc biệt, tác giả Wan từ Canada đã đăng ký bản quyền cho việc sử dụng màng BC từ Acetobacter xylinum trong điều trị bỏng Ngoài ra, Jonas và Farad (1998), cùng với Czaja và cộng sự (2006) đã phát triển màng BC thành da nhân tạo và mặt nạ dưỡng da cho phụ nữ.
Tại Việt Nam, nghiên cứu về việc sử dụng màng BC trong điều trị bỏng đang ngày càng hiệu quả Năm 2006, Nguyễn Văn Thanh và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu về màng BC từ Acetobacter xylinum, thiết lập các đặc tính của màng BC, từ đó tạo cơ sở cho việc chế tạo màng sinh học phục vụ điều trị bỏng tại Việt Nam.
Phương pháp điều trị bỏng bằng thuốc có nguồn gốc tự nhiên đã được áp dụng từ lâu và mang lại nhiều lợi ích trong việc chữa trị vết thương Màng Bacterial cellulose (BC) được tạo ra từ vi khuẩn Acetobacter xylinum có thành phần tự nhiên, giúp tăng hiệu quả trong điều trị bỏng Nghiên cứu của Đinh Thị Kim Nhung, Nguyễn Thị Thùy Vân, và Trần Như Quỳnh (2012) cho thấy màng BC có sợi cellulose nhỏ, dai, độ bền kéo cao, thấu khí tốt và khả năng hút nước hiệu quả, mở ra triển vọng ứng dụng trong điều trị bỏng.
1.4.2 Tình hình nghiên cứu về Omeprazole natri
Nhiều nghiên cứu thực nghiệm đã chỉ ra hiệu quả tích cực của thuốc omeprazole natri trong điều trị các bệnh dạ dày Thuốc này có khả năng giảm tiết acid mạnh mẽ, mang lại hiệu quả giảm triệu chứng nhanh chóng và tỷ lệ lành loét cao.
Nghiên cứu về hiệu quả của thuốc không chỉ dừng lại ở việc sử dụng thuốc, mà còn mở rộng ra việc đánh giá khả năng tiêu diệt vi khuẩn HP với omeprazole natri qua các phác đồ điều trị khác nhau Kết quả nghiên cứu cho thấy tính kháng thuốc của vi khuẩn là yếu tố quyết định đến hiệu suất tiêu diệt HP, vì vậy việc đánh giá tính kháng thuốc trước khi lựa chọn phác đồ điều trị cho bệnh nhân là rất quan trọng.
Vào năm 1973, các nghiên cứu về cimetidine đã dẫn đến ý tưởng của các nhà khoa học Thụy Điển về việc gắn vòng Benzylimidazol vào chất này nhằm tạo ra một hợp chất mới với khả năng kháng acid mạnh hơn Đến năm 1975, Timoprazole được phát minh với tác dụng ức chế bài tiết acid mạnh mẽ, nhờ vào việc bất hoạt enzym H+, K+/ATPase.
Tiếp theo đó hàng loạt các thay đổi về công thức hóa học để đến năm
Omeprazole, được tổng hợp vào năm 1979, đã được giới thiệu rộng rãi tại hội nghị tiêu hóa toàn cầu ở Rome vào năm 1988 và nhanh chóng trở nên phổ biến trong lâm sàng.
Một số đề tài nghiên cứu liên quan đến thuốc omeprazole như:
“Formulation, Characterisation and Stabilisation of Buccal Films for
Paediatric Drug Delivery of Omeprazole” Sajjad Khan, Joshua S Boateng,
John Mitchell and Vivek Trivedi, AAPS PharmSciTech January 2015,
“Preparation and evaluation of floating microspheres of omeprazole microspheres by solvent evaporation method”, Ramya Shivani B and
Krishna Sailaja A, International Journal Available, August 2015,… tuy nhiên hướng ứng dụng tăng sinh khả dụng của thuốc omeprazole natri trên màng
BC vẫn còn ít người nghiên cứu
Phùng Thị Vinh và Trịnh Văn Lẩu (2007) đã thực hiện nghiên cứu đánh giá tương đương sinh học của viên nang Helinzole (Omeprazol 20G) bằng mô hình đơn liều kết hợp đa liều Nghiên cứu này được thực hiện tại Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương thuộc Bộ Y tế, với sự tham gia của Nguyễn Nam Hương.
(2009), Nghiên cứu bào chế viên nang chứa pellet omeprazol tan trong ruột,
Trần Hữu Giáp và các cộng sự đã thành công trong việc tổng hợp thuốc ức chế bơm proton omeprazol qua hai bước chính: tạo chất trung gian sulfid 3 và oxy hóa sulfid để tạo ra omeprazol Nghiên cứu này được công bố trong Tạp chí Dược học, T 55, S 2 (2015).
ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Vật liệu nghiên cứu
2.1.1 Hóa chất và dung môi sử dụng trong nghiên cứu
- Chủng vi khuẩn G.xylinus được mua từ Nhật Bản
- Thuốc omeprazole natri (95%) xuất sứ từ Ấn Độ
- Dung môi là dung dịch NaOH 0,1M
- Các hóa chất được cung cấp từ Viện Nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng - Trường ĐHSP Hà Nội 2
- Màng BC được lên men từ chủng vi khuẩn G.xylinus trong môi trường nước vo gạo
2.1.2 Thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu
- Buồng cấy vô trùng (Haraeus)
- Cân kỹ thuật (Sartorius - TE612)
- Cân phân tích (Sartorius - Thụy sỹ)
- Khuấy từ gia nhiệt (IKA - Đức)
- Máy đo quang phổ UV - 2450 (Shimadzu - Nhật Bản)
- Máy lắc tròn tốc độ chậm (Orbital Shakergallenkump - Anh)
- Nồi hấp khử trùng HV - 110/HIRAIAMA
- Tủ sấy, tủ ấm (Binder - Đức)
- Các dụng cụ hóa sinh thông dụng khác.
Đối tượng nghiên cứu
Khả năng hấp thụ omeprazole natri của các loại vật liệu BC được tạo ra từ nước vo gạo bằng phương pháp lên men.
Phạm vị nghiên cứu, địa điểm và thời gian
Phạm vi nghiên cứu: thực hiện trên quy mô phòng thí nghiệm
16 Địa điểm: Phòng thí nghiệm Sinh lí người và động vật - Viện Nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng – Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2
Thời gian: Tháng 10-2018 đến tháng 4-2019
Phương pháp nghiên cứu
2.4.1 Phương pháp chế tạo màng BC
2.4.1.1 Lên men tạo màng BC từ môi trường nước vo gạo
Bước 1 : Chuẩn bị môi trường lên men chủng vi khuẩn theo bảng 2.1
Bảng 2.1: Môi trường lên men màng BC
Thành phần Môi trường gạo
Lưu ý: Đo và hiệu chỉnh pH trong khoảng từ 4-6 băng HCl hoặc NaOH Trong điều kiện pH thấp sẽ tránh sự lây nhiễm từ các vi khuẩn khác
Bước 2 : Đem môi trường vừa pha hấp khử trùng trong nồi hấp khử trùng HV-110/HIRAIAMA Ở 113C trong 15 phút
Bước 3: Sau khi hấp xong, khử trùng môi trường bằng tia UV trong 15 phút rồi để nguội
Bước 4 : Thêm 10% dịch giống vào môi trường, đem lắc đều để cho dịch giống phân bố hoàn toàn trong dung dịch
Bước 5: Chuyển dịch vào bình nuôi cấy có kích thước phù hợp với nghiên cứu, đảm bảo bịt kín miệng dụng cụ để ngăn ngừa nhiễm khuẩn Sau đó, để bình ở điều kiện tĩnh trong khoảng thời gian từ 4 đến 14 ngày tại nhiệt độ 28 độ C.
Bước 6 : Khi màng đạt độ dày cần nghiên cứu, tiến hành thu màng và rửa sạch
2.4.1.2 Xử lý vật liệu BC trước khi hấp thụ thuốc
Màng BC sau khi thu chứa nhiều tạp chất, vì vậy việc xử lý màng BC là cần thiết để loại bỏ các tạp chất này Quá trình này không chỉ giúp nâng cao hiệu suất hấp thụ thuốc mà còn phá hủy và trung hòa các độc tố do vi khuẩn gây ra.
- Phương pháp: Sau một thời gian nuôi cấy trong điều kiện tĩnh, thu được màng BC với các độ dày cần thiết
Màng BC chứa nhiều tạp chất, vì vậy việc hấp vật liệu trong NaOH nóng 3% ở nhiệt độ 113°C trong 15 phút bằng nồi hấp khử trùng sẽ phá vỡ thành tế bào vi khuẩn và giải phóng nội độc tố.
Sau khi ngâm NaOH, cần xả màng dưới vòi nước cho đến khi có màu trắng trong Để kiểm tra, sử dụng quỳ tím; nếu màng đạt trạng thái trung tính, bạn sẽ thu được BC tinh khiết.
2.4.1.3 Xác định pH của vật liệu BC tinh chế pH của màng BC sau khi tinh chế phải đạt mức trung tính Tiến hành đo pH của dịch chiết bằng máy đo pH
Cho bình nón vào máy lắc theo tỉ lệ khối lượng/thể tích Để bình ở nhiệt độ phòng trong 3 giờ, sau đó lấy mẫu dịch chiết để đo pH.
2.4.1.4 Xác định lượng vật liệu BC tạo thành
Vật liệu BC sau khi được tạo thành sẽ thông qua các công đoạn xử lí để tạo thành BC tinh chế
Vật liệu BC tinh chế được cân và sau đó sử dụng giấy thấm để loại bỏ 50% hàm lượng nước trong vật liệu, từ đó xác định khối lượng vật liệu BC còn lại.
2.4.1.5 Đánh giá độ tinh khiết của vật liệu BC
Mục đích của việc kiểm tra vật liệu BC sau tinh chế là xác định sự hiện diện của các tạp chất, cụ thể là đường glucozo và protein, nhằm đảm bảo chất lượng của vật liệu.
Tìm sự hiện diện của glucose trong vật liệu BC tinh chế
- Nguyên tắc: Kiểm tra bằng thuốc thử Fehling Nếu có kết tủa nâu đỏ, chứng tỏ vật liệu vẫn còn đường glucozo [3]
Chuẩn bị 4 ống nghiệm: ống 1 chứa nước cất, ống 2 chứa dung dịch đường glucose, ống 3 và ống 4 lần lượt chứa dịch chiết của màng có kích thước 0.5 cm và 1 cm sau khi đã được xử lý hóa học.
+ Nhỏ vào mỗi ống nghiệm 1 ml dung dịch Fehling, ngâm trong cốc nước nóng
Quan sát hiện tượng trong từng ống nghiệm để xác định sự xuất hiện của kết tủa nâu đỏ Nếu không có kết tủa, điều này chứng tỏ màng BC đã được tinh sạch Ngược lại, nếu thấy kết tủa, màng BC vẫn còn protein và cần tiếp tục xả nước.
Tìm sự hiện diện của protein trong vật liệu BC tinh chế
- Nguyên tắc: Kiểm tra bằng axit triclo axetic Nếu có kết tủa, chứng tỏ còn sót protein
+ Cắt nhỏ vật liệu BC rồi cho vào 50ml nước cất, lắc trên máy rung trong 10 phút
+ Chuẩn bị 3 ống nghiệm, ống 1 chứa nước cất, ống 2 và ống 3 lần lượt chứa dịch chiết của màng 0.5cm và 1cm
+ Nhỏ dung dịch acid triclor acetic 1% vào từng ống nghiệm, lắc đều
Nếu quan sát hiện tượng mà không thấy xuất hiện kết tủa, điều này chứng tỏ màng BC đã được tinh sạch Ngược lại, nếu có kết tủa, điều đó cho thấy màng BC vẫn còn protein và cần tiếp tục xả nước.
Vật liệu BC sau khi tinh chế phải đạt điều kiện:
+ Vật liệu khi cầm phải có sự mềm mại, dẻo dai, mỏng, khả năng che phủ tốt
+ Độ ẩm thích hợp, có khả năng hút nước và thấm nước tốt [15]
2.4.2 Quét phổ hấp thụ của thuốc omeprazole natri Đem cân 2mg thuốc vào 100ml dung môi NaOH 0.1M Trong khoảng bước sóng 200 nm đến 400 nm, sử dụng máy đo quang phổ UV-Vis 2450 để tìm bước sóng hấp thụ cực đại của thuốc omeprazole natri
2.4.3 Chế tạo màng BC nạp thuốc
2.4.3.1 Xây dựng đường chuẩn của thuốc Omeprazole natri
Phương pháp: Dùng máy quét quang phổ UV-Vis
Máy đo quang phổ UV-2450 của Shimadzu (Nhật Bản) được sử dụng để đo phổ vùng tử ngoại và khả kiến, với hệ thống quang học cung cấp ánh sáng đơn sắc trong khoảng từ 200 đến 800nm Máy sử dụng hai cuvet đo làm từ chất liệu thạch anh cho dung dịch thử và dung dịch đối chiếu, với dung sai độ dài quang trình là ± 0,005cm Việc làm sạch và thao tác cuvet đo được thực hiện cẩn thận để đảm bảo độ chính xác trong các phép đo.
Chuẩn bị dung dịch mẫu trắng là NaOH 0,1M
Chuẩn bị mẫu chuẩn với các nồng độ khác nhau bằng cách pha dung dịch thuốc ở các nồng độ 0,1 mg/ml, 0,2 mg/ml, 0,4 mg/ml, 0,6 mg/ml, 0,8 mg/ml và 1 mg/ml, sử dụng dung môi NaOH 0,1M.
Tiến hành đo OD của các dung dịch ở bước sóng cực đại bằng máy đo quang phổ
Thí nghiệm lặp lại 3 lần, lấy giá trị trung bình quang phổ của thuốc omeprazole natri để xây dựng đường chuẩn của thuốc Omeprazole natri
Phương trình biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ và độ hấp thụ có dạng: y = ax + b với R 2 là hệ số tương quan
Trong đó: y: Giá trị OD của dung dịch tại λmax x: nồng độ của dung dịch
Dựng đường chuẩn và phương trình đường chuẩn của thuốc bằng Microsoft Excel
2.4.3.2 Nạp thuốc Omeprazole natri vào màng BC
Sau khi tinh chế màng BC, tiến hành nạp thuốc vào màng bằng cách cho 20ml dung dịch NaOH 0,1M vào bình 100ml chứa 30mg thuốc omeprazole natri Đặt bình vào máy lắc theo các điều kiện đã chỉ định trong bảng 2.2 Sau 1 giờ và 2 giờ, lần lượt rút các dung dịch chiết từ từng bình Cuối cùng, sử dụng máy UV-2450 để đo quang phổ và xác định lượng thuốc hấp thụ vào màng.
Bảng 2.2: Các thí nghiệm hấp thụ thuốc
Trường hợp Đường kính Độ dày của màng
Nhiệt độ Chế độ lắc
2.4.5 Xác định lượng thuốc được hấp thụ vào vật liệu BC
Màng BC được hấp thụ thuốc bằng phương pháp hấp thụ sau khi đã được làm sạch