Nghiên cứu thiết lập hệ thống nuôi cấy tế bào huyền phù cây dừa cạn (Catharanthus roseus L.) của Việt Nam.

Nghiên cứu thiết lập hệ thống nuôi cấy tế bào huyền phù cây dừa cạn (Catharanthus roseus L.) của Việt Nam.Nghiên cứu thiết lập hệ thống nuôi cấy tế bào huyền phù cây dừa cạn (Catharanthus roseus L.) của Việt Nam.Nghiên cứu thiết lập hệ thống nuôi cấy tế bào huyền phù cây dừa cạn (Catharanthus roseus L.) của Việt Nam.Nghiên cứu thiết lập hệ thống nuôi cấy tế bào huyền phù cây dừa cạn (Catharanthus roseus L.) của Việt Nam.

Hà Nội - 2020

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-

NGUYỄN THỊ THANH HUYỀN

“NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP HỆ THỐNG NUÔI CẤY TẾ BÀO

DẠNG HUYỀN PHÙ CÂY DỪA CẠN ( CATHARANTHUS ROSEUS L.)

CỦA VIỆT NAM”

LUẬN VĂN THẠC SĨ: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Hà Nội - 2020

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-

NGUYỄN THỊ THANH HUYỀN

“NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP HỆ THỐNG NUÔI CẤY TẾ BÀO

DẠNG HUYỀN PHÙ CÂY DỪA CẠN ( CATHARANTHUS ROSEUS L.)

CỦA VIỆT NAM”

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 6020114

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC Hướng dẫn 1 : TS Trần Mỹ Linh Hướng dẫn 2: TS Nguyễn Tường Vân

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan:

Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các cộng sự khác

Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án này là trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Hà Nội, ngày tháng năm 2020

Tác giả

LỜI CẢM ƠN

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin trân trọng cảm ơn TS Trần Mỹ Linh – Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam (VAST), TS Nguyễn Tường Vân – Viện Công nghệ sinh học, VAST và ThS Nguyễn Chi Mai - Viện Hóa sinh biển, VAST đã tận tình hướng dẫn, động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn Xin cảm ơn Nhiệm vụ HTQT cấp Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, mã số QTBY01.05/18-19 do TS Trần Mỹ Linh làm chủ nhiệm đã hỗ trợ trong quá trình thực hiện nghiên cứu

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô trong Học viện Khoa học và Công nghệ, VAST đã hết lòng truyền đạt kiến thức cho tôi xong suốt hai năm học vừa qua

Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ thuộc Phòng Nghiên cứu Tài nguyên sinh vật – Viện Hóa sinh biển, VAST đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận văn

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè động viên giúp

đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày tháng năm 2020

Học viên

Nguyễn Thị Thanh Huyền

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN 1

LỜI CẢM ƠN 2

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT 5

DANH MỤC CÁC BẢNG 6

DANH MỤC CÁC HÌNH 7

MỞ ĐẦU 8

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 10

1.1 Giới thiệu chung về dừa cạn 10

1.1.1 Đặc điểm sinh học và phân bố 10

1.1.2 Giá trị y học 11

1.2 Nuôi cấy mô tế bào cây thuốc in vitro 12

1.2.1 Các xu hướng trong sản xuất chất thứ cấp in vitro 13

1.2.2 Các yếu tố chính ảnh hưởng nuôi cấy mô và tế bào cây thuốc in vitro 16

1.2.3 Nuôi nhân chồi in vitro 19

1.2.4 Nuôi cấy mô sẹo và tế bào huyền phù 20

1.3 Nuôi cấy mô cây dừa cạn để tăng cường sx chất thứ cấp có hoạt tính sinh học 23 1.4 Những thách thức trong sản xuất chất thứ cấp in vitro 26

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27

2.1 Vật liệu 27

2.1.1 Các giống thực vật nghiên cứu 27

2.1.2 Các môi trường dùng cho nghiên cứu 27

2.2 Phương pháp nghiên cứu 28

2.2.1 Khử trùng và nảy mầm hạt 28

2.2.2 Tạo nguồn vật liệu bằng phương pháp nhân nhanh chồi in vitro 28

2.2.3 Thí nghiệm cảm ứng tạo mô sẹo từ đoạn thân dừa cạn 28 2.2.3.1 Tối ưu hóa loại và nồng độ chất điều hòa sinh trưởng lên khả năng tạo mô sẹo 28

2.2.3.2 Đánh giá ảnh hưởng của ví trí và kích thước đoạn thân đến hình thành mô sẹo 29

2.2.3.3 Tối ưu hóa kích thước đoạn thân 29

2.2.3.4 So sánh khả năng tạo mô sẹo giữa các giống dừa cạn thu thập tại Việt Nam30 2.2.4 Tối ưu hóa môi trường nhân nhanh mô sẹo dừa cạn 30

2.2.5 Phát triển điều kiện nuôi cấy tế bào huyền phù cây dừa cạn 30

2.2.6 Đánh giá ảnh hưởng của ánh sáng và nhiệt độ lên sự phát triển của tế bào huyền phù dừa cạn 31

2.2.7 Tách chiết và định lượng alkaloid tổng số 31

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33

3.1 Nghiên cứu tạo mô sẹo phù hợp cho việc nuôi cấy tế bào huyền phù từ các vật liệu ban đầu khác nhau của hai giống dừa cạn 33

3.1.1 Đánh giá khả năng nảy mầm hạt dừa cạn trong điều kiện in vitro 33

3.1.2 Đánh giá khả năng nhân chồi in vitro của dừa cạn 33

3.1.3 Nghiên cứu cảm ứng tạo mô sẹo từ các vật liệu nuôi cấy in vitro 35

3.1.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của đoạn lóng thân đến khả năng hình thành mô sẹo 39 3.1.5 Tối ưu hóa kích thước đoạn thân dùng trong thí nghiệm cảm ứng tạo mô sẹo39 3.1.5 Đánh giá khả năng hình thành mô sẹo ở hai giống dừa cạn QN02 và H01 từ đoạn thân thứ 3, kích thước 0,3cm 41

3.2 Nghiên cứu phát triển tế bào huyền phù dừa cạn 43

3.2.1 Phát triển môi trường nhân nhanh mô sẹo, bảo toàn khả năng sinh tổng hợp alkaloid 43

3.2.2 Ảnh hưởng của nồng độ tế bào ban đầu đến sự phát triển của tế bào dừa cạn nuôi lỏng 47

3.2.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ và ánh sáng lên tốc độ phát triển của tế bào 49

3.2.4 So sánh khả năng nhân nhanh của tế bào huyền phù của hai giống dừa cạn QN02 và H01 51

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 54

4.1 Kết luận 54

4.2 Kiến nghị 54

TÀI LIỆU THAM KHẢO 55

DDW Nước cất hai lần (double distilled water)

LS Môi trường nuôi cấy của Linsmaier và Skoog (1965)

MS Môi trường nuôi cấy của Murashige và Skoog (1962) N6 Môi trường nuôi cấy của Chu và cs (1975)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1: Thông tin ký hiệu mẫu dừa cạn 27 Bảng 2.2: Thành phần các môi trường nuôi cấy mô 27 Bảng 3.1 Tỷ lệ tạo mô sẹo của các đoạn lóng thân lên môi trường CT2 36 Bảng 3.2 A Trọng lượng tươi tế bào dừa cạn giống QN02 thử nghiệm trên

các công thức của môi trường nhân nhanh tế bào 45

Bảng 3.2 B Trọng lượng tươi tế bào dừa cạn giống H01 thử nghiệm trên các

công thức của môi trường nhân nhanh tế bào 45

Bảng 3.3 Sự tăng trưởng của tế bào dừa cạn QN02 sau 27 ngày nuôi cấy 48 Bảng 3.4 Trọng lượng tươi tế bào dừa cạn thử nghiệm trong môi trường lỏng

CT4 nhân nhanh tế bào huyền phù trong thí nghiệm cấy chuyển tế bào từ môi trường đặc CT3 sang môi trường lỏng CT4 51

DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Cây dừa cạn 10 Hình 2.1 Lựa chọn đoạn thân trong thí nghiệm cảm ứng tạo mô sẹo ở dừa

cạn 29

Hình 3.1 Hạt dừa cạn nảy mầm sau 1 tuần gieo hạt 33 Hình 3.2 Hình ảnh thí nghiệm nhân chồi dừa cạn tạo nguyên liệu cho TN tạo

mô sẹo 34

Hình 3.3 Mô sẹo dừa cạn QN02 (A) và H01 (B) sau 4 tuần phát triển trên

môi trường CT2 có các nồng độ thử nghiệm 1,5 mg/L IAA 35

Hình 3.4 Hình ảnh mô sẹo dừa cạn QN02 (A) và H01 (B) sau 4 tuần phát

triển trên môi trường CT2 có các nồng độ thử nghiệm 1,5 mg/L NAA 37

Hình 3.5 Mô sẹo dừa cạn H01 sau 4 tuần phát triển trên môi trường CT2 có

các nồng độ thử nghiệm 2,4-D khác nhau 38

Hình 3.6 Hình ảnh mô sẹo dừa cạn QN02 sau 4 tuần phát triển trên môi

trường CT2 có các nồng độ thử nghiệm 2,4-D khác nhau 38

Hình 3.7 Một số hình ảnh thí nghiệm tối ưu vị trí đoạn lóng thân trong thí

nghiệm tạo mô sẹo sau 4 tuần đặt trên môi trường tạo mô sẹo A: đoạn 1; B: đoạn 2; C: đoạn 3 39

Hình 3.8 Hình ảnh thí nghiệm tối ưu kích thước đoạn thân trong TN tạo mô

sẹo 40

Hình 3.9 Mô sẹo dừa cạn trên môi trường CT2 chứa 1,5 mg/L 2,4-D 41 Hình 3.10 Tốc độ nhân sinh khối của tế bào dừa cạn QN02 và H01 47 Hình 3 11 Hình ảnh tế bào dừa cạn QN02 phát triển trên môi trường CT3-547 Hình 3.12 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của tế bào dừa cạn 50 Hình 3.13 Ảnh hưởng của ánh sáng đến sự phát triển của tế bào huyền phù

dừa cạn A tế bào nuôi trong tối; B tế bào nuôi ngoài ánh sáng 50

Hình 3.14 Hình ảnh tế bào huyền phù dừa cạn QN02 nuôi lỏng tại thời điểm

A: 1 ngày; B: 3 ngày; C: 5 ngày; D: 7 ngày; E: 10 ngày; F: 14 ngày 52

MỞ ĐẦU

Từ lâu thực vật luôn là nguồn cung cấp một số lượng khổng lồ các hợp chất hóa học có hoạt tính và được dùng làm thuốc Các hợp chất hoạt tính sinh học được chiết xuất từ thực vật có thể được sử dụng như thuốc điều trị bệnh, thực phẩm chức năng, thuốc bảo vệ thực vật, phụ gia thực phẩm, thuốc nhuộm, chất tạo hương vị và mỹ phẩm Hiện có khoảng 25–28% thuốc chữa bệnh có nguồn gốc từ thực vật, hơn 60% thuốc điều trị ung thư trực tiếp hoặc gián tiếp từ thực vật và có nhiều loại không có sản phẩm tổng hợp hoặc bán tổng hợp thay thế Vì thế nguồn sinh khối thực vật đang ngày một tăng cao và những nghiên cứu nhằm tăng cường sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp có hoạt tính dược học là đòi hỏi cấp bách

Trong vài thập kỷ qua, kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật đã có những bước phát triển vượt bậc, là một phương pháp thay thế thích hợp trong việc tạo các nguồn sinh khối ở quy mô khác nhau không phụ thuộc vào mùa

vụ Ngoài ra, việc nuôi cấy mô tế bào còn có thể tiến hành ở bất cứ nơi nào trong điều kiện vô trùng và không phải sử dụng các chất bảo vệ thực vật độc hại Một trong những tiến bộ đáng kể trong kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật chính là tạo tế bào dạng huyền phù (tế bào không bị biệt hóa) của thực vật để nghiên cứu các hoạt tính sinh học và sản xuất các chất trao đổi thứ cấp có giá trị Nuôi cấy tế bào huyền phù còn là một trong những giải pháp để cải thiện khó khăn khi nồng độ các chất trao đổi thứ cấp trong cây thấp và đã được phát triển thành công như chất artemisinin (phân lập từ cây thanh hao hoa vàng, có tác dụng chữa sốt rét) và chất paclitaxel (hay taxol, phân lập từ cây thông đỏ,

có tác dụng chữa ung thư)

Cây dừa cạn (Catharanthus roseus L.) G Don) là cây dược liệu, chứa

nhiều chất thứ cấp khác nhau trong đó có nhóm chất terpenoid alkaloid có nhân indole (TIA) như vinblastine và vincristine để điều trị một số bệnh ung thư nguy hiểm như bệnh bạch cầu, ung thư hạch bạch huyết

(lymphosarcoma), ung thư biểu mô rau (choriokarsinoma), u nguyên bào thần kinh, ung thư vú, ung thư phổi, bệnh Hodgkin, các khối u dạng Wilkin và ung thư tế bào lưới Trên thực tế nhu cầu về các alkaloid ngày một tăng, nhưng quá trình sản xuất những hợp chất này vẫn gặp nhiều khó khăn do hai hợp chất này chỉ có mặt trong cây dừa cạn với hàm lượng rất thấp, khoảng 0,0002- 0,0005% tổng hàm lượng alkaloid trong cây và phụ thuộc vào giống và các cơ

quan khác nhau của cây Vì thế, sử dụng kỹ thuật nuôi cấy tế bào in vitro để

phát triển sinh khối và sau đó là điều khiển sinh tổng hợp các chất thứ cấp có giá trị đã được nghiên cứu rộng rãi, đặc biệt ở cây dừa cạn, tuy nhiên kết quả vẫn còn hạn chế và phụ thuộc nhiều vào hệ thống nuôi cấy bao gồm vật liệu, điều kiện nuôi cấy… Trong khuôn khổ luận văn này, nghiên cứu sẽ tập trung

“ Nghiên cứu thiết lập hệ thống nuôi cấy tế bào huyền phù cây dừa cạn

(Catharanthus roseus L.) của Việt Nam” nhằm chọn tạo được các dòng tế

bào có khả năng phát triển sinh khối với tốc độ nhanh và giữ đươc khả năng tổng hợp các chất thứ cấp Kết quả của luận văn sẽ là cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo nhằm cải thiện khả năng tổng hợp các chất thứ cấp của tế bào

dừa cạn ở điều kiện in vitro

Để đạt được mục tiêu, các công việc cụ thể sẽ được tiến hành như sau:

1 Nghiên cứu ảnh hưởng của vật liệu, môi trường, chất kích thích sinh trưởng khác nhau đến khả năng hình thành mô sẹo của 02 giống dừa cạn của Việt Nam

2 Nghiên cứu điều kiện thích hợp cho nuôi cấy huyền phù tế bào từ mô sẹo dừa cạn đã được chọn lọc

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung về dừa cạn

1.1.1 Đặc điểm sinh học và phân bố

Dừa cạn có tên khoa học là Catharanthus roseus (L) G Don, tên

thường gọi là dừa cạn hoặc bông dừa hay trường xuân hoa là một loài thực vật

thân thảo thuộc chi Catharanthus, họ Trúc đào (Apocynaceae) Chi

Catharanthus gồm 8 loài, trong đó 7 loài có nguồn gốc từ bán đảo Madagascar

(C coriaceus, C lanceus, C longifolius, C ovalis, C roseus, C scitulus, C

trichophyllus) và 1 loài C pusillus từ Ấn Độ Loài Catharanthus roseus (L)

G Don (dừa cạn) được du nhập vào Việt Nam, phân bố ở nhiều vùng, trải dài

từ Bắc vào Nam [1] Loài cây này chủ yếu được trồng ở các nước nhiệt đới, ở những vùng lạnh cây được trồng vào mùa hè vì không chịu được lạnh

Hình 1.1: Cây dừa cạn (Nguồn: http://www.uphcm.edu.vn/caythuoc/index.php?q=node/195)

Dừa cạn là dạng cây thường xanh hoặc cây thân thảo, cao tới 80 cm đến

1 m và hoa nở liên tục quanh năm với hoa màu hồng, tím hoặc trắng [2] Lá cây có hình từ bầu dục đến thuôn, dài từ 2,5- 9,0 cm và rộng từ 1- 3,5 cm, không có lông, màu xanh bóng với một gân ở giữa màu nhạt và cuống lá

ngắn khoảng 1-1,8 cm và được sắp xếp theo cặp đối diện Hai giống C roseus

phổ biến nhất được đặt tên dựa trên màu hoa, bao gồm một giống hoa màu hồng Rosel và một giống hoa màu trắng Alba Hoa có nhiều màu từ màu trắng đến hồng đậm với hoa gồm 5 cánh mỏng, tiểu nhụy gắn với phần trên

của ống vành, tâm bì rời ở noãn sào với năm cánh giống thùy hoa Quả là

một cặp nang dài khoảng 2-4 cm và rộng 3 mm Dừa cạn C roseus là một

loài khác biệt với hầu hết các loài khác trong họ ở khả năng tự tương thích Tuy nhiên, quá trình tự thụ phấn trong hoa thường không xảy ra ở cây dừa cạn

vì sự tách biệt vật lý giữa nhụy và bao phấn, một hiện tượng được gọi là herkogamy ngược, khi nhụy bị thấp xuống dưới mức bao phấn [3]

Ở Việt Nam, dừa cạn là cây hoang dại, có vùng phân bố tự nhiên tương đối đặc trưng từ tỉnh Quảng Ninh đến Kiên Giang dọc theo vùng ven biển, tập trung ở các tỉnh miền Trung như Thanh Hóa, Nghệ An, Thừa Thiên - Huế, Quảng Nam, Đà Nẵng, Bình Định và Phú Yên Ngoài ra dừa cạn còn xuất hiện ở các đảo như Cô Tô, Côn Đảo và Phú Quốc [1] Ở những vùng phân bố

tự nhiên ven biển, dừa cạn có khi mọc gần như thuần loại trên các bãi cát dưới rừng phi lao, trảng cỏ cây bụi thấp, có khả năng chịu đựng điều kiện đất đai khô cằn của vùng cát ven biển

1.1.2 Giá trị y học

Catharanthus roseus được coi là một nhà máy sản xuất đến 130

terpenoid indole alkaloids (TIAs) khác nhau, trong đó có nhiều chất có hoạt tính dược học quan trọng được dùng trong điều trị ung thư, tiểu đường, cao huyết áp, dị ứng, táo bón và nhiều bệnh đường ruột Trong đó, vinblastine là hợp chất đã được FDA (Food and Drug Administration) của Mỹ phê duyệt vào năm 1965 và trở thành một thành phần chính của phương pháp hóa trị liệu trong điều trị nhiều loại ung thư như bạch cầu, bàng quang, tinh hoàn, các u bạch huyết, ung thư vú, ung thư phổi tế bào nhỏ…, được bán trên thị trường hơn 40 năm nay Ngoài ra, vincristine và vinblastine còn thể hiện hoạt tính kháng khuẩn [4] Một hợp chất khác của nhóm TIA là ajmalicin được sử dụng làm chất chống cao huyết áp, hợp chất vindoline được nghiên cứu ứng dụng trong điều trị bệnh tiểu đường [5] Khi nghiên cứu để phát hiện các chất có hoạt tính hạ đường huyết từ cây dừa cạn của Việt Nam, Nguyen và cs [6] đã

phân lập và xác định cấu trúc hóa học của 9 hợp chất có hoạt tính ức chế enzyme glucosidase từ cây và rễ dừa cạn thu hái tại Hoài Nhơn, Bình Định, trong đó có 2 chất lần đầu tiên được phân lập từ loài này Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào trên 9 dòng tế bào ung thư ở người, gồm ung thư gan (Hep- G2), ung thư biểu mô (KB), ung thư phổi (LU-1), ung thư vú (MCF-7), melanoma cancer ung thư sắc tố (SK-Mel2), ung thư bạch cầu cấp tính (HL60), ung thư buồng trứng (SW626), ung thư tuyến tiền liệt (LNCaP) và ung thư ruột kết (HT-29) đã có những kết quả nhất định Mặc dù có vai trò quan trong nhưng cấu trúc phức tạp của vinblastine và vincristine làm cho việc tổng hợp hóa học các chất này rất khó khăn

Dừa cạn cũng được dùng phổ biến trong các bài thuốc Đông y để trị cao huyết áp, trị bệnh tiểu đường, tiêu hóa kém, lỵ thông tiểu tiện, bệnh đi tiểu

đỏ và ít Một số trường hợp còn dùng để trị ung thư máu, ung thư phổi [7] Trước đây, nguồn dừa cạn mọc tự nhiên ở Việt Nam tương đối dồi dào Trước năm 1975, miền Bắc đã từng xuất khẩu sang Đông Âu 1-3 tấn/năm Những năm gần đây, lượng xuất khẩu sang Pháp (khoảng trên 10 tấn/năm) thường xuyên hơn, nhưng chủ yếu là từ cây trồng tại Phú Yên

1.2 Nuôi cấy mô tế bào cây thuốc in vitro

Nuôi cấy mô tế bào thực vật được bắt đầu từ đầu thế kỷ 20 Trong những năm 1940 và 1960, những tiến bộ công nghệ đã dẫn đến sự phát triển của kỹ thuật nuôi cấy mô tế thực vật nhằm nghiên cứu hoạt động của tế bào (bao gồm tế bào học, dinh dưỡng, chuyển hóa, quá trình phát sinh hình thái, hình thành phôi và bệnh học), tạo ra cây sạch bệnh và điều kiện lưu trữ tế bào

và nhân giống vô tính Từ những năm 1960, quá trình sinh tổng hợp các chất chuyển hóa thứ cấp đã được nghiên cứu rộng rãi trong nhiều loại tế bào thực vật và nhiều ứng dụng mới đã được phát triển, cải thiện đáng kể cho quá trình nuôi cấy mô và tế bào thực vật Hiện nay, việc nuôi cấy tế bào thực vật trở thành công cụ hiệu quả để sản xuất quy mô lớn các chất chuyển hóa thứ

cấp dùng trong chăm sóc sức khỏe cho con người (ví dụ, thuốc chống ung thư) [8]

Những ưu điểm chính của hệ thống nuôi cấy mô tế bào so với trồng trọt ngoài tự nhiên bao gồm: các hợp chất thực vật được lựa chọn có thể được tạo liên tục không phụ thuộc các yếu tố bên ngoài như mùa vụ, điều kiện đất đai

và khí hậu; các tế bào nuôi cấy không bị đe dọa bởi sự tấn công của vi sinh vật hoặc côn trùng; các tế bào của bất kỳ loài thực vật nào thậm chí là những loài quý hiếm hoặc có nguy cơ tuyệt chủng có thể dễ dàng duy trì để tạo ra các chất chuyển hóa thứ cấp; và quá trình sản xuất chất chuyển hóa thứ cấp có thể điều khiển nhằm giảm chi phí và cải thiện năng suất

1.2.1 Các xu hướng trong sản xuất chất thứ cấp in vitro

Nuôi cấy in vitro liên quan đến việc sản xuất các tế bào, mô và cơ quan

mới đơn thuần từ phân bào, do đó tạo ra các tế bào, mô và cơ quan, có cùng

gen di truyền của cây mẹ Việc sử dụng các kỹ thuật in vitro để tạo ra các chất

thứ cấp, đặc biệt là các chất có hoạt tính dược học có những ưu điểm chính như không bị ảnh hưởng bởi các điều kiện môi trường bên ngoài và các điều kiện nuôi cấy được kiểm soát trong phòng nuôi cấy; việc sinh tổng hợp chất thứ cấp có khả năng cải thiện bằng cách tạo ra các quy trình đặc thù cho từng bước để tăng tốc tích lũy sinh khối tươi và tăng nồng độ chất trong các mô; có thể sản xuất quanh năm không phụ thuộc vào mùa vụ; các chất thứ cấp được tạo ra trong điều kiện vô trùng và có rất ít rủi ro bị nhiễm bởi các hợp chất độc hại không mong muốn

Các chất thứ cấp được sản xuất in vitro bắt đầu bằng việc đưa các vật

liệu ban đầu từ các loài cây thuốc mong muốn vào trong nuôi cấy Vật liệu

ban đầu được khử trùng bề mặt và nuôi cấy trong điều kiện in vitro, sử dụng

môi trường nuôi cấy đã được tối ưu hóa trong các điều kiện vật lý được kiểm soát cho từng giai đoạn khác nhau Môi trường nuôi cấy chứa các nguồn dinh dưỡng cần thiết cho việc phát triển của tế bào như đường, vì thường bị hạn

chế trong trong điều kiện thiếu ánh sáng và CO2 nồng độ thấp; các chất điều hòa sinh trưởng thực vật, được sử dụng để kiểm soát sự phát triển của mô và

để kích thích sự gia tăng sinh khối thực vật và hàm lượng chất thứ cấp; các chất bổ sung khác như axit amin, vitamin, than hoạt tính, chất chống oxy hóa

và các chất khác tùy thuộc vào loài cụ thể

Các vật liệu ban đầu cho việc nuôi cấy thường là các chồi mang mô phân sinh, các mảnh lá non và các mô phù hợp khác, được khử trùng bề mặt (vô trùng) để loại bỏ vi sinh vật sử dụng cồn 70% hoặc natri hypochlorite Tiếp theo, các vật liệu ban đầu được cấy vào môi trường nuôi cấy phù hợp để

bắt đầu thiết lập hệ thống nuôi cấy in vitro Khởi đầu của hệ thống có thể là

tạo mô sẹo từ các các mô phân sinh, tạo cây hoàn chỉnh, tạo chồi hoặc chỉ là

tạo rễ in vitro Một vài vật liệu ban đầu như mảnh lá, có thêm một một số giai

đoạn được gọi là organogenesis để biến các dạng tế bào chuyên biệt thành các

tế bào có khả năng phân bào và phát triển mô sẹo (indirect organogenesis) hoặc chồi và chồi trực tiếp từ mô ban đầu (direct organogenesis) Sau khi

thiết lập thành công giai đoạn khởi đầu nuôi cấy in vitro, không bị nhiễm với

vi khuẩn và nấm, các giai đoạn tiếp theo bao gồm quá trình nhân các tế bào,

mô, chồi và rễ Các giai đoạn này rất quan trọng, có tính quyết định về hiệu quả kinh tế của quá trình, chủ yếu là do càng nhiều tế bào và mô được sản xuất, năng suất của các chất thứ cấp mục tiêu càng cao

Việc nuôi cấy in vitro của các loài cây thuốc có thể giúp sản xuất cây

dược liệu theo nhiều phương thức khác nhau như : i) vi nhân giống trên các dòng vô tính quy mô lớn với chất lượng di truyền ổn định và nồng độ chất thứ cấp cao và nhân giống các loài khó nhân giống bằng các phương pháp thông thường, chẳng hạn như cây có chu kỳ sinh trưởng dài hoặc bị nhiễm bệnh, ví dụ virus và vi khuẩn nếu nhân bằng phương pháp vô tính thông thường; ii) sử dụng elicitor (sinh học hoặc phi sinh học áp dụng để kích thích

sản xuất các chất thứ cấp) để kích thích các mô trong điều kiện in vitro để sản

xuất chất thứ cấp mục tiêu; iii) biến đổi gen của cây thuốc để sản xuất chất thứ cấp trong các mô cụ thể, nhằm cải thiện hiệu quả sản xuất sinh khối, tế bào và do đó, chất thứ cấp từ các loài hiếm hoặc khó phát triển trong tự nhiên, hoặc các chất ở nồng độ thấp trong các loài ban đầu được cải thiện hiệu quả hơn

Quá trình vi nhân giống có thể góp phần vào việc sản xuất thuốc thảo dược và các sản phẩm thông thường sử dụng hợp chất thứ cấp được chiết xuất

từ cây thuốc Các kỹ thuật vi nhân giống in vitro đẩy nhanh quá trình sản xuất

cây vô tính từ giống có khả năng sinh tổng hợp các chất thứ cấp tốt hơn và có thể phát triển tốt hơn trong điều kiện tự nhiên Mặc dù hai phương thức còn lại cũng có thể dẫn đến việc sản xuất các loại thuốc thảo dược, nhưng được ứng dụng chủ yếu để sản xuất các chất thứ cấp có giá trị cao vì chi phí của các kỹ thuật liên quan tương đối đắt đỏ [9] Dùng các chất elicitor là một phương tiện có thể thúc đẩy những khó khăn khác nhau liên quan đến việc sản xuất quy mô lớn của hầu hết các chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính sinh học quan trọng từ thực vật, nuôi cấy mô biệt hóa và không biệt hóa bằng cách

áp dụng nồng độ thấp của các yếu tố sinh học và phi sinh học đã được tiến hành rộng rãi Một vài hợp chất hóa học thường được sử dụng là salicylic axit, metyl salicylat, axit bezoic, chitosan, v.v có ảnh hưởng đến sản xuất các hợp chất phenolic và kích hoạt các enzym liên quan đến chống chịu trong thực vật [10] Đối với tạo cây thuốc biến đổi gen, hiện đang có nhiều yêu cầu về an toàn sinh học liên quan đến việc trồng cây dược liệu chuyển gen ngoài tự

nhiên và nhận thức của người tiêu dùng [9] Do vậy, các mô chuyển gen in

vitro sẽ chỉ có nghĩa là để tạo ra sinh khối cho việc chiết xuất các hợp chất

hóa học tinh khiết (như ở cây không chuyển gen)

Các dòng thuốc lá chuyển gen có khả năng sinh tổng hợp các chất thứ cấp hiếm, như vincristine và vinblastine đã được tạo ra Các tế bào mô sẹo của cây thuốc lá chuyển gen sẽ đóng vai trò là nơi để sản xuất các chất mong

muốn Các tế bào phát triển rất nhanh này sẽ cho phép tăng khả năng sinh tổng hợp chất thứ cấp theo cấp số nhân Tế bào cây thuốc lá được lựa chọn vì đây là các tế bào dễ dàng tiến hành biến đổi gen và cho phép điều khiển quá trình phát triển sinh khối Ngoài ra, cây thuốc lá biến đổi gen đã được dùng để sản xuất các loại chất có hoạt tính khác nhau như vắc-xin, hormone và kháng thể [11]

1.2.2 Các yếu tố chính ảnh hưởng nuôi cấy mô và tế bào cây thuốc in vitro

Kiểu gen là yếu tố có ảnh hưởng trực tiếp đối với việc sản xuất sinh khối thực vật và chất thứ cấp Các giống có hàm lượng chất thứ cấp cao là lựa chọn đầu tiên cho việc sử dụng nuôi cấy mô Ví dụ như cây gai Ấn độ

(Pilocarpus microphyllus) có hàm lượng pilocarpin, một alkaloid có vai trò

tăng cường hoạt động của hệ thần kinh giao cảm, nằm trong khoảng từ 16,3 đến 235,9 µg/g lá khô tùy thuộc vào giống [12], có sự chênh lệch đến 14,5 lần về hàm lượng pilocarpin Tuy nhiên, các kiểu gen quý của cây dược liệu

có hàm lượng chất có hoạt tính cao còn hạn chế và cần phải có những nghiên cứu chi tiết đối với các giống ở từng vùng địa lý khác nhau

Việc sử dụng các kiểu gen có hàm lượng chất thứ cấp tự nhiên cao là

điều kiện cần thiết để đảm bảo hiệu quả trong nuôi cấy in vitro cây thuốc do

chi phí của hệ thống nuôi cấy thường cao hơn so với các kỹ thuật thông

thường khác Bên cạnh đó, vì nuôi cấy in vitro dựa trên nguyên phân, các kiểu

gen sinh tổng hợp các chất có hoạt tính cao sẽ dẫn đến hàm lượng chất mong muốn cao hơn đáng kể trong cây hoặc các mô được nuôi cấy Tuy nhiên, ngay cùng với một kiểu gen thì trong điều kiện phát triển ngoài tự nhiên quần thể cây thường có nhiều biến động về di truyền, dẫn đến biến động về sinh khối

và hàm lượng chất trao đổi thứ cấp [13] Do đó, điều cần thiết là phải nghiên cứu tương tác giữa kiểu gen và môi trường, để tạo ra điều kiện nuôi trồng tốt

nhất, kể cả với hệ thống nuôi cấy in vitro Trong điều kiện nuôi trồng ngoài tự

nhiên, yếu tố nội sinh như kiểu gen, loại cơ quan và tuổi

mô, đồng hồ sinh học; và các yếu tố ngoại sinh, chẳng hạn như chu kỳ quang, cường độ chiếu sáng và bước sóng, nhiệt độ, nguồn nước, loại đất và thành phần không khí, có thể riêng rẽ hoặc phối hợp ảnh hưởng đến cả thành phần

và nồng độ của một chất thứ cấp đơn lẻ hoặc nhiều chất khác nhau [14,15]

Những yếu tố tương tự cũng có thể ảnh hưởng đến hình thành các chất

thứ cấp có hoạt tính trong nuôi cấy in vitro Ví dụ, Kapoor và cs [16] cho biết

chỉ cần một thay đổi một yếu tố là chất lượng ánh sáng đã có ảnh hưởng đến tích lũy sinh khối, tốc độ sinh trưởng và nồng độ của hợp chất phenolic Salidroside trong cây rễ vàng Rhodiola imbricata Dưới tác động của ánh sáng

đỏ, mô sẹo có chỉ số tăng trưởng cao nhất (2,97) và nồng độ phenolic tổng số

và Salidroside lại cao nhất dưới ánh sáng xanh sau 21 ngày nuôi cấy Trong trường hợp này, nuôi cấy mô sẹo để phát triển sinh khối cần ánh sáng trắng và sau đó để tăng cường sinh tổng hợp chất mong muốn sẽ chuyển đổi sang ánh sáng xanh Các yếu tố khác có thể được vì thế cũng cần được tối ưu hóa để cải thiện quá trình nuôi cấy, chẳng hạn như kết hợp ánh sáng xanh /trắng với tỷ lệ thích hợp có thể cải thiện đồng thời việc tăng sinh khối và sinh tổng hợp chất thứ cấp

Điều khiển các yếu tố môi trường trong nuôi cấy mô tế bào in vitro để

tăng cường sinh khối và theo sinh tổng hợp chất thứ cấp là một ưu việt của hệ thống này vì không phụ thuộc vào mùa vụ trong năm và trong điều kiện vô trùng Tuy nhiên, nhược điểm chính nằm ở chi phí sản xuất cao, vì thế cần phải được bù đắp bằng hệ thống nuôi cấy được thiết kế phù hợp Các yếu tố chính được sử dụng để tính năng suất thu nhận các chất thứ cấp trong điều

kiện in vitro chính là khối lượng sinh khối tươi hoặc khô và nồng độ chất kèm

theo, diện tích dùng cho nuôi cấy (bình nuôi hoặc bioreactor) và thời gian cần thiết để có hoàn thành 1 chu kỳ sản xuất Các yếu tố khác, như thể tích môi trường nuôi cấy, cũng có thể được sử dụng trong công thức này Tuy nhiên, môi trường nuôi cấy thường chiếm chưa đến 5% tổng chi phí

Diện tích cần dùng cho nuôi cấy in vitro thay đổi tùy theo loại và kích

cỡ bình, hiệu quả tạo sinh khối và hệ thống sử dụng Các hệ thống thông thường bao gồm môi trường bán rắn, chứa agar hoặc môi trường lỏng, có khuấy trộn không liên tục hoặc trong hệ thống bioreactor ngập tạm thời (TIB) Việc sử dụng TIB được cho gia tăng tích lũy sinh khối tốt hơn so với nuôi cấy trên môi trường bán rắn [17, 18]

Các yếu tố phi sinh học, chẳng hạn như nhiệt độ, ánh sáng cường độ, thời gian chiếu sáng và bước sóng, độ ẩm tương đối và thành phần không khí quyển trong bình nuôi cũng ảnh hưởng mạnh đến sự tích lũy sinh khối tươi và khô, nồng độ chất trong sinh khối và thời gian nuôi Những đặc điểm trên cũng phụ thuộc vào từng loài cây thuốc cần nuôi cấy Môi trường nuôi cấy và các thành phần dinh dưỡng, chẳng hạn như lượng nước và áp suất của môi trường nuôi cấy, dinh dưỡng đa lượng, vi lượng, carbohydrate, vitamin và axit amin, và các chất kích thích sinh trưởng thuộc các nhóm khác nhau như auxin, cytokinin [19], gibberellin, jasmonate và salicylate [20] cũng ảnh hưởng sâu sắc đến các đặc điểm này

Các yếu tố ảnh hưởng khác là loại, cường độ và thời gian tương tác với các elicitor, được sử dụng để kích thích sinh tổng hợp và tăng nồng độ PDMC vào cuối chu kỳ tăng trưởng hoặc tích lũy sinh khối thực vật [21] Elicitor là các chất hóa học được đưa vào môi trường nuôi cấy, là bức xạ ion hóa hoặc các yếu tố vật lý khác áp dụng cho các tế bào và mô, hoặc thậm chí đồng nuôi cấy mô thực vật với các vi sinh vật nào đó [22] hoặc áp dụng các điều kiện môi trường bất lợi, chẳng hạn như nhiệt độ cao hoặc thấp trong một thời gian nhất định Trong số các chất elicitor hóa học được áp dụng cho môi trường nuôi cấy, có cả các chất điều hòa sinh trưởng như axit salicylic và jasmonic [23], chitosan [24], chiết xuất từ vi sinh vật [25] và các dạng phân tử thế hệ mới khác [26] Trong số các yếu tố vật lý, bức xạ cực tím đã được sử dụng

thường xuyên và có tác dụng kích hoạt các quá trình khác nhau trong nuôi cấy

in vitro [27]

Việc đồng nuôi cấy tế bào thực vật với vi sinh vật đã được sử dụng để

kích hoạt sinh tổng hợp một số chất thứ cấp có giá trị Nấm Aspergillus flavus

đồng nuôi cấy với mô dừa cạn đã dẫn đến tăng 7,88 và 15,5% nồng độ vinblastine và vincristine, so với các mô đối chứng [22] Nhiều khả năng việc kích hoạt tổng hợp một số chất chuyển hóa thứ cấp là do đáp ứng của cây sản xuất chất có hoat tính sinh học chống lại vi sinh vật gây bệnh Ludwig-Müller [28] cho rằng cảm ứng chuyển hóa thứ cấp ở thực vật cũng được sinh ra bởi các vi sinh vật nội sinh (endophyte) Tuy nhiên, việc đồng nuôi cấy mô thực vật với vi sinh vật cũng có thể dẫn đến tăng chi phí sản xuất vì việc liên quan đến nuôi cấy hai loại sinh vật riêng rẽ và sau đó là giai đoạn đồng nuôi cấy Ngoài ra, vi sinh vật được sử dụng cho đồng nuôi cấy có thể tạo ra các thành phần độc hại và làm tăng nguy cơ tế bào thực vật bị nhiễm khuẩn

Do đó, việc xây dựng một quy trình nuôi cấy tế bào in vitro các tế bào,

mô của cây thuốc để tạo ra chất thứ cấp đòi hỏi phải nghiên cứu nhiều yếu tố

đặc thù cho từng loài và loại chất cần sản xuất in vitro

1.2.3 Nuôi nhân chồi in vitro

Nuôi nhân chồi tương tự như vi nhân giống thông thường, bao gồm nuôi cấy các vật liệu ban đầu đã được khử trùng bề mặt trong môi trường tái sinh chồi, sau đó là nhân nhanh chồi bằng cách bổ sung chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin vào môi trường nuôi cấy Sau một số chu kỳ nhân chồi và tích lũy sinh khối, elicitor có thể được bổ sung để kích hoạt việc tăng cường sinh tổng hợp chất thứ cấp trong các mô của chồi Tiếp theo, các chất thứ cấp có hoạt tính sẽ được tách chiết từ chồi, thay vì từ trồng cây con hoàn chỉnh như là vi nhân giống

Để xác định và định lượng các chất chuyển hóa thứ cấp chính được tạo

trong chồi cây hoàng cầm râu (Scutellaria alpine), Gzegorczyk-Karolak và cs

[19] đã bắt đầu bằng cấy đỉnh sinh trưởng có kích thước 0,5 cm của cây trong môi trường có bổ sung các loại cytokinin ở các nồng độ khác nhau Đỉnh sinh trưởng được tách ra từ hạt đã được khử trùng và nảy mầm trên môi trường

MS Kết quả cho thấy, BAP (2-4 µM) có khả năng kích thích việc nhân chồi

và tạo sinh khối cao nhất Liên quan đến việc sử dụng elicitor, Sharma và vs [23] phát hiện hàm lượng bacoside cao nhất (8,73 mg/g sinh khối khô) thu

được ở chồi cây đắng biển Bacopa monnieri là từ các chồi được kích thích với

45 mg/L CuSO4 trong môi trường nuôi cấy từ 6 đến 9 ngày Đồng thời, 1,0 mg/l axit jasmonic và 50 µM axit salicylic trong thời gian 6 đến 9 ngày cũng làm tăng tăng nồng độ bacoside là 8,46 và 8,14 mg/g so với đối chứng không

có elicitor (6,41 mg/g sinh khối khô)

1.2.4 Nuôi cấy mô sẹo và tế bào huyền phù

Tạo mô sẹo và nhân mô sẹo đã được sử dụng rộng rãi trong sản xuất sinh khối và các chất có hoạt tính sinh học Đây là hệ thống được cho là hiệu quả nhất để sản xuất chất có hoạt tính trong thực vật ở quy mô lớn bởi chất

được tạo ra trực tiếp trong mô và các mô được nhân nhanh in vitro [16] Các

yếu tố ảnh hưởng đến việc nhân nhanh mô sẹo đã được nghiên cứu kỹ lưỡng

và nhiều quy trình nhân nuôi mô sẹo ổn định ở nhiều loại cây khác nhau đã được sử dụng thương mại [29]

Việc nuôi cấy mô sẹo cũng liên quan đến khả năng đáp ứng phản phân hóa của nhiều dạng tế bào và mô từ các cơ quan khác nhau để tạo ra mô sẹo trên môi trường có các chất điều hòa sinh trưởng thuộc nhóm auxin như 2,4D và/hoặc cùng với cytokinin [29] Ưu điểm của mô sẹo là hầu hết các tế bào trong khối mô đều có khả năng tăng trưởng liên tục trong môi trường nuôi cấy thích hợp Do đó, các tế bào duy trì các chu kỳ phân chia liên tục trong giai đoạn được gọi là giai đoạn tăng trưởng lũy thừa, sau đó là giai đoạn dừng tăng trưởng rồi giảm tăng trưởng Khả năng duy trì các tế bào này trong điều kiện không biệt hóa giúp có thể dễ dàng tính được lượng sinh khối tạo ra

trên một đơn vị thời gian và diện tích Quá trình này hiệu quả, đơn giản và rẻ tiền hơn các quá trình tạo cây, cơ quan

Mô sẹo thường không thể hình thành trên môi trường không có chất kích thích sinh trưởng Vật liệu nuôi cấy đối chứng sẽ bị chết và không quan sát được sự xuất hiện của mô sẹo Gao và Bjork (2000) [30] cho biết mô sẹo

được tạo ra từ đỉnh chồi của cây nữ lang Valeriana officinalis trong môi

trường có bổ sung các tổ hợp auxin (IAA, IBA và NAA) và cytokinin (BA và kin), trong khi đấy Chang và Chang (1998) [31] thông báo mô sẹo hình thành

từ cây lan kiếm Cymibidium ensifolium trên môi trường MS có chứa 2,4-D và

TDZ Kumar và Bhavanandan [32] tạo mô sẹo thành công cho cây bạch hoa

xà Plumbago rosea sử dụng tổ hợp chất kích thích phù hợp Mô sẹo cũng được tạo ra từ chồi nách của cây sâm đất Boerhavia repens trên môi trường

MS bổ sung với 0,5-1,5mg/L NAA và 0,25-1,0 mg/L BAP Có tới 100% mẫu tạo ra mô sẹo tơi xốp và có màu xanh sáng trong tổ hợp 1,0 mg/l NAA+1,0 mg/L BAP Khi thử nghiệm khả năng tạo mô sẹo của các mảnh lá cây xạ

hương Falcaria vulgaris trên môi trường MS bổ sung với các nồng độ NAA,

2,4-D, TDZ khác nhau, riêng rẽ hoặc kết hợp với BAP, Chalageri và Babu [33] nhận thấy rằng tỷ lệ tạo mô sẹo cao nhất là trên môi trường có 0,5 mg/L

2,4-D kết hợp với 0,5 mg/L BA Ở cây cỏ ngọt Stevia rebaudiana, các mảnh

lá đươc khử trùng và nuôi cấy trên môi trường MS có chứa 2,0 mg/L BAP và 2,0 mg/L 2,4-D đã tạo ra các mô sẹo chất lượng [29]

Các loài thuộc chi diệp hạ châu Phyllanthus có chứa nhiều chất trao đổi

thứ cấp quan trọng, đặc biệt là các phyllantine và hypophyllanthin thuộc

nhóm alkaloid [34] Hạt của loài P amarus có hàm lượng các alkaloid cao

được nảy mầm trên mội trường 1/2MS Cây mầm cao khoảng 1 cm được chuyển sang môi trường tạo mô sẹo có chứa 0,5 mg/L 2,4-D [13] Mô sẹo được nhân trên cùng môi trường trong tối và cấy chuyển sau 20-30 ngày Nhiều loại elicitor đã được sử dụng để thử nghiệm khả năng sản xuất

phyllantine và hypophyllanthin của các tế bào mô sẹo Các mô sẹo thu cũng được sử dụng tiếp để thiết lập hệ thống nuôi cấy tế bào huyền phù và trở thành một giai đoạn mới của nuôi cấy mô sẹo Nuôi cấy tế bào cây

Hypericum perforatum, có nguồn gốc châu Âu, được tiến hành trên môi

trường MS lỏng chứa 1,0 mg/L 2,4-D và 0,2 mg/L BA từ các mô sẹo tơi xốp được tạo thành trên môi trường đặc có cùng thành phần Thông thường các đoạn thân tạo ra các dạng mô sẹo này, trong khi mô lá và hoa lại tạo ra dạng

mô sẹo cứng, có màu xanh Sau khi chuyển mô sẹo tơi xốp sang môi trường lỏng, các bình nuôi được đặt trên máy lắc quay và cấy chuyển sang chu kỳ sinh trưởng mới sau 20 ngày Trọng lượng tươi (≈200 g/L) và khô (≈7-8 g/L) tối đa thu được sau 20-25 ngày, kèm theo hàm lượng flavonoid tích lũy cũng đạt cao nhất (≈15-16 mg/g DW) Wang và cs [35] cho thấy việc sử dụng methyl jasmonate và axit salicylic cũng dẫn đến hàm lượng flavonoid trong tế bào nuôi cấy huyền phù tăng gấp 2,1 và 1,5 lần so với đối chứng

Nuôi cấy rễ tơ được tạo ra bởi lây nhiễm với vi khuẩn Agrobacterium

rhizogenes với các vật liệu ban đầu khác nhau in vitro là nguồn mô quan trọng

để sản xuất các chất thứ cấp với hàm lượng thường cao hơn so với nuôi cấy tế bào huyền phù ở một số loài [36] Sujatha và cs [37] đã sử dụng 4 chủng

Agrobacterium rhizogenes chuyển vào chồi, lá và đoạn thân của cây ngải cứu Artemisia vulgaris và quan sát thấy rằng chủng A4GUS có hiệu suất vào các

mảnh lá là cao nhất đạt 92,6% Từ tất cả các dòng rễ tơ chuyển gen thu được

từ lá , họ đã chọn được 2 dòng AV1 và AV2 phát triển tốt nhất, với độ tăng sinh, phân nhánh và tích lũy sinh khối rễ tơ cao hơn các dòng khác Việc nuôi cấy các dòng rễ tơ biến đổi gen này đã tăng tốc độ phát triển của rễ lên gấp 9 lần và có nồng độ tinh dầu cao hơn so với các rễ không chuyển gen Cảm ứng tạo rễ tơ kết hợp với hệ thống bioreactor nuôi chìm cũng có thể cải thiện năng suất các chất thứ cấp Khi nghiên cứu sản xuất ajmalicine từ rễ tơ cây dừa cạn

C roseus, Thakore và cộng sự [18] đã cho thấy thời gtian nuôi cấy, nồng độ

sucrose trong môi trường nuôi cấy, lương rễ tơ ban đầu, thời gian chiếu sáng, loại bioreactor và thể tích khí có ảnh hưởng đáng kể đến sự phát triển của rễ

tơ và nồng độ của ajmalicine, và kết luận rằng bioreactor tạo bong bóng kết hợp với polyurethane đã cải thiện đáng kể sinh khối rễ tơ khô (15,4 lần trong

30 ngày nuôi cấy) và nồng độ ajmalicine tăng 3,4 lần so với hệ thống nuôi cấy

sử dụng que trống quay thông thường Hầu hết các nghiên cứu so sánh nuôi cấy rễ tơ với nuôi cấy tế bào, mô sẹo và chồi trong việc sản xuất các chất thứ cấp đã cho thấy nuôi cấy rễ tơ có nhiều lợi thế nhưng quan trọng nhất là sự ổn định di truyền và khả năng sản xuất các chất thứ cấp ở nồng độ cao [18, 37, 38]

1.3 Nuôi cấy mô cây dừa cạn để tăng cường sản xuất các hợp chất terpene indole alkaloid (TIA)

Việc sản xuất các hợp chất TIA sử dụng nuôi cấy mô cây dừa cạn là một công nghệ được các nhà nghiên cứu đặc biệt quan tâm Một trong những vấn đề có tính quyết định trước khi tiến hành nuôi cấy mô với mục đích sản xuất chất thứ cấp là lựa chọn giống dừa cạn thích hợp, có khả năng sinh tổng hợp TIA cao Mặc dù có nhiều nghiên cứu dựa trên phân tích phổ HPLC cho thấy các giống khác nhau có hàm lượng hợp chất TIA là như nhau, nhưng một vài dòng tế bào dừa cạn có khả năng sản xuất TIA cao hơn Trên thực tế, việc chọn lọc các giai đoạn phát triển của một dòng tế bào tổng hợp và tích lũy được TIA phụ thuộc vào việc chọn lọc các vật liệu ban đầu cho nuôi cấy (loại, kích thước, tuổi) và điều kiện nuôi cấy (dinh dưỡng, chất kích thích sinh trưởng, pH, nhiệt độ, ánh sáng…) Thêm vào đó, việc sàng lọc các tế bào trong quá trình cấy chuyển cũng giúp chọn ra được các dòng tế bào có năng suất cao, mặc dù các dòng này thường không ổn định và có xu hướng giảm khả năng sinh tổng hợp sau nhiều chu trình cấy chuyển [39, 40, 41] Mannonen và cs [42] đã sử dụng các phương pháp giữ lạnh, các chất bảo vệ

và quá trình làm lạnh và giải lạnh khác nhau Dầu khoáng đã được dùng để

bảo quản tế bào trước khi bắt đầu chu trình phát triển tế bào trong môi trường mới [43]

Ngoài ra, nhiều nghiên cứu đã được tiến hành sử dụng nuôi cấy cây nguyên vẹn, chồi, mô sẹo và tế bào đã cho thấy việc sản xuất hợp chất TIA phụ thuộc vào cả quá trình biệt hóa và hình thành cơ quan [44] Endo và cs [45] quan sát được mô hình sản xuất TIA ở trong nuôi cấy rễ và chồi của cây dừa cạn là giống như trong cây hoàn chỉnh Tuy nhiên, nhiều loại TIA không thể được tổng hợp trong tế bào nuôi cấy vì việc điều khiển kích hoạt con đường sinh tổng hợp là đặc hiệu mô và giai đoạn phát triển Shukla và cs [46] quan sát thấy hàm lượng vindoline và catharanthine được tăng cường trong cây dừa cạn nuôi cấy khi mức độ biệt hóa của tế bào tăng lên Tuy nhiên, những hợp chất này chỉ được phát hiện trong điều kiện có chất kích hoạt, hàm lượng catharanthine và vindoline cao nhất có được trong chồi (0.0039% và 0.0013% dwt - trọng lượng khô) so với trong mô sẹo (0.00019% và 0.00015%)

Thành phần môi trường nuôi cấy cùng như điều kiện môi trường và việc bổ sung các hợp chất nhất định đã cho thấy có khả năng tăng cường năng suất TIA trong nuôi cấy mô dừa cạn, đôi khi tăng cao một cách bất ngờ Ví

dụ như, ion nitrate và/hoặc phosphate của môi trường bị giảm hoặc loại bỏ dẫn đến giảm đáng kế tốc độ phát triển của tế bào nhưng lại tăng tích lũy TIA [47] Trong một nghiên cứu khác, việc bổ sung KCl (4 g/L) không những không kìm hãm tế bào phát triển tế bào mà còn giúp làm tăng khả năng sản xuât ajmalicine và serpentine gấp 3 lần so với nuôi cấy mô sẹo [48] Tương

tự, khi bổ sung NaCl (1,7 g/L) đã tăng lượng catharanthine (khoảng 90%), trong khi với nồng độ KCl tương tự thì làm tăng hàm lượng catharanthine lên đến 300% Đặc biệt, nồng độ NaCl cao (2,9 g/L) có tác dụng làm tăng hàm lượng vindoline, catharanthine, vinblastine và vincristine trong cây mầm của dừa cạn [49] Hàm lượng TIA cao nhất thu được khi bổ sung mannitol

250 mM (4 đến 5 lần cao hơn so với đối chứng) vào môi trường nuôi cấy khối mô sẹo [50] Nồng độ nguồn carbon cũng là một yếu tố quan trọng khác cho quá trình sinh tổng hợp TIA Schlatmann và cs [51] cho rằng có mặt của nồng độ glucose thấp liên quan đến mức độ sản xuất ajmalicine cao Zhao và

cs [52] quan sát thấy nồng độ ajmalicine, serpentine và catharanthine (hàm lượng alkaloid tổng số cao hơn 43 mg/L) tăng lên khi nồng độ sucrose trong môi trường nuôi cấy callus tăng lên Tương tự, Jung và cs [53] cũng thu được nồng độ catharanthine cao khi nguồn carbon source được thay đổi (fructose thay sucrose) trong nuôi cấy rễ tơ Nhiều tác giả đã chỉ rõ rằng việc sản xuất ajmalicine bị thấp đáng kể khi mật độ nuôi cấy tế bào dừa cạn thấp mặc dù hàm lượng catharanthine là như nhau ở cả mật độ nuôi cấy tế bào thấp và cao [54]

Việc cố định của tế bào thực vật cung cấp khả năng chiu được lực tác động của quá trình lắc và có thể giúp làm tăng hàm lượng TIA, đặc biệt khi sử dụng mật độ tế bào nuôi cấy cao Một số chất mang đã được sử dụng để cố định tế bào dừa cạn [55] Nồng độ tổng hợp và nồng độ tiết của hợp chất ajmalicine ra môi trường tăng lên đáng kể khi tế bào dừa cạn được cố định bằng alginate canxi [56] Tương tự, Lee và Shuler [57] đã quan sát thấy mật

độ nuôi cấy cao và tế bào được cố định trên các hạt alginate cũng tạo ra nồng

độ ajmalicine cao (120 mg/L)

Về tác dụng của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật, 2,4-D ức chế sản xuất TIA [52], ngay cả khi các tiền chất như loganin và tryptamine, được thêm vào môi trường nuôi cấy [58] Việc bổ sung ethylene cũng gây ức chế sản xuất ajmalicine [59] Tuy nhiên, sự kết hợp của BAP hoặc kinetin với IAA dẫn đến tăng cường sản xuất TIA (hàm lượng alkaloid tổng số đạt trên

45 mg/L) Satdive và cs [60] đã cho thấy hàm lượng ajmalicine tăng cao (trên 0,85 g/L) được giải phóng ra môi trường nuôi cấy chồi dừa cạn với sự có mặt của BAP cao (8,90 mM) và nồng độ IAA thấp (2,85 mM) Nếu sử dụng nồng

IAA cao (11,42 mM) và BAP thấp (2,22 mM) thì tổng hợp ajmalicine cũng tăng cao (trên 0,40 g/L) trong các chồi Ngoài ra, quá trình sinh tổng hợp các TIA được cải thiện khi mô sẹo dừa cạn được xử lý với BAP, IAA và ánh sáng, đặc biệt là vindoline chiếm 0,19 mg/g DW và serpentine chiếm 0,53 mg/g DW, đều tăng so với mô sẹo không tiếp xúc với ánh sáng [52]

1.4 Những thách thức trong sản xuất chất thứ cấp in vitro

Hiện nay, một trong số những hạn chế đối với việc sản xuất chất thứ cấp in vitro là năng suất sinh khối còn thấp, dẫn đến hàm lượng chất trao đổi

thứ cấp không cao Bên cạnh đó, chi phí sản xuất trong điều kiện in vitro cao

hơn, đòi hỏi kỹ thuật và công nghệ kiểm soát điều kiện môi trường kèm theo nhu cầu lao động có chuyên môn [9], vì thế các hệ thống nuôi cấy quy mô lớn, mang lại lợi nhuận trong việc sản xuất các chất thứ cấp có hoạt tính mới chỉ có được ở một số lượng ít các loài cây thuốc Hầu hết vẫn là các nghiên cứu và tìm hiểu ảnh hưởng của các yếu tố khác nhau đối với quá trình nuôi cấy Giống như các ứng dụng nuôi cấy mô thực vật khác, sản xuất các chất

thứ cấp ở quy mô lớn in vitro có thể mang lại lợi ích thiết thực với sản xuất

các chất hiếm và có giá trị cao Mặc dù vậy, môi trường được kiểm soát chặt chẽ trong nuôi cây mô tế bào thực vật, có thể dễ dàng tăng công suất không phụ thuộc vào mùa vụ sẽ rất hữu ích cho việc sản xuất các chất trao đổi thứ cấp có giá trị

Cây dừa cạn là nguồn cung cấp tự nhiên một số hợp chất thứ cấp có giá trị y học và việc nuôi cấy mô dừa cạn là cần thiết để phát triển ổn định sinh khối, tăng cường khả năng tổng hợp chất thứ cấp trong điều kiện an toàn sinh học Việc nuôi cấy mô tế bào dừa cạn cũng như các cây dùng làm thuốc đã được tiến hành, tuy nhiên kết quả là khác nhau giữa các nghiên cứu, phù thuộc vào giống, vùng trồng và nhiều điều kiện nuôi cấy khác nhau Vì thế trong khuôn khổ luận văn này, các giống đã thích ứng với điều kiện Việt Nam

sẽ được nghiên cứu nhằm phát triển hệ thống nuôi cây tế bào in vitro đặc thù

giống

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu

2.1.1 Các giống thực vật nghiên cứu

Mẫu dừa cạn QN02 và H01 thu tại Quảng Ninh và Huế, chi tiết về mẫu được thể hiện trong Bảng 2.1)

Bảng 2.1: Thông tin ký hiệu mẫu dừa cạn

1 QN02 Catharanthus roseus var ocellatus Cô Tô – Quảng Ninh

2.1.2 Các môi trường dùng cho nghiên cứu

Bảng 2.2: Thành phần các môi trường nuôi cấy mô

Nảy mầm hạt (MS) 4,3 g/L MS + 30 g/L sucrose + 8 g/L agar + 103,1 mg/L

vitamin MS, pH = 5,8 Môi trường nhân

chồi (CT1)

4,3 g/L MS + 30 g/L sucrose + 8 g/L agar + 103,1 mg/L vitamin MS + 1 mg/L BAP + 0,2 mg/L NAA, pH = 5,6

Cảm ứng tạo mô

sẹo(CT2)

4,3 g/L MS + 30 g/L sucrose + 8 g/L agar + 103,1 mg/L vitamin MS + A, pH = 5,8

Chất điều hòa sinh trưởng: IAA (0,5; 1; 1,5; 2; 2,5 mg/L); NAA (0,5; 1; 1,5; 2; 2,5 mg/L); 2,4D (0,5; 1; 1,5; 2; 2,5 mg/L) Nhân nhanh mô sẹo

trên MT đặc (CT3)

4,3 g/L MS + 30 g/L sucrose + 103,1 mg/L vitamin MS + 1- 1,5-2 mg/L 2,4-D+ 1,6 mg/L kinetin + 8 g/L agar, pH = 5,8

Nhân nhanh mô sẹo

trên MT lỏng (CT4)

4,3 g/L MS + 30 g/L sucrose + 103,1 mg/L vitamin MS + 2,4-

D + 1,6 mg/L kinetin, pH = 5,8

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Khử trùng và nảy mầm hạt

Để thu cây làm vật liệu nuôi cấy ban đầu, hạt của các giống dừa cạn được thu từ quả dừa cạn được trồng ngoài tự nhiên và được khử trùng bằng khí theo phương pháp của Clough và Bent [61] Trước hết bình đựng hạt được đưa vào bình hút ẩm (desicator) và khí chlorin được tạo ra bằng cách bổ sung 3

mL HCl đậm đặc vào 100 mL dung dịch javen được đặt sẵn Sau đó, ngay lập tức đậy chặt bình hút ẩm và khử trùng trong 4 giờ Hạt sau khi được khử trùng được chuyển sang tủ cấy và để trong 2-3 giờ để loại hết khí chlorin Hạt sau khi được khử trùng có thể được dùng ngay hoặc bảo quản trong ngăn mát tủ lạnh khoảng 1-2 tuần Hạt sạch được đặt riêng rẽ trên môi trường gieo hạt -

MS Khả năng nảy mầm của 2 giống nghiên cứu được đánh giá sau 3 tuần

2.2.2 Tạo nguồn vật liệu bằng phương pháp nhân nhanh chồi in vitro

Sau khi hạt nảy mầm 3 tuần, trước hết chồi mầm bao gồm đoạn thân trên hai lá mầm được chuyển sang môi trường nhân chồi (CT1) Khi chồi phát triển đến giai đoạn có hai lóng thân thì đoạn thân chứa nách lá được cấy chuyển tiếp sang môi trường CT1 mới để tạo chồi nách sau khi cắt bỏ lá Các chồi nách có chiều cao khoảng 1,5 cm tiếp tục được tách ra và chuyển sang môi trường CT1 mới Quy trình này thực hiện liên tục để tạo nguyên liệu phục vụ thí nghiệm tạo mô sẹo

2.2.3 Thí nghiệm cảm ứng tạo mô sẹo từ đoạn thân dừa cạn

2.2.3.1 Tối ưu hóa loại và nồng độ chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng tạo mô sẹo

Các chồi đơn có chiều cao từ 2 - 3 cm, có ít nhất 3 lóng được sử dụng

để làm nguyên liệu tạo mô sẹo Các đoạn thân không chứa đỉnh chổi và nách

lá, được cắt thành các đoạn kích thước 0,3-0,7 cm và đặt nằm ngang trên môi trường tạo mô sẹo cơ bản CT2 (Bảng 2.2) có bổ sung các chất điều hòa sinh

trưởng IAA, NAA và 2,4-D ở các dải nồng độ 0,5; 1,0; 1,5; 2 và 2,5 mg/L Mẫu đối chứng là mẫu đặt trên môi trường CT2 không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng Kết quả thí nghiệm được tổng kết sau 7, 14, 21 và 28 ngày nuôi cấy dựa vào hình thái và tỷ lệ phát sinh mô sẹo Mỗi công thức thí nghiệm tiến hành trên 30 đoạn thân, thí nghiệm lặp lại 3 lần

2.2.3.2 Đánh giá ảnh hưởng của ví trí và kích thước đoạn thân đến khả năng hình thành mô sẹo

Lóng thân được cắt thành đoạn có kích thước 0,5 cm ở ba vị trí trên thân cây như hình 2.1 và đặt nằm ngang trên môi trường CT2 có bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng đã được tối ưu ở thí nghiệm 2.2.3.1 Kết quả thí nghiệm được tổng kết sau 4 tuần nuôi cấy dựa vào hình thái và tỷ lệ phát sinh

mô sẹo Mỗi công thức thí nghiệm tiến hành trên 10 đoạn thân, thí nghiệm lặp lại 3 lần

Hình 2.1 Lựa chọn đoạn thân trong thí nghiệm cảm ứng tạo mô sẹo

2.2.3.3 Tối ưu hóa kích thước đoạn thân

Các lóng đoạn thân dừa cạn được cắt thành 3 loại kích thước 0,3; 0,5 và 0,7 cm, đặt nằm ngang trên môi trường CT2 có bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng thích hợp Sau 2 tuần nuôi cấy, đánh giá loại kích thước đoạn thân

Đoạn 3

Đoạn 1

tối ưu dựa vào hình thái và tỷ lệ phát sinh mô sẹo của từng lô thí nghiệm Mỗi

lô thí nghiệm được tiến hành với 10 đoạn thân có kích thước như nhau, thí nghiệm lặp lại 3 lần

2.2.3.4 So sánh khả năng tạo mô sẹo giữa các giống dừa cạn thu thập tại Việt Nam

Các chồi đơn có chiều cao từ 2 - 3 cm và có ít nhất 3 lóng của giống dừa cạn trắng và đỏ được sử dụng để làm nguyên liệu tạo mô sẹo Đoạn thân đã được lựa chọn trong thí nghiệm 2.2.3.2 được cắt đồng đều thành các đoạn kích thước đã được tối ưu ở thí nghiệm 2.2.3.3, đặt nằm ngang trên môi trường CT2 có bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng đã được tối ưu ở thí nghiệm 2.2.3.1

2.2.4 Tối ưu hóa môi trường nhân nhanh mô sẹo dừa cạn

Các cụm tế bào mô sẹo kích thước 2 x 2 mm2 hình thành trên môi trường CT2 từ đoạn thân được chuyển sang môi trường nhân mô sẹo CT3 có

bổ sung 2,4D ở các nồng độ 1,0; 1,5 và 2,0 mg/L và 1,6 mg/L kinetin Trọng lượng tế bào nuôi cấy ban đầu được tính bằng hiệu số trọng lượng thu được giữa bình môi trường trước và sau khi mô được chuyển vào môi trường Tốc

độ phát triển của mô sẹo được xác định sau 30 ngày dựa vào khối lượng (tính bằng mg) mô sẹo thu được trên mỗi bình Mỗi công thức được tiến hành trên

30 cụm mô sẹo và được lặp lại 3 lần

2.2.5 Phát triển điều kiện nuôi cấy tế bào huyền phù cây dừa cạn

Cụm tế bào dừa cạn kích thước 5 x 5 mm2 phát triển tốt trên môi trường CT3 được cấy chuyển sang môi trường lỏng CT4 để tạo tế bào huyền phù Nuôi cấy tế bào huyền phù được tiến hành trong bình thủy tinh tam giác 250

mL có chứa 100 mL môi trường Sinh khối tế bào đưa vào nuôi cấy khoảng

150 mg trọng lượng tươi Bình tam giác được đặt trong máy lắc với tốc độ

120 vpm ở 27oC ± 1oC trong tối Cấy chuyển được tiến hành 3 tuần/ lần cho khi các dung dịch tế bào huyền phù có màu trắng đục