Nghiên cứu chọn dòng tế bào chịu hạn và mặn của giống lúa việt lai 20

Một trong những lĩnh vực của sinh học là về tính chống chịu ở thực vật nhằm làm sáng tỏ tác động cụ thể của các yếu tố bất lợi, đặc biệt là phản ứng liên quan đến khả năng chống chịu.. X

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN KHOA KHOA HỌC T ự NHIÊN VÀ XÃ HỘI

GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN: ThS NGUYỄN THỊ HẢI YẾN

THÁI NGUYÊN - 2007

Lưi cam cm

Em xin bay to long biet on säu säe tori cư giäo ThS N guyin Thi Hai Yen

da tän tlnh hirưng dän vä giüp dư em hộn thänh khộ luan tot nghiep nay

Em xin chän thänh cam on cäc thäy cư trong Bo mon Sinh hoc Khoa Khoa hoc Tu nhien vä Xä hưi da giüp dư vä tao di^u kien cho em trong suot qua trinh thuc hien khộ luän tot nghiep

Cuưi cüng em xin gui loi cam on toi gia dinh, ban be, tap the lưp Cir nhän Sinh K l dä quan täm, dong vien em trong suưt qua trinh hoc tap vä nghien cuu tai khoa

Trong qua trinh thuc hien, khộ luän cüa em cư the con nhieu sai sot kinh mong nhän duoc su dưng gưp y kien tü phia cäc thäy cư giäo vä cäc ban

Sinh vien

VG Thi Dung

MỤC LỤC

TÓM TẮT KẾT QUẢ ĐỀ T À I 1

MỞ Đ Ầ U 2

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN c ú u 4

1.1 Giới thiệu chung về cây lú a 4

1.2 Tình hình sử dụng lúa kháng hạn và m ặ n 5

1.2.1 Lúa kháng hạn và mặn trên thế g iớ i 5

1.2.2 Lúa kháng hạn và mặn ở Việt N am 6

1.3 Đại cương về tính chịu hạn, mặn của thực v ậ t 6

1.3.1 Đại cương vẻ tính chịu hạn của thực vật 6

1.3.1.1 Khái niệm về tính chịu h ạ n 6

1.3.1.2 Cơ chế chịu hạn 7

1.3.1.3 Thiệt hại do hạn gây ra 8

1.3.2 Đại cương về tính chịu mặn của thực v ậ t 10

1.3.2.1 Khái niệm về tính chịu m ặn 10

1.3.2.2 Cơ chế chịu m ặn 11

1.3.2.3 Ảnh hưởng của m ặn 12

1.4 Sơ lược nuôi cấy mô tế b à o 13

1.5 Lược sử nuôi cấy mô tế bào thực vật 14

1.6 Chọn dòng tế bào thực vật 16

1.6.1 Cơ sở khoa h ọ c 16

1.6.2 Nguyên lý c h u n g 18

1.6.3 Phương pháp chọn d ò n g 19

1.6Ế3.1 Chọn trực tiếp 19

1.6.3.2 Chọn gián tiế p 19

1.6.3.3 Chọn tổng th ể 19

1.6.3.4 Chọn lọc sau xử lý đột biến 20

1.6.4 Thành tựu đạt được trong chọn dòng tế bào thực v ậ t 20

1.6.4.1 Chọn dòng chịu khô h ạ n 20

1.6.4.2 Chọn dòng chịu m ặ n 21

1.6.4.3 Các dòng chống chịu kh ác 21

CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨlJ 23

2.1Ế Vật liệu 23

2.2 Phương pháp 23

2.2.1 Tạo mô sẹo từ hạt lúa 24

2.2.2 Chọn dòng chịu mặn thông qua xử lý muối N aC l 24

2.2.3 Chọn dòng chịu hạn thông qua thổi khô 24

2.3 Phuơng pháp tính toán sô' liệu 24

2.3.1 Xác định tỉ lệ tạo mô sẹo ( C i ): 24

2.3.2 X ác định tỉ lệ tái sinh (Rc) 25

2.4 Phương pháp xử lý số liệu 25

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26

3.1 Ảnh hưởng của một số yếu tố lên quá trình tạo mô sẹo 26

3.1.1 Ảnh hưởng của môi trường nuôi c ấ y 26

3.1.2 Ảnh hưởng của các kích thích sinh trưởng 29

3.1.2.1 Ảnh hưởng của 2,4-D 29

3.1.2.2 Ảnh hưởng của a N A A 31

3.1.2.3 Ảnh hưởng phối hợp giữa 2,4-D và aN A A 32

3.1 Chọn dòng tế b à o 34

3.2.1 Chọn dòng tế bào chịu m ặn 34

3.2.2 Chọn dòng chịu hạn 36

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ N G H Ị 39

CHỮ VIẾT TẮT

2,4-D : 2,4- Dichlorophenoxy acetic acid

aNAA : a- naphathalene acetic acid

BAP : 6 - benzyl amino purin

Luan vän t ot nọhi ép Vil U n U u n x

TÓ M TẮT KẾT QUẢ ĐỂ TÀI

1 Tên đề tài: “N ghiên cứu chọn dòng tế bào chịu m ặn và hạn của giông lúa

Việt Lai 20”.

2 Kết quả nghiên cứu của đề tài:

+ Các yếu tố ảnh hưởng lên quá trình tạo mô sẹo:

Môi trường nuôi cấy: Môi trường MS là môi trường thích hợp cho tạo

mô sẹo từ phôi hạt giống lúa Việt lai 20 hơn so với N6

Các chất kích thích sinh trưởng: Ảnh hưởng của các phytohormone khác nhau lên quá trình tạo mô sẹo từ phôi hạt cũng khác nhau Sau 5 ngày môi trường có 2mgA 2,4-D và 3mg/l aNA A cho tỉ lệ mô sẹo cao nhất tương ứng 60% và 52,5% Khi phối hợp 2,4-D và aNAA thì tỉ lệ tạo mô sẹo cao hơn khi bổ sung riêng rẽ (đạt 72,5%)

+ Chọn dòng tế bào:

Chọn dòng chịu hạn: Thời gian thổi khô tăng thì khả năng tái sinh của

mô sẹo giảm 4 giờ là ngưỡng chọn các dòng cây chịu hạn

Chọn dòng chịu mặn: Khi nồng độ NaCl tăng thì tỷ lệ tái sinh cây giảm Nồng độ 1,5% NaCl là ngưỡng là để chọn dòng cây chịu mặn

Luân văn tôt nehiêp Vu ỊJu uunu

MỞ ĐẦU

I Đặt vấn đề

Lúa là cây lương thực chính cho khoảng 2,7 tỉ người trên thế giới Lúa được trồng trên khoảng 1 / 1 0 diện tích đất nông nghiệp và là nguồn năng lượng thực phẩm lớn nhất cung cấp cho 1/2 dân số thế giới Trong hơn 130 triệu ha đất trồng lúa thì 39 triệu ha bị nhiễm mặn cao, 26 triệu ha bị hạn gây ảnh hưởng xấu đến sản xuất lương thực Ở Việt Nam, theo thống kê của Tổ chức Lương thực thế giới (FAO), trong số 6,58 triệu ha đất trồng lúa thì 2 triệu ha

bị hạn và 1,3 triệu ha bị mặn gây thiệt hại cho năng suất, giảm từ 1 - 2 tấn/ha [7], Do đó việc tạo cây lúa có khả năng chịu hạn và mặn chống lại điều kiện ngoại cảnh bất lợi là rất cần thiết

Sinh học ngày nay đã có nhiều đóng góp có giá trị cho sản xuất nông nghiệp đặc biệt là trên lĩnh vực tạo giống thích nghi sinh thái Một trong những lĩnh vực của sinh học là về tính chống chịu ở thực vật nhằm làm sáng tỏ tác động cụ thể của các yếu tố bất lợi, đặc biệt là phản ứng liên quan đến khả năng chống chịu Trên cơ sở đó mà đề ra các biện pháp về giống và phương hướng tạo giống, về kỹ thuật trồng trọt và thâm canh nhằm hạn chế tối đa các mặt tiêu cực của sinh thái, tăng cường tính thích nghi của giống góp phần làm ổn định và gia tăng năng suất cây trồng

Trước đây, các nhà chọn giống thường tạo giống lúa chịu hạn, mặn bằng phương pháp truyền thống: chọn lọc và lai tạo nhưng phương pháp này mất rất nhiều thời gian, tốn kém và hiệu quả không cao Nhưng hiện nay nhờ

kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào và chọn dòng tế bào các nhà khoa học có thể tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của các tác nhân bất lợi lên thực vật ở các mức độ khác nhau như mức mô và cơ quan nuôi cấy phân lập, cây hoàn chỉnh Nhờ đó

có thể nghiên cứu một cách riêng biệt hay tổ hợp theo ý muốn các tác động

mà ngoài tự nhiên khó thực hiện Qua đó cho phép các nhà nghiên cứu tìm

Luân văn tôt nehiêp Vu t m u u n a

hiểu và xác định bản chất sinh học của tính chống chịu Hệ thống tế bào và

mô nuôi cấy còn cho phép chọn tạo và thử nghiệm hàng loạt không cần trồng trọt trên đồng ruộng kết hợp với xử lý đột biến để tìm ra các dòng tế bào và cây có tính chống chịu thuần khiết

Xuất phát từ những vấn đề trên mà chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài

“Nghiên cứu chọn dòng tê bào chịu mặn và hạn của giông lúa Việt Lai 20

+ Tim hiểu ảnh hưởng của một số yếu tố lên giai đoạn tạo mô sẹo của phôi hạt:

- Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy

- Ảnh hưởng của phytohormone

+ Chọn dòng tế bào chịu hạn và mặn từ mô sẹo thu được

Đề tài được thực hiện tại Phòng thí nghiệm bộ môn Sinh học - Khoa Khoa học Tự nhiên và Xã hội - Đại học Thái Nguyên

Luán văn tôt nehiêp Vũ I hi Dune

CHƯƠNG 1

TỔ N G Q UAN TÀI LIỆU N G H IÊN cứu

1.1 Giới thiệu chung về cây lúa

Cây lúa thuộc họ Hòa thảo, là loài thực vật sống một nãm, có thể cao hơn vói các lá bản mỏng, hẹp bản (2-2,5cm) và dài (50-100cm) Các hoa nhỏ, thụ phấn nhờ gió, mọc thành cụm nhỏ, phân nhánh cong hay rủ xuống Hạt

dài là loại quả thóc Cây lúa thuộc chi Oryza với nhiều loài khác nhau Trong

số 23 loài đã được phân loại chỉ có hai loài là o glaberrima Sreud và

O sativa L là được trồng Loài o glaberrima được trồng chủ yếu ở một số

nước miền Tây Châu Phi Loài o sativa L được trồng khắp thế giới Nhưng phần lớn tập trung ở Châu Á và được chia thành 3 loài phụ: Indica, Japónica

váJavanica [21].

Loài lúa trồng Oryza sativa L được thuần hóa từ lúa dại Tổ tiên của các loại lúa trồng hiện nay là loài lúa dại Oryza fatua, Oryza zaofciracis,

Oryza minuta Các nhà khoa học đã đi đến thống nhất là nguồn gốc cày lúa ở

Đông Nam Châu Á vì đây là vùng có diện tích lúa tập trung lớn nhất thế giới

[1] Ngày nay, lúa Indica chiếm tới 80% các giống lúa trồng trên thế giới Lúa

Japónica được trồng chủ yếu ở các nước ôn đới và cận nhiệt đới còn lúa Javanica chỉ được trồng ở một vài vùng của Indonesia.

Lúa O sativa L có số NST đơn bội n = 12 Đa số các loài lúa dại và

lúa trồng hiện nay có bộ gene ở trạng thái lưỡng bội và là cây tự thụ phấn ít khi thụ phấn chéo Theo GS.Khush (1997) [20], Trên thế giới có khoảng 120 giống lúa được trồng Từ năm 1960, Viện nghiên cứu lúa quốc tế đã nghiên cứu, cải tiến những giống lúa tốt, có hạt dẻo ngon và đã phổ biến được khoảng 70% diện tích trồng lúa trên thế giới Theo thống kê có 15 nước trên thế giới

Luân văn tôt nehiêp Vu I til Uunu

trồng lúa vói diện tích trên 1 triệu ha, trong đó có 13 nước ở Châu Á Riêng Trung Quốc và Ấn Độ chiếm khoảng 50% diện tích trồng lúa và 50% sản lượng lúa toàn cầu Bangladesh, Indonesia và Thái Lan mỗi nước đều có diện tích trồng lúa lớn hơn tổng diện tích trồng lúa của cả các nước Mỹ La Tinh Châu Phi có diện tích trồng lúa gần bằng diện tích trồng lúa của Việt Nam nhưng sản lượng lúa lại thấp hơn Việt Nam từ hai đến ba lần [12],

Việt Nam có 80% dân số sống bằng nghề nông nghiệp Lúa không những cung cấp lương thực cho toàn bộ dân số trong nước mà còn mang lại hiệu quả kinh tế cao do xuất khẩu gạo ra thị trường quốc tế Năng suất lúa ở Việt Nam đạt 20,473 triệu tấn năm 2000, năm 2001 đạt 20,627 triệu tấn và năm 2003 đạt

34 triệu tấn [12].Trong tiến trình công nghiệp hóa, hiện đại hóa ở nước ta hiện nay cải thiện năng suất, chất lượng lúa gạo là một trong những yêu cầu cấp bách đặt ra

1.2ệ Tình hình sử dụng lúa kháng hạn và mặn

1.2.1 Lúa kháng hạn và mặn trên th ế giới

Nhu cầu sản xuất giống lúa chống chịu hạn, mặn có từ lâu và các biệnpháp làm tăng tính chịu hạn và mặn đã được thực hiện ở nhiều nước [19] Năm

1980, Epstein đã mô tả tập hợp một số vấn đề về sinh lý và kỹ thuật liên quanđến tính chịu mặn Khả năng chịu mặn rất khác nhau ở các sinh vật đã đượcbiết Từ những năm 1930 và những năm đầu thế kỷ 18 người ta đã chọn lọc ragiống có khả năng chống chịu mặn ở lúa và lúa mạch [2 ],[ 15],[ 16]

Mặc dù có những phát hiện sớm như vậy nhưng mãi đến năm 1993Flower và Yeo mới xem xét nghiên cứu và tổng kết có dưới 30 giống có khảnăng chống chịu mặn Đến năm 1993 mới chỉ có 3 giống kháng mận đượcđăng ký Một giống chịu mặn được đăng ký tại Mỹ và một phương pháp tăngtính kháng mặn ở ngũ cốc nhờ kết hợp với protein ở phôi hạt [7],[11 ],[ 13],[14],[18],[23]

Luán văn tốt nghiên Vu íh iU u n e

1.2.2 Lúa kháng hạn và mặn ở Việt Nam

Hiện nay, ở Việt Nam mới chỉ sử dụng các giống lúa có khả năng chịuhạn và mặn được chọn lựa, thu thập từ các giống lúa địa phương theo phươngpháp truyền thống như các giống Cườm có tính chịu mặn, Lốc có tính chịuhạn Một số giống khác được trồng rải rác ở các địa phương có vùng địa lý đặctrưng hạn và mặn khác nhau nhưng chưa có quy hoạch đồng nhất và các giốngđịa phương này được trồng trên diện tích đất còn hạn chế Hơn nữa, các giốngđịa phương này không thích ứng với những vùng sinh thái khác nhau do đặctrưng và phản ứng quang chu kì của mỗi giống là khác nhau Ngoài ra, một sốgiống được chọn tạo bởi các cơ quan, Viện nghiên cứu Nông nghiệp đưa vàosản xuất chưa có hiệu quả đáp ứng cao với thực tế Thường các giống chốngchịu này có năng suất thấp, chất lượng lúa không tập trung được những đặctính quý như năng suất cao, hạt dẻo, thơm ngon và chống chịu được với sâubệnh cỏ dại [17]ế

l ễ3 Đại cương về tính chịu hạn, mặn của thực vật

1.3.1 Đại cương vê tính chịu hạn của thực vật

13.1.1 Khái niệm về tính chịu hạn

Bất cứ loại cây trồng nào cũng cần có nước để duy trì sự sống Mức độcần nhiều hay ít nước là tùy thuộc vào từng loại cây trồng và từng giai đoạn phát triển của chúng Hạn đối với thực vật là khái niệm dùng để chỉ sự thiếu nước của thực vật do môi trường gây nên trong suốt cả quá trình hay trong từng giai đoạn làm ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển Mức độ tổn thương của cây trồng do khô hạn gây ra có nhiều mức khác nhau: chết, chậm phát triển Cây cho năng suất tương đối ổn định trong điều kiện khô hạn gọi là cây chịu hạn và khả năng của thực vật có thể giảm thiểu mức độ tổn thương do thiếu hụt nước gây ra gọi là tính chịu hạn [3],

Luán văn tốt nehiêp Vu im Uunu

Tuy nhiên, khó có thể xác định được thế nào là một trạng thái hạn đặc trưng vì mức độ hạn do môi trường gây nên khác nhau theo từng mùa, từng năm, từng vùng địa lý và không thể dự đoán trước được [3]

Khả năng điều chỉnh áp suất thẩm thấu: Khả năng điều chỉnh áp suất thẩm thấu của tế bào thực vật, đặc biệt là những tế bào có liên quan trực tiếp đến khả năng cạnh tranh nước giữa tế bào rễ cây và đất Trong điều kiện hạn,

áp suất thẩm thấu được điều chỉnh tăng lên giúp cho tế bào rễ thu nhận được những phân tử nước ít ỏi có trong đất Bằng cơ chế như vậy thực vật có thể vượt qua được tình trạng hạn cục bộ Đối với những giống lúa nước tính chịu hạn cục bộ có ý nghĩa quan trọng cho những vùng chưa chủ động được tưới tiêu

Có khá nhiều nghiên cứu tập trung tìm hiểu cơ chế của tính chịu hạn Trong đó không ít nghiên cứu đề cập đến vai trò của ABA và của prolin đối với khả năng chịu hạn của thực vật nói chung và cây trồng nói riêng ABA giúp mô tăng khả năng chống chịu mất nước do làm khô, do muối hoặc do lạnh gây ra Nhìn chung, khi tế bào bị mất nước dần dần, trong tế bào chất nhằm chống lại việc giảm tiềm năng nước và tăng khả năng giữ nước của

Luân văn tỗt nehiêp Vũ I til Uune

nguyên sinh chất bằng cách tích lũy các chất hòa tan Các chất hòa tan có liên quan bao gồm: các loại đường, các acid hữu cơ, các loại chất hòa tan hữu cơ, các loại acid amin, các loại rượu đa chức hay các ion (chủ yếu là K+) Hầu hết các chất hòa tan hữu cơ có tác dụng điều chỉnh áp suất thẩm thấu được sinh ra ngay trong quá trình đồng hóa và trao đổi chất [3]

Trong tự nhiên khi phôi phát triển đến giai đoạn hạt chín thường chuyển sang trạng thái ngủ, lượng nước trong tế bào phôi và trong hạt giảm tói mức tối thiểu, đây là trạng thái thiếu nước sinh lý Có khá nhiều gene tham gia vào bảo vệ phôi ở trạng thái thiếu nước sinh lý Như nhóm gene LEA (late embryogene abundant protein) tạo ra hàng loạt protein trong giai đoạn phôi muộn của quá trình hình thành phôi, v ề vai trò sinh học của các protein này bước đầu đã được nêu ra là các gene dehydrin (DH) có khả năng bảo vệ tế bào chất khi bị mất nước [1],

Ngoài ra màng cuticula (cấu trúc bao gồm sáp và các phân tử cutin) cũng tham gia bảo vệ cho tế bào bên trong của thực vật không bị mất nước Lớp sáp vỏ ngoài cùng (epicuticular war) có vai trò làm giảm sự thoát hơi nước qua màng cutin giúp cây trồng cân bằng được nước trong điều kiện khô hạn Sự thay đổi của lớp vỏ sáp là do kiểu gene và môi trường quyết định Trong các loại cây đã nghiên cứu thì lớp vỏ sáp ở lúa mỳ là có hiệu quả cao nhất [3]

13.1.3 Thiệt hại do hạn gây ra

Nước là yếu tố giới hạn đối với cây trồng, nước vừa là sản phẩm khởiđầu, trung gian và cuối cùng của các quá trình chuyển hóa sinh hóa, vừa là môi trường để các phản ứng trao đổi chất xảy ra, vì vậy việc cung cấp đủ nước cho cây trồng canh tác và hướng nghiên cứu tăng cường tính chịu hạn của cây trồng là mục tiêu tạo giống thường xuyên được quan tâm

Mức độ thiếu hụt nước càng lớn thì ảnh hưởng càng xấu đến quá trình sinh trưởng và phát triển của cây Thiếu hụt nước nhẹ thì giảm tốc độ sinh

Luánvăn tôt nehiêp u 1 tu Liunk

trưởng, thiếu nước trầm trọng sẽ dẫn đến biến đổi hệ keo nguyên sinh chất làm tăng cường quá trình hóa già tế bào Khi bị khô hạn kiệt nước nguyên sinh chất bị đứt vỡ cơ học dẫn đến tế bào mô bị tổn thương và chết Ngoài ra nước còn tham gia cấu tạo nên chất nguyên sinh (tạo thành màng nước thủy hóa xung quanh keo nguyên sinh) và tham gia điều hòa thân nhiệt tăng cường khả năng chống chịu cho cơ thể thực vật [3]

Đối với cây trồng nói riêng và thực vật nói chung, hạn ảnh hưởng nhiều nhất tới 2 giai đoạn sinh trưởng và phát triển của cây đó là: giai đoạn cây non

và giai đoạn ra hoa Trên thế giới có khoảng 40 - 60% diện tích đất trồng bị hạn, trong đó 35% diện tích bị khô hạn và nửa khô hạn, 25% bị khô hạn trong thời gian khác nhau

Nước ta có địa hình đa dạng và diễn biến phức tạp, lượng mưa phân bố không đều giữa các vùng và các thời kì trong năm nên hạn hán có thể xảy ra trong bất kì vùng nào, mùa nào 4/5 lãnh thổ là đồi núi, đất canh tác của khu vực này thường xuyên bị đe dọa Trong điều kiện như vậy nên thành phần thổ nhưỡng của các khu vực này rất khác nhau Các yếu tố đó chi phối mạnh mẽ mực nước ngầm và khả năng giữ nước của đất Theo ước tính ở nước ta, năng suất lúa bị thiệt hại do hạn hán là đáng kể: Diện tích lúa bị hạn hàng năm lên tới 0,4 triệu ha; riêng năm 1989, năm 1990 sản lượng lúa của đồng bằng sông Hồng giảm 20 - 28% so với mức trung bình, chủ yếu là do hạn hán [3], Hay các năm 1998, 1999 ở Nghệ An, Hà Tĩnh, Quảng Trị năng suất đã bị giảm tới 4/5 ở những diện tích bị hạn trong giai đoạn lúa làm đòng Vụ đông xuân

2003, hàng ngàn ha lúa của các tỉnh miền Trung và Tây nguyên bị khô cháy không cho thu hoạch Các diện tích lúa trồng cạn năng suất trung bình đạt 5-7 tạ/ ha Người ta cho rằng, khô hạn là một trong những hạn chế chủ yếu để

mở rộng diện tích trồng lúa ở các nước đang phát triển trong đó có Việt Nam

Để nâng cao và ổn định sản lượng lúa trong điều kiện khô hạn, việc nghiên cứu chọn tạo các giống lúa có khả năng chịu hạn và có đặc tính chống chịu

Luân văn tôt nehiép V u I m uuna

khác (phèn, mặn, lạn h ) đã trở thành một trong những nội dung quan trọng của các chương trình nghiên cứu tạo giống lúa trên thế giới và Việt Nam [3]

1.3.2 Đ ại cương vê' tính chịu mặn của thực vật

13.2.1 Khái niệm về tính chịu mặn

Nước biển chứa 3 - 4% muối Biển và đại dương chiếm 75% bề mặthành tinh chúng ta, 25% diện tích đất bị nhiễm mặn Hiện nay, có khoảng 230triệu ha đất nhiễm mặn Riêng ở Đông Nam Á ước tính có khoảng 54 triệu ha

bị nhiễm mặn và 27 triệu ha đất có tiềm năng trồng lúa ở vùng nhiệt đới Châu

Á không thể canh tác vì bị nhiễm mặn Việt Nam là một nước có bình quândiện tích đất canh tác trên đầu người vào loại thấp nhất thế giới: 0,14 hađất/ người ở nông thôn, ở đồng bằng sông Hồng con số này chỉ còn 0,06 hađất/ người Bên cạnh tính chất khan hiếm đất còn chất lượng kém Ngoại trừ

đất ở vùng châu thổ sông Hồng và sông cử u Long, đất đai ở hầu hết các khu

vực khác đều có chất lượng kém Đa số đất feralit đỏ vàng ở trung du và miềnnúi chứa nhiều Al3+, Fe3+ vùng phù sa cổ thì bị bạc màu khoảng 3 triệu ha đấtđai châu thổ các sông bị nhiễm mặn, kiềm hóa và ngập lụt Chính vì thế việcnghiên cứu khả năng chịu mặn ở lúa và một số cây trồng khác có ý nghĩa thực

tiễn đặc biệt quan trọng đối với sản xuất nông nghiệp ở Việt Nam, không những tăng năng suất ở vùng nhiễm mặn mà còn có thể mở rộng diện tích

canh tác sang những vùng lâu nay vẫn bị bỏ hoang vì nhiễm mặn [3]

Thực vật thích nghi sống được trong những đất thừa muối gọi làgalofyte (thực vật chịu muối) Do chữ galos - muối, phyton - thực vật,galofyte tự bảo vệ khỏi nồng độ muối cao bằng 3 biện pháp chủ yếu :

1 Hút lượng muối và tập trung chúng vào dịch không bào dẫn đến tăng áp suất thẩm thấu

2 Thải muối đã hấp thụ ra khỏi tế bào cùng với nước nhờ các tuyến muối chuyên hóa và loại bỏ lượng muối dư thừa cùng với lá rụng Một trong

Luán văn tô t n e h iê p V li I ni uuna

SỐ các biến dạng của biện pháp đó là tập trung muối đã hấp thụ được

vào không bào của các tế bào đầu, cuối của các lông hút chuyên hóa sau đó rụng đi

3 Các tế bào rễ hạn chế sự hút muối [4]

1.3.2.2 Cơ c h ế chịu mặn

Những nghiên cứu về tác động của muối lên sinh trưởng và phát triểncủa cây trồng như lúa mạch, tế bào cam nuôi cấy, về trao đổi ion ở lúa chothấy cây trồng có khả năng thích ứng trong một giới hạn nhất định với tácđộng của muối trong môi truờng đất và nước Tuy nhiên mức độ đó rất phụthuộc vào kiểu gene của đối tuợng nghiên cứu [1],

v ể khả năng chịu mặn của thực vật, trước hết nói đến cơ chế tích lũy vàduy trì nồng độ cao các chất hòa tan trong tế bào nhằm đảm bảo sức cạnhtranh với nước, với môi trường nhiễm muối và chống lại hiện tượng hạn sinh

lý Một số tác giả cho rằng khi bị nhiễm mặn thực vật thường hạn chế khảnăng thẩm thấu nước của màng tế bào khiến cho nước không dễ dàng thẩmthấu ra

ở các loài thực vật sống thường xuyên trên nền đất nhiễm mặn (chịu mặn) khả năng thu nhận và tích tụ Na+ và c r cao hơn nhiều so với thực vật không chịu mặn Đây là cơ chế chính chịu mặn trong thế giới cây cỏ có khả nâng sống trên đất nhiễm mận [3]

Người ta đã tìm thấy các protein lạ sau khi cây bị xử lý muối, PEG hoặc KC1 Các protein nhóm này cũng đã được tìm thấy trong tế bào thuốc lá nuôi cấy, cà chua, đậu xanh và cây đinh lăng sau khi xử muối Hoạt động của một

số enzyme như polyphenoloxydase và catalase tăng lên ở hạt lúa nảy mầm trong điều kiện mận

Betain và glycinbetain là sắc tố nội bào khi bổ sung từ bên ngoài vào cũng có tác dụng làm tăng tính chịu mặn

Luân văn tốt nehiêp ^ Il I m uuna

Mối liên quan giữa ABA, tính chịu mặn và sự tổng hợp các protein đặc biệt là điểm mấu chốt khởi đầu cho những nghiên cứu sâu hơn, vì nó liên hệ giữa stress của môi trường bên ngoài với những đặc điểm sinh lý và phân tử bên trong tế bào Những nghiên cứu về sau vói những kỹ thuật phân tử có được đã liên kết nhanh chóng các sự kiện này để xác định các vùng NST đặc biệt của gene liên quan đến sự vận chuyển các ion [1]

Nhiều công trình đã thông báo rằng hàm lượng prolin đã tăng trong các dòng chịu mặn Vai trò của prolin đối với khả năng chịu mặn của thực vật trước hết được nghiên cứu khía cạnh tích lũy khi cây gặp mặn Việc bổ sung prolin ngoại sinh và glycinebetain vào môi trường nuôi cấy

Hordeum vugare L đã làm tăng chiều dài chồi dưới tác dụng của NaCl Các

đột biến sản xuất prolin nhiều hơn bình thường thì có thể chịu mặn tốt hơn Bên cạnh đó người ta thấy những cây chịu mặn tốt còn có những đặc tính riêng Đó là khả năng tăng hàm lượng acid hữu cơ khá lớn trong điều kiện đất mặn, ở một số cây lượng acid hữu cơ có thể đạt tới 25% trọng lượng chất khô của cơ thể, các acid hữu cơ này có tác dụng bảo vệ cơ thể bằng cách nó liên kết với ammoniac hạn chế độc cho cây [1],

Về mặt hoạt động sinh lý, người ta thấy thông thường các quá trình quang hợp, hô hấp trao đổi chất ở những cây chịu mặn thấp hơn so với những cây kém chịu mặn Song nó tương đối điều hòa khi hàm lượng muối cao [3]

1.3.2.3 Ảnh hưởng của mặn

Ở thực vật không chịu mặn tế bào nhạy cảm với muối bị chết trongdung dịch chứa 1 - 1,5% NaCl, còn cây chịu mặn được nồng độ muối lớn hơn hoặc bằng 6 % Lúa là loại cây rất nhạy cảm với mặn Thừa muối trong đất làm cho cây không chịu mặn bị chết, đặc biệt là cây bị mặn vào pha sinh trưởng mạnh và ra hoa Mặn gây hại trước hết là ức chế pha sinh trướng kéo dài của

tế bào và ở mức ít hơn với pha phân chia Thừa muối phá hoại sự trao đổi nitơ làm tăng tích lũy các sản phẩm phân giải trung gian đặc biệt là các acid amin

Luân văn tôt nehiêp V u L líi uuna

và NH3 Những hợp chất này có thể gây hại nặng đối với cây Mặn phá hoại sự cân bằng hấp thu Na, K, Mg Hấp thụ nhiều Na làm giảm sự thâm nhập của K

và Mg vào tế bào Mặn cản trở sự thâm nhập nước vào cây, trên nền mặn sunfat tích lũy nhiều sản phẩm của quá trình oxy hóa các acid amin chứa lưu huỳnh, chúng là các chất độc cho cây

Mặn làm cho tăng nồng độ các muối Clo là tác nhàn ngăn cách quá trình oxy hóa và photphoryl hóa Điều đó làm giảm khả nãng cung cấp năng lượng cho cây Mặn phá hủy cấu trúc tế bào đặc biệt là lục lạp Ở điều kiện mặn, tính thấm chọn lọc của tế bào bị hư hại Trong các cơ quan của cây hệ rễ

bị mặn gây hại mạnh nhất, các tế bào của hệ mạch dãn trong thân cũng bị mặn gây tổn thương mạnh [3]

1.4 Sơ lược nuôi cấy mó tê bào

Mọi cơ thể sinh vật đều gồm nhiều đơn vị cơ bản là tế bào và các tế bào

đã phân hóa đều mang trong đó một lượng thông tin di truyền đủ để mã hóa cho việc hình thành nên một cơ thể mới Cũng chính vì vậy việc ứng dụng công nghệ này trong thực tiễn rất đa dạng và phong phú Nuôi cấy mô, tế bào, dung hợp tế bào trần, kỹ thuật A D N , Nhằm tạo giống mới, giống sạch bệnh, tạo các dòng chống chịu với điều kiện môi trường và đặc biệt là trong lĩnh vực

nuôi cấy mô tế bào in vitro trong việc chọn giống và nhân giống vô tính cây

trồng Các tế bào được nuôi trong môi trường nhân tạo ở điều kiện thích hợp, dưới tác dụng của các phytohormone chúng có thể phân hóa, xảy ra quá trình phát sinh phôi vô tính, phát sinh cơ quan và hình thành nên cơ thể mới [1 0].Với kỹ thuật nhân giống bằng nuôi cấy mô có thể tạo ra một quần thể cây trồng đồng đều, giữ nguyên đặc tính của cây mẹ, có hệ sô' nhân giống cao, sớm cho hiệu quả kinh tế cao không tốn diện tích nhân giống, Phương pháp này tỏ ra ưu việt với các loài cây khó nhàn giống bằng con đường hữu tính, cũng như với các cây quý hiếm, có lượng giống ban đầu hạn chế, nhưng lại yêu cầu nhân nhanh [1 0]

Luân văn tôt nehiêp Vu i m uuna

Hiện nay đã có rất nhiều giống cây trồng mới được tạo ra nhờ nuôi cấy

mô, tế bào có năng suất cao phẩm chất tốt vượt xa các giống ban đầu Công nghệ nuôi cấy mô, tế bào thực vật đã mở ra một hướng đi mới cho các nhà di truyền học, hóa sinh học, vi sinh vật học và sinh lý thực vật

1.5ề Lược sử nuôi cấy mô tế bào thực vật

Năm 1938, hai nhà sinh vật học người Đức là Schleiden và Schwann đã

để xướng thuyết tế bào và nhấn mạnh: Mọi cơ thể sinh vật phức tạp đều được cấu tạo từ nhiều tế bào Các tế bào đã phân hóa đều mang thông tin có trong tế bào đầu tiên, đó là trứng sau khi thụ tinh, nó là những đơn vị độc lập từ đó có thể xây dựng lại toàn bộ tế bào [9]

Gotieb Haberlandt (1902) nhà thực vật học người Đức đã đặt nền móng đầu tiên cho nuôi cấy mô tế bào thực vật Ông đưa ra giả thiết về tính toàn năng của tế bào trong cuốn sách “Thực nghiệm về nuôi cấy mô tế bào tách rời” Theo ông mỗi tế bào bất kỳ của cơ thể sinh vật nào cũng đều mang toàn

bộ thông tin di truyền của cơ thể đó và có khả năng phát triển thành cơ thể hoàn chỉnh khi gặp điều kiện thuận lợi Nhưng ông đã gặp thất bại trong nuôi cấy các tế bào đã phân hóa tách từ lá một số cây một lá mầm như:

Erythromum, Ornithogalum, Tradescantia.

Năm 1922, Kotte học trò của Haberlandt và Robbins (Mỹ) đã lập lại thực nghiệm của Haberlandt với đỉnh sinh trưởng tách từ đầu rễ một cây hòa thảo Trong môi trường lỏng gồm có muối khoáng và glucose, đầu rễ sinh trưởng khá mạnh, tạo nên một hệ rễ nhỏ có cả rễ phụ Tuy nhiên sự sinh trưởng như vậy chỉ tồn tại một thời gian sau đó chậm dần và ngừng lại [9].Năm 1934, W hite (Mỹ) nuôi cấy thành công trong một thời gian dài

đầu rễ cà chua (Lycopersycum esculentum) với thiamin (vitamine Bl),

piridoxin (vitamine B6) và nicotinacid Từ đó việc nuôi cấy đầu rễ trong thời gian vô hạn đã được tiến hành ở nhiều cây khác nhau với một môi trường lỏng chứa muối khoáng glucose và dịch chiết nấm men Sau đó ít lâu, White chứng

Luân văn tôt nehiêp Vu n u uuna

minh là có thể thay thế dịch chiết nấm men bằng hỗn hợp 3 loại vitamine nhóm B

Went và Thirmann phát hiện chất sinh trưởng thực vật đầu tiên: acid a indolaxetic (IAA) và Gautheret xác nhận tác dụng kích thích sinh trưởng mô sẹo của IAA và ba nhóm vitamine do White đề nghị

Năm 1941, Overbeck (Mỹ) đã chứng minh tác dụng kích thích sinh

trưởng của nước dừa trong nuôi cấy cây họ cà {Datura) Steward và Miles

(1952) cũng xác nhận tầm quan trọng của nước dừa trong nuôi cấy mô sẹo và phát sinh phôi ở cà rốt Trong thời gian này nhiều chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm auxin được nghiên cứu và tổng hợp thành công: aNAA,2,4-D Nhiều nhà nghiên cứu nhận thấy cùng với nước dừa, aNAA và 2,4-D

đã giúp tạo mô sẹo thành công ở nhiều đối tượng mà truớc đây khó nuôi cấy.Năm 1954, Skoog (Mỹ) đã tình cờ thấy nếu thêm một ít chế phẩm đã để lâu của acid deoxyribonucleic lấy từ tinh dịch cá bẹ vào môi trường nuôi cấy các mảnh mô thân cây thuốc lá thì tác dụng kích thích sinh trưởng trở nên rõ rệt Sau này chất này được xác nhận là kinetin Việc phát hiện ra vai trò của IAA, aNAA, 2,4-D và kinetin cùng với việc phát hiện vai trò của các vitamine

và nước dừa là những bước tiến rất quan trọng trong lịch sử nuôi cấy mô thực vật, là tiền đề kĩ thuật cho việc xây dựng các môi trường xác định bề mặt hóa học và cho việc làm các thí nghiệm ổn định [9]

Năm 1957, Skoog mà Miller công bô' các kết quả nghiên cứu về ảnh hưởng của tỉ lệ kinetin/auxin trong môi trường nuôi cấy đối với sự hình thành

cơ quan của mô sẹo thuốc lá Khi giảm thấp tỉ lệ kinetin/auxin mô sẹo có khuynh hướng phát triển rễ, ngược lại nếu tỉ lệ kinetin/auxin tăng thì dẫn đến khuynh hướng tạo chồi ở mô sẹo Hiện tượng này góp phần điều khiển sinh trưởng và phát sinh cơ quan của mô tế bào nuôi cấy

Năm 1960, Bergman công bô' có thể dùng phương pháp lọc đơn giản để thu được một huyền phù không có các tế bào kết cụm mà gồm hầu hết các tế

Luán vãn tôt nehiẻp Vu I Hl Duna

bào đơn Các tế bào đơn có thể gieo trên môi trường trong các hộp lồng tiếp tục sống, phân chia và tái tạo lại mô sẹo [9]

Cùng với lã thuật gieo tế bào của Bergman nhiều tác giả khác đã thành công trong việc tạo được cây hoàn chỉnh từ một tế bào, chứng minh một cách tốt đẹp tính toàn năng của tế bào thực vật

Việc ứng dụng nuôi cấy mô tế bào thực vật trong nhân giống được Nozeman nâng lên một mức mới khi ông nhận thấy sự trẻ hóa của các chồi nách cây nho và cây khoai tây đem nuôi cấy và cấy truyền nhiều lần trong ống nghiệm

Các nghiên cứu vể protoplast thực vật đầu tiên được bắt đầu bởi những công trình của Cooking (1960) Tác giả đã dùng enzyme để tách bỏ màng cellulose của tế bào nhu mô mảnh lá và thu được một tế bào trần gọi là protoplast

Năm 1972, Karson đã thành công trong việc lai vô tính hai loài thuốc lá

Nicotiana glance và Nicotiana langsdorffii với số NST là 24 và 18 Họ đã

nhận được cây lai vói số NST là 42 và có những tính trạng hoàn toàn giống cây lai hữu tính Còn vể mặt hình thái thì cây lai này nằm giữa cây bô' và cây

mẹ Công trình này đã thúc đẩy mạnh mẽ công tác nghiên cứu tế bào soma và protoplast thực vật Năm 1974, Melchers và Labbit đã thành công trong việc lai vô tính protoplast tách từ bao phấn [1 0]

Đó là một số mốc chính của công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật Ngày nay đã có rất nhiều quy trình nghiên cứu hoàn thiện cho các giống cây trồng khác nhau Nó đã được ứng dụng rộng rãi trong thực tiễn chọn tạo giống thực vật

l ẻ6 Chọn dòng tế bào thực vật

1.6.1 C ơ sở khoa học

Cơ sở khoa học đầu tiên của chọn dòng tế bào thực vật là tế bào thực vật

mang tính toàn năng Đây là một vấn đề quan trọng trong chọn dòng và đến

Luân văn tôt nehièp Vu I ni u una

nay danh sách các loài đã tái sinh thành cây từ mô hoặc tế bào nuôi cấy

in vitro ngày một tăng Tuy nhiên mỗi loài có khả năng tái sinh khác nhau.

Cơ sở thứ hai là mô hoặc quần thể tế bào nuôi cấy bao gồm một số lượng các tế bào không đồng nhất Vì thế quần thể tế bào nuôi cấy có thể xem như quần thể thực vật, ở đấy cũng diễn ra những thay đổi về kiểu gene, kiểu hình và tuổi Khi những tế bào được tái sinh thành cây sẽ thể hiện những thay đổi đó ở mức độ cơ thể Thậm chí những quần thể tế bào phát triển từ một quần thể tế bào ban đầu nhưng trong suốt quá trình sinh trưởng và phát triển

tế bào đến khi hình thành một cơ thể hoàn chỉnh có thể diễn ra nhiều thay đổi

về di truyền do ảnh hưởng của các yếu tố trong môi trường nuôi cấy, đặc biệt

là các chất điều hòa sinh trưởng Mặt khác cũng có các quẩn thể tế bào đồng đều về mặt sinh lý, di truyền và phát triển những quần thể tế bào này là nhũng đối tượng hết sức lý tưởng trong việc sử dụng các chất gây đột biến để thu nhận các đột biến có ý nghĩa Trong nuôi cấy mô và tế bào, có thể quan sát thấy hai loại thay đổi kiểu hình Một là kết quả của sự thay đổi kiểu gene, còn loại kia không liên quan đến những thay đổi về gene được gọi là biến đổi ngoài gene [8]

Ngoài các vấn đề trên, nuôi cấy mô tế bào còn gặp một hiện tượng phổ biến là: một phần đáng kể mô hoặc cây tái sinh từ cụm tế bào thậm chí từ một

tế bào có thể thay đổi một số đặc điểm mà không cần áp dụng các phương pháp chọn lọc nào Những biến đổi di truyền tự phát xảy ra trong quá trình nuôi cấy mô hoặc tế bào được Larkin và Scowcroft (1982) gọi là “biến dị sinh dưỡng” hay “biến dị soma” Theo Skirvin và cs (1994), sự xuất hiện biến dị soma có thể là do rối loạn trong phân bào nguyên nhiễm gày ra bời các chất kích thích sinh trường hoặc sự có mặt của một số chất trong môi trường nuôi cấy [24],[22],[6],

Luân văn lòt nehiêp Vu 1m Ouna

1.6.2 Nguyên lý chung

Tế bào nuôi cấy in vitro có tỉ lệ biến dị di truyền lớn (10'5 - 10"8) vì thế

có thể lựa chọn được các cá thể đột biến nhanh hơn và có hiệu quả hơn so với các phương pháp chọn lọc giống thông thường khác áp dụng trên cây nguyên vẹn Nếu kết hợp với gây đột biến thì tần suất càng cao hơn Ở mức độ tế bào nhất là tế bào đơn bội hầu như những đặc điểm đột biến được thể hiện ngay

Kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào còn cho phép làm giảm bớt đáng kể thời gian cần thiết để chọn được những tính trạng theo ý muốn

Kỹ thuật chọn dòng tế bào đã ra đời rất sớm trong nghiên cứu vi sinh vật Nhưng đối với các đối tượng thực vật bậc cao, kỹ thuật này mới được ứng dụng từ những năm 70 của thế kỉ trước

Có thể tiến hành xử lý và chọn lọc tế bào thực vật ở 3 mức độ khácnhau:

• Chọn dòng sản suất dư thừa các loại sản phẩm chủ yếu là acid amin nhằm mục tiêu xây dựng quy trình sản xuất quy mô công nghiệp các loại sản phẩm đó

• Chọn dòng mang những đặc điểm đánh dấu để nghiên cứu di truyền [ 1 ]

Luân văn tôt nehiêp Vu I m uun a

1.6.3 Phương pháp chọn dòng

1.6.3.1 Chọn trực tiếp

Thông qua ưu thế về sinh trưởng hay sự khác biệt thấy được về màu sắc

có thể chọn được dòng tế bào từ quần thể tế bào

Một số dòng có khả năng chịu kháng sinh, chịu các chất tương tự acid amin hoặc muối cũng có thể chọn trực tiếp quần thể tế bào Điều kiện chọn lọc ở đây là các dược chất với nồng độ khác nhau gây tác động trực tiếp lên sinh trưởng của tế bào Những tế bào có khả năng phân chia trong điều kiện chứa độc tố với nồng độ tăng dần từ lần cấy chuyển này đến lần cấy chuyển khác được sàng lọc dần Hoặc có thể đưa cả quần thể tế bào vào điều kiện môi trường ức chế sinh trưởng hoàn toàn để chọn ra những tế bào sống sót

Thông thường người ta trộn tế bào vào môi trường thạch chứa dược tố

và chờ những tế bào sống sót phân chia thành cụm mô sẹo hoặc cũng có thể cấy trực tiếp lên môi trường chọn lọc chứa dược tố Dòng chống chịu thường xuất hiện từ một phần của khối tế bào nuôi cấy này

1.6.3.2 Chọn gián tiếp

Trong trường hợp này đặc điểm của dòng được chọn là kết quả biểuhiện khuyết tật của tế bào Thí dụ điển hình là chọn dòng thiếu enzyme nitratreductase Trên môi trường chứa CIO3 những tế bào có nitratreductase sử dụng C103 như NO3 và khử thành clorit Clorit tác dụng như một độc tô' cho nên chỉ có những tế bào không có nitratreductase mới sống sót

1.6.3.3 Chọn tổng th ể

Các tế bào dị thường thực vật thường được chọn bằng phương pháp xử

lý đột biến và nuôi trên môi trường có chứa yếu tố dinh dưỡng cần thiết có khi lại chính là yếu tố gây đột biến, ví dụ đột biến lặn chịu được S-2-aminoethylcystein xuất hiện sau khi xử ký đột biến phôi nuôi cấy