Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật vào nhân giống cà chua múi (lycopersicon esculentum)

Do vậy, để tạo được cây giống cà chua có khả năng kháng sâu bệnh, đồng đều, năng suất chất lượng cao là rất cần thiết đặc biệt đó là tạo ra những cây giống địa phương mang được đặc sản r

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH

LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP

Người hướng dẫn khoa học: TS LÊ VĂN ĐIỆP

NGHỆ AN, 10/2012

LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn TS Lê Văn Điệp - Giảng viên khoa Nông - Lâm - Ngư, Giảng viên Phùng Văn Hào, khoa Sinh học trường Đại Học

Vinh đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn tôi trong quá trình triển khai thực hiện đề tài, cũng như trong quá trình hoàn chỉnh luận văn

Tập thể thầy giáo, cô giáo khoa Nông – Lâm – Ngư trường Đại học Vinh,

Cảm ơn các sinh viên thực tập tốt nghiệp 50A- Sinh, 51B - Sinh, 49K1- Nông học, nhóm nghiên cứu khoa học khoa Nông - Lâm- Ngư trường Đại học Vinh đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài

Cảm ơn bạn bè, và người thân đã động viên giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn

Xin chân thành cảm ơn!

TÁC GIẢ

Đào Thị Anh

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT SỬ DỤNG

IBA : β- Indol Butyric Acid

MS : Murashige and Skoog

và phát triển của mầm (sau 2 tuần nuôi cấy) 423.4 Ảnh hưởng của phương thức và thời gian khử trùng đến tỷ lệ sống 44

của mẫu cấy

3.5 Ảnh hưởng của BAP lên khả năng nhân nhanh chồi cà chua múi 483.6 Ảnh hưởng của Kinetin lên khả năng nhân nhanh chồi cà chua múi 503.7 Ảnh hưởng tổ hợp của BAP và α- NAA đến khả năng nhân nhanh

chồi cà chua múi (sau 3 tuần nuôi cấy) 533.8 Ảnh hưởng của hàm lượng IBA đến khả năng ra rễ cà chua 55

(sau 2 tuần nuôi cấy)

3.9 Ảnh hưởng của hàm lượng Than hoạt tính đến khả năng ra rễ của

3.10 Ảnh hưởng của giá thể ra cây sau ống nghiệm 59

DANH MỤC HÌNH

3.1 Ảnh hưởng của thời gian khử trùng đến tỷ lệ nảy mầm và

3.2 Hạt cà chua trong môi trường không bổ sung chất ĐTST 403.3 Mầm cà chua múi ở công thức 2.3 423.4 Ảnh hưởng của phương thức khử trùng đến tỷ lệ sống và

3.5 Ảnh hưởng của hàm lượng BAP đến khả năng nhân nhanh 483.6 Giai đoạn nhân nhanh chồi cà chua 503.7 Ảnh hưởng của hàm lượng Kinetin đến khả năng nhân nhanh 513.8 Ảnh hưởng tổ hợp của BAP và α –NAA đến khả năng nhân

3.9 Ảnh hưởng của hàm lượng IBA đến khả năng ra rễ của

3.10 Ảnh hưởng của hàm lượng THT đến khả năng ra rễ của

3.11 Rễ của cà chua khi bổ sung IBA và Than hoạt tính 583.12 Ảnh hưởng của giá thể đến sức sống của cà chua múi

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Rau xanh là thực phẩm không thể thiếu được trong cơ cấu bữa ăn hàng ngày của con người trên khắp hành tinh Nó cung cấp phần lớn các khoáng chất, vitamin và nhiều chất dinh dưỡng khác Rau xanh còn chứa nhiều xenlulo giúp cho cơ thể tiêu hóa thức ăn được dễ dàng, phòng ngừa bệnh tim mạch, huyết áp cao

Trong các loại rau thì cà chua (Lycopercicon esculentum) là loại rau ăn

quả được ưa chuộng trên toàn thế giới Đây là nguồn thực phẩm cung cấp dinh dưỡng rất cần thiết cho sự phát triển của cơ thể con người như: B-Caroten, chất khoáng Ca, Fe, P, S, K, Mg, Na , đường và các loại vitamin A,

B, B2, C, E và PP [15] Ngoài ra nó còn có tác dụng chữa bệnh [13] Chất Licopen - thành phần tạo nên màu đỏ của Cà chua có khả năng giúp giảm nguy cơ mắc bệnh tim mạch, có khả năng ngăn ngừa sự hình thành các gốc tự

do gây ung thư, đặc biệt là ung thư tuyến tiền liệt [8], [13] [15]

Cà chua là loại rau ăn trái rất được ưa thích vì phẩm chất ngon và chế biến được nhiều cách đồng thời nó được trồng nhiều nơi Việc trồng cà chua còn có ý nghĩa quan trọng về mặt luân canh, tăng vụ và tăng năng suất trên đơn vị diện tích Vì vậy, cà chua là loại rau được khuyến khích phát triển khắp trên cả nước Bên cạnh đó cà chua tươi và sản phẩm chế biến còn là mặt hàng xuất khẩu có giá trị kinh tế, góp phần nâng cao thu nhập và cải thiện điều kiện kinh tế cho người sản xuất Chính nhờ những giá trị quan trọng đó của cây cà chua trong nền nông nghiệp thế giới, trong những năm gần đây diện tích và sản lượng cà chua cao hơn so với các loại rau khác Theo FAO, diện tích trồng cà chua toàn thế giới năm 2007 là 4.626.232 ha với sản lượng 126.246.708 tấn, đứng đầu trong các loại rau trồng trên toàn cầu [41] Ở nước

ta, cà chua được trồng trên diện tích hẹp (24.160 ha), sản lượng thấp (472.569 tấn), mức tiêu thụ bình quân đầu người chỉ đạt 5,6kg/người/năm, trong khi

cà chua Song sản lượng cà chua còn quá thấp, đặc biệt vào thời điểm giáp vụ

từ tháng 4 đến tháng 9 trong năm Nguyên nhân chủ yếu là chưa có nguồn giống tốt, đồng loạt và các biện pháp kỹ thuật phù hợp để sản xuất cà chua đạt hiệu quả kinh tế cao

Cà chua múi (Lycopersicon esculentum sp.) là giống địa phương có

nhiều đặc tính quý: năng suất cao, chất lượng tốt, có tính thích nghi chống chịu cao với điều kiện khí hậu các huyện miền núi tỉnh Nghệ An như: Tương Dương, Kỳ Sơn Trước đây, giống cà chua này được trồng nhiều ở các địa phương tỉnh Nghệ An Hiện nay nhiều giống cà chua nhập nội được đưa và trồng nhiều đã làm mất dần giống cà chua múi Các giống cà chua địa phương thường có khả năng thích nghi cao do có sự chọn lọc tự nhiên, đồng thời chất lượng của nó mang một lợi thế cạnh tranh cao

Cà chua nói chung và cà chua múi nói riêng rất dễ bị sâu bệnh phá hại, đặc biệt là những bệnh do nấm, vi khuẩn, virus Chúng gây hại từ giai đoạn cây con trong vườn ươm, giai đoạn trồng ngoài sản xuất cho đến khi thu hoạch [4] Bệnh xoắn lá do viruts là loại bệnh nguy hiểm và không thể loại bỏ chúng khỏi cây bằng các biện pháp hóa học mà chỉ có phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng mới loại bỏ hẳn được viruts gây hại trong cây [33]

Do vậy, để tạo được cây giống cà chua có khả năng kháng sâu bệnh, đồng đều, năng suất chất lượng cao là rất cần thiết đặc biệt đó là tạo ra những cây giống địa phương mang được đặc sản riêng để cạnh tranh với thị trường tiêu dùng khó tính như hiện nay là vấn đề cần thiết cần phải làm.

Và chính công nghệ nuôi cấy mô thực vật đã và đang giúp cho việc tạo giống cây trồng được tiến hành một cách nhanh chóng và dễ dàng hơn Ưu điểm nổi trội của phương thức này là cho hệ số nhân giống rất cao, sản xuất quanh năm không phụ thuộc vào mùa vụ, cần ít diện tích sản xuất và vật liệu nhân giống ban đầu, cây giống sản xuất ra hoàn toàn sạch bệnh, đồng nhất về mặt di truyền [3] Việc vận chuyển cây giống đi xa thuận tiện, ít tổn thất, chất lượng cây giống được đảm bảo do đó hoàn toàn có thể đáp ứng được các yêu cầu về sản xuất cây giống số lượng lớn mang tính công nghiệp Phương pháp này đã áp dụng thành công với nhiều loại cây trồng như các loại cây Nông nghiệp: Khoai tây, Chuối Mía ; các loại cây Lâm nghiệp: Keo lai, Bạch Đàn, Gió trầm ; Các loại hoa: Phong Lan, Cẩm Chướng ; các loại cây dược liệu: Trinh nữ hoàng cung, Lô hội [25]

Với những yêu cầu cấp thiết đó chúng tôi tiến hành đề tài "Ứng dụng

kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật vào nhân giống cà chua múi (Lycopersicon esculentum)”.

2 Mục tiêu của đề tài

2.1 Mục tiêu của đề tài

Xây dựng được quy trình nhân giống cà chua múi bằng phương pháp nuôi cấy mô thực vật nhằm tạo cây giống cà chua múi sạch bệnh, góp phần duy trì và bảo tồn nguồn giống địa phương có nhiều đặc tính quý được thị trường người tiêu dùng ưa chuộng

2.2 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài

2.2.1 Ý nghĩa khoa học

Việc thực hiện đề tài này là vô cùng cấp thiết và mang nhiều ý nghĩa về kinh tế, xã hội, nhân văn, góp phần duy trì, phát triển đặc sản của địa phương.

Khẳng định được giống cà chua múi có khả năng nhân giống bằng phương pháp nuôi cây mô thực vật

Đánh giá được tác động của một số chất điều tiết sinh trưởng trong quá nuôi cấy mô cà chua

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 NGUỒN GỐC, PHÂN BỐ VÀ GIÁ TRỊ CỦA CÂY CÀ CHUA

1.1.1 Nguồn gốc, phân bố của cây cà chua

1.1.1.1 Nguồn gốc

Cà chua (Lycopersicon esculentum Mill.) là một loại rau ăn quả được

trồng khắp các nước trên thế giới Theo tài liệu nghiên cứu của nhiều tác giả cho rằng: bờ biển Tây Nam Mỹ nằm giữa dãy núi Andes và biển, trải dài từ Ecuador đến Peru là trung tâm khởi nguyên của cà chua Theo De Candolle và nhiều tài liệu nghiên cứu của nhiều tác giả cho rằng: cà chua trồng hiện nay

có nguồn gốc từ Pêru, Ecuador, Chilê, Bolivia và các nước Nam Mỹ thuộc khu vực nhiệt đới khô hạn [40]

1.1.1.2 Phân bố

Theo tác giả Trần Khắc Thi và Mai Thị Phương Anh cho biết, từ châu

Mỹ cà chua được các thương gia Bồ Đào Nha và Tây Ban Nha di chuyển sang trồng ở châu Âu và châu Á, sau đó từ châu Âu được chuyển sang châu Phi nhờ những người dân đi khai phá lục địa [22] Cây cà chua được du nhập vào Châu Âu tương đối sớm (giữa thế kỷ 16), nhưng đến thế kỷ 17 thì mới được trồng phổ biến, song tại thời điểm đó cà chua chỉ được xem như là cây cảnh

và có quan niệm sai lầm là quả có chất độc, và cà chua thuộc họ cà có họ hàng với cây cà độc dược Năm 1650, ở Bắc Âu thời gian đầu cà chua chỉ được dùng để trang trí và thỏa mãn tính tò mò Cho đến thế kỷ 18 cà chua mới được xác định là cây thực phẩm Cây thực phẩm này lần đầu tiên được trồng ở Italia và Tây Ban Nha, đến năm 1750 được dùng làm thực phẩm ở Anh, sau

đó được lan rộng khắp mọi nơi trên thế giới [42]

Ở Italia cà chua có tên gọi là “Pomid’oro” nghĩa là “quả táo vàng”, ở Pháp cà chua mang tên rất hấp dẫn “Pomme d’amour” “quả táo tình yêu” [41] Cuối thế kỷ 18 cà chua bắt đầu được trồng ở các nước thuộc Liên Xô cũ,

sau đó giữa thế kỷ 19 mới được chấp nhận một cách rộng rãi ở Hoa Kỳ, Pháp

và các nước khác Ngày nay cà chua là một loại rau được trồng trong vườn phổ biến nhất ở Mỹ [42]

Ở châu Á, cà chua được du nhập đầu tiên vào Philippin, đảo Java và Malayxia qua các thương nhân và thực dân Hà Lan, Bồ Đào Nha, Tây Ban Nha vào thế kỷ 17, sau đó được trồng phổ biến ra các vùng khác trong khu vực [42] Một số nhà nghiên cứu cho rằng, cà chua được nhập vào Việt Nam

từ thời gian thực dân Pháp chiếm đóng [22]

1.1.2 Giá trị sử dụng

1.1.2.1 Giá trị dinh dưỡng

Cà chua là loại rau ăn quả có giá trị dinh dưỡng cao, theo Tạ Thu Cúc

và cộng sự, thành phần hóa học trong quả cà chua chín như sau: Nước

94-95%, chất khô 5-6% Trong đó gồm các chất chủ yếu: đường (glucoza, fructoza, saccaroza) chiếm 55%; chất không hoà tan trong rượu (prôtein, xenlulo, pectin, polysacarit) chiếm 21%; Axit hữu cơ (xitric, malic, galacturonic, pyrolidoncaboxylic) chiếm 12%; chất vô cơ 7%; các chất khác (carotenoit, ascorbic axit, chất dễ bay hơi, amino axit ) chiếm 5% [6] Kết

quả phân tích 100 mẫu giống trồng ở vùng đồng bằng sông Hồng của tác giả

Tạ Thu Cúc và cộng sự, trong quả cà chua có thành phần hoá học như sau: chất khô từ 4,3 - 6,4%; đường tổng số từ 2,6-3,5%; hàm lượng các chất tan từ 3,4-6,2%; axit tổng số từ 0,22 - 0,72% và hàm lượng vitamin C từ 17,1-38,8mg % [6] Theo Tạ Thu Cúc, ở quả còn có một số axit amin và các caroten [7] Thành phần dinh dưỡng trong quả cà chua được thể hiện ở bảng 1.1

Bảng 1.1 Thành phần dinh dưỡng trong 100g quả cà chua chín

Nguyên tố hóa

học

Thành phần

Vitamin +khoáng Thành phần

có sắc tố (lycopen, caroten và xantophyl) cao được dùng nhiều trong công

nghiệp chế biến thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao Hạt cà chua chứa 24% dầu và dịch chiết được sử dụng trong công nghiệp đồ hộp, dầu khô được dùng trong dầu giấm để sử dụng cho công nghiệp chế biến Bơ [1] Giá trị dinh dưỡng của quả cà chua rất phong phú, vì vậy theo một số tài liệu cho biết hàng ngày mỗi người sử dụng từ 100-200g cà chua sẽ thoả mãn nhu cầu các Vitamin cần thiết và các chất khoáng chủ yếu [15], [23] Với giá trị dinh dưỡng cao nên cà chua là loại rau được trồng phổ biến ở khắp các châu lục, là món ăn thông dụng của nhiều nước và là loại rau có giá trị sử dụng cao Quả

cà chua được sử dụng với nhiều phương thức khác nhau: nấu chín, ăn sống, làm salát hoặc chế biến thành nhiều sản phẩm khác như nước quả, tương cà chua, bột nhuyễn, sấy khô, mứt đóng hộp

1.1.2.2 Giá trị kinh tế

Ngoài giá trị dinh dưỡng cao, cà chua còn là loại rau cho hiệu quả kinh

tế cao và là mặt hàng xuất khẩu quan trọng của nhiều nước trên thế giới Ở Đài Loan hàng năm xuất khẩu cà chua tươi với tổng giá trị là 925.000 USD và 40.800 USD cà chua chế biến, mỗi hecta có thể đem lại thu nhập cho nông dân từ 4.000 - 5.000 USD [10] Ở Mỹ, hàng năm tổng giá trị xuất khẩu cà chua rất cao, chỉ tính riêng kim ngạch xuất khẩu năm 1997 đạt cao hơn 4 lần

so với Lúa nước và 20 lần so với Lúa mì [16] Ở Việt Nam, cà chua là cây rau quan trọng của nhiều vùng chuyên canh, là cây trồng cho hiệu quả kinh tế cao

Theo số liệu điều tra của phòng nghiên cứu kinh tế thị trường- Viện nghiên cứu rau quả cho biết, sản xuất cà chua ở Đồng bằng Sông Hồng cho thu nhập bình quân từ 42-68 triệu đồng/ha/vụ, với mức lãi thuần 15-26 triệu đồng/ha, cao hơn rất nhiều so với Lúa nước [35] Còn theo Bùi Thị Gia, 2000 thì ở vùng Gia Lâm Hà Nội, tổng giá trị sản xuất thu từ cà chua là 27,4 triệu đ/ha, lãi 15 triệu đ/ha [7]

Như vậy, cà chua là cây có giá trị kinh tế cao, cho thu nhập vượt trội hơn so với Lúa nước, Lúa mì, Ngô và một số loại rau màu khác Điều này cũng đã được thực tế công nhận Vì vậy, cà chua là cây mang lại thu nhập cao cho người sản xuất

1.2 Đặc điểm sinh học và phân loại

Cà chua là loại thân thảo, sống theo mùa, ưa khí hậu ấm áp và ánh sáng đầy đủ Có ánh sáng cây mới sinh trưởng và phát triển tốt Cà chua sinh trưởng và phát triển thích hợp trong điều kiện nhiệt độ trung bình từ 22oC -26oC Nếu nhiệt độ trên 35oC cây cà chua ngừng sinh trưởng, khi nhiệt độ xuống dưới 10oC cà chua không ra hoa Mặc dù được xếp vào nhóm cây tương đối chịu hạn song cà chua cũng là cây ưa nước, cà chua cần một lượng nước lớn cho suốt quá trình sinh trưởng, phát triển nên cà chua cần phải được

tưới nhiều nước, nếu để ruộng trồng cà chua lúc thừa lúc thiếu nước sẽ làm cho quả dễ bị nứt Vào thời gian ra hoa nếu thiếu nước sẽ làm cho hoa được hình thành ít, dễ bị rụng quả [12].

Hình 1.1: Quả và thân cây Cà chua múi Tương Dương

Cà chua có thân tròn, phân nhánh nhiều, cao 0.6 - 1m, toàn thân có lông mềm và lông tuyến, đặc tính của cây cà chua là bò lan ra xung quanh hoặc mọc thành bụi Lá kép lông chim phân thuỳ, số lượng thuỳ không cố định Lá chét hình trứng thuôn dài 7-12cm, rộng 2-5 cm, đầu nhọn hoặc tù, gốc lệch, mép khía, răng thô, cuống dài 2-3cm [6]

Hoa màu vàng, mọc thành chùm ở kẽ lá, mỗi chùm 5-8 hoa hoặc nhiều hơn Khi gặp những điều kiện bất lợi như quá lạnh, quá nóng, quá khô hạn, quá ẩm ướt hoặc thiếu dinh dưỡng, sâu bệnh gây hại, thì sẽ làm cho hoa và quả dễ bị rụng Thường người ta sử dụng chất kích thích sinh trưởng 2,4D để ngăn cản hiện tượng này [3]

Quả cà chua có hình tròn hoặc hơi dẹt, cũng có giống quả hình trứng, hình quả Lê, Khi quả chín, tuỳ thuộc vào đặc điểm của giống mà có màu sắc khác nhau như màu đỏ, màu vàng, màu vàng hồng, Chất màu chủ yếu của

cà chua là carotinoit, chlorophyll, theo mức độ chín, lượng chlorophyll giảm, lượng carotinoit tăng Trong quả cà chua có chứa thịt quả, chất dịch chua ngọt

và nhiều hạt dẹt hình thận [6] Lớp thịt càng dày, buồng đựng hạt càng bé, chất lượng quả càng cao Ở độ chín hoàn toàn, lượng vitamin C và carotinoit đạt tỷ lệ cao nhất, lượng acid giảm, lượng đường tăng, thịt quả có vị ngọt hơn lúc còn xanh Lượng protopectin giảm làm cho vỏ dễ tách ra và quả bị mềm

Dựa vào đặc điểm hình thái của quả mà người ta phân loại cà chua thành các nhóm khác nhau Ở nước ta, các giống cà chua đang được trồng chủ yếu thuộc ba nhóm chính là nhóm cà chua múi, nhóm cà chua hồng và nhóm

cà chua bi (hay còn gọi là cà chua ta hoặc cà chua kiu) [15]

- Cà chua múi: Quả to, nhiều ngăn tạo thành múi Quả có vị chua, nhiều hạt, cây mọc khoẻ, sai quả, chống chịu sâu bệnh tốt Giống điển hình là cà chua múi đặc sản ở Nghệ An là cà chua múi được trồng nhiều ở huyện Tương Dương

- Cà chua hồng: Là loại cà chua được trồng phổ biến hiện nay Quả có hình dạng như quả hồng, không có múi hoặc múi không rõ Chất lượng ăn tươi cũng như lúc chế biến và nấu ăn cao do thịt quả đặc, nhiều bột, lượng đường cao Phần lớn trong nhóm này là các giống được lai tạo, chọn lọc trong nước và một số giống nhập nội Một số giống thường được trồng là PT18, HT7, HT14, VT3, HP1, MV1,

- Cà chua bi: Là giống địa phương, gặp rải rác ở các vùng núi cao và ven biển miền trung, chúng có lượng acid cao, hạt nhiều, năng suất thấp do quả bé nhưng khả năng chống chịu tốt nên được sử dụng làm vật liệu tạo giống Gần đây, nhiều vùng trong nước đã trồng các giống cà chua quả nhỏ nhập nội Những giống này cho năng suất và chất lượng tốt, được sử dụng chủ

yếu như một loại quả sau bữa ăn Các giống có màu sắc và hình dáng rất đa

và hướng lên trên Lá thường cúp xuống và không mềm như khi cây khô héo Hoa có thể héo, quả nếu có thì nhỏ hoặc không bán được Viruts xoắn lá cà chua có thể gây nhầm lẫn với một số bệnh cà chua khác như là : Nụ hoa cà chua lớn, cà chua vàng trên đầu, bệnh xoắn lá sinh lý và bệnh thiếu photphats

Cách khắc phục hiện tượng sương giá này thì chúng ta nên dùng nilon phủ cho cà chua từ chiều hôm trước đến buổi sáng hôm sau khi nhiệt độ ngoài trời tăng lên

3 Bệnh Héo rũ

Bệnh này do 2 loại Nấm gây nên đó là Fusarium và Vercticillium Loại bệnh này để khắc phục thì phải mua cây, hạt giống đã được xử lý 2 loại nấm này.

1.4 Tình hình sản xuất và tiêu thụ cà chua trong và ngoài nước.

1.4.1 Tình hình sản xuất và tiêu thụ cà chua trên thế giới

Cà chua là cây rau màu quan trọng thứ 2 trên thế giới (sau cây Khoai tây) Diện tích trồng cà chua hàng năm của thế giới được ước tính khoảng 4,6 triệu ha với sản lượng hơn 126 triệu tấn (Dilip R Panthee và Feng Chen, 2010)

Về tình hình tiêu thụ cà chua trên thế giới khá biến động và tùy thuộc vào nhu cầu tiêu thụ đầu người của mỗi quốc gia Theo tài liệu của Thế Mậu, Viện nghiên cứu rau quả cho biết, người Hy Lạp tiêu thụ 187,1kg/người/năm, cao nhất thế giới, sau đó đến Thổ Nhĩ Kỳ 107kg và Ý 95kg/người/năm [15], [35]

Châu Âu luôn là khu vực xuất khẩu cà chua lớn nhất thế giới ở tất cả các dạng sản phẩm, năm 1999 xuất khẩu cà chua cô đặc của châu Âu chiếm 56% lượng xuất khẩu của thế giới, trong khi đó châu Á là 24% Mặc dù lượng

cà chua được sản xuất ra ở châu Âu tương đối lớn, nhưng hàng năm các nước như: Anh, Đức, Hà Lan, Italia, Bỉ và Tây Ban Nha vẫn phải nhập khẩu khoảng 21 triệu tấn cà chua tươi, bằng 60% lượng nhập khẩu của toàn thế giới [19] Đối với xuất nhập khẩu, ngày nay các nước phát triển có xu hướng tăng nhập khẩu cà chua tươi cũng như các sản phẩm chế biến của nó, đây là điều kiện tốt cho các nước đang phát triển Tuy-ni-di là nước chế biến cà chua lớn nhất châu Phi, nhưng lại là nước tiêu thụ cà chua cô đặc lớn nhất thế giới với

743 nghìn tấn/năm từ 2004 trở lại đây Mặc dù vậy, Tuy-ni-di vẫn có khả năng xuất khẩu cà chua chế biến, từ năm 2005 đến nay Tuy-ni-di xuất khẩu

sang các nước láng giềng và châu Âu từ 20-25 nghìn tấn [40].

1.4.2 Những kết quả nghiên cứu về giống cà chua trên thế giới

So với các loại cây trồng khác thì cà chua là cây có lịch sử phát triển tương đối muộn, song với giá trị dinh dưỡng và hiệu quả kinh tế cao cho nên ngay từ thế kỷ 18, các nhà khoa học đã tập trung đi sâu vào nghiên cứu về chúng, đặc biệt là trong lĩnh vực chọn tạo giống Việc chọn tạo giống cà chua

đã có nhiều tiến bộ trong khoảng 200 năm trở lại đây Tuy nhiên, mãi đến nửa đầu thế kỷ 20 cà chua mới trở thành cây trồng phổ biến trên thế giới thông qua con đường tăng nhanh số lượng các giống mới

Cho đến nay, số lượng và chủng loại giống cà chua đã nhanh chóng trở nên phong phú đa dạng, phần nào đáp ứng được nhu cầu của người tiêu dùng trên khắp thế giới Để tập trung nghiên cứu chọn tạo những giống cà chua có năng suất và chất lượng cao, nhiều nhà khoa học đã sử dụng nguồn gen di truyền của các loài hoang dại và bán hoang dại, nhằm khai thác khả năng chống chịu tốt với nhiều điều kiện ngoại cảnh bất thuận Bằng nhiều con đường khác nhau như: lai tạo, chọn lọc, gây đột biến nhân tạo v.v., bước đầu

đã thu được những kết quả khả quan, tạo ra giống thích hợp trồng trong điều kiện nhiệt độ cao, có phổ thích ứng rộng, có khả năng trồng nhiều vụ trong năm [26]

1.4.3 Tình hình sản xuất và tiêu thụ cà chua ở Việt Nam

Ở Việt Nam, cây cà chua được xếp vào các loại rau có giá trị kinh tế cao, diện tích trồng cà chua lên đến chục ngàn ha, tập trung chủ yếu ở đồng bằng

và trung du phía Bắc Hiện nay có một số giống chịu nhiệt mới lai tạo chọn lọc có thể trồng tại miền Trung, Tây Nguyên và Nam Bộ nên diện tích ngày càng được mở rộng

Diện tích trồng cà chua ở nước ta ngày càng tăng: năm 2005 là 23.566 ha năm 2009 là 13.729 ha, [13].

Theo số thống kê, Lâm Đồng hiện là địa phương có diện tích, năng suất và sản lượng cà chua lớn nhất cả nước với khoảng từ 4.000 đến 5.000 ha gieo trồng hàng năm Năng suất trung bình đạt khoảng 40-50 tấn/ ha, một số trường hợp có thể đạt năng suất từ 80-90 tấn/ ha [31]

Để phục vụ công tác chọn tạo giống đáp ứng những đòi hỏi của sản xuất, việc thu thập và bảo quản nguồn gen cà chua ở Việt Nam đã được Nhà nước và các nhà khoa học quan tâm, thực hiện

Từ năm 2000 đến nay, Viện nghiên cứu rau quả đã thu thập và đưa vào duy trì, đánh giá nguồn quỹ gen các giống rau với trên 2000 mẫu giống, trong

đó cà chua là một trong 5 cây chủ lực [36] Tác giả Trần Văn Lài và cộng sự cho biết, trong giai đoạn từ 2000 - 2002 Viện nghiên cứu Rau Quả đã thu thập, bảo quản và đưa vào sử dụng một tập đoàn gồm 180 mẫu giống cà chua thu thập trong nước và nhập ngoại Trong đó nhiều dòng giống thể hiện tính

kháng cao đối với vi khuẩn Ralstonia solanacearum và có khả năng sinh

trưởng phát triển tốt trong điều kiện trái vụ ở nước ta [11]

Những năm gần đây quá trình nghiên cứu và chọn tạo giống cà chua đã đạt được những thành tựu đáng kể, các nhà khoa học đã chọn tạo ra nhiều giống thích ứng được với điều kiện tự nhiên ở nước ta, chúng có khả năng cho năng suất cao và phẩm chất tốt Đặc biệt, các nhà khoa học đã tập trung nghiên cứu chọn tạo ra những giống thích hợp trồng trong điều kiện trái vụ như Xuân - Hè và Hè - Thu, nhằm rải vụ và tạo ra sản phẩm lớn để cung cấp cho nhân dân trong thời kỳ khan hiếm

1.5 Tình hình nuôi cấy mô cà chua

1.5.1 Một số công trình nghiên cứu nuôi cấy mô cà chua ở nước ngoài

Năm 1934, White đã thành công khi nuôi cấy mô rễ cà chua trong môi trường lỏng chứa khoáng, glucose, và nước chiết nấm men Sau đó, White cũng là người chứng minh có thể thay thế nước dịch chiết nấm men bằng hỗn hợp ba loại Vitamin nhóm B, Thiamin (B1), Pyridoxin (B6) và Nicotinic acid. Bằng thì nghiệm này, ông đã chứng minh được mô phân sinh có thể duy trì thời gian sinh trưởng hơn nữa nếu chúng tiếp tục được nuôi cấy bằng môi trường dinh dưỡng mới [37]

Năm 1941, hai nhà khoa học người Mỹ Ovebeek và steward đã tiến

hành thí nghiệm nuôi cấy cây họ cà và đã chỉ ra được rằng Auxin kích thích sinh trưởng có trong nước dừa Trong thời gian này đã nghiên cứu thành công α-NAA, 2,4D có ảnh hưởng tích cực trong việc tạo mô sẹo và gây phân chia

tế bào

Năm 2003, Trung tâm nghiên cứu nông nghiệp Viện Port Blair,

Andamans Ấn Độ đã tiến hành nghiên cứu “Sự ra hoa và đậu quả của cà chua trong ống nghiệm” Theo kết quả nghiên cứu cho thấy môi trường MS bổ sung 2mg/lBAP cho kết quả tốt nhất sự ra hoa từ mô sẹo và tái sinh cây con

từ lá Tiếp theo là môi trường MS bổ sung 2mg/lBAP+ 1mg/l ABA + 0,5 mg/l IAA Trái cây đã được thiết lập trong ống nghiệm trong vòng 162 ngày sau tự

thụ phấn [http://www.msmbb.org.my]

- Năm 2008, Tạp chí công nghệ sinh học Ấn Độ đã công bố “Ảnh

hưởng của các chất điều hòa tăng trưởng đến tái sinh và ra rễ invitro của cây

cà chua”

Một loạt thí nghiệm đã được tiến hành kết quả cho thấy: Theo các nồng

độ khác nhau và sự kết hợp của các chất điều hòa tăng trưởng Các phân tích những biến động, khác biệt ở mức ý nghĩa 5% chỉ ra rằng: Môi trường MS bổ sung với 3mg/l BAP + 3mg/l α-NAA và IAA 2,5 mg/l là tối ưu nhất cho cảm ứng mô sẹo, tái sinh Tốt nhất cho sự ra rễ được tìm thấy là ở môi trường MS

bổ sung 0,2 mg/l IBA

Năm 2009, Uỷ ban công nghệ sinh học và kỹ thuật di truyền, trung tâm

nghiên cứu quốc gia SuDan công bố “ Ảnh hưởng của một số chất điều tiết sinh trưởng đến tái sinh chồi từ lá mầm cây cà chua” Kết quả cho thấy: Lá mầm 8-10 ngày tuổi được phân lập và vô trùng bằng Clorox 0,5% sau đó nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung các chất điều hoà tăng trưởng: Benzyladenine (BA), Kinetin tại các nồng độ giao động từ 0,5-5mg/l riêng lẻ hoặc kết hợp với axit Naphthaleneactic (a- NAA) 0,5-1mg/l cho kết quả như sau: Khi bổ sung BA và Kinetin riêng rẽ vào môi trường nuôi cấy với nồng độ giao động 0,5-5mg/l thì Kinetin được chứng minh là hiệu quả hơn BA (cho 2 chồi/mẫu nghiên cứu) Khi bổ sung kết hợp BA, Kinetin với a- NAA vào môi trường nuôi cấy cho hiệu quả không cao

Năm 2010, Zubeda cùng cộng sự của Cục Thực vật học, Đại học

Hazara, Mansehra, Pakistan, tiến hành nghiên cứu khả năng tác động của các chất điều hòa sinh trưởng đến sự tăng sinh mô sẹo và tái sinh của cà chua

Kết quả nghiên cứu cho thấy: Khi cấy hạt trên môi trường MS có bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng: BAP, NAA, Kinetin, IBA (mg/l) cho kết quả cảm ứng mô sẹo tối đa trên môi trường α-NAA (2mg/l), IAA (2mg/l), BAP (5mg/l); Kinetin (4mg/l) Khả năng tái sinh tối đa trên môi trường MS

có bổ sung Zeatin (1mg/l) và IAA (1mg/l)

- Năm 2010, ở Trung Quốc đã tiến hành nghiên cứu các yếu tố ảnh

hưởng đến tái sinh của lá mầm cà chua

Trong nghiên cứu này, họ đã sử dụng giống cà chua có tên là Zhongshu

Si Hảo làm tài liệu nghiên cứu để nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố lên sự tái sinh chồi ngẫu nhiên theo các điều kiện khác nhau kết hợp với nội tiết tố Kết quả nghiên cứu đã kiểm tra ra phương pháp để khử trùng bề mặt hạt giống tốt nhất và môi trường thích hợp nhất cho ra rễ Kết quả cho thấy rằng phương pháp tốt nhất để khử trùng bề mặt của hạt giống cà chua như sau: thứ nhất, ngâm hạt giống trong ethanol 70% trong 30 giây, sau đó súc rửa chúng

trong 20% NaClO khoảng 20 phút Công thức trung bình tốt nhất cho lá mầm tái sinh là MS + Zeatin 2 mg/l + IAA 0,1 mg/l, và đặt lá mầm lộn ngược là tốt nhất để tạo ra các chồi Môi trường tốt nhất để hình thành rễ từ chồi tái sinh là: 1/2MS + IAA 0,3 mg /l

[http://bio.sophiapublisher.com]

1.5.2.Một số công trình nghiên cứu nuôi cấy mô cà chua ở Việt Nam

- Tại khu Nông nghiệp công nghệ cao TP HCM, năm 2011 đã tiến hành xây dựng mô hình các loại cây rau trong đó có cà chua bằng invitro, hiện đã được tiến hành và chưa đánh giá về mặt hiệu quả kinh tế

[hcmbiotech.com.vn].

- Kiều phương Nam, Đỗ Thị Di Thiện, Trần Minh Tuấn, Bùi Văn Lệ (2009) - Khoa sinh, trường đại học KHTN, ĐHQG TPHCM đã tiến hành

nghiên cứu Ảnh hưởng của vi khuẩn Methylobacterium Radiotolerans lên sự

phát sinh cơ quan thực vật ở cà chua trong điều kiện nuôi cấy invitro Kết quả nghiên cứu cho thấy:

Trong môi trường MS có bổ sung 2,5 mg/l BA + 0,05 mg/l NAA+1ml dịch vi khuẩn đã làm thay đổi tỷ lệ các chất điều hòa tăng trưởng, qua đó thúc đẩy hay làm thay đổi chiều hướng biệt hóa cơ quan thực vật nuôi cấy invitro

Ở cây cà chua chúng làm gia tăng sự hình thành chồi, ức chế sự tạo mô sẹo [32]

Các nghiên cứu về nuôi cấy mô trên cây cà chua tại Việt Nam hiện đang còn rất ít

1.6 Kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào và ứng dụng trong nhân giống vô tính cây trồng

1.6.1 Cơ sở khoa học của Phương pháp nuôi cấy mô, tế bào

Nuôi cấy mô, tế bào thực vật là lĩnh vực nuôi cấy các nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các Vi sinh vật trong môi trường nhân tạo, trong điều kiện

vô trùng [3] Cở sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô, tế bào thực vật dựa

trên học thuyết về tính toàn năng của tế bào Cuối thế kỷ 19 đầu thế kỷ 20 nhà sinh lý thực vật người Đức Haberlandt (1902) đã phát biểu tính toàn năng của

tế bào như sau:

Mỗi tế bào bất kỳ của một cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh [3]

Theo quan niệm của sinh học hiện đại thì mỗi tế bào riêng rẽ đã phân hóa đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và đầy đủ của cơ thể sinh vật đó Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh Cho đến nay con người đã hoàn toàn chứng minh được khả năng tái sinh một cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một tế bào riêng rẽ Trong nuôi cấy in vitro, tế bào thực vật thể hiện tính toàn năng thông qua sự phản phân hóa và phân hóa của tế bào Cơ thể thực vật trưởng thành là một chỉnh thể thống nhất bao gồm nhiều cơ quan chức năng khác nhau Tuy nhiên, tất cả các loại tế bào đó đều bắt nguồn từ một tế bào đầu tiên (tế bào hợp tử) Ở giai đoạn đầu, tế bào hợp tử tiếp tục phân chia hình thành nhiều tế bào phôi sinh chưa mang chức năng riêng biệt (chuyên hóa) Sau đó từ các tế bào phôi sinh này chúng tiếp tục được biến đổi thành các tế bào chuyên hóa đặc hiệu cho các mô, các cơ quan có chức năng khác nhau Sự phân hóa tế bào là sự chuyển các tế bào phôi sinh thành các tế bào mô chuyên hóa, đảm nhận các chức năng khác nhau Tế bào phôi sinh -> tế bào dãn -> tế bào phân hóa có chức năng riêng biệt Tuy nhiên, khi tế bào đã phân hóa thành các tế bào có chức năng chuyên, chúng không hoàn toàn mất khả năng biến đổi của mình Trong trường hợp cần thiết, ở điều kiện thích hợp, chúng lại có thể trở

về dạng tế bào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ, quá trình đó gọi là phản phân hóa tế bào, ngược lại với dự phân hóa tế bào

Về bản chất thì sự phân hóa và phản phân hóa là một quá trình hoạt hóa, ức chế các gen Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển cá thể, có một số gen được hoạt hóa (mà vốn trước nay bị ức chế) để cho tính

trạng mới, còn một số gen khác lại bị đình chỉ hoạt động Điều này xảy ra theo một chương trình đã được mã hóa trong cấu trúc của phân tử ADN của mỗi tế bào khiến quá trình sinh trưởng phát triển của cơ thể thực vật luôn được hài hòa

1.6.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô

+ Ảnh hưởng của các chất điều hoà sinh trưởng

Các chất điều hoà sinh trưởng là thành phần không thể thiếu trong môi trường nuôi cấy Chúng có vai trò quan trọng trong quá trình phát sinh hình thái thực vật in vitro Hiệu quả tác động của các chất điều hoà sinh trưởng phụ thuộc vào: Nồng độ sử dụng, hoạt tính vốn có của chất điều hoà sinh trưởng, loại mẫu nuôi cấy, [44]

Các chất điều hoà sinh trưởng bao gồm hai nhóm chính là Auxin và Cytokinin Tỷ lệ, hàm lượng hai nhóm chất điều hoà sinh trưởng này trong môi trường nuôi cấy khác nhau sẽ định hướng cho sự phát sinh hình thái của

mô nuôi cấy khác nhau.[18]

- Nhóm Auxin: Được đưa vào môi trường nuôi cấy nhằm thúc đẩy sự sinh trưởng và giãn nở của tế bào, tăng cường các quá trình sinh tổng hợp và trao đổi chất, kích thích sự hình thành rễ và tham gia vào cảm ứng phát sinh sinh phôi vô tính

Một số loại Auxin thường dùng trong nuôi cấy: IAA ( Indole acetic acid); IBA (Indole butyric acid); 2.4-D (2.4 - Dichlorophenoxy acetic acid); α-NAA (α-Naphthaleneacetic acid)

Các Auxin đều có hiệu quả sinh lý ở nồng độ thấp, phạm vi sử dụng

từ 0,1 - 1mg tuỳ theo mục đích và vật liệu nuôi cấy Auxin được thêm vào sẽ kết hợp với các auxin nội sinh để điều khiển chiều hướng và cường độ các quá trình sinh trưởng Tuỳ theo loại Auxin, hàm lượng sử dụng và đối tượng nuôi cấy mà tác động sinh lý của Auxin là kích thích sinh trưởng của mô,

hoạt hóa sự hình thành rễ hay thúc đẩy sự phân chia mạnh mẽ của tế bào dẫn đến hình thành mô sẹo [44].

- Nhóm Cytokinin: Kích thích sự phân chia tế bào, sự hình thành và sinh trưởng của chồi in vitro Các Cytokinin có biểu hiện ức chế sự tạo rễ và sinh trưởng của mô sẹo nhưng có ảnh hưởng dương tính rõ rệt đến phát sinh phôi vô tính của mẫu nuôi cấy Vì thế, trong giai đoạn đầu của phát sinh phôi soma, sự có mặt auxin là cần thiết nhưng trong giai đoạn sau của phôi phải được nuôi cấy trong môi trường có Cytokinin để biệt hóa chồi [45]

Một số loại Cytokinin thường dùng trong nuôi cấy: Zeatin; Kinetin; BAP,…Hàm lượng sử dụng các loại Cytokinin giao động từ 0,1-2,0mg/l Ở những nồng độ cao hơn, Cytokinin có tác dụng kích thích rõ rệt đến sự hình thành chồi bất định, đồng thời ức chế mạnh sự tạo rễ của chồi nuôi cấy Ngược lại, ở nồng độ thấp hơn, Cytokinin biểu hiện hiệu quả kích thích kém, dẫn đến sự tạo chồi và sinh trưởng của chồi giảm

Trong nuôi cấy các loại mẫu chỉ cần Auxin hoặc Cytokinin, hoặc không cần cả hai Còn đa số các trường hợp phải sử dụng phối hợp cả Auxin và Cytokinin ở những tổ hợp tỉ lệ khác nhau [44] Theo Bhojwani(1980) ở một

số loài, môi trường nuôi cấy chỉ có một loại Cytokinin cũng cho hệ số tạo chồi cực đại Với các cây ngũ cốc sự phối hợp của hai hay nhiều loại Cytokinin cho kết quả tốt hơn khi sử dụng Cytokinin riêng rẽ Tuy nhiên, muốn có tương quan sinh trưởng tối ưu thì phái có cân bằng hormone thích hợp Sự biệt hóa cơ quan thực vật in vitro là kết quả tác động qua lại giữa hai nhóm Auxin và Cytokinin Tỷ lệ Auxin/Cytokinin cao sẽ kích thích sự tạo thành rễ, ngược lại sẽ đẩy mạnh sự biệt hóa chồi, còn nếu tỷ lệ đó là trung bình thì mô sẹo được hình thành Vì thế mỗi loại mô ở từng giai đoạn sinh trưởng khác nhau thì tổ hợp nồng độ giữa Auxin và Cytokinin là rất quan trọng

Ngoài hai nhóm chính là Auxin và Cytokinin, trong nuôi cấy người ta còn sử dụng thêm các chất điều hoà sinh trưởng khác như GA (thông dụng nhất là GA3), ABA, Etylen,…Sự có mặt của GA3 trong môi trường nuôi cấy

sẽ tăng cường quá trình vươn thân của chồi và tạo cây hoàn chỉnh ở một số loài thực vật Tuy nhiên đối với một số đối tượng thì việc bổ sung GA3 là không cần thiết vì nó ảnh hưởng xấu đến sự hình thành chồi bất định, sự tạo

rễ và phát sinh phôi ABA chỉ được sử dụng trong nuôi cấy nhằm kìm hãm sự sinh trưởng của chồi, tham gia bảo quan lương thực và quỹ gen in vitro Trong nuôi cấy phôi, việc bổ sung ABA vào môi trường nuôi cấy là cần thiết

vì ABA giúp phôi chống lại sự khô hóa

+ Ảnh hưởng của mẫu nuôi cấy lên khả năng tái sinh cây

Mẫu dùng cho nuôi cấy mô tế bào thực vật có thể là hầu hết các cơ quan bộ phận của cây: Chồi ngọn, chồi bên, phiến lá, cuống lá,…Các cấu trúc của phôi (lá mầm, trụ lá mầm,…); Các cơ quan dự trữ (củ, …) Tuỳ theo sự tiếp xúc với môi trường mà các mẫu thực vật có chứa ít hay nhiều mầm bệnh (vi khuẩn, nấm) Các cấu trúc thực vật được bao kín (lá mầm, phôi, mô thịt trong quả,…) thường không chứa hoặc có ít vi sinh vật Ngược lại các mô và

cơ quan thực vật tiếp xúc trực tiếp với đất, nước như rễ, thân ngầm, củ thường

có lượng vi sinh vật rất cao và rất khó loại bỏ hoàn toàn chúng khỏi nguồn mẫu

Các loài cây khác nhau có hiệu quả nuôi cấy khác nhau Thông thường thực vật hai lá mầm có khả năng tái sinh cao hơn thực vật một lá mầm Thậm chí tuy mang cùng một lượng thông tin di truyền như nhau nhưng các cấu trúc

mô khác nhau trên một cây có thể cho các kết quả phát sinh hình thái khác nhau, với khả năng tạo chồi, rễ hay mô sẹo,… Vì vậy, để chọn mẫu cấy cho phù hợp, phải căn cứ vào trạng thái sinh lý hay tuổi của mẫu Mẫu non trẻ có

sự phản ứng với các điều kiện và môi trường nuôi cấy nhanh, dễ tái sinh, đặc

biệt là trong nuôi cấy mô sẹo, phôi Ngoài ra mô non trẻ mới được hình thành, sinh trưởng mạnh, mức độ nhiễm mầm bệnh ít hơn [44].

Để đạt được hiệu quả tái sinh cao, khi lấy mẫu phải chọn đúng loại mô, đúng giai đoạn phát triển cần thiết Thông thường người ta lấy mẫu mô ở đỉnh chồi ngọn, đỉnh chồi nách rồi đến đỉnh chồi hoa và có thể là đoạn thân non, hoặc mảnh lá non Đỉnh chồi ngọn, đỉnh chồi nách dùng để nhân nhanh nhiều loại cây trồng như: Dứa, khoai tây, Thuốc lá, Cà chua, Hoa cúc, Hoa hồng,… Mảnh lá mầm để nhanh họ Bầu bí,…Sử dụng chồi non của hạt nảy mầm cũng

dễ dàng nhân nhanh nhiều loại cây trồng

Bên cạnh đó, chất lượng của mẫu cấy phụ thuộc vào chất lượng của cây cho mẫu, thường người ta lấy mẫu từ những cây có những đặc điểm ưu việt cần quan tâm: Sinh trưởng, phát triển mạnh, chống chịu tốt với các điều kiện bất lợi (hạn, lạnh, mặn,…) hoặc sâu bệnh, cho sản lượng và chất lượng ngon của quả, hạt,…

Tuỳ thuộc vào mục đích và khả năng nuôi cấy mà người ta chọn mẫu cho phù hợp: Để phục vụ cho nhân giống vô tính thường chọn chồi ngọn, chồi bên (chồi muộn) Nuôi cấy mô sẹo, nuôi cấy phôi có thể sử dụng lá mầm, trụ mầm, thân, lá, phôi,… Để thu cây đơn bội phục vụ cho lai tạo giống: Dùng bao phấn và hạt phấn cho nuôi cấy Bên cạnh đó, nguồn gốc, tuổi sinh lý của mẫu cấy cũng ảnh hưởng đến khả năng tái sinh của mô Các mảnh nuôi cấy càng nhỏ thì tỉ lệ sống càng thấp và các mô có nguồn gốc từ chồi đỉnh có khả năng sinh trưởng tốt hơn các mô có nguồn gốc từ chồi nách

Tuy vậy, nguyên tắc căn bản là mẫu cấy phải chứa các tế bào sống từ các mô non có các tế bào đang phân chia mạnh chiếm tỷ lệ lớn, nhất là dễ tạo

mô sẹo Mẫu cấy phải được khử trùng trước khi đưa vào môi trường nuôi cấy Nếu mẫu lấy từ hạt, cần phải khử trùng bề mặt và gieo hạt vào điều kiện vô trùng để mọc thành cây và lấy mẫu Nếu mẫu lấy trực tiếp từ cây tươi, cần

phải được xử lý để thu được mẫu sạch bệnh Nồng độ và thời gian xử lý tuỳ theo loại mẫu.

1.6.3 Giới thiệu các bước trong kỹ thuật nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô

a Giai đoạn chuẩn bị:

Đây là bước đầu tiên của quy trình nhân giống Tùy theo điều kiện, giai đoạn này kéo dài từ 3-6 tháng Giai đoạn này gồm các khâu như:

- Chọn lọc cây mẹ để lấy mẫu: (cây mẹ thường là cây khỏe, ưu việt, có

vị trí kinh tế); Chọn cơ quan để lấy mẫu thường là chồi đỉnh, chồi nách, chồi ngủ, lá non, đầu rễ) Mô chọn để nuôi cấy thường là các mô có khả năng tái sinh cao trong ống nghiêm, sạch bệnh, giữ được các đặc tính quý của cây mẹ

- Chọn chế độ khử trùng thích hợp đảm bảo mẫu cấy bị nhiễm là thấp nhất, đồng thời khả năng sinh trưởng và phát triển tốt Phương pháp vô trùng mẫu cấy dùng để khử trùng là cồn 70%, HgCl2 Nồng độ chất khử trùng được chọn trên cơ sở thực tiễn thí nghiệm Thời gian khử trùng được xác định tùy vào loại mô, loài cây Tuy nhiên, mô non khử trùng ngắn hơn mô già

b Giai đoạn khởi động mẫu cấy

Sau khi khử trùng, người ta đưa mẫu cấy vào nuôi cấy in vitro trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo thích hợp để tái sinh mô cấy Môi trường này được xác lập cho từng loại cây, loại mô nuôi cấy Các mẫu nuôi cấy nếu không bị nhiễm khuẩn, nấm hoặc vi rút sẽ được lưu giữ ở phòng nuôi cấy với điều kiện nhiệt độ, ánh sáng phù hợp Sau một thời gian nhất định, từ mẫu nuôi cấy ban đầu sẽ xuất hiện các cụm tế bào hoặc cơ quan (chồi, cụm chỗi, rễ) hoặc các phôi vô tính gần như phôi hữu tính Đây sẽ là những vật liệu khởi đầu để cho quá trình nhân nhanh tiếp đó

c Giai đoạn nhân nhanh

Khi mẫu cấy sạch bệnh đã được tạo ra và từ đó nhân được các cụm

chồi, các phôi vô tính sinh trưởng tốt, quá trình nuôi cấy sẽ bước vào giai đoạn nhân nhanh Người ta cần thu được tốc độ nhân nhanh cao nhất trong điều kiện nuôi cấy và thành phần môi trường được tối ưu hóa nhằm đạt được mục tiêu này Quy trình cấy chuyển để nhân nhanh chồi thường kéo dài trong khoảng 1-2 tháng tùy mỗi loại cây.

d Giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh

Các chồi hình thành trrong quá trình nuôi cấy có thể tự phát sinh rễ, nhưng thông thường các chồi này phải được cấy sang một môi trường khác để kích thích tạo rễ Ở giai đoạn này phải tạo cây trong ống nghiệm phát triển cân đối về thân, lá, rễ để đạt tiêu chuẩn của một cây giống [3]

e Giai đoạn vườn ươm

Đây là giai đoạn đánh giá tính hiện thực của quá trình nhân giống in vitro khi chuyển cây từ điều kiện vô trùng của phòng thí nghiệm ra ngoài tự nhiên Khi đưa ống nghiệm ra ngoài vườn ươm, nhằm giảm đi hiện tượng

“sốc’’ do thay đổi môi trường cần có giai đoạn thích nghi Quá trình thích nghi với điều kiện ngoại cảnh của cây yêu cầu phải chăm sóc đặc biệt, do đó ở giai đoạn này cần chủ động để điều khiển được quá trình chiếu sáng, dinh dưỡng và giữ nước cũng như lựa chọn các giá thể thích hợp vào trong điều kiện cách ly sạch bệnh để cây con đạt tỷ lệ sống cao

1.6.4 Ưu điểm và hạn chế của nhân giống invitro

* Ưu điểm

1- Đưa ra sản phẩm nhanh hơn: Từ một cây ưu việt bất kỳ đều có thể tạo ra một quần thể có độ đồng đều cao với số lượng không hạn chế, phục vụ sản xuất thương mại, dù cây đó là dị hợp về mặt di truyền

2- Nhân nhanh với hệ số nhân giống cao: Trong hầu hết các trường hợp, công nghệ vi nhân giống đáp ứng tốc độ nhân nhanh cao, từ 1 cây trong vòng 1-2 năm có thể tạo thành hàng triệu cây

3- Sản phẩm cây giống đồng nhất: Vi nhân giống về cơ bản là công nghệ nhân dòng Nó tạo ra quần thể có độ đều cao dù xuất phát từ cây mẹ có kiểu gen dị hợp hay đồng hợp

4- Tiết kiệm không gian: Vì hệ thống sản xuất hoàn toàn trong phòng thí nghiệm, không phụ thuộc vào thời tiết và các vật liệu khởi đầu có kích thước nhỏ Mật độ cây tạo ra trên một đơn vị diện tích lớn hơn rất nhiều so với sản xuất trên đồng ruộng và trong nhà kính theo phương pháp truyền thống

5- Nâng cao chất lượng cây giống: Nuôi cấy mô là một phương pháp

hữu hiệu để loại trừ virus, nấm khuẩn khỏi các cây giống đã nhiễm bệnh Cây

giống sạch bệnh tạo ra bằng cấy mô thường tăng năng suất 15 - 30% so với giống gốc

6- Khả năng tiếp thị sản phẩm tốt hơn và nhanh hơn: Các dạng sản phẩm khác nhau có thể tạo ra từ hệ thống vi nhân giống như cây con in vitro (trong ống nghiệm) hoặc trong bầu đất Các cây giống có thể được bán ở dạng cây, củ bi hay là thân củ

7- Lợi thế về vận chuyển: Các cây con kích thước nhỏ có thể vận chuyển đi xa dễ dàng và thuận lợi, đồng thời cây con tạo ra trong điều kiện vô trùng được xác nhận là sạch bệnh Do vậy, bảo đảm an toàn, đáp ứng các qui định về vệ sinh thực vật quốc tế

8- Sản xuất quanh năm: Quá trình sản xuất có thể tiến hành vào bất kỳ thời gian nào, không phụ thuộc mùa vụ

* Hạn chế

1- Hạn chế về chủng loại sản phẩm: Trong điều kiện kỹ thuật hiện nay, không phải tất cả cây trồng đều được nhân giống thương phẩm bằng vi nhân giống Nhiều cây trồng có giá trị kinh tế hoặc quý hiếm vẫn chưa thể nhân nhanh để đáp ứng nhu cầu thương mại hoặc bảo quản nguồn gen Nhiều vấn

đề lý thuyết liên quan đến nuôi cấy và tái sinh tế bào thực vật in vitro vẫn chưa được giải đáp

1- Chi phí sản xuất cao: Vi nhân giống đòi hỏi nhiều lao động kỹ thuật thành thạo Do đó, giá thành sản phẩm còn khá cao so với các phương pháp truyền thống như chiết, ghép và nhân giống bằng hạt

2- Hiện tượng sản phẩm bị biến đổi kiểu hình: Cây con nuôi cấy mô có thể sai khác với cây mẹ ban đầu do hiện tượng biến dị tế bào soma Kết quả là cây con không giữ được các đặc tính quý của cây mẹ Tỷ lệ biến dị thường thấp ở giai đoạn đầu nhân giống, nhưng sau đó có chiều hướng tăng lên khi nuôi cấy kéo dài và tăng hàm lượng các chất kích thích sinh trưởng Hiện tượng biến dị này cần được lưu ý khắc phục nhằm đảm bảo sản xuất hàng triệu cây giống đồng nhất về mặt di truyền

Chương 2 3ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU, ĐỊA ĐIỂM, NỘI DUNG VÀ

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là giống cà chua múi (Lycopersicon esculentum sp.) tại huyện Tương Dương - Nghệ An Đây là giống cà chua địa phương có

nhiều đặc tính quý được người tiêu dùng ưu chuộng

2.2 Vật liệu nghiên cứu

Vật liệu nghiên cứu là hạt cà chua múi không bệnh và đỉnh sinh trưởng của cây cà chua múi sinh trưởng tốt được trồng trong vườn thí nghiệm

Chất điều tiết sinh trưởng: Auxin (Các loại Auxin dùng trong thí nghiệm) và Xytokinin (Các loại Xytokinin dùng trong thí nghiệm)

2.3 Địa điểm nghiên cứu

- Địa điểm và điều kiện tiến hành nghiên cứu:

* Quá trình nuôi cấy invitro được tiến hành trong môi trường nhân tạo,

vô trùng và có thể thay đổi các điều kiện phòng nuôi cấy với thời gian chiếu sáng: 16h sáng/8h tối, nhiệt độ : 20 – 30oC, độ ẩm: 60 – 70%

* Các thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm “Nuôi cấy mô tế bào thực vật”, Tổ Sinh – Địa, Trung tâm Thực hành thí nghiệm, Trường Đại học Vinh

- Thời gian nghiên cứu: từ tháng 12/2011 – 8/2012

2.4 Nội dung nghiên cứu

1 Xác định yếu tố thích hợp cho giai đoạn tạo vật liệu ban đầu cây

cà chua invitro

a Đối với mẫu nuôi cấy là hạt cà chua

+ Thí nghiệm 1: Xác định ảnh hưởng của thời gian khử trùng đến khả năng nảy mầm và sống của mẫu

Công thức Thời gian (phút) số mẫu hạt nghiên cứu

Công thức Hàm lượng Kinetin

- Đối với mẫu nuôi cấy là đỉnh sinh trưởng

+ Thí nghiệm 4: Xác định ảnh hưởng của phương thức và thời gian khử trùng đến khả năng sống của mẫu nuôi cấy

Công thức Thời gian Lần1

(Phút)

Lần2 Thời gian (Phút)

Số mẫu thí nghiệm

+ Thí nghiệm 7: Xác định ảnh hưởng phối hợp của BAP (hàm lượng tối

ưu ở thí nghiệm 5 (x)) và α- NAA đến khả năng nhân nhanh chồi

Công thức Hàm lượng

BAP(mg/l)

Hàm lượng α- NAA (mg/l)

Số mẫu thí nghiệm

3 Xác định môi trường thích hợp của giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh

+ Thí nghiệm 8: Xác định ảnh hưởng của hàm lượng IBA bổ sung vào môi trường nuôi cấy đến hiệu quả ra rễ của chồi cà chua múi invitro

Công thức Hàm lượng IBA (mg/l) Số mẫu thí nghiệm

+ Thí nghiệm 9: Xác định ảnh hưởng phối hợp của (y mg/l) IBA và

Than hoạt tính (THT) g/l bổ sung vào môi trường nuôi cấy đến hiệu quả ra

rễ chồi cà chua múi invitro

Công thức Hàm lượng IBA

(mg/l)

Hàm lượng

THT (g/l)

Số mẫu thí nghiệm

y: là làm lượng tối ưu ở thí nghiệm 8

4 Xác định giá thể thích hợp cho giai đoạn ra cây ngoài vườn

+ Thí nghiệm 10: Xác định ảnh hưởng của giá thể đến sức sống của cây invitro ngoài vườn ươm

* Giá thể 1: Đất + bột xơ dừa + Phân hữu cơ (1:1:1) theo tỷ lệ khối lượng

* Giá thể 2: Trấu hun + Đất+ Phân hữu cơ (3:4:3) theo tỷ lệ khối lượng

2.5 Phương pháp nghiên cứu

- Phương pháp bố trí thí nghiệm

Các thí nghiệm được tiến hành theo sơ đồ sau:

- Các thí nghiệm trong kỹ thuật nuôi cây mô

Các thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp 20 bình, mỗi bình cấy đồng đều 2 mẫu

Các bình nuôi cấy invitro được đặt trong phòng nuôi cấy có chế độ chiếu sáng 16h sáng/ 8h tối với cường độ ánh sáng 2.500 – 3.000 Lux

Nhiệt độ phòng nuôi cấy: 20-25 0 C

Giai đoạn tạo vật liệu khởi đầu

a Chuẩn bị môi trường nuôi cấy invitro

Giai đoạn tạo vật liệu khởi đầu

Mẫu: Hạt cây cà chua khử trùng bằng

Giai đoạn nhân nhanh chồi

Mẫu: Đoạn chồi invitro Kích thích tạo chồi bằng BAP: TN5

Kích thích tạo chồi bằng Kinetin: TN6

Kích thích tạo chồi bằng BAP

và α- NAA: TN7 Thí nghiệm: TN4,TN5,TN6

Giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh

(giai đoạn ra rễ) Mẫu: chồi invitro Kích thích tạo rễ bằng IBA: TN8

Kích thích tạo rễ bằng tổ hợp IBA và Than hoạt tính: TN9

Cây cà chua múi

Giai đoạn huấn luyện thích nghi

Mẫu: cây con invitro Thí nghiệm: TN10

- Sử dụng môi trường muối MS (Muraskige & Skoog, 1962) có chứa 15g/l đường Sacaroza và 8g/l aga.

- Các chất điều tiết sinh trưởng sử dụng thuộc nhóm Auxin, Xytokinin; Than hoạt tính

- Giá trị pH của môi trường nuôi cấy trước khi khử trùng là 5,7

- Thể tích dung dịch dinh dưỡng (môi trường nuôi cấy) trong bình nuôi cấy

là 50 ml/bình

- Môi trường nuôi cấy được hấp khử trùng ở nhiệt độ 1210C, áp suất 1,1atm trong 30 phút

b Phương pháp vô trùng mẫu nuôi cấy

- Đối với mẫu nuôi cấy là hạt cà chua:

+ Chọn mẫu: Hạt cà chua được chọn từ những quả của cây giống khỏe mạnh, không sâu bệnh, hạt to, chắc, khả năng nảy mầm tốt

+ Xử lý mẫu: Rửa sạch mẫu hạt cấy bằng xà phòng loãng dưới vòi nước chảy 3 lần trong 10 – 15 phút, sau đó khử trùng sơ bộ bằng cồn 70oC trong 2 phút, tiếp đến ngâm vào Nước Javen 60% trong 20 phút sau đó khử trùng bằng hóa chất khử trùng và cuối cùng được rửa lại 4 lần bằng nước cất

vô trùng trước khi cấy lên môi trường

+ Hóa chất khử trùng: Thủy ngân clorua HgCl2 0,1%

+ Các công thức thí nghiệm được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn với 3 lần nhắc lại, tiến hành trên 20 bình, mỗi bình cấy 2 hạt

* Các chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ hạt nhiễm, tỷ lệ nảy mầm và chết, tỷ lệ hạt nảy

∑ hạt nảy mầm và chết

+ Tỷ lệ nảy mầm và chết (%) = x 100

∑ hạt nuôi cấy

∑ hạt nảy mầm và sống+ Tỷ lệ nảy mầm và sống (%) = x 100

∑ mẫu nuôi cấy

- Đối với mẫu nuôi cấy là đỉnh sinh trưởng

+ Chọn mẫu: Mẫu cấy được chọn là đỉnh sinh trưởng lấy từ các cây cà chua trưởng thành, sạch bệnh, sinh trưởng tốt trồng ở chậu cát trong vườn thí nghiệm

+ Xử lý mẫu: Mẫu được cắt bằng dao sắc rồi được đem vào rửa sạch bằng nước xà phòng loãng dưới vòi nước chảy và tráng lại 3 lần bằng nước cất Khử trùng sơ bộ bằng cồn 700C Tiếp đó đưa mẫu vào tủ cấy để tiến hành các bước khử trùng bằng HgCl2 0,1% theo 2 phương thức khử trùng là khử trùng đơn và khử trùng kép

+ Tỷ lệ mẫu sống (%) = x 100

∑ mẫu nuôi cấy

∑ mẫu chết+ Tỷ lệ mẫu chết (%) = x 100

∑ mẫu nuôi cấy

2.5.2 Giai đoạn nhân nhanh chồi

*Phương pháp nhân nhanh

- Mẫu: Mẫu nuôi cấy ở giai đoạn nhân nhanh là các đỉnh sinh trưởng của các cây cà chua trồng trong vườn thí nghiệm sau khi đã khử trùng với thời gian khử trùng tối ưu ở thí nghiệm 4 Và được cấy lên môi trường muối MS

có bổ sung các chất điều tiết sinh trưởng là BAP, Kinetin, α- NAA với các hàm lượng theo thí nghiệm 5, 6, 7 dưới đây:

- Các công thức thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên hoàn toàn với 3 lần nhắc lại, được tiến hành trên 20 bình, mỗi bình cấy 2 mẫu

- Các chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ mẫu phát sinh chồi, hệ số nhân chồi (hệ số

nhân nhanh), chiều dài chồi, số lá/chồi, Trạng thái chồi

∑ số mẫu tạo chồi

+ Mẫu phát sinh chồi (%) = ∑ số mẫu cấy x 100

+ Trạng thái chồi: Chồi tốt: chồi mập, lá xanh thẫm

Chồi khá: chồi bình thường, lá xanh

Chồi trung bình: Chồi hơi gầy, lá xanh