Nội dung và phương pháp nghiên cứu
Thời gian và địa điểm nghiên cứu
3.1.1 Thời gian nghiên cứu Đề tài được nghiên cứu từ tháng 11/2015 đến tháng 4/2016
- Phòng thí nghiệm Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung Ương (TTCĐ)
- Khu nuôi động vật ATSH của TTCĐ
- Phòng thí nghiệm ATSH củaTTCĐ.
Nguyên liệu, đối tượng dùng trong nghiên cứu
- Gà và vịt 1 ngày tuổi
Vacxin CGC là vacxin vô hoạt tái tổ hợp cúm H5 nhị giá, bao gồm chủng Re-6 và Re-8, được nhập khẩu từ Trung Quốc Vacxin này được phát triển dựa trên virus H5N1 clade 2.3.2.1 (chủng Re-6) và virus H5N6 clade 2.3.4.4 (chủng Re-8).
- Virus cúm gia cầm H5N6 clade 2.3.4.4B phân lập từ mẫu gà ở Lạng Sơn ngày 08/01/2016 (A/Ck/Vietnam/LangSon/16A10/2016(H5N6)
- Kháng nguyên chuẩn H5N1 dùng cho phản ứng HI: A/ck/VN1203/2004 (clade 1), A/Hubei/1/2010 (clade 2.3.2.1) và A/ck/VN/LangSon(TrangDinh)- NCVD140450(14A324)/2014 (H5N6 clade 2.3.4.4)
3.2.2 Các loại dung dịch, môi trường
- Môi trưởng bảo quản swabs
- Bộ kit chiết tách ARN, kit nhân gen qRT-PCR
- Prime, Probe, đối chứng dương H5N6.
Trang thiết bị máy móc, dụng cụ trong phòng thí nghiệm
Buồng cấy an toàn sinh học cấp 2, máy ly tâm lạnh, và các tủ lạnh âm sâu 80°C và âm 20°C là những thiết bị quan trọng trong phòng thí nghiệm Hệ thống bơm hút chân không hỗ trợ trong quá trình chiết tách RNA, trong khi máy Real time PCR (RT-PCR) được sử dụng để phân tích và định lượng RNA một cách chính xác.
- Phòng thí nghiệm ATSH cấp 2 để phân lập virus
- Phòng nuôi động vật ATSH cấp 2+ để công cường độc.
Nội dung và phương pháp nghiên cứu
- Tình hình dịch bệnh cúm trên đàn gia cầm tại Việt Nam
- Nghiên cứu sự phân bố và lưu hành các chủng virus cúm gia cầm trên địa bàn cả nước
- Đánh giá hiệu giá kháng thể của vacxin Re-6 + Re-8 khi tiêm cho đàn gà, vịt thí nghiệm
+ Hiệu giá kháng thể của vacxin Re-6 +Re-8 sau khi tiêm phòng trên gà với kháng nguyên H5N1 clade 2.3.2.1
+ Hiệu giá kháng thể của vacxin Re-6 +Re-8 sau khi tiêm phòng trên gà với kháng nguyên H5N6 clade 2.3.4.4
+ Hiệu giá kháng thể của vacxin Re-6 +Re-8 sau khi tiêm phòng trên vịt với kháng nguyên H5N1 clade 2.3.2.1
+ Hiệu giá kháng thể của vacxin Re-6 +Re-8 sau khi tiêm phòng trên vịt với kháng nguyên H5N6 clade 2.3.4.4
- Nghiên cứu triệu chứng lâm sàng, bệnh tích và mức độ bài thải virus của gà thí nghiệm sau khi công cường độc
+ Nghiên cứu các triệu chứng lâm sàng của gia cầm sau công cường độc + Xét nghiệm virus bài thải
+ So sánh hiệu giá kháng thể trung bình và tỉ lệ bảo hộ lâm sàng của lô gà và vịt
+ Bệnh tích đại thể của đàn gà, vịt sau khi công cường độc
Gà và vịt được lựa chọn từ đàn sạch bệnh, chưa tiêm phòng vacxin CGC và không có kháng thể kháng cúm H5 Trước khi tiêm vacxin, khoảng 30% tổng đàn sẽ được lấy máu để kiểm tra kháng thể kháng cúm gia cầm bằng phương pháp HI với kháng nguyên H5N1.
Bố trí tiêm vacxin cho gà gồm 50 con, chia thành hai lô: lô Vacxin 30 con và lô Đối chứng 20 con Theo khuyến cáo của nhà sản xuất, 30 gà trong lô Vacxin sẽ được tiêm 1 mũi vacxin khi đạt 03 tuần tuổi, trong khi gà thuộc lô Đối chứng sẽ không được tiêm.
Bố trí tiêm vacxin cho 50 vịt được chia thành hai lô: lô Vacxin gồm 30 con và lô Đối chứng gồm 20 con Lô Vacxin sẽ được tiêm 1 mũi vacxin khi 3 tuần tuổi và nhắc lại vào 6 tuần tuổi theo khuyến cáo của nhà sản xuất, trong khi lô Đối chứng sẽ không được tiêm vacxin.
Bảng 3.1 Bố trí thí nghiệm kiểm tra hiệu lực vacxin
Nhóm Số lượng Liều vacxin
Gà Tiêm vacxin 30 0,3 ml/con Đối chứng 20 Không tiêm
Vịt Tiêm vacxin 30 0,3 ml/con Đối chứng 20 Không tiêm
Sau khi hoàn tất liệu trình vacxin, cần lấy máu gà và vịt sau ba tuần để xác định hiệu giá kháng thể kháng H5 của virus CGC Việc này được thực hiện bằng phương pháp HI với kháng nguyên H5N1 đồng chủng vacxin hoặc kháng nguyên gần nhất với chủng virus vacxin, cùng với kháng nguyên virus dùng để công cường độc.
Công cường độc cho gà được thực hiện khi gà đạt 6 tuần tuổi, trong khi vịt cần 9 tuần tuổi, tức là 3 tuần sau khi hoàn tất liệu trình vacxin Việc lựa chọn gà và vịt để công cường độc cần dựa trên tỷ lệ phân bố hiệu giá kháng thể đối với kháng nguyên đồng chủng vacxin Mỗi loài bao gồm 10 con thuộc lô vacxin và 5 con thuộc lô đối chứng.
Số còn lại để dự phòng
- Theo dõi trong vòng 10 ngày sau công cường độc, chấm điểm lâm sàng hằng ngày theo quy trình của OIE Đánh giá theo các mức độ sau: Điểm Ý nghĩa
Không chấm điểm Khoẻ mạnh
- Mổ khám gia cầm chết, đánh giá bệnh tích đại thể Mổ khám gia cầm sống sót để so sánh bệnh tích với những con chết
Lấy mẫu swab hầu họng vào ngày thứ 3, thứ 10 và vào ngày gia cầm chết sau khi công cường độc, sau đó tiến hành xét nghiệm virus bài thải bằng phương pháp Real-time RT-PCR.
- Lấy mẫu huyết thanh gia cầm sống sót vào ngày thứ 10 để đánh giá đáp ứng miễn dịch đối với virus cường độc
3.4.2.2 Phương pháp điều tra hồi cứu
Bài viết thu thập và tổng hợp thông tin từ Cục Thú y về tình hình chăn nuôi gia cầm, diễn biến dịch cúm gia cầm (CGC), kết quả tiêm phòng vaccine và kết quả xét nghiệm giám sát huyết thanh sau tiêm phòng qua các năm Qua đó, đánh giá hiệu quả của việc tiêm phòng vaccine cúm trên thực địa.
3.4.2.3 Chuẩn đoán phòng thí nghiệm
Sơ đồ chẩn đoán bệnh cúm gia cầm yêu cầu tất cả các thao tác liên quan đến xử lý mẫu, chiết tách ARN và phân lập virus phải được thực hiện trong buồng an toàn sinh học cấp 2 hoặc cao hơn Việc lấy mẫu bệnh phẩm là bước đầu tiên trong quy trình chẩn đoán.
*) Lấy mẫu xét nghiệm kháng nguyên
Mẫu xét nghiệm kháng nguyên yêu cầu lấy từ 3 gam đến 5 gam bệnh phẩm từ các bộ phận như não, phổi, khí quản, lách hoặc ruột của gia cầm bị bệnh Nếu gia cầm còn sống, cần sử dụng tăm bông để ngoáy dịch ổ nhớp, họng hoặc thu thập phân tươi, sau đó cho vào dung dịch PBS có pH từ 7,2 đến 7,4, kèm theo dung dịch kháng sinh với tỉ lệ 1:10.
Dung dịch muối đệm phosphat (PBS):
+ Natri clorua (NaCl) 8 g + Natri hydro photphat dihydrat (Na 2 HPO 4 2H 2 O) 2,9 g + Kali dihydro photphat (KH 2 PO 4 ) 0,2 g + Kali clorua (KCl) 0,2 g
Chỉnh pH bằng dung dịch NaOH 1N hoặc dung dịch HCl 1N Hấp vô trùng ở 121 o C trong 30 giây
*) Lấy mẫu xét nghiệm kháng thể
Chỉ thực hiện lấy máu từ gia cầm nghi mắc cúm gia cầm chưa tiêm vacxin Sử dụng xy lanh 5 ml để thu thập 1 ml máu, cần rút cán xy lanh tới mức cao nhất nhằm tạo nhiều khoảng trống bên trong Đặt xy lanh nằm nghiêng để tiến hành lấy mẫu hiệu quả.
5 o ở nhiệt độ 20 đến 30 o C trong thời gian 30 min để máu tự đông lại và tiết ra huyết thanh Chắt huyết thanh sang ống 1,5 ml mới để dùng cho xét nghiệm
Các mẫu phải được bảo quản lạnh từ 2 o C đến 8 o C và vận chuyển ngay đến phòng thí nghiệm trong vòng 24h b Phát hiện kháng nguyên
- Mẫu bệnh phẩm (não, phổi, khí quản, lách, ruột)
+ Nghiền 1 gam bệnh phẩm bằng cối chày sứ với dung dịch PBS pH 7,2 theo tỉ lệ 1:10 thành huyễn dịch 10 %
+ Bổ sung 1/10 lượng kháng sinh đậm đặc, chuyển sang ống ly tâm Ly tâm ở tốc độ 8 000 r/min trong 15 s
Thu thập bệnh phẩm vào hai ống 1,5 ml; một ống dành cho xét nghiệm Realtime RT-PCR (rRT-PCR), phân lập virus trên tế bào và trứng, ống còn lại dùng để lưu mẫu bảo quản ở nhiệt độ -80°C.
- Dịch ngoáy ổ nhớp, họng, khí quản, phân tươi
+ Lắc ống chứa tăm bông dịch ngoáy bằng máy lắc trong 15 s, ly tâm ống ở tốc độ 8000 g/min trong 15 giây
Sử dụng pipet để chuyển dịch trong ống sang hai ống 1,5 ml Một ống sẽ được dùng cho các xét nghiệm Realtime RT-PCR, phân lập virus trên tế bào hoặc trên trứng, trong khi ống còn lại sẽ được bảo quản mẫu ở nhiệt độ -80 độ C.
*) Phương pháp Realtime PCR (phụ lục 4)
Tất cả các quy trình tiêm truyền trứng và thu hoạch nước trứng (dịch niệu mô) sau khi phân lập cần phải được thực hiện trong môi trường an toàn sinh học cấp 3.
+ Mỗi mẫu bệnh phẩm cần được tiêm truyền lên 3 trứng
+ Chọn trứng gà có phôi 9 ngày đến 10 ngày tuổi khoẻ mạnh không có kháng thể cúm
+ Lau trứng bằng cồn 70 % và đục lỗ nhỏ phía trên buồng hơi
+ Dùng xi lanh 1 ml với kim 23G và hút dịch bệnh phẩm tiêm phía trên buồng hơi thẳng xuống xoang niệu mô với lượng 0,2 ml/trứng
+ Bịt lỗ tiêm trên vỏ trứng bằng keo dán
+ Đặt trứng trong tủ ấp trứng 37 o C và theo dõi trong vòng 72 h
+ Soi trứng mỗi ngày 2 lần, nếu phát hiện trứng chết, giữ trứng trong tủ lạnh (4 o C) cho đến khi thu hoạch dịch niệu mô để giám định virus
+ Đối với trứng không chết sau 72 h, cất vào tủ lạnh (4 o C) qua đêm hoặc ít nhất 4 h trước khi thu hoạch dịch niệu mô cho giám định virus
- Thu hoạch dịch niệu mô
+ Dùng panh và kéo vô trùng cắt vỏ trứng, bộc lộ buồng hơi, gạt màng xoang niệu mô sang bên
+ Thu hoạch dịch niệu mô từ 5 ml đến 10 ml/trứng vào các ống nghiệm riêng rẽ để giám định virus
Trước khi tiến hành giám định, cần sử dụng phương pháp HA để xác định sự có mặt của virus cúm gia cầm (Newcastle, vi rút gây hội chứng giảm đẻ) trong dịch niệu mô Nếu kết quả HA dương tính, điều này cho thấy dịch niệu mô có chứa virus.
+ Giám định virus trong dịch niệu mô bằng phương pháp HI sử dụng kháng huyết thanh chuẩn H5 hoặc bằng phương pháp Realtime RT-PCR
+ Kết quả giám định (bằng HI hoặc phản ứng realtime RT- PCR hoặc RT- PCR) dương tính, dịch niệu mô có virus cúm gia cầm H5N1
Kết quả giám định cho thấy dịch niệu mô không có virus cúm gia cầm H5N1 Nếu kết quả giám định lần đầu âm tính, cần sử dụng dịch niệu mô thu hoạch từ lần đầu để tiêm truyền trứng lần hai, sau đó theo dõi và thu hoạch dịch niệu mô như lần đầu để giám định Nếu kết quả giám định lần hai vẫn âm tính, mẫu sẽ được kết luận là âm tính với virus cúm gia cầm H5N1.