Nghiên cứu khả năng gây bệnh gan thận mủ trên cá tra (pangasianodon hypophthalmus) và thử nghiệm môi trường nuôi cấy chủng vi khuẩn edwardsiella ictaluri đột biến gen pura trong điều kiện thí nghiệm

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG TRẦN THỊ BÍCH THỦY NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GÂY BỆNH GAN THẬN MỦ TRÊN CÁ TRA PANGASIANODON HYPOPHTHALMUS VÀ THỬ NGHIỆM MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY CHỦNG VI KHUẨN EDWARDSIELL

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

TRẦN THỊ BÍCH THỦY

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GÂY BỆNH GAN THẬN MỦ TRÊN CÁ TRA

(PANGASIANODON HYPOPHTHALMUS) VÀ THỬ NGHIỆM MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY CHỦNG VI KHUẨN EDWARDSIELLA ICTALURI

ĐỘT BIẾN GEN PURA TRONG ĐIỀU KIỆN THÍ NGHIỆM

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Nha Trang, năm 2012

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

TRẦN THỊ BÍCH THỦY

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GÂY BỆNH GAN THẬN MỦ TRÊN CÁ TRA

(PANGASIANODON HYPOPHTHALMUS) VÀ THỬ NGHIỆM MÔI

TRƯỜNG NUÔI CẤY CHỦNG VI KHUẨN EDWARDSIELLA ICTALURI

ĐỘT BIẾN GEN purA TRONG ĐIỀU KIỆN THÍ NGHIỆM

Chuyên ngành: Nuơi trồng thuỷ sản

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan các số liệu và kết quả đã nêu trong luận văn này là công trình nghiên cứu của tôi cùng với sự cho phép sử dụng chung số liệu của nhóm tác giả thực hiện đề tài thuộc chương trình Công nghệ sinh học cấp Nhà nước do Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản III chủ trì, những số liệu này là trung thực, chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tác giả

LỜI CẢM ƠN

Luận văn này đã được thực hiện với sự giúp đỡ của nhóm nghiên cứu đề tài

Công nghệ sinh học cấp Nhà nước: “Nghiên cứu tạo dòng vi khuẩn Edwardsiella

ictaluri nhược độc dùng làm vắc xin phòng bệnh gan thận mủ cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) bằng kỹ thuật gây đột biến gen” do Viện Nghiên cứu Nuôi trồng

Thủy sản III chủ trì, tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quí báu đó

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc sự chỉ dẫn nhiệt tình, chu đáo của cô giáo hướng dẫn PGS.TS Đỗ Thị Hoà đã giúp tôi trong suốt quá trình xây dựng đề cương, triển khai thực hiện các nội dung và hoàn thiện bản luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi của các cán bộ thuộc Phòng nghiên cứu Bệnh Thủy sản và dự báo, Trung tâm quốc gia quan trắc cảnh báo môi trường và phòng ngừa dịch bệnh thủy sản khu vực miền Trung-Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản III để tôi hoàn thành bản luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn Khoa Nuôi trồng Thuỷ sản, Khoa sau Đại học, Trường Đại học Nha Trang, cùng quý thầy cô đã tận tình giảng dạy tôi trong suốt thời gian qua

Cuối cùng tôi xin cảm ơn gia đình đã động viên và giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này

Tác giả

MỤC LỤC

Trang

Trang phụ bìa ……… i

LỜI CAM ĐOAN ……… ii

LỜI CẢM ƠN ……… iii

MỤC LỤC ……… iv

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT….……… vii

DANH MỤC CÁC BẢNG ……… viii

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ……… ix

MỞ ĐẦU ……… 1

Chương 1 – TỔNG QUAN ……… 3

1.1 Nuôi cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) thương phẩm trên Thế giới và Việt Nam ……… 3

1.1.1 Thế giới ……… 3

1.1.2 Việt Nam ……… 3

1.2 Những nghiên cứu về bệnh gan thận mủ cá tra nuôi trên Thế giới và Việt Nam ……… 5

1.2.1 Thế giới ……… 5

1.2.2 Việt Nam ……… 5

1.3 Những nghiên cứu về đặc điểm sinh học, khả năng gây bệnh trên cá tra nuôi của vi khuẩn E ictaluri ……… 6

1.3.1 Đặc điểm sinh học vi khuẩn E ictaluri ……… 6

1.3.2 Những nghiên cứu về khả năng gây bệnh trên cá tra nuôi của vi khuẩn E ictaluri ……… 8

1.4 Những công nghệ đột biến gen được ứng dụng để tạo chủng vi khuẩn E ictaluri bị đột biến dùng làm nguyên liệu sản xuất vaccine phòng bệnh hiện nay trên Thế giới và Việt Nam ……… 9

1.4.1 Thế giới ……… 9

1.4.2 Việt Nam ……… 13

1.5 Một số môi trường thường sử dụng trong nuôi cấy tăng sinh chủng vi khuẩn E ictaluri hoang dại và chủng E ictaluri bị đột biến gen ………… 14

Chương 2 – VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ……… 16

2.1 Vật liệu nghiên cứu ……… 16

2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu ……… 16

2.2.1 Thời gian nghiên cứu ……… 16

2.2.2 Địa điểm nghiên cứu ……… 16

2.3 Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu của đề tài ……… 16

2.4 Phương pháp nghiên cứu ……… 17

2.4.1 Phương pháp quan sát hình dạng, màu sắc khuẩn lạc; đo kích thước của vi khuẩn; nghiên cứu đặc điểm sinh lý, sinh hóa chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri ……… 17

2.4.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm đánh giá khả năng gây bệnh gan thân mủ trên cá tra của vi khuẩn E ictaluri đột biến gen purA ……… 19

2.4.3 Phương pháp tiêm khẳng định lại khả năng gây bệnh gan thận mủ cá tra của chủng E ictaluri đột biến gen purA phân lập từ mẫu cá tra cảm nhiễm nhân tạo trên môi trường EIM agar có bổ sung adenine ……… 20

2.4.4 Phương pháp xác định môi trường nuôi cấy vi khuẩn E.ictaluri đột biến gen purA trong điều kiện thí nghiệm ……… 21

2.4.5 Phương pháp cắt mô gan, thận, lách cá tra 22 2.4.6 Phương pháp xác định một số chỉ tiêu môi trường nước ở các bể thí nghiệm ……… 24

2.4.7 Phương pháp phân tích, xử lý số liệu ……… 24

Chương 3 - KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ……… 26

3.1 Kết quả nghiên cứu đặc điểm vi khuẩn E ictaluri bị đột biến gen purA (E ictaluri PAM) và vi khuẩn E ictaluri chưa bị đột biến (E ictaluri WT) ……… 26

3.1.1 Đặc điểm hình thái ……… 26

3.1.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa ……… 28

3.1.3 Đặc điểm sinh trưởng ……… 31

3.2 Kết quả nghiên cứu khả năng gây bệnh gan thận mủ trên cá tra của chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri bị đột biến gen purA ……… 32 3.2.1 Kết quả theo dõi một số chỉ tiêu môi trường nước ở các bể thí nghiệm 32

3.2.2 Kết quả nghiên cứu khả năng gây bệnh gan thận mủ trên cá tra của chủng

vi khuẩn Edwardsiella ictaluri sau khi đột biến gen purA ……… 32 3.2.3 Kết quả tiêm khẳng định lại khả năng gây bệnh gan thận mủ cá tra của

chủng E ictaluri sau đột biến gen purA phân lập từ mẫu cá tra cảm nhiễm

nhân tạo trên môi trường EIM agar có bổ sung Adenine+Kanamycine … 37

3.2.3.1 Kết quả nuôi cấy, phân lập và định danh lại chủng E ictaluri PAM trên

cá tra cảm nhiễm nhân tạo dùng để làm thí nghiệm ……… 37 3.2.3.2 Kết quả tiêm khẳng định lại khả năng gây bệnh gan thận mủ cá tra của

chủng E ictaluri PAM phân lập từ cá tra nhiễm bệnh gan thận mủ nhân

tạo ……… 38

3.3 Kết quả nuôi cấy chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri bị đột biến gen

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

API 20E: Hệ thống định danh vi khuẩn họ Enterobacteriaceae và vi khuẩn Gram âm

hình que

BHIA: Brain Heart Infusion Agar (Môi trường thạch Brain Heart Infusion)

BHIB: Brain Heart Infusion Broth (Môi trường dịch canh Brain Heart Infusion)

CFU: Colony Forming Unit (Đơn vị hình thành khuẩn lạc)

Cs: Cộng sự

DMM: Defined Minimal Medium (Môi trường tối thiểu cho vi khuẩn E ictaluri) EIM: Edwardsiella Ictaluri Medium (Môi trường chọn lọc vi khuẩn E ictaluri)

ESC: Enteric Septicemia of Catfish (Bệnh xuất huyết nội tạng trên cá nheo Mỹ)

KIA: Klegler Iron Agar

LB: Luria Bertami (Môi trường Luria Bertami)

LDC: Lysine decarboxylase

MAC: Mac Conkey Agar (Môi trường thạch Mac-Conkey)

NN&PTNT: Nông nghiệp và phát triển nông thôn

OD: Optical Density (mật độ quang)

ODC: Ornithine decarboxylase

O/F: Oxydation/Fermentation

ONPG: β- Galactosidase

TSA: Tryptone Soya Agar (Môi trường thạch Tryptone Soya)

DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Bố trí thí nghiệm đánh giá khả năng gây bệnh gan thân mủ trên cá tra

của vi khuẩn E ictaluri đột biến gen purA……… 19 Bảng 3.1 Đặc điểm khuẩn lạc, hình dạng và kích thước chủng vi khuẩn E

Bảng 3.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn E ictaluri PAM, E ictaluri

WT……… 28 Bảng 3.3 Một số yếu tố môi trường nước trong bể nuôi thí nghiệm……… 32 Bảng 3.4 Tỉ lệ chết tích lũy trung bình (%) của cá tra sau 14 ngày thí nghiệm 33 Bảng 3.5 Tỉ lệ chết tích lũy trung bình (%) của cá tra sau 14 ngày thí nghiệm

tiêm chủng E ictaluri PAM đã “hoàn độc” một lần trên cá tra khỏe 39

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Diện tích (ha) nuôi cá tra các tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long 2008-

Hình 1.2 Sản lượng nuôi (nghìn tấn) cá tra các tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long

2008-2010 4 Hình 1.3 Con đường tổng hợp adenylosuccinate synthetase từ gen purA 10 Hình 2.1 Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu của đề tài 17 Hình 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tiêm khẳng định lại khả năng gây bệnh gan

thận mủ cá tra của chủng E ictaluri đột biến gen purA 21

Hình 2.3 Thí nghiệm chọn môi trường phù hợp nuôi cấy chủng E ictaluri

PAM 22 Hình 2.4 Sơ đồ tiến hành làm tiêu bản mô học mẫu cá tra 23 Hình 3.1 Khuẩn lạc vi khuẩn E ictaluri (A, B) trên môi trường BHIA 27

Hình 3.2 Vi khuẩn E ictaluri hoang dại chưa đột biến gen purA và vi khuẩn E

ictaluri đột biến gen purA 27 Hình 3.3 Sinh trưởng quần thể vi khuẩn E ictaluri đột biến gen purA trên môi

trường DMM có bổ sung adenine (E ictaluri PAM+Ad.0,05) và không bổ sung adenine (E ictaluri PAM) 30

Hình 3.4 Đường cong sinh trưởng (theo mật độ) vi khuẩn E ictaluri PAM và

E ictaluri WT trên môi trường nuôi cấy BHIB 31 Hình 3.5 Đường cong sinh trưởng (theo giá trị OD) vi khuẩn E ictaluri PAM

và E ictaluri WT trên môi trường nuôi cấy BHIB 31

Hình 3.6 Tỉ lệ chết tích lũy trung bình (%) của cá tra theo thời gian thí nghiệm 33 Hình 3.7 Một số dấu hiệu bệnh lý của cá tra cảm nhiễm nhân tạo 35 Hình 3.8 Nội quan cá tra khỏe mạnh và bệnh được gây cảm nhiễm nhân tạo 35 Hình 3.9 Mô học gan, thận và lách của cá tra bệnh gan thận mủ và cá tra khỏe 36

Hình 3.10 Sự phát triển của chủng E ictaluri PAM trên các môi trường và nồng

Hình 3.11 Sự phát triển của chủng E ictaluri PAM trên các môi trường nuôi

cấy có nồng độ adenine khác nhau……… 40

Hình 3.12 Sự phát triển của chủng E ictaluri PAM trên các môi trường khác

MỞ ĐẦU

Cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) là đối tượng nuôi nước ngọt chủ lực,

cung cấp thực phẩm trong nước và là mặt hàng thủy sản xuất khẩu quan trọng của Việt Nam trong nhiều năm qua Để đạt được sản lượng cao, ngoài việc mở rộng diện tích, người nuôi cá tra đã phát triển nhiều loại hình nuôi như: Nuôi ao, nuôi lồng bè với mật

độ thâm canh rất cao Chính vì vậy, nhiều loại bệnh đã xuất hiện, trong đó bệnh gan thận mủ đã và đang gây thiệt hại lớn đến năng suất và sản lượng cá nuôi Tỷ lệ cá mắc bệnh chết từ 10-90% tùy thuộc vào mức độ nhiễm bệnh và kích thước cá nuôi [3]

Ở Việt Nam, bệnh gan thận mủ xuất hiện đầu tiên vào mùa lũ năm 1998 ở các tỉnh nuôi cá tra thâm canh: An Giang, Đồng Tháp và Cần Thơ Những năm gần đây bệnh xuất hiện hầu như quanh năm, nhưng cao điểm là tháng 6, 7 và 9 ở tất cả các giai đoạn phát triển của cá, đặc biệt là cá giống [3] Khi cá tra bị bệnh gan thận mủ biểu hiện bên ngoài không có gì đặc biệt, một số trường hợp cá bệnh có hiện tượng xuất huyết ở các vây, có khi xuất huyết toàn thân, khi giải phẫu và quan sát nội tạng thấy có nhiều đốm trắng trên gan, thận và lá lách [3, 15]

Các nghiên cứu của Crumlish (Đại học Stirling-Anh); Công ty Bayer Việt Nam; Công ty Pharma Nauy và Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II kết hợp với NAVETCO đã cùng đi đến kết luận tại hội thảo ở Tp.Hồ Chí Minh tháng 9/2007:

“Mặc dù có thể phát hiện nhiều tác nhân vi khuẩn trên cá tra bệnh nhưng chỉ có duy

nhất vi khuẩn Edwardsiella ictaluri là tác nhân thực sự gây bệnh gan thận mủ trên cá tra” Gần đây nhất, vào ngày 11/8/2009 hội thảo bàn về tác nhân gây bệnh gan thận

mủ trên cá tra do Bộ NN&PTNT tổ chức tại thành phố Hồ Chí Minh cũng đã đi đến

kết luận rằng: Vi khuẩn E ictaluri là một tác nhân thực sự gây bệnh gan thận mủ trên

cá tra nuôi tại Việt Nam

Vi khuẩn E ictaluri trên cá tra đã kháng với một số loại thuốc kháng sinh như

Oxytetracylin, Oxolinic acid, Sulphonamid [3]; Bactrime, Colistin, Amoxicilin, Tetracyclin, Doxycyclin [5, 14] Hơn nữa, các sản phẩm thủy sản sau đó thường không được ưa chuộng do sự tích lũy thuốc, hoá chất trong thịt cá Do vậy, việc phòng bệnh gan thận mủ cá tra bằng vaccine là vấn đề được đặt ra cho công nghiệp nuôi cá tra hiện nay

Nghiên cứu về vi khuẩn E ictaluri cho thấy vi khuẩn này có đặc tính sinh miễn

dịch rất mạnh [43, 46] Do đó, hiện nay các nghiên cứu đang tập trung phát triển vaccine nhược độc không chỉ kích thích sinh miễn dịch dịch thể mà còn kích hoạt sinh miễn dịch trung gian tế bào Các vaccine như vậy đã và đang được phát triển ở Mỹ

nhờ vào công nghệ gây đột biến loại bỏ gen aroA hoặc purA hoặc cả 2 của chủng vi khuẩn E ictaluri

Việc sản xuất vaccine nhược độc phòng bệnh gan thận mủ cá tra cần có nguồn

nguyên liệu là chủng vi khuẩn E ictaluri bị đột biến gen purA đã bị nhược độc và có

khả năng sinh miễn dịch Do vậy, việc nghiên cứu xác định khả năng gây bệnh gan

thận mủ trên cá tra của chủng vi khuẩn E ictaluri bị đột biến gen purA để từ đó làm cơ

sở cho sản xuất vaccine là việc làm đầu tiên hết sức cần thiết

Trước thực tế trên, cùng với việc hoàn thành khóa học, được sự đồng ý của

Trường Đại học Nha Trang, tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu khả năng gây bệnh gan

thận mủ trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) và thử nghiệm môi trường nuôi cấy chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri đột biến gen purA trong điều kiện thí nghiệm” với mục tiêu và nội dung nghiên cứu như sau:

* Mục tiêu nghiên cứu:

Đánh giá khả năng gây bệnh gan thân mủ cá tra của chủng Edwardsiella

ictaluri sau khi đột biến gen purA và tìm ra môi trường nuôi cấy tăng sinh phù hợp

chủng vi khuẩn này trong điều kiện thí nghiệm

* Nội dung nghiên cứu:

1 Các đặc điểm của chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri sau khi đột biến gen

purA

2 Xác định khả năng gây bệnh gan thận mủ trên cá tra của chủng vi khuẩn

Edwardsiella ictaluri sau khi đột biến gen purA

3 Thử nghiệm nuôi cấy chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri sau khi đột biến gen purA ở các môi trường khác nhau

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 Nuôi cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) thương phẩm trên Thế giới và

Việt Nam

1.1.1 Thế giới

Trên thế giới, cá tra được nuôi phổ biến ở hầu hết các nước Ðông Nam Á, là một trong các loài cá nuôi quan trọng nhất của khu vực này Bốn nước vùng hạ lưu sông Mê Kông đã có nghề nuôi cá tra truyền thống là Thái Lan, Campuchia, Lào và Việt Nam do có nguồn cá tra tự nhiên phong phú Ở Campuchia, tỷ lệ cá tra thả nuôi chiếm 98% trong 3 loài thuộc họ cá tra, chỉ có 2% là cá ba sa và cá vồ đém, sản lượng

cá tra nuôi chiếm một nửa tổng sản lượng các loài cá nuôi Tại Thái Lan, trong số 8 tỉnh nuôi cá nhiều nhất, số trại nuôi cá tra chiếm 50%, đứng thứ hai sau cá rô phi Một

số nước trong khu vực như Malaysia, Indonesia cũng đã nuôi cá tra có hiệu quả từ những thập niên 70-80 của thế kỷ XX [52]

Ở Indonesia, cá tra có vai trò rất quan trọng và được xem là nguồn cung cấp thực phẩm chủ yếu cho nước này Gần đây, nuôi cá tra ở Indonesia đã phát triển nhanh chóng nhờ vào khả năng cung cấp giống của Trung tâm phát triển nuôi nước ngọt Jambi và sự hợp tác kỹ thuật với JICA (Nhật) Cá tra được nuôi nhiều ở các đảo Java

và Sumatra vì đặc tính dễ nuôi và khả năng chống chịu bệnh [50]

1.1.2 Việt Nam

Nghề nuôi cá da trơn thương phẩm, đặc biệt là cá tra tại Việt Nam thật sự bắt đầu phát triển mạnh vào đầu năm 2000 tại các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long: An Giang, Đồng Tháp, Cần Thơ, Bến Tre khi kỹ thuật sản xuất giống nhân tạo cá tra thành công và có thể sản xuất ở quy mô lớn tại các vùng nuôi [35] Nuôi cá tra thương phẩm ở đồng bằng sông Cửu Long được coi là một thành công của nuôi trồng thủy sản Việt Nam Theo thống kê của Tổng cục Thủy sản, Bộ NN&PTNT, sản lượng và doanh thu xuất khẩu từ cá tra khoảng 1,2 triệu tấn, đạt 1,0 tỷ USD trong năm 2007; 1,48 tỷ USD vào năm 2008 và 1,5 tỷ USD vào năm 2010 [16] Nó đã tạo ra một ngành chế biến cung cấp 150.000 việc làm, chủ yếu là cho phụ nữ nông thôn, và nhiều hơn nữa trong các lĩnh vực dịch vụ khác liên quan Năng suất trung bình đạt 400-600 tấn/vụ, và

có lẽ là cao nhất không chỉ trong nuôi trồng thủy sản mà còn trong bất kỳ lĩnh vực sản xuất chính nào [35]

Hình 1.1 Diện tích (ha) nuôi cá tra các tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long 2008-2010

(nguồn: Tổng cục thủy sản, Bộ NN&PTNT, 2011) [16]

Hình 1.2 Sản lượng nuôi (nghìn tấn) cá tra các tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long

2008-2010 (nguồn: Tổng cục thủy sản, Bộ NN&PTNT, 2011) [16]

An GiangĐồng ThápVĩnh Long Hậu GiangCần Thơ

1.2 Những nghiên cứu về bệnh gan thận mủ cá tra nuôi trên Thế giới và Việt Nam

1.2.1 Thế giới

Năm 2002, Indonesia đã xảy ra dịch bệnh trên cá tra nuôi và gây chết cá hàng loạt ở các trại nuôi, tỉ lệ cá chết lên đến 50-100% Nhóm nghiên cứu của Yuasa và cộng sự cũng lần đầu tiên phát hiện cá tra nuôi trong ao ở Sumatra có dấu hiệu bệnh lý

tương tự như bệnh xuất huyết nội tạng và xác định tác nhân gây bệnh là E ictaluri

[50] Ngoài ra, Kasornchandra (1987), Thune và cộng sự (1997) cũng đã phát hiện vi

khuẩn E ictaluri không những gây bệnh trên cá nheo Mỹ mà còn gây bệnh trên cá trê trắng (Clarias batrachus) ở Thái Lan và trên một số loài cá da trơn khác ở Indonesia

và Trung Quốc [3, 43]

Tại Hoa Kỳ, căn bệnh nghiêm trọng nhất, gây thiệt hại đến ngành công nghiệp nuôi cá nheo (catfish) là bệnh xuất huyết nội tạng (ESC-Enteric Septicemia of Catfish) [32] Edwardsiella ictaluri, trực khuẩn gram âm, là nguyên nhân gây bệnh xuất huyết

nội tạng trên cá nheo Ictalurus punctatus tại Hoa Kỳ [43] Vi khuẩn này lần đầu tiên được phân lập và định danh bởi Hawke vào năm 1976 sau khi được thu nhận từ các trang trại nuôi cá nheo ở Georgia và Alabama [25] Từ đó, vi khuẩn E ictaluri luôn

được xem là tác nhân gây bệnh với tỷ lệ chết cao (trên 60%) và thiệt hại hàng năm trên

50 triệu USD cho ngành nuôi cá nheo công nghiệp ở Mỹ [32]

ở Việt Nam Tỉ lệ thất thoát do bệnh ở vi khuẩn có thể lên đến 50% so với các bệnh khác [34]

Trong các bệnh do vi khuẩn gây ra trên cá tra, bệnh gan thận mủ gây thiệt hại nặng nề nhất, tiếp đến là bệnh xuất huyết Theo Từ Thanh Dung và cộng sự (2004), ở vùng đồng bằng sông Cửu Long, bệnh gan thận mủ ảnh hưởng đến nghề nuôi cá tra thâm canh ở các tỉnh/thành phố như: An Giang, Đồng Tháp và Cần Thơ, sau đó bệnh lây lan sang các vùng lân cận và hiện tại bệnh cũng xuất hiện ở một số tỉnh mới phát triển nuôi cá tra như: Trà Vinh, Bến Tre và Sóc Trăng [3] Bệnh này xuất hiện hầu như

ở mọi kích cỡ cá, tuy nhiên tỉ lệ hao hụt lớn và gây thiệt hại chủ yếu ở cá nuôi cỡ 3 tháng tuổi, có khối lượng từ 300-500 g/con [3, 7] Bệnh thường xảy ra vào thời điểm giao mùa, nhưng tập trung vào mùa mưa từ tháng 7-11 [7] Sự bùng phát của dịch bệnh chủ yếu gây ra bởi các yếu tố stress và có tính thời vụ Các nghiên cứu đã cho thấy, các yếu tố gây suy thoái môi trường, chất thải từ hoạt động nông nghiệp, chăm sóc không đúng cách, mật độ thả cao, và chất lượng con giống thả kém làm cho cá dễ

bị nhiễm bệnh [34]

1.3 Những nghiên cứu về đặc điểm sinh học, khả năng gây bệnh trên cá tra của vi

khuẩn E ictaluri

1.3.1 Đặc điểm sinh học vi khuẩn E ictaluri

Trong hệ thống phân loại của Bergey, vi khuẩn Edwardsiella ictaluri thuộc

giống Edwardsiella, họ Enterobacteriaceae, bộ Enterobacteriales, lớp

Gammaproteobacteria, ngành Proteobacteria Giống Edwardsiella có các đặc điểm

là: vi khuẩn dạng hình que thẳng, nhỏ, kích thước 1μm x 2-3 μm, gram âm, có khả năng di động bằng vành lông rung (peritrichous flagella) ở nhiệt độ 25oC, không di động ở 37oC, yếm khí tùy tiện Có khả năng sử dụng D-glucose và một số đường khác kết quả sinh ra acid và thường sinh hơi Oxidase âm tính, catalase dương tính, Voges-proskauer và simmon citrate âm tính, LDC dương tính, ODC dương tính, khử Nitrate Tất cả các loài thuộc giống này đều có khả năng lên men đường maltose và D-mannose Các loài trong giống vi khuẩn này là nguyên nhân gây bệnh ở cá da trơn và một số động vật khác, hiếm khi là tác nhân gây bệnh cơ hội cho người [28]

Loài vi khuẩn Edwardsiella ictaluri là vi khuẩn hình que, gram âm, kích thước

khoảng 0,75 x 2,5 µm ở 26oC [25], hay kéo dài 5-7 µm khi ở 37oC [37] hoặc có thể biến thiên 1,2-15 µm [50] Vi khuẩn có khả năng chuyển động bằng tiêm mao, di động yếu ở 25-30oC nhưng không di động ở nhiệt độ cao hơn, không chịu được độ muối cao hơn 1,5% [38] Edwardsiella ictaluri là một trong những loài khó tính nhất trong số

các loài thuộc giống Edwardsiella Chúng sinh trưởng yếm khí tùy tiện ở khoảng nhiệt

độ tối ưu 22 -28oC và phát triển chậm trên môi trường BHIA Sau 48 giờ nuôi cấy ở

28oC, vi khuẩn tạo nên khuẩn lạc hình tròn, bóng có kích thước khoảng 2 mm [54] E ictaluri thường được phân lập từ môi trường nuôi, từ nội quan hoặc mô não cá bị bệnh

Trong môi trường nước, vi khuẩn E ictaluri có thể tồn tại khoảng 9 ngày [36]

Vi khuẩn E ictaluri phân lập từ cá tra nhiễm bệnh gan thận mủ ở Đồng bằng

sông Cửu Long Việt Nam được xác định là kháng lại với một số loại thuốc kháng sinh thông thường và rất có hiệu quả trong việc kiểm soát bệnh xuất huyết nội tạng (ESC) trên cá nheo Mỹ như: Oxytetracylin, Oxolinic acid, Sulphonamid [3, 7, 23]; Bactrime, Colistin, Amoxicilin, Tetracyclin, Doxycyclin [5]

Vi khuẩn E ictaluri có đặc tính sinh miễn dịch rất mạnh, tiêu biểu là kết quả của

Thune và cộng sự (1997), Vinitnantharat và Plumb (1993) đã phát hiện sự tương quan

ở nồng độ pha loãng huyết thanh 1/2048 và 1/256 [43, 46] Do đó, hiện nay các nghiên cứu đang phát triển vaccine nhược độc không chỉ kích thích sinh miễn dịch dịch thể

mà còn kích hoạt sinh miễn dịch trung gian tế bào Các vaccine như vậy đã và đang

được phát triển ở Mỹ nhờ vào công nghệ gây đột biến gen loại bỏ gen aroA hoặc purA hoặc cả 2 của vi khuẩn E ictaluri Chủng E ictaluri đột biến không có khả năng hoàn

nguyên độc lực do không có khả năng lấy lại gen đã bị loại bỏ Các loại vaccine từ các

chủng đột biến không những được sử dụng để phòng bệnh vi khuẩn E.ictaluri mà còn

được sử dụng làm đường truyền kháng nguyên cho các tác nhân khác gây bệnh ở cá kể

cả tôm [43]

Vi khuẩn E ictaluri có thể xâm nhiễm vào cá tra theo hai con đường chủ yếu:

từ môi trường nước qua da hoặc mang cá và qua miệng theo đường thức ăn gây bệnh gan thận mủ Vi khuẩn có thể xâm nhập vào cơ quan khứu giác, sau đó lên não gây

viêm não Ngoài ra, vi khuẩn E ictaluri còn có thể xâm nhiễm từ đường tiêu hóa qua

niêm mạc ruột vào máu và gây hiện tượng nhiễm trùng máu Nghiên cứu của Baldwin

và Newton (1993)cho thấy vi khuẩn có thể vượt qua lớp màng nhầy ruột sau khi gây nhiễm 15 phút, xuất hiện trong không bào của phagocyte sau 24 giờ và trong các không bào đã thoái hóa sau 72 giờ Trong vòng 2 tuần sau khi nhiễm bệnh, vi khuẩn gây viêm ruột, viêm gan và viêm cầu thận Các cơ quan nội tạng bị hoại tử hoặc xuất hiện đốm trắng, trong ruột chứa đầy dịch máu [17]

1.3.2 Những nghiên cứu về khả năng gây bệnh trên cá tra nuôi của vi khuẩn E ictaluri

Vi khuẩn E ictaluri lần đầu tiên được xác định là tác nhân gây bệnh gan thận mủ

trên cá tra ở đồng bằng sông Cửu Long bởi Crumlish và cộng sự năm 2002 [23] Các kết quả nghiên cứu của Từ Thanh Dung (2004), Trần Thị Minh Tâm (2003), Nguyễn

Hữu Thịnh và cộng sự (2007), Lý Thị Thanh Loan (2007) trên cá tra bị bệnh gan thận

mủ cho thấy một phức hợp gồm nhiều tác nhân gây bệnh gồm: Edwardsiella ictaluri,

E tarda, Aeromonas sp., Pseudomonas, Hafnia alvei, Plesiomonas shigelloides, Vibrio, Klebsiella, Bacillus, Entercoccus, Enterobacter, Clostridinium spp [3, 6, 11, 13] Tuy nhiên, có hai nghiên cứu đáng chú ý nhất đó là: Kết luận của đề tài “Nghiên cứu bệnh đốm trắng trên cá tra nuôi công nghiệp” của Trần Thị Minh Tâm (2003) đã phỏng đoán tác nhân gây bệnh đốm trắng tức bệnh gan thận mủ trên cá tra là do vi

khuẩn Hafnia alvei và Plesiomonas shigelloides dựa trên tần suất bắt gặp cao nhất (73,1% cho Hafnia alvei và 31,9% cho Plesiomonas shigelloides), kết quả cảm nhiễm

để thử độc lực và phản ứng vi ngưng kết với kháng nguyên toàn phần [11] Tuy nhiên, thông tin gần đây lại cho thấy, sau khi kiểm chứng lại bằng kỹ thuật PCR thì vi khuẩn

Hafnia alvei chính là vi khuẩn E ictaluri [51] Nghiên cứu thứ 2 đó là sản phẩm hợp tác của trường Đại Học Stirling (Anh) với Trường Đại học Cần Thơ kết luận: tác nhân

gây bệnh gan thận mủ trên cá tra là do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri [23] Sau đó, Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản II phối hợp với Công ty thuốc thú y trung ương II (NAVETCO) tiến hành điều tra thu mẫu cá tra bệnh tại các vùng địa lý khác nhau ở

các ổ dịch và xác định chính vi khuẩn Edwardsiella ictaluri là tác nhân gây bệnh gan

thận mủ nhờ vào kết quả phân lập định danh vi khuẩn, kiểm tra sinh hóa và kiểm chứng bằng kỹ thuật PCR [12, 41]

Cho đến nay, các nghiên cứu về tác nhân gây bệnh gan thận mủ trên cá tra nuôi ở đồng bằng sông Cửu Long Việt Nam như: Crumlish (Đại học Stirling-Anh); nghiên cứu của nhóm Công ty Bayer Việt Nam; nghiên cứu của nhóm công ty Pharma Na uy; nghiên cứu của Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản II kết hợp với NAVETCO; nghiên cứu của Đặng Thị Hoàng Oanh và Nguyễn Thanh Phương (Đại học Cần Thơ) năm 2009; nghiên cứu của Đồng Thanh Hà và Đỗ Thị Hòa (Đại học Nha Trang) năm

2009 đã cùng đi đến kết luận mới nhất tại hội thảo bàn về tác nhân gây bệnh gan thận

mủ trên cá tra do Bộ NN&PTNT tổ chức tại Tp Hồ Chí Minh vào ngày 11/8/2009: Vi

khuẩn E ictaluri là một tác nhân thực sự gây bệnh gan thận mủ trên cá tra nuôi tại

Việt Nam Thêm vào đó, nhóm nghiên cứu của Crumlish (Đại học Stirling-Anh)

khẳng định rằng chủng vi khuẩn E ictaluri ở Hoa Kỳ và chủng vi khuẩn E ictaluri ở

Việt Nam có một số sai khác đáng kể [23]

Cá tra bệnh gan thận mủ do vi khuẩn E ictaluri có thể có hoặc không xuất hiện

dấu hiệu bất thường ở bên ngoài Đa số thể hiện dấu hiệu xuất huyết nhẹ ở các gốc vây, xung quanh miệng và vùng bụng, hoặc kèm theo dấu hiệu trắng mang (mang nhợt nhạt, tiết nhiều nhớt) Giải phẫu nội tạng cho thấy 100% cá bệnh đều tồn tại của các đốm trắng có đường kính 0,5-3,0 mm ở các tổ chức nội tạng như gan, thận, lá lách Các đốm trắng thường xuất hiện trước tiên ở thận, làm thận sưng to gấp 2-3 lần bình thường và mềm nhũn, khi bệnh nặng mới có thể quan sát thấy ở tỳ tạng và gan, các đốm trắng ở gan thường thưa và nhỏ hơn ở thận [4]

Bệnh do vi khuẩn E ictaluri gây ra trên cá tra ở đồng bằng sông Cửu Long xuất

hiện hàng năm và theo mùa vụ, thường vào tháng 8-11 trong đó đỉnh cao nhất vào tháng 9 [7] Vi khuẩn E ictaluri gây bệnh cho cá tra ở mọi lứa tuổi, thường gặp nhất

và gây chết nhiều nhất ở cá tra dưới 3 tháng tuổi [7] Việc phòng và trị bệnh do vi

khuẩn E ictaluri cho cá tra hiện nay ở Việt Nam vẫn hoàn toàn dựa vào kháng sinh và

hóa chất [7, 10] Phần lớn khi có bệnh xảy ra trên cá tra, người nuôi sử dụng nhiều loại kháng sinh kết hợp nhằm điều trị có hiệu quả cho tất cả các bệnh nhiễm khuẩn nói chung Việc sử dụng thuốc như vậy dẫn đến tình trạng kháng thuốc của vi khuẩn ngày một gia tăng, đồng thời gây ảnh hưởng lớn đến chất lượng thực phẩm và gây ô nhiễm môi trường [7] Do vậy, phòng bệnh gan thận mủ cá tra bằng vaccine là vấn đề được đặt ra cho công nghiệp nuôi cá tra hiện nay

1.4 Những công nghệ đột biến gen được ứng dụng để tạo chủng vi khuẩn E

ictaluri bị đột biến dùng làm nguyên liệu sản xuất vaccine phòng bệnh hiện nay

trên Thế giới và Việt Nam

1.4.1 Thế giới

Trong sản xuất vaccine thủy sản, nghiên cứu tạo chủng vi khuẩn E ictaluri đột

biến dùng làm vaccine đã được thực hiện với những phương pháp gây đột biến khác nhau: Đột biến mất đoạn gen, đột biến chuyển vị (đột biến nhảy), đột biến làm mất biểu hiện của các gen liên quan đến quá trình sinh trưởng, các gen quy định tính dộc của vi khuẩn

1.4.1.1 Đột biến làm hỏng gen (knock out gen)

Lawrence và cộng sự (1997) lần đầu tiên đã tạo thành công chủng vi khuẩn E

ictaluri đột biến hỏng gen purA, mất khả năng tổng hợp adenine, dùng làm nguyên liệu

sản xuất vaccine nhược độc [30] Đoạn gen purA, mã hóa cho enzyme tổng hợp

adenine, bị gây đột biến mất đoạn 598 bp và thay bằng gen kháng kanamycin Khi loại

bỏ gen purA, gen mã hóa cho enzyme adenylosuccinate synthase là enzyme đầu tiên

xúc tác cho quá trình tổng hợp AMP- tham gia vào quá trình tổng hợp purin ribonucleotide [53] Do vậy, nếu đột biến gen purA thì enzyme adenylosuccinate synthase không được tạo thành và quá trình chuyển hóa inosine monophosphate (IMP) thành adenylosuccinate sẽ không xảy ra, dẫn đến ATP không được hình thành để cung cấp năng lượng cho quá trình chuyển hóa từ XMP thành GMP), tạo ra GTP tham gia quá trình tổng hợp DNA và RNA (Hình 1.3) [1] Từ đó làm ảnh hưởng trực tiếp đến

khả năng sinh trưởng vi khuẩn E ictaluri, gây ảnh hưởng gián tiếp đến độc lực của

chủng vi khuẩn này

Hình 1.3 Con đường tổng hợp adenylosuccinate synthetase từ gen purA

(trích bởi Nguyễn Quốc Bình, 2010) [1]

Chủng vi khuẩn E ictaluri bị đột biến gen purA (LSU-E2) không gây chết cá

nheo Mỹ khi tiến hành gây bệnh thực nghiệm bằng phương pháp cho ăn hay ngâm nhưng gây chết khoảng 50% khi sử dụng phương pháp tiêm với liều khoảng 107-108cfu/cá (gây chết 46,7% cá thí nghiệm ở liều tiêm 107 cfu/cá và 53,3% ở liều tiêm 108cfu/cá) Điều này có thể do các gen quy định độc tính của chủng vi khuẩn LSU-E2 vẫn nguyên vẹn [30] Wise và cộng sự (2000) đã sử dụng chủng vi khuẩn E ictaluri bị đột

biến gen purA ở nồng độ 3,65 x 107 CFU/ml cấp theo đường ngâm chỉ một lần cho cá nheo Mỹ nhỏ sạch bệnh Kết quả cho thấy tỷ lệ sống của cá đạt 66,3% [48]

Phương pháp tạo đột biến làm hỏng gen sau đó cũng được Thune và cộng sự (1999) thực hiện để tạo ra chủng E ictaluri đột biến gen aroA, gen mã hóa enzyme cần thiết cho quá trình tổng hợp các acid amin mạch vòng [44] Các vi khuẩn khi bị

mất gen aroA sẽ không tạo được chorismate Chorismate là tiền chất đưa vào con

đường cuối để tổng hợp folate, menaquinone, ubiquinone và ca-techlate siderophores, sản xuất các acid amin mạch vòng Do vậy, vi khuẩn bị đột biến gen aroA cần được cung cấp chorismate hoặc các chất chuyển hóa trung gian như 3-Dihydroxybenzoic (DHB) acid, p-aminoben-OIC acid (PABA) và p-hydroxybenzoic (HB) acid để sản xuất các sản phẩm thiết yếu nêu trên Vì chorismate, DHB, PABA, HB không hoặc chỉ tồn tại ở nồng độ thấp trong các mô động vật có xương sống, nên các chủng vi khuẩn

E ictaluri đột biến vẫn giữ nguyên độc lực cần thiết để xâm nhập và gây nhiễm bệnh

nhưng bị hạn chế khả năng sinh sản trong vật chủ

Khi sử dụng chủng vi khuẩn E ictaluri đột biến gen aroA làm vaccine bằng

phương pháp ngâm cho cá da trơn ở các nồng độ 107 và 108cfu/ml, sau đó 4 tuần cá tiếp tục được ngâm tăng cường với chủng đột biến ở các nồng độ tương tự một lần

nữa Bốn tuần sau cá tiếp tục được ngâm với chủng E ictaluri hoang dại (gây bệnh)

với nồng độ 107 cfu/ml Kết quả nghiên cứu cho thấy, tỷ lệ sống của cá đạt 54,1-63,8% khi ngâm một lần và 77,3-94,4% khi được ngâm 2 lần với cùng chủng đột biến [44]

1.4.1.2 Đột biến chuyển vị (Transpositional mutagenesis)

Cooper và cộng sự (1996) đã áp dụng phương pháp đột biến chuyển vị tạo

chủng vi khuẩn E ictaluri đột biến gen mã hóa enzyme chondroitinase (Ch), làm vi

khuẩn mất khả năng tổng hợp enzyme chondroitinase [22] Enzyme chondroitinase là enzyme có nguồn gốc vi sinh, có mặt phổ biến trên 253 loài vi sinh theo khóa phân

loại Bergey’s (1994), gồm 7 giống Aeromonas, Vibrio, Flavobacterium, Beneckea,

Proteus, Micrococcus và Arthrobacter Enzyme chondroitinase phân giải chuỗi

polymer chondroitin sulphate, dermatan sulphate và hyaluronic acid trong màng tế

bào, trong chất cơ bản ngoại bào Qua nguồn nước, vi khuẩn E ictaluri có thể xâm

nhập vào cơ quan khứu giác, có thể di chuyển vào bên trong dây thần kinh khứu giác

và sau đó lên não cá nheo Mỹ Enzyme chondroitinase phân giải chondroitin thành phần mô liên kết và sụn vì thế có thể là nguyên nhân gây nên tổn thương ở đầu

sulphate-cá nheo Mỹ khi bị bệnh xuất huyết nội tạng [47]

Khi sử dụng chủng vi khuẩn E ictaluri đột biến gen mã hóa enzyme chondroitinase (Ch) tiêm cho cá da trơn ở nồng độ 108cfu/cá để kiểm tra độc lực của chủng đột biến, Cooper và cộng sự nhận thấy, sau 2 tuần theo dõi, cá không có dấu

hiệu bệnh lý đặc trưng của bệnh nhiễm trùng do E ictaluri gây ra Sau đó tác giả tiếp tục tiêm E ictaluri hoang dại (gây bệnh) cho cá, cá cũng không có dấu hiệu bệnh

nhiễm trùng đặc trưng trong khi cá đối chứng chưa được tiêm chủng đột biến từ trước

bị chết toàn bộ Vậy tỷ lệ bảo vệ của chủng đột biến là 100% [22]

Lawrence và cộng sự (2001) cũng sử dụng phương pháp đột biến chuyển vị để

tạo và phân lập chủng E ictaluri đột biến kháng nguyên O Khi tiến hành gây bệnh

thực nghiệm trên cá nheo Mỹ cho thấy các chủng đột biến trên đều có độc lực yếu hơn

so với chủng vi khuẩn gốc [31]

Thune và cộng sự (2007) bằng phương pháp tạo đột biến gắn trình tự đặc trưng (STM – Signature-Tagged Mutagenesis) đã xác định được rất nhiều gen gây độc trên

E ictaluri, trong đó có gen liên quan đến hệ thống bài tiết dạng III, tương tự như gen

gây độc của Salmonella enterica [45] Phương pháp STM sử dụng hệ thống tạo đột biến gen nhảy (transposon mutagenesis) trong đó mỗi đột biến gen nhảy được gắn với một trình tự DNA đặc trưng nhằm chọn lọc được các đột biến mất tính độc dựa theo phương pháp chọn lọc âm tính [27] Phương pháp này cho phép xác định kiểu hình của một lượng lớn các đột biến cùng lúc, trong khi đó trước đây, việc xác định kiểu hình chỉ tiến hành trên từng đột biến Bên cạnh phương pháp STM, kỹ thuật IVET (in vivo expression technique) dựa vào phương pháp chọn lọc dương tính cũng được dùng để xác định gen quy định độc tính của vi khuẩn gây bệnh Các gen gây độc xác định bởi IVET và STM trùng nhau rất ít, điều này cho thấy hai phương pháp này có tác dụng bổ sung cho nhau trong việc xác định các gen quy định độc tính của vi khuẩn [19] Gần đây, Karsi và cộng sự (2009) giới thiệu một phương pháp chọn lọc đột biến mới dựa trên hiện tượng phát sáng sinh học (BLMS-Bioluminescence-based mutant screening)

để xác định chủng E ictaluri mất tính độc, có khả năng dùng làm vaccine nhược độc

Phương pháp này cho phép kiểm tra số lượng lớn các đột biến trên đĩa 384 giếng bằng robot nhờ vào việc sử dụng luciferase của vi khuẩn, giảm công sức và thời gian cho quá trình chọn lọc đột biến, Tuy nhiên, phương pháp này chỉ áp dụng trong các phòng thí nghiệm với trang thiết bị hiện đại [29]

1.4.1.3 Đột biến làm mất biểu hiện của gen

Một trong những phương pháp tạo đột biến khác cũng đã được Datsenko và Wanner (2000), Yamamoto và cộng sự (2009) sử dụng là làm mất biểu hiện của gen xác định trên chromosome vi khuẩn [24, 49] Đây là phương pháp tạo đột biến khá đơn giản và hiệu quả, sử dụng hệ thống λ Red để bất hoạt gen đích thông qua sự tái tổ hợp tương đồng giữa vùng gen trên nhiễm sắc thể và đoạn DNA dạng thẳng mang gen kháng kháng sinh với hai bên là trình tự tương đồng với gen đích (cassette) Bằng phương pháp này các tác giả đã làm mất biểu hiện của 13 gen xác định trên bộ gen vi

khuẩn E coli và nhiều loài vi khuẩn Gram âm khác: Salmonella, Yersinia, Shigella,

Serratia, Klebsiella, Pseudomonas với độ dài trình tự tương đồng cần thiết để xảy ra

tái tổ hợp tương đồng là khác nhau ở các loài E coli chỉ cần trình tự tương đồng khoảng 50 nucleotide, Vibrio cholerae cần trình tự 100 nucleotide [24, 49]

1.4.2 Việt Nam

Nhiều nghiên cứu trong nước tạo vi khuẩn E ictaluri bất hoạt bằng nhiều

phương pháp khác nhau để dùng làm nguyên liệu sản xuất vaccine Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thuỷ sản II và công ty thuốc Thú Y Trung ương (Navetco) vào năm 2006

đã công bố kết quả tiêm vaccine bất hoạt vi khuẩn E ictaluri bằng formalin, tỉ lệ sống

của cá tra sau khi gây nhiễm nhân tạo lần lượt ở các liều 2 LD50, 20 LD50, và 80 LD50 là 97%, 93% và 71% [51]; Nguyễn Hữu Thịnh và cộng sự (2009) thử nghiệm vaccine bất

hoạt vi khuẩn E ictaluri bằng phương pháp ngâm kết hợp cho ăn 2 lần, kết quả cho tỷ

lệ bảo hộ đạt 52% [42]

Tuy nhiên, kể từ khi sử dụng vaccine phòng bệnh cho vật nuôi thủy sản năm

1987 [33], đến nay vẫn có ít những sản phẩm vaccine sống được tạo ra, đáp ứng nhu cầu của thị trường Việc ứng dụng công nghệ sinh học tạo các vi sinh vật đột biến dùng làm nguyên liệu sản xuất vaccine trong lĩnh vực thủy sản Việt Nam hiện nay chỉ

ở giai đoạn bắt đầu Trong đề án phát triển và ứng dụng công nghệ sinh học trong lĩnh vực thủy sản của chính phủ Việt Nam, năm 2010 đã triển khai thực hiện đề tài cấp Nhà

nước “Nghiên cứu tạo dòng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri nhược độc dùng làm vaccine phòng bệnh gan thận mủ cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) bằng kỹ thuật

gây đột biến gen” do Viện nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản III chủ trì Nhóm nghiên cứu phối hợp với Trung tâm Công nghệ sinh học thành phố Hồ Chí Minh đã tạo thành

công chủng vi khuẩn E.ictaluri bị đột biến gen purA, E ictaluri bị đột biến gen aroA

và E ictaluri bị đột biến gen mã hóa enzyme chondroitinase (Ch) Các chủng vi khuẩn

đột biến này được xác định là ổn định về mặt kiểu hình so với chủng vi khuẩn gốc ban đầu [8, 9]

1.5 Một số môi trường thường sử dụng trong nuôi cấy tăng sinh chủng vi khuẩn

E ictaluri hoang dại và chủng E ictaluri bị đột biến gen

Shotts và Waltman (1990) đã nghiên cứu và thử nghiệm các môi trường nuôi cấy

vi khuẩn E ictaluri bao gồm: Môi trường MAC, TSA, và EIM Kết quả cho thấy, EIM được xem là môi trường chọn lọc của vi khuẩn E ictaluri so với môi trường MAC và

TSA EIM có khả năng ức chế hầu hết sự phát triển của: Vi khuẩn gram âm ngoại trừ

Proteus sp., Serratia marcescens và một số chủng phân lập của Aeromonas hydrophila và Yersinia ruckeri; Vi khuẩn gram dương ngoại trừ cầu khuẩn đường ruột,

ức chế được các chủng Pseudomonas spp mà không ảnh hưởng đến sự phát triển của

E ictaluri Vi khuẩn E ictaluri phát triển trên EIM có thể dễ dàng phân biệt với các vi

khuẩn khác dựa trên hình thái khuẩn lạc Trên EIM, sau 48 giờ nuôi cấy, khuẩn lạc vi

khuẩn E ictaluri có đường kính 0,5-1,0 mm, màu xanh mờ [40]

Năm 1996, Collins và Thune đã xác định thành phần môi trường tối thiểu để vi

khuẩn E ictaluri có thể phát triển được (môi trường DMM) [20] Năm 1998, Hawke

đã sử dụng môi trường BHIA và TSA ở nhiệt độ 25-30oC để nuôi cấy chủng vi khuẩn

E ictaluri Tuy nhiên, sự phát triển của E ictaluri rất chậm và không thể xác định

được sau 24 giờ Sau 48 giờ nuôi cấy, các khuẩn lạc điển hình với số lượng lớn được hình thành [26]

Lawrence và cộng sự (1997), Nguyễn Quốc Bình và cộng sự (2010) cho rằng,

khi đột biến gen khuyết dưỡng (gen purA, aroA), chủng vi khuẩn bị đột biến cần được

bổ sung chất dinh dưỡng phù hợp thì mới có thể sống được [1, 30] Đối với chủng vi

khuẩn Edwardsiella ictaluri bị đột biến gen purA, chất dinh dưỡng cần bổ sung là

adenine Hàm lượng adenine cung cấp tùy thuộc vào môi trường nuôi cấy vi khuẩn: 25µg/mL adenine đối với môi trường DMM [30], 50 µg/mL adenine đối với môi trường BHIB [1] Ngoài ra, Nguyễn Trọng Bình và cộng sự (2011) còn sử dụng các

môi trường BHIB, LB, EIM để nuôi cấy tăng sinh chủng vi khuẩn E ictaluri sau khi

đột biến [2] Kết quả cho thấy, sau 48 giờ nuôi cấy ở nhiệt độ 28oC, vi khuẩn E

ictaluri bị đột biến gen purA, aroA, Ch và wzz đều có khả năng phát triển trên các môi

trường này [2]

Tóm lại, những nghiên cứu về môi trường nuôi cấy chủng vi khuẩn E ictaluri hoang dại (chưa đột biến) và chủng vi khuẩn E ictaluri bị đột biến gen cho thấy

chúng có sự tương đồng nhau Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu nào chỉ ra môi trường

nuôi cấy thích hợp cho chủng vi khuẩn E ictaluri bị đột biến gen, đặc biệt là vi khuẩn

E ictaluri bị đột biến gen purA Do vậy, việc tìm kiếm một môi trường phù hợp cho

sự sinh trưởng của chủng vi khuẩn E ictaluri bị đột biến gen purA là việc làm cần

thiết

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu nghiên cứu

+ Chủng Edwardsiella ictaluri hoang dại có độc lực cao gây bệnh gan thận mủ cá tra (E ictaluri WT) và chủng E ictaluri bị đột biến gen purA từ chủng WT (E ictaluri

PAM) được cung cấp bởi đề tài cấp Nhà nước, mã số 163/HĐ-BNN-KHCN

+ Cá tra Pangasianodon hypophthalmus có khối lượng trung bình 10g/con được

nuôi tại khu thực nghiệm Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản III từ nguồn cá của Trung tâm Quốc gia giống Thủy sản nước ngọt Nam Bộ

+ Môi trường phân lập, nuôi cấy tăng sinh và kiểm tra sinh hóa chủng vi khuẩn E

ictaluri:

- Phân lập chủng E ictaluri: Sử dụng môi trường nuôi cấy không chọn lọc BHIA

và môi trường nuôi cấy chọn lọc EIM agar theo Shotts và Waltman (1990) [40]

- Nuôi cấy tăng sinh chủng E ictaluri: Sử dụng môi trường BHIB, LB theo

Nguyễn Trọng Bình và cộng sự (2011) [2]

- Kiểm tra khả năng tổng hợp adenine của chủng E ictaluri bị đột biến gen purA:

sử dụng môi trường DMM theo Lawrence và cộng sự (1997) [30]

- Kiểm tra các chỉ tiêu sinh hóa: Sử dụng bộ test API 20E (Bio Merieux – Pháp); kết hợp một số phản ứng sinh lý, sinh hóa truyền thống: BHIA, KIA, Manitol, O/F, LDC, ODC

+ Hóa chất, thuốc kháng sinh: Adenine, Kanamycin, mannitol 0,35%, Colistin sulphate, thuốc nhuộm Gram (cồn, acetone, Fucsine, Crystian violet), Chlorin, KMnO4, NaCl

2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

2.2.1 Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 6/2010 đến tháng 09/2011

2.2.2 Địa điểm nghiên cứu: Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản III

2.3 Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu của đề tài: Được thể hiện qua sơ đồ hình 2.1

Hình 2.1 Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu của đề tài 2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phương pháp quan sát hình dạng, màu sắc khuẩn lạc; đo kích thước của vi

khuẩn; nghiên cứu đặc điểm sinh lý, sinh hóa chủng vi khuẩn E ictaluri

2.4.1.1 Quan sát hình dạng, màu sắc khuẩn lạc, đo kích thước vi khuẩn E ictaluri

+ Quan sát khuẩn lạc vi khuẩn: Vi khuẩn được nuôi cấy trên môi trường BHIA ở nhiệt độ 28oC, sau 48 giờ nuôi cấy, quan sát hình dạng, màu sắc khuẩn lạc bằng mắt thường và đo kích thước khuẩn lạc bằng thước đo có độ chính xác đến mm

+ Hình dạng, kích thước vi khuẩn E ictaluri: Được xác định bằng phương pháp

nhuộm Gram (Barrow, Feltham, 1993) [18], soi và đo kích thước vi khuẩn trên kính hiển vi (Olympus CX 31, Nhật) có gắn trắc vi thị kính, quan sát ở độ phóng đại 1000 lần

2.4.1.2 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh lý, sinh hóa chủng E ictaluri

hypophthalmus) và thử nghiệm môi trường nuôi cấy chủng vi khuẩn Edwardsiella

ictaluri đột biến gen purA trong điều kiện thí nghiệm

bị đột biến gen purA ở các

môi trường khác nhau

Khả năng gây bệnh gan thận mủ trên cá tra của

Khả năng gây bệnh của chủng

E ictaluri

hoang dại

Khả năng gây bệnh của chủng

E ictaluri đột biến gen purA

Sinh lý,

sinh hóa

Môi trường BHIB

Môi trường

LB

Môi trường DMM

Tiêm lại chủng đột biến phân lập

từ cá nhiễm bệnh nhân tạo

+ Kiểm tra các đặc điểm sinh lý, sinh hóa: Sử dụng bộ dụng cụ API 20E (Bio Merieux - Pháp) kết hợp một số phản ứng sinh lý, sinh hóa truyền thống (KIA-Kligler Iron Agar, Mannitol, di động, oxidase, catalase, khả năng chịu mặn ở 0; 5; 10; 15; 20; 25; 30 ‰) Tính di động của vi khuẩn được quan sát bằng cách nhỏ một giọt nước lên lam kính, trải đều trên lam kính một ít vi khuẩn, đậy bằng lamen và quan sát bằng kính hiển vi ở độ phóng đại 1000 lần

+ Kiểm tra khả năng tổng hợp adenine của chủng vi khuẩn E ictaluri PAM bằng

cách nuôi cấy chủng vi khuẩn này trên môi trường DMM (Defined Minimal Medium) của Collins và Thune (1996) [20] không bổ sung adenine (E ictaluri PAM) và có bổ sung 50 µg adenine/ml môi trường (E ictaluri PAM+Ad.0,05) Theo dõi và xác định mật độ vi khuẩn bằng máy so màu quang phổ (Spectro 2000, Labomed, Inc.) ở bước sóng 600nm tại các thời điểm 12, 24, 36, 48 và 60 giờ nuôi cấy ở 28oC

+ Định danh vi khuẩn dựa vào hệ thống phân loại của Bergey’s (1994) [28]

2.4.1.3 Thiết lập đường cong sinh trưởng vi khuẩn E.ictaluri đột biến gen purA ở điều kiện thí nghiệm

* Sử dụng môi trường nuôi cấy đặc thù vi khuẩn E ictaluri EIM agar của Shotts

và Waltman (1990) [40] Thành phần môi trường EIM được thể hiện ở phụ lục 1

* Đun tan hỗn hợp EIM, làm nguội đến 50oC, chỉnh pH 7,0 Hấp vô trùng ở

121oC, 15 phút, 1atm Làm nguội môi trường đến 50oC, bổ sung thêm 20ml mannitol 0,35% và Colistin sulphate 10µg/ml lọc qua màng lọc vô trùng

* Thiết lập đường sinh trưởng vi khuẩn E ictaluri:

+ Chủng vi khuẩn E ictaluri hoang dại WT (E ictaluri WT) và chủng đột biến gen purA (E ictaluri PAM) giữ đông ở -80oC được đem nuôi cấy trên môi trường EIM

có bổ sung adenine 50µg/ml và Kanamycin 50µg/ml, ủ ở 28oC trong 48 giờ

+ Chọn khuẩn lạc đơn (có màu xanh lá, trong mờ) trên đĩa EIM có bổ sung adenine 50µg/ml và Kanamycin 50µg/ml, tăng sinh trong môi trường BHIB, nuôi lắc

2.4.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm đánh giá khả năng gây bệnh gan thận mủ trên

cá tra của vi khuẩn E ictaluri đột biến gen purA

Thí nghiệm tiến hành trên hệ thống bể 100L, sục khí 24/24 giờ Hệ thống thí nghiệm được tẩy trùng bằng chlorin 30 ppm trước khi tiến hành và khi kết thúc; nước trong bể sau thí nghiệm có vi khuẩn gây bệnh được xử lý với thuốc tím (KMnO4) 50 ppm 1 ngày trước khi thải ra nguồn nước thải chung Cá tra giống có khối lượng từ 10–12 g/con khỏe mạnh được nuôi lớn và ổn định tại Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản III trước khi đưa vào thí nghiệm Cá được bố trí ngẫu nhiên 30 cá/bể với 3 lần lặp lại theo không gian Trước khi gây cảm nhiễm, chọn ngẫu nhiên 3 cá để kiểm tra ký sinh trùng và sự hiện diện của vi khuẩn

Bảng 2.1 Bố trí thí nghiệm đánh giá khả năng gây bệnh gan thân mủ trên cá tra của vi

khuẩn E ictaluri đột biến gen purA

Nghiệm thức Liều tiêm (cfu/ml) Số lượng cá Tổng

ictaluri PAM (chủng đột biến gen purA) vào khoang bụng của cá thí nghiệm với liều

tiêm 0,1 mL/cá ở các nồng độ 106(PAM.6), 107(PAM.7), 108(PAM.8), 109(PAM.9),

1010(PAM.10)cfu/ml và tiêm lô đối chứng dương với chủng vi khuẩn E ictaluri WT

(chủng hoang dại) ở các nồng độ: 104(WT.4), 105(WT.5), 106(WT.6), 107(WT.7),

108(WT.8), 109(WT.9) cfu/ml Lô đối chứng âm (ĐC) tiêm 0,1ml/con nước muối sinh

lí (0,9% NaCl) Thí nghiệm được theo dõi trong 2 tuần

Theo dõi và ghi nhận biểu hiện của cá trong suốt quá trình thí nghiệm: xác định thời gian cá bắt đầu xuất hiện dấu hiệu bệnh do vi khuẩn gây ra; thời gian cá chết; mổ khám nghiệm để đánh giá mức độ bệnh lý của cá; thu mẫu cắt lát mô gan, thận và lách

cá theo Coolidge và Howard (1979) [21] để đánh giá mức độ của bệnh trên tế bào mô,

từ đó so sánh với lô đối chứng để đánh giá độc lực của chủng vi khuẩn đột biến, đồng thời tái phân lập và định danh lại vi khuẩn từ gan, thận và lách cá yếu để khẳng định

sự hiện diện của vi khuẩn E ictaluri.

2.4.3 Phương pháp tiêm khẳng định lại khả năng gây bệnh gan thận mủ cá tra của chủng E ictaluri đột biến gen purA phân lập từ mẫu cá tra cảm nhiễm nhân tạo trên môi trường EIM agar có bổ sung adenine

Chọn ngẫu nhiên cá tra được tiêm chủng E ictaluri đột biến gen purA, mổ thu

gan, cấy trên môi trường BHIA có bổ sung adenine 50µg/ml và kanamycin 50µg/ml, ủ

ở 28oC trong 48 giờ Sau đó, chọn những khuẩn lạc riêng lẻ cấy chuyền sang môi

trường đặc thù cho vi khuẩn E ictaluri (EIM agar) có bổ sung adenine 50µg/ml và

kanamycin 50µg/ml

* Định danh lại vi khuẩn E ictaluri đột biến gen purA

+ Theo dõi thời gian mọc, quan sát hình dạng, màu sắc khuẩn lạc trên môi trường BHIA bằng mắt thường, đo kích thước khuẩn lạc bằng thước đo có độ chính xác đến

mm; hình dạng và kích thước vi khuẩn E ictaluri bằng nhuộm Gram (Barrow, Feltham, 1993) [18], soi trên kính hiển vi (Olympus CX 31, Nhật) ở độ phóng đại

1000 lần; so sánh với chủng E ictaluri đột biến gen purA gốc ban đầu

+ Định danh lại vi khuẩn E ictaluri dựa vào hệ thống phân loại của Bergey’s (1994) [28], thông qua việc kiểm tra các đặc điểm sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn

+ Kiểm tra khả năng phát triển của chủng vi khuẩn phân lập và định danh được trên môi trường DMM có và không có bổ sung adenine thông qua việc so màu quang phổ trên máy Spectro 2000, Labomed, Inc ở bước sóng 600nm (OD)

* Tiêm khẳng định lại khả năng gây bệnh gan thận mủ cá tra của chủng E

ictaluri đột biến gen purA

+ Thí nghiệm được tiến hành trên hệ thống bể 100L, tương tự như mục 2.4.2

Chủng vi khuẩn E ictaluri đột biến gen purA thu được ở trên được tiêm vào xoang

bụng của cá tra khỏe với liều tiêm 0,1 ml/cá ở các nồng độ 107(PAM.7), 108(PAM.8),

109(PAM.9) và 1010(PAM.10) cfu/ml Lô đối chứng (ĐC) tiêm 0,1ml/con nước muối sinh lí (0,9% NaCl) Thí nghiệm bố trí 30 cá tra/bể và được theo dõi trong 2 tuần Thí nghiệm được lặp lại 2 lần Theo dõi và ghi nhận biểu hiện của cá trong suốt quá trình thí nghiệm tương tự như mục 2.4.2

+ Sơ đồ bố trí thí nghiệm: Được thể hiện ở hình 2.2

Hình 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tiêm khẳng định lại khả năng gây bệnh gan thận

mủ cá tra của chủng E ictaluri đột biến gen purA

2.4.4 Phương pháp xác định môi trường nuôi cấy vi khuẩn E ictaluri đột biến gen purA trong điều kiện thí nghiệm

Dựa trên những nghiên cứu của Hawke (1979), Shotts và Waltman (1990), Collins và Thune (1996), Nguyễn Quốc Bình (2010), Nguyễn Trọng Bình và cs (2011)

đã sử dụng một số môi trường BHIB, TSA, EIM, MAC, DMM và LB để nuôi cấy

chủng vi khuẩn E Ictaluri [1, 2, 20, 25, 40] Thí nghiệm nuôi cấy chủng vi khuẩn E ictaluri hoang dại chưa đột biến (E ictaluri WT) và chủng đột biến gen purA (E ictaluri PAM) được tiến hành trên các môi trường sau:

Cá tra đã bị nhiễm bệnh nhân

tạo do tiêm E ictaluri PAM

Nuôi cấy, phân lập và định danh

E ictaluri PAM

Kiểm tra khả năng tổng hợp

adenine của E ictaluri PAM

Nuôi cấy tăng sinh vi khuẩn

107 cfu/ml

PAM.8

Tiêm 0,1ml/cá dịch vi khuẩn

108 cfu/ml

PAM.9

Tiêm 0,1ml/cá dịch vi khuẩn

109 cfu/ml

PAM.10

Tiêm 0,1ml/cá dịch vi khuẩn

1010 cfu/ml

+ Môi trường 1: BHIB (Brain Heart Infusion Broth)- Biorad (Mỹ), với thành phần dinh dưỡng được thể hiện ở phụ lục 2

+ Môi trường 2: LB (Luria Bertami), với thành phần dinh dưỡng được thể hiện

Bố trí thí nghiệm: Tất cả 3 môi trường BHIB, LB và DMM được sử dụng nuôi

cấy chủng vi khuẩn E ictaluri PAM trong điều kiện không và có adenine ở các mức

khác nhau Cụ thể, nồng độ adenine bổ sung vào môi trường: 0, 25, 50, 75, 100 µg/ml Nuôi cấy ở 28oC Sơ đồ bố trí thí nghiệm được thể hiện ở hình 2.3

Hình 2.3 Thí nghiệm chọn môi trường phù hợp nuôi cấy chủng E ictaluri PAM

2.4.5 Phương pháp cắt mô gan, thận lách cá tra

Phương pháp mô bệnh học cho cá của Coolidge và Howard (1979) [21] đã được

áp dụng, thể hiện ở hình 2.4, cụ thể như sau:

E ictaluri PAM

- Nuôi cấy vi khuẩn ở 28oC

- Theo dõi sự phát triển của vi khuẩn theo thời gian: 12 giờ, 24 giờ,

36 giờ, 48 giờ và 60 giờ bằng phương pháp so màu quang phổ

(Spectro 2000, Labomed, Inc.) ở bước sóng 600nm (OD)

- Đánh giá sinh trưởng quần thể chủng E ictaluri PAM ở các môi

trường và các nồng độ adenine khác nhau thông qua giá trị OD

Hình 2.4 Sơ đồ tiến hành làm tiêu bản mô học mẫu cá tra

+ Cố định mẫu: Mẫu được ngâm trong dung dịch Bouin Trước khi cố định mẫu,

dùng kéo giải phẫu lấy nội tạng (gan, thận, lách) đưa vào cố định từng bộ phận trong dung dịch Bouin với tỷ lệ thể tích 1/10 Thời gian cố định từ 36 giờ; sau đó được chuyển sang cồn 70% qua đêm

+ Xử lý và làm mất nước mẫu: Lần lượt đưa mẫu qua cồn etylic với các nồng độ khác nhau tăng dần: 70%, 80%, 95%, 99,5% cho đến khi mẫu bị mất nước hoàn toàn, thời gian xử lý ở mỗi bước tuỳ thuộc vào kích thước mẫu (30 đến 60 phút) Sau đó mẫu được làm trong bằng xylene (yêu cầu giữa 2 lần thay đổ dung dịch xylene từ 30 đến 60 phút), rồi thấm mẫu trong parafin 2 đến 3 lần, mỗi lần 1 giờ

+ Đúc mẫu trong parafin: Parafin đun chảy (56oC) được cho vào khuôn đã có mẫu (đã xử lý và làm mất nước), sau đó đặt khuôn lên dàn lạnh, sau 5 phút có thể tạo ra các khối parafin chứa mẫu Dùng dao gọt và cắt thành 1 khối hình chữ nhật

+ Cắt mẫu: Gắn khối parafin có mẫu vào máy microtome, cắt lát với độ dày 5 m, sau đó đưa lát cắt vào nước ấm (45oC) có bổ sung anbumin khoảng 1-2 phút để lát cắt

Cố định trong dung dịch Bouin (36 giờ)

Xử lý mẫu (làm mất nước bằng cồn 70%, 80%, 95%, 99,5% trong 30 phút đến 60

phút mỗi nồng độ; làm trong mẫu bằng xilen 30 phút đến 1giờ; thấm mẫu trong

parafin 2 đến 3 lần, mỗi lần 1 giờ)

Đúc mẫu trong parafin Cồn 70% (12 giờ) Mẫu nghiên cứu

Cắt lát mẫu (5m)

Nhuộm Hematoxylin và Eosin (làm mất parafin, làm no

nước mẫu, nhuộm mẫu, làm mất nước mẫu, làm trong mẫu)

Đọc kết quả mô bệnh học bằng kính hiển vi

giãn Dùng lam sạch để lấy lát cắt ra khỏi nước rồi đặt lên máy sấy lam ở nhiệt độ từ

50oC trong thời gian từ 2 giờ

+ Nhuộm và làm tiêu bản: Mẫu phải làm mất parafin bằng xylene (2 lần, mỗi lần

5 phút) và làm no nước mẫu bằng cách đưa mẫu vào ethanol với các nồng độ khác nhau giảm dần: 100%, 95%, 80%, 50% (2 lần mỗi nồng độ, mỗi lần 2 phút), rồi nhúng trong nuớc 3-6 lần trước khi nhuộm Nhuộm mẫu bằng thuốc nhuộm Hematoxylin (4 phút, rồi rửa qua vòi nước nhẹ) và Eosin (2 phút), sau đó làm mất nước bằng cồn etylic với các nồng độ khác nhau tăng dần và làm trong mẫu bằng xylene (2 lần, mỗi lần 2 phút) trước khi đậy lamen sạch lên mẫu bằng keo bomcanada

+ Đọc mẫu trên kính hiển vi quang học: Soi dưới kính hiển vi quang học với độ

phóng đại 400 lần đến 1000 lần, đọc kết quả theo Coolidge và Howard (1979) [20]

2.4.6 Phương pháp xác định một số chỉ tiêu môi trường nước ở các bể thí nghiệm

+ Nhiệt độ đo bằng nhiệt kế thủy ngân, độ chính xác đến 1oC

+ pH đo bằng pH kế cầm tay của hãng Hanna-Mỹ, độ chính xác đến 0,1

+ Độ kiềm đo bằng test đo độ kiềm của Thái Lan

+ Xác định chỉ số oxy hòa tan (DO): Dùng máy đo Orbeco-hellige 975 MP, hãng Orbeco analytical systems, Inc., Mỹ

+ NH3-N: Dùng máy đo Orbeco-hellige 975 MP, hãng Orbeco analytical systems, Inc., Mỹ

2.4.7 Phương pháp phân tích, xử lý số liệu

+ Phương pháp xác định liều gây chết 50% (LD50): Phương pháp Reed-muench (1938) [39] được áp dụng để xác định liều gây chết 50% của cá được lây nhiễm với

các mật độ vi khuẩn E ictaluri PAM (vi khuẩn đột biến gen purA) là 106; 107; 108; 109

và 1010 cfu/mL và vi khuẩn hoang dại E ictaluri WT (chưa bị đột biến) là 104; 105;

106; 107; 108 và 109 cfu/mL

LD50 = 10x-pd ; pd = (L-50%)/(L-H) Trong đó:

L- tỷ lệ % cá nhiễm bệnh tại liều gây chết cá trên 50% thấp nhất H- tỷ lệ % cá nhiễm bệnh tại liều gây chết cá dưới 50% cao nhất + Số liệu thí nghiệm được xử lý bằng phép phân tích ANOVA một nhân tố (ANOVA-Single factor) và hai nhân tố không lặp (ANOVA-Two factor Without Replication) trên phần mềm Excel của máy vi tính; sử dụng phần mềm thống kê SPSS

16.0 for Window phân tích phương sai một nhân tố (oneway-ANOVA) với phép thử Tukey để kiểm định sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05).

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1 Kết quả nghiên cứu đặc điểm vi khuẩn Edwardsiella ictaluri bị đột biến gen

purA (E ictaluri PAM) và vi khuẩn E ictaluri chưa bị đột biến (E ictaluri WT)

3.1.1 Đặc điểm hình thái

Trên môi trường nuôi cấy BHIA, vi khuẩn E ictaluri bị đột biến gen purA (E

ictaluri PAM) cũng như vi khuẩn E ictaluri hoang dại (E ictaluri WT) đều phát triển

chậm Cụ thể, ở nhiệt độ 28oC, sau 48 giờ nuôi cấy, khuẩn lạc vi khuẩn hình thành trên mặt đĩa thạch và hình dạng, kích thước vi khuẩn có các đặc điểm được thể hiện ở bảng 3.1 và hình 3.1

Bảng 3.1 Đặc điểm khuẩn lạc, hình dạng và kích thước chủng vi khuẩn E ictaluri bị

đột biến gen purA

TT Đặc điểm Chủng E ictaluri WT Chủng E ictaluri PAM

2 Hình dạng khuẩn lạc trên môi

trường BHIA sau 48 giờ

Dạng tròn, trơn, hơi lồi Dạng tròn, trơn, hơi lồi

3 Màu sắc khuẩn lạc trên môi

trường BHIA sau 48 giờ

Màu trắng hơi mờ Màu trắng hơi mờ

4 Kích thước khuẩn lạc trên

BHIA sau 48 giờ (mm)

trường BHIA, khuẩn lạc vi khuẩn chủng E ictaluri PAM hình thành có kích thước

đường kính khoảng 1,350,100mm nhỏ hơn so với chủng E ictaluri WT (đường kính khuẩn lạc khoảng 2,450,270mm), kích thước vi khuẩn chủng E ictaluri PAM cũng nhỏ hơn so với vi khuẩn chủng E ictaluriWT và sự sai khác này có ý nghĩa thống kê (p<0,05) (phụ lục 5)

Cũng từ kết quả bảng 3.1 cho thấy màu sắc, hình dạng, thời gian mọc khuẩn lạc

và hình dạng vi khuẩn ở cả hai chủng E ictaluri WT và E ictaluri PAM đều tương tự

nhau Cụ thể, khuẩn lạc có màu trắng hơi mờ đục, dạng tròn trơn, hơi lồi, rìa có dạng không đồng nhất (hình 3.1A, B) Khi nhuộm Gram và soi dưới kính hiển vi ở độ phóng

đại 1000 lần, vi khuẩn chủng E ictaluri PAM và E ictaluri WT bắt màu hồng (vi

khuẩn Gram âm) và có hình que ngắn, đơn hoặc chuỗi ngắn và không sinh bào tử (hình 3.2 A, B)

Hình 3.1 Khuẩn lạc vi khuẩn E ictaluri (A, B) trên môi trường BHIA

Hình 3.2 Vi khuẩn E ictaluri hoang dại chưa đột biến gen purA (A) và vi khuẩn E

ictaluri đột biến gen purA (B)

Kết quả nghiên cứu về đặc điểm hình thái 108 chủng E ictaluri thu được từ 181

cá tra bị bệnh gan thận mủ của Từ Thanh Dung và cộng sự năm 2004 cho thấy, khuẩn lạc tạo thành có màu trắng đục, rìa có dạng không đồng nhất, vi khuẩn bắt màu hồng (Gram âm), hình que và có kích thước biến đổi [3] cũng tương tự như những mô tả về

hình thái chủng vi khuẩn E ictaluri hoang dại (E ictaluri WT) và chủng E ictaluri bị đột biến gen purA (E ictaluri PAM) mà chúng tôi nghiên cứu Điều này chứng tỏ vi khuẩn E ictaluri PAM (bị đột biến gen purA) có kiểu hình khá ổn định, không thay

đổi sau khi bị đột biến và có khả năng nuôi cấy và lưu giữ

10µm

A

A 1mm B B