Nghiên cứu thu hồi và đặc trưng hóa tính chất sản phẩm thủy phân protein từ đầu tôm bằng enzyme

21Hình 3.1 Ảnh hưởng của chế độ xử lý ban đàu khác nhau đến độ thủy phân củađầu tôm thẻ chân trắng...38Hình 3.2 Ảnh hưởng của công đoạn xử lý nhiệt và bổ sung enzyme đển hàmlượng protein

T R Ư Ờ N G Đ Ạ I H Ọ C NHA TRANG

NGUYỄN THỊ NGỌC HOÀI

NGHIÊN CỨU THU HỒI VÀ ĐẶC TRƯNG HÓA TÍNH CHẤT SẢN PHẨM THỦY PHÂN PROTEIN TỪ ĐẦU TÔM BẰNG ENZYME

Chuyên ngành : Công nghệ sau thu hoạch

Mã số : 60.54.10

LUẬN VĂN THẠC s ĩ KỸ THUẬT

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS NGÔ ĐĂNG NGHĨA

N ha Trang - 2012

sỐ - J ỹ 3 /QĐ-ĐHNT

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

Nha Trang, ngày^é^thảng 02 năm 2011

QUYẾT ĐỊNHV/v giao đề tài luận văn thạc sĩ

HIỆU TRƯỞNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

Căn cứ Quyết định số 155/CP ngày 16/8/1966 của Hội đồng Chính phủ v/v thành lập và quy định nhiệm vụ, quyên hạn của Trường Thủy sản nay là Trường Đại học Nha' Trang;

Căn cứ Quyết định số 58/2010/QĐ-TTg ngày 22/9/2010 của Thủ tướng Chính phủ v/v ban hành Điều lệ trường Đại học;

Căn cứ Quyết định số 526/2008/QĐ-BGD&ĐT ngày 05/8/2008 của Bộ trưởng Bộ Giáo dục và Đào tạo v/v ban hành Quy chế đào tạo trình độ Thạc sĩ;

Xét đề nghị của Trưởng khoa Chế biến và Trưởng phòng Đào tạo Đại học - Sau Đại học,

QUYẾT ĐỊNH:

Điều 1 Giao cho học viên Nguyễn Thị Ngọc Hoài - lớp Cao học Công nghệ sau thu hoạch 2009, đề tài luận vãn thạc sĩ: “Nghiên cứu thu hồi và đặc trưng hóa tính chất sản phẩm thủy phân Protein từ đầu tôm bằng Enzyme”, thuộc chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch, mã số: 60 54 10

Thời gian thực hiện: từ 15/2/2011 đến 15/11/2011

Cán bộ hướng dẫn: PGS.TS Ngô Đăng Nghĩa - Trường ĐH Nha Trang

Điều 2 Trưởng khoa Chế biến, Trưởng phòng Đào tạo Đại học - Sau Đại học, PGS.TS Ngô Đãng Nghĩa và học viên Nguyễn Thị Ngọc Hoài chịu trách nhiệm thi hành Quyết định n à y / ^ /

Nơỉ nhận:

' -NhưĐiều2;

- Lưu VT, ĐT ĐH-SĐH.

HIỆU TRƯỞNG

LỜI CAM KẾT

Luận văn Thạc sỹ khoa học này được tác giả thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS.TS Ngô Đăng Nghĩa, Viện trưởng Viện Công nghệ sinh học và môi trường, Trường Đại học Nha Trang, Việt Nam

Những kết quả thực nghiệm của chúng tôi thu được trong luận văn Thạc sỹ khoa học này là hoàn toàn mới và chưa được ai công bố chính thức Tôi xin cam đoan đây là sự thật và hoàn toàn chịu trách nhiệm với những kết quả mình đã công bố

Nha Trang, ngày 30 thảng 06 năm 2012

Tác giả thực hiện

Nguyễn Thị Ngọc Hoài

LỜI CẢM ƠN

Tôi xỉn chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến:

- Thây PGS.TS Ngô Đăng Nghĩa, Viện trưởng Viện công nghệ sinh học và môi

trường - Trường Đại học Nha Trang đã tận tình giúp đỡ và hướng dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

- Cô Ngô Thị Hoài Dương, Bộ môn Công nghệ chế biển - Khoa chế biển thực phẩm - Trường Đại học Nha Trang đã trợ giúp tôi trong việc thực hiện đề tài

- Toàn thể thầy, cô Viện công nghệ sinh học & môi trường, Bộ môn hóa sinh -

vi sinh thực phẩm - Khoa chế biển - Trường Đại học Nha Trang tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình triển khai

- Ba mẹ, các anh, chị, em đã luôn động viên, không ngừng ủng hộ tôi

- Cùng các bạn hữu, đồng nghiệp đã tận tình giúp đỡ và cùng tôi chia sẻ những khó khăn để hoàn thành luận văn này

- Tôi mãi mãi ghi nhận sự giúp đỡ quỉ báu của quỉ thầy, cô, đồng nghiệp và bạn hữu.

MỤC LỤC

LỜI CAM KẾT i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤ C iii

DANH MỤC BẢNG vi

DANH MỤC H ÌN H vii

DANH MỤC Sơ ĐỔ ix

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT X MỞ Đ Ầ U 1

CHƯƠNG 1: TỐNG QUAN 4

1.1 Tổng quan về phế tiêu tôm 4

1.1.1 Giới thiệu chung về phế liệu tôm 4

1.1.2 Thành phần, tính chất của phế liệu tôm 4

1.1.3 Tình hình nghiên cứu 6

1.1.3.1 Tình hình nghiên cứu trong nước 6

1.1.3.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước 8

1.2 Tổng quan về enzyme và quá trình thủy phân 13

1.3 Tổng quan về protein, tính chất và phương pháp thu hồi protein 14

1.3.1 Tổng quan về protein, tính chất hòa tan của protein 14

1.3.2 Thu hồi protein bằng phương pháp sấy phun 15

1.3.2.1 Nguyên lý của phương pháp sấy phun 16

1.3.2.2 Cấu tạo và nguyên lý hoạt động của máy sấy phun 16

1.3.2.3 Ưu và nhược điểm của công nghệ sấy phun 17

1.4 Tổng quan về mantodextrin - Chất ứng dụng bổ sung trong quá trình thu hồi protein hòa tan 18

1.5 Tổng quari về gốc tự do và khả năng chống oxy hóa 18

1.5.1 Tổng quan về gốc tự do 18

1.5.2 Cơ chế hoạt động chống oxy hóa 20

1.5.2.1 Sự hình thành các gốc tự do 20

1.5.2.2 Sự chống ôxi-hóa 21

CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CÚ Ư 23

2.1 Nguyên vật liệu dùng trong nghiên cứu 23

2.1.1 Nguyên liệu đầu tôm thẻ chân trắng 23

2.1.2 Dụng cụ, hóa chất, dụng cụ chuyên dụng 23

2.2 Phương pháp nghiên cứu 24

2.2.1 Bổ trí thí nghiệm tổng quát 24

2.2.2 Bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của công đoạn xử lý nhiệt trước thủy phân đến chất lượng dịch thủy phân 25

2.2.3 Bố trí thí nghiệm xác định chế độ thủy phân tói ưu 26

2.2.4 Xác định thành phần hóa học và đặc trưng hóa tính chất của dịch thủy phân thu được 31

2.2.5 Bố trí thí nghiệm nghiên cứu sự ảnh hưởng của quá trình cô quay chân không đến chất lượng của dịch thủy phân và chọn chế độ cô quay phù hợp 31

2.2.5.1 Nghiên cứu sự ảnh hưởng của nhiệt độ cô quay đến chất lượng của dịch thủy phân 31

2.2.5.2 Nghiên cứu sự ảnh hưởng của áp suất hút chân không đến chất lượng của dịch thủy phân 33

2.2.5.3 Nghiên cứu sự ảnh hưởng của thời gian cô quay đến chất lượng của dịch thủy phân 34

2.2.6 Bổ trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ sấy phun và hàm lượng mantodextrin đến chất lượng của bột đạm 34

2.3 Phương pháp phân tích đã áp dụng 36

2.4 Phương pháp xử lý số liệu 36

Chương 3: KẾT QƯẢ NGHIÊN c ứ u VÀ THẢO LUẬN 37

3.1 Kết quả xác định thành phần hóa học trên đầu tôm thẻ chân trắng 37

3.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của công đoạn xử lý nhiệt trước thủy phân đến quá trình thủy phân 37

3.3 Kết quả thí nghiệm tối ưu hóa quá trình thủy phân đầu tôm bằng Alcalase 43

3.3.1 Kểt quả xác định mô hình hồi quy cho hàm lượng protein hòa tan trong dịch thủy phân 43

3.3.2 Kết quả xác định mô hình hồi quy cho khả năng khử gốc tự do của dịch thủy phân 46

3.3.3 Kết quả xác định mô hình hồi quy cho hiệu suất khử protein 49

3.3.4 Kết quả xác định mô hình hồi quy cho độ thủy phân 53

3.3.5 Tìm thông số tối uu của quá trình thủy phân 55

3.3.6 Kết quả đặc trưng tính chất dịch thủy phân protein thu được 59

3.4 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của quá trình cô quay đến chất lượng của dịch thủy phân 61

3.4.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ cô quay đến chất lượng dịch thủy phân 61

3.4.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng áp suất hút chân không trong quá trình cô quay đến chất lượng dịch thủy phân 62

3.4.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian cô quay đến chất lượng dịch thủy phân 63

3.4.4 Kết quả đo nồng độ chất khô và độ Brix của dịch thủy phân sau cô quay 65

3.5 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của quá trình sấy phun đến chất lượng của bột đạm 67

3.5.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ sấy phun và nồng độ mantodextrin bổ sung đến hàm lượng protein hòa tan trong bột đạm 67

3.5.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ sấy phun và nồng độ mantodextrin bổ sung đến khả năng khử gốc tự do của bột đạm 71

3.5.3 Tìm thông số tối ưu cho quá trình sấy phun 74

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 76

TÀI LIỆU THAM KHẢO f 77 PHỤ LỤC

Bảng 1 Sản lượng tôm năm 2009-2010 1

Bảng 2 Sản lượng tôm năm 2010-2011 .1

Bảng 1.1 Thành phần đầu và vỏ phế liệu tôm (%) 5

Bảng 1.2 Sản lượng và giá trị tôm năm 2009 và 8 tháng đầu năm 2010 theo sổ liệu hải quan Việt Nam 6

Bảng 2.1 Bố ừí thí nghiệm theo quy hoạch thực nghiệm với biến ảo của công đoạn thủy phân protein từ đầu tôm bằng Alcalasetheo mô hình composit 29

Bảng 2.2 Bố trí thí nghiệm theo quy hoạch thực nghiệm với biến thật và các hàm mục tiêu của công đoạn thủy phân protein từ đàu tôm bằng Alcalase 30

Bảng 3.1 Thành phàn hóa học cơ bản của phế liệu đầu tôm Penaeus vannamei 37

Bảng 3.2 Kết quả đo pH 37

Bảng 3.3 Các hệ số ảnh hưởng ưong mô hình hồi qui 44

Bảng 3.4 Các hệ sổ ảnh hưởng trong mô hình hồi qui 47

Bảng 3.5 Các hệ số ảnh hưởng trong mô hình hồi quy 50

Bảng 3.6 Các hệ số ảnh hưởng trong mô hình hồi quy 54

Bảng 3.7 Tiên đoán một số thí nghiệm tối ưu cho quá trình thủy phân 56

Bảng 3.8 Kết quả tối ưu thèo tiên đoán và thực nghiệm 57

Bảng 3.9 Nhận xét cảm quan dịch thủy phân protein từ đầu tôm 59

Bảng 3.10 Một số chỉ tiêu sinh hóa học của dịch thủy phân protein từ đầu tôm 59

Bảng 3.11 Kết quả nồng độ chất khô và độ Brix của dịch thủy phân sau cô quay 65

Bảng 3.12 Kết quả thí nghiệm sấy phun 67

Bảng 3.13 Bảng Effect list cho hàm mục tiêu hàm lượng protein hòa tan 67

Bảng 3.14 Bảng Effect list cho hàm mục tiêu là khả năng khử gốc tự do của bột đạm 71

Bảng 3.15 Các chế độ tối ưu kiến nghị cho quá trình sấy phun 75

Bảng 3.16 Kết quả thí nghiệm kiểm chứng tại điểm tối ưu công đoạn sấy phu n 75

DANH MỤC BẢNG

Hình 1.1 Phản ứng thủy phân protein 10Hình 1.2 Sự hình thành các gốc tự d o 21Hình 1.3 Sự chổng ôxi-hóa 21Hình 3.1 Ảnh hưởng của chế độ xử lý ban đàu khác nhau đến độ thủy phân củađầu tôm thẻ chân trắng 38Hình 3.2 Ảnh hưởng của công đoạn xử lý nhiệt và bổ sung enzyme đển hàmlượng protein hòa tan (mg/130ml dịch) 39Hình 3.3 Ảnh hưởng của công đoạn XL nhiệt và bổ sung enzyme đến khả năngbắt gốc tự do DPPH 40Hình 3.4 Ảnh hưởng của công đoạn XL nhiệt và bổ sung enzyme đến hiệu suấtkhử protein còn lại trên bã 42Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn sự biến đổi hàm lượng protein hòa tan theo sự thay đổicủa nồng độ enzyme và nhiệt độ thủy phân (3D) 45Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn sự biến đổi hàm lượng protein hòa tan theo sự thay đổicủa nồng độ enzyme và nhiệt độ thủy phân (đường cong) 45Hình 3.7 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ và nhiệt độ thủy phân đếnnồng độ DPPH bị khử của dịch thủy phân 48Hình 3.8 Đồ thị 3D biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ và nhiệt độ thủy phân đếnnồng độ DPPH bị khử của dịch thủy phân 48

Hình 3.9 Đồ thị (contour) biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ enzyme và thời gianthủy phân đến hiệu suất khử protein 51Hình 3.10 Đồ thị 3D biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ enzyme và thời gian thủyphân đến hiệu suất khử protein 51

Hình 3.11 Đồ thị (contour) biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian thủyphân đến hiệu suất khử protein 52Hình 3.12 Đồ thị 3D biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian thủy phânđến hiệu suất khử protein 52Hình 3.13 Đồ thị (contour) biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ enzyme và thời gianthủy phân đến độ thủy phân 55Hình 3.14 Đồ thị 3D biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ enzyme và thời gian thủy phân đến độ thủy phân 55

DANH MỤC HÌNH

Hình 3.15 Đồ thị đường cong biểu diễn mô hình tối ưu của quá trình thủy phânprotein từ đầu tôm bằng Alcalase 58Hình 3.16 Đồ thị 3D biểu diễn mô hình tối ưu của quá trình thủy phân protein từđàu tôm bằng Alcalase 58Hình 3.17 Đồ thị biểu diễn thành phàn % của các axit amin có trong dịch thủyphân tối ưu 60Hình 3.18 Đồ thị biểu diễn thành phần % của các axit béo có trong dịch thủyphân tối ưu 60Hình 3.19 Ảnh hưởng của nhiệt độ cô quay đến hàm lượng protein hòa tan(mg/100ml dịch) 61Hình 3.20 Ảnh hưởng của nồng độ cô quay đến khả năng khử góc tự do DPPH 62Hình 3.21 Ảnh hưởng áp suất hút chân không trong quá trình cô quay đến hàmlượng protein của dịch thủy phân 62Hình 3.22 Ảnh hưởng áp suất hút chân không trong quá trình cô quay khả năngkhử gốc tự do của dịch thủy phân 63Hình 3.23 Ảnh hưởng của thời gian cô quay đến hàm lượng protein hòa tan củadịch thủy phân 64Hình 3.24 Ảnh hưởng của thời gian cô quay đến khả năng khử gốc tự do của dịchthủy phân 64Hình 3.25 Mối tương quan giữa nồng độ chất khô và độ Brix của dịch thủy phânsau cô quay 66Hình 3.26 Đồ thị Half-Normal Plot đánh giá mức độ ảnh hưởng của các yếu tố đến hàm lượng protein hòa tan trong bột đạm 68Hình 3.27 Đồ thị ảnh hưởng của yếu tố nhiệt độ (hình a), nồng độ mantodextrin (hình b), ảnh hưởng qua lại của nhiệt độ sấy phun và nồng độ mantodextrin bổsung (hình c) đến hàm lượng protein hòa tan trong bột đạm 70Hình 3.28 Đồ thị Half-Normal Plot đánh giá mức độ ảnh hưởng của các yểu tốđến khả năng khử gốc tự do của bột đạm 72Hình 3.29 Đồ thị ảnh hưởng của yểu tổ nhiệt độ (hình a), nồng độ mantodextrin (hình b), ảnh hưởng qua lại của nhiệt độ sấy phun và nồng độ mantodextrin bổ sung (hình c) đến khả năng khử gốc tự do DPPH của bột đạm 74

DANH MỤC S ơ ĐỒ

Sơ đồ 1 : Sơ đồ bổ ừí thí nghiệm tổng qu át 24

Sơ đồ 2: Bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của công đoạn xử lý nhiệt trướcthủy phân đến chất lượng dịch thủy phân 25

Sơ đồ 3: Bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ cô quay đển chấtlượng của dịch thủy p hân 32

Sơ đồ 4: Bố trí thí nghiệm nghiên cứu sự ảnh hưởng của áp suất hút chân khôngđến chất lượng của dịch thủy phân 33

Sơ đồ 5 : Bố trí thí nghiệm nghiên cứu sự ảnh hưởng của thời gian cô quay đến chất lượng của dịch thủy phân 34

MỞ ĐẰƯ

Tính cấp thiết của đề tài:

ở Việt Nam nguồn nguyên liệu tôm là rất dồi dào, được thu từ 2 nguồn chính là đanh bat tự nhien va nuôi trông Đặc biệt, nuôi tôm đã phát triển mạnh trong những năm gần đây và trở thành ngành kinh tế mũi nhọn

Sản lượng tôm nguyên liệu khai thác biển và nuôi trồng cả nước năm 2006 là 463.200 tẩn, năm 2007 được 498.200 tấn, năm 2008 được 510.000 tấn Ngành chể biên thủy sản xuât khâu được đánh giá là ngành kinh tế mũi nhọn của cả nước, hàng năm ngành đã đóng góp kim ngạch xuất khẩu đáng kể, năm 2008 kim ngạch xuất khẩu4,5 tỷ USD Riêng năm 2008 chể biến tôm đông lạnh xuất khẩu đạt 190.000 tấn, kim ngạch xuất khẩu đạt 1,6 tỷ USD (tăng 7,7% so với cùng kỳ) với khối lượng xuất khẩu 191.550 tấn (tăng 18,8% so với cùng kỳ) [1]

Trong những năm gần đây, sản lượng tôm thu được trong cả nước rất lớn

Bảng 1: Sản lượng tôm năm 2009-2010[ll]

Bảng 2: Sản lượng tôm năm 2010-2011

lợi ích kinh tê ngành, nâng cao thu nhập và đời sống ngư dân Bên cạnh đó, lượng phế liệu thải ra cũng rât lớn, nếu chúng ta giải quyết tốt vấn đề này sẽ làm gia tăng giá trị sử dụng của nguyên liệu, ngược lại sẽ gây ô nhiễm môi trường một cách trầm trọng hơn, tác động xâu đên phát triển bền vững ngành thủy sản Sản lượng phế liệu tôm [1]: Theo thống kê của Tổ chức lương thực và Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc (FAO) thì sản lượng tôm trên thế giới khoảng trên dưới 4 triệu tấn /năm Hầu hết sản lượng tôm trên thế giới từ các nước đang phát triển như: Thái Lan, Việt Nam, Trung Quốc, Ecudo, Malaysia, Án Độ, và Indonexia Theo đó đã tạo ra một lượng phế liệu tôm rất lớn, ước tính có khoảng 1,6-2 triệu tấn/năm[l] Theo Hall và De Silva (1992) phàn lỏn thải ra

từ các nước đang phát triển như Thái Lan, Chilê, Philippin, Ấn Độ, Pakixtan và Indonesia

Phế liệu thủy sản, nhất là phế liệu tôm thải ra từ các cơ sở chế biển thủy sản nếu không xử lý đúng cách sẽ gây ô nhiễm môi trường lớn Công nghệ chế biến tôm tạo ra một lượng lớn phế thải rắn bao gồm đầu và vỏ tôm, (Đỗ Văn Nam và cs, 2005, Shahidi và Synowiecki, 1991)

Phần còn lại trong ngành chế biển tôm chủ yếu được dùng để sản xuất chitin- chitosan theo phương pháp hoá học có sử dụng các loại hoá chất với nồng độ cao, thời gian xử lý dài gây ảnh hưởng tới chất lượng chitin-chitosan và các chế phẩm khác được sản xuất từ phế liệu giáp xác Hiện nay cũng đã có nhiều nghiên cứu xây dựng quy trình kết hợp phương pháp hoá học với phương pháp sinh học nhằm giảm tối đa lượng hoá chất sử dụng, góp phần giảm chi phí sản xuất, nâng cao chất lượng sản phẩm Ngoài ra, còn có rẩt nhiều hướng nghiên cứu sử dụng phế liệu tôm sản xuất các mặt hàng có giá trị khác như: astaxanthin, thức ăn chăn nuôi, chiết rút chất mùi nhưng công nghệ gây ô nhiễm nên không cho phép tận dụng các chất có hoạt tính sinh học khác

Phần còn lại của ngành chế biến tôm thường chiếm 50-70% nguyên liệu ban đầu, trong đó hàm lượng protein còn lại là rất lớn, nếu không xử lý đúng cách sẽ gây ô nhiễm, do đỏ việc thu hồi dịch protein thủy phân sau quá trình thủy phân bằng một số enzyme sẽ tận dụng được nguồn chât dinh dưỡng trong phê liệu đâu, vỏ tôm đê đưa vào một số ứng dụng như: bổ sung vào thức ăn cho động vật, cho người từ đó nâng cao nâng cao được giá trị của nguyên liệu, giảm tải cho quá trình xử lí nước thải, hạn chế

sự ô nhiêm môi trường Đồng thời việc sử dụng thủy phân bàng enzyme sẽ hạn chế việc sử dụng hóa chất, gây ô nhiễm môi trường.

Chất thải hiện nay đã trở thành quốc nạn tại nhiều nước trên thế giới, trong đó

có chất thải từ ngành thủy sản, một loại dễ bị phân hủy trong môi trường tự nhiên, gây

ô nhiễm môi trường không khí bởi các chất sunfuahydro, amoniac, methan, nitrit Trong khoa học hiện đại ngày nay người ta đã biết tân dụng những chất thải có khả năng phát sinh những khí độc gây ô nhiễm cho sự sống con người như cách phân loại rác từ đầu nguồn để có thể biến chúng trở thành khí ga phục vụ cho cuộc sống thường ngày của cộng đồng dân cư Trong thực tế hiện nay tại các cơ sở sản xuất phải thu nhận nguyên liệu từ các khu vực xa, không tập trung và khối lượng không lớn gây khó khăn về chi phí vận chuyển Do vậy việc nghiên cứu ứng dụng chế độ thủy phân bằng enzyme góp phần kéo dài thời gian bảo quản nguyên liệu, giảm chi phí do phơi hoặc sấy khô nguyên liệu, giảm sự ô nhiễm môi trường do không vận chuyển tạm thời, đồng thời loại bỏ một phần các chất khoáng, protein

Xuất phát từ thực tế trên, dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Ngô Đăng Nghĩa, tôi

đề xuất đề tài: “Nghiên cứu thu hồi và đặc trưng hóa tính chất sản phẩm thủy phân protein từ đầu tôm bằng enzyme”.

Mục đích của đề tài: Nghiên cứu thu hồi protein từ đàu tôm bằng enzyme nhằm nâng cao hiệu quả sử dụng nguyên liệu tôm, góp phần hạn chế thất thoát tài nguyên và giảm thiểu ô nhiễm môi trường Xác định một số tính chất đặc trưng của sản phẩm thủy phân thu được nhằm đánh giá và nâng cao giá trị sử dụng

Tính mới của đề tài: Sử dụng phương pháp mặt đáp ứng cho quá trình thủy phân Đặc biệt là thu hồi được protein hòa tan, có các hoạt tính sinh học như khả năng chống oxy hóa Bên cạnh đó còn thu hồi chitin

K hả năng áp dụng của đề tài: Kết quả của đề tài trên qui mô phòng thí nghiệm là cơ sở để triển khai thực nghiệm trên qui mô lớn tại doanh nghiệp sản xuât Chitin-Chitosan, với mục đích tận dụng nguồn protein từ đầu tôm, hạn chế việc sử dụng hoá chất và các tác động đển môi trường Dữ liệu của đề tàỉ sẽ là cơ sở cho các nghiên cửu sâu hơn về lĩnh vực này

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về phế tiệu tôm.

1.1.1 Giói thiệu chung về phế liệu tôm.

Phê liệu tôm là những thành phân phê thải từ các cơ sở chế biến tôm bao gôm: đâu, vỏ và đuôi tôm Ngoài ra, còn có tôm gãy thân, tôm lột vỏ sai quy cách hoặc tôm bị biển màu Tùy thuộc vào loài và phương pháp xử lý mà lượng phế liệu

có thể vượt quá 60% khối lượng sản phẩm Có thể lấy tôm sú Penaeus monodon

làm ví dụ, đầu tôm chiếm tới 40% trọng lượng tôm Với sản phẩm tôm lột vỏ, rút chỉ lưng, lượng đuôi và vỏ của tôm chiếm khoảng 25% trọng lượng tôm[5] Đối với

tôm thẻ chân trắng Penaeus vannameỉ, lượng phế liệu đàu tôm chiếm 28% và vỏ

chiếm 9%, như vậy tổng lượng phế liệu đầu vỏ tôm thẻ là 37% Theo Shahidi et al,

1992, phế liệu tôm chiếm 35-40% so với lượng nguyên liệu ban đàu còn trong phàn phế liệu thì đầu tôm chiếm 71,4%, vỏ chiếm 28,6% (Meyers, 1986) và có thể đặt ra vấn đề là chúng sẽ hư hỏng và gây vấn nạn về môi trường (Quaglia and Orban 1987; Gilgberg 1993) Do đó việc giảm lượng phế liệu từ khâu chế biến hoặc tìm giải pháp tái sử dụng chúng chính là một phương cách giúp làm tăng lợi nhuận cho ngành thủy sản đồng thời làm giảm ô nhiễm môi trường

1.1.2 Thành phần, tính chất của phế liệu tôm.

Trong thành phần phế liệu tôm, phần đầu thường chiếm khoảng 35+45% trọng lượng của tôm nguyên liệu, phần vỏ chiếm 10+15% Tuy vậy, tỷ lệ này còn phụ thuộc vào giống loài, giai đoạn sinh trưởng

Thành phần chiếm tỉ lệ đáng kể trong đầu, vỏ tôm là chitin, protein, canxi cacbonat, sắc tố, và tỷ lệ giữa các thành phần này là không ổn định, chúng thay đổi theo đặc điểm sinh thái, sinh lý, loài, Thành phần chitin và protein trong vỏ tôm tươi tương ứng là 4,5% và 8,05%; trong vỏ tôm khô là 11 - 27,5% và 23,25 - 53%

Hàm lượng chitin, protein, khoáng và carotenoid trong phế liệu vỏ tôm thay đổi rất rộng phụ thuộc vào điều kiện bảo quản cũng như phụ thuộc vào loài, trạng thải dinh dưỡng, chu kỳ sinh sản v ỏ giáp xác chứa chủ yếu là protein (30 - 40%), khoáng (30 - 50%), chitin (13 - 42%)

Theo Mayer (1986), thành phần hóa học của phế liệu tôm như sau

Bảng 1.1 : Thành phần đầu và vỏ phế liệu tôm (%)[9]

Phế liệu Protein Chitin Lipid Tro Calci Phospho

- Protein: Trong phế liệu tôm thường là loại protein không hòa tan, do đó khó

trích ly khỏi vỏ, nó tồn tại dưới hai dạng:

+ Dạng tự do: Tồn tại trong các cơ quan nội tạng và các cơ gắn ở phần vỏ

+ Dạng phức tạp: Liên kết với chitin, CaC03 như một phàn thống nhất của vỏtôm

- Chitin: Tồn tại dưới dạng liên kết với protein, khoáng, và những hợp chất hữu

cơ khác, chủ yểu là CaC03 là thành phần chính cẩu tạo nên vỏ tôm Chính sự liên kểt này đã gây khó khăn trong việc tách chiết và tinh chế

- Canxi: Trong thành phần vỏ, đầu tôm có chứa 1 lượng lớn muối vô cơ, chủ

yếu là cacbonat canxi (CaC03)

- Ástaxanthin: Là sắc tố chủ yếu trong vỏ tôm, astaxanthin là dẫn xuất của

caroten, thường ở dạng liên kết với acid béo (ester hóa) hay với protein tạo nên một phức hợp chặt chẽ có màu xanh đặc trưng cho tôm Khi liên kết này bị phá vỡ thì astaxanthin dễ dàng bị oxy hóa thành astaxin

Ngoài các thành phần kể trên, trong vỏ tôm còn có các thành phần khác như: nước, lipid, phospho, enzyme

- Lipid: Chứa một lượng đáng kể, chủ yếu gồm các acid béo chưa no bão hòa

như eicosapentaenoic (EPA), decosahexaenoic (DHA) Đây là những acid béo rất có lợi cho sức khỏe con người và có nhiều ứng dụng khác trong y học

- Enzyme: 7rong phế liệu tôm cũng có chứa một số loại enzyme, theo tạp chí

Khoa học và Công nghệ Thủy sản (số 05/1993) thì hoạt độ enzyme của protease của đầu tôm khoảng 6,5 đơn vị hoạt độ/g tươi Trong đầu tôm có chứa enzyme tiêu hóa

Chymotrypsin, và một vài loại enzyme khác cỏ mặt trong phế liệu tôm như alkaline phosphatase, ß-N-acetyl glucosaminse, chitinase cũng được ứng dụng nhiêu trong thực tê

Từ thành phần, tính chất nguồn phế liệu đầu, vỏ tôm, nhận thấy đây là nguồn nguyên liệu phong phú không chỉ sản xuất chitin-chitosan mà còn chứa một lượng protein, astaxanthin và các acid béo không no có lợi cho cơ thê cân được thu hôi

1.1.3 Tình hình nghiên cửu.

Với sản lượng tôm dôi dào và phong phú đã giúp cho mặt hàng thủy sản tôm đông lạnh ở nước ta tăng trưởng mạnh Hàng chục năm qua, tôm là mặt hàng xuất khâu chủ lực của thủy sản Việt Nam và hiện nay đang chiếm hơn 50% kim ngạch xuât khâu toàn ngành Theo Hiệp hội Chế biển và Xuất khẩu Thủy sản Việt Nam (VASEP), năm 2009 là một năm đáng ghi nhận đối với ngành tôm Việt Nam bởi kim ngạch xuât khâu vẫn tăng ngay cả trong bối cảnh kinh tế thế giới khủng hoảng nghiêm trọng Trong 11 tháng đầu năm 2009, xuất khẩu tôm của Việt Nam đạt 190,490 tấn, ừị giá trên 1,518 tỉ đô la Mỹ, tăng 7,4% về lượng và 0,73% về giá trị

so với cùng kỳ năm 2008 Do đỏ lượng phế liệu từ tôm thải ra từ các nhà máy chế biến là khá lớn khoảng 70000 tẩn/năm [8] Đây là nguồn phế liệu dồi dào để sản xuất chitin - chitosan và các sản phẩm giá trị khác

Bảng 1.2 Sản lượng và giá trị tôm năm 2009 và 8 tháng đầu năm 2010 theo số liệu

hải quan Việt Nam.

Loại xuất khẩu

2009 8 tháng đầu năm 2010 Sản lượng

(tấn)

Giá trị (USD)

Sản lượng (tấn)

Giá trị (USD) Tưoi và đông lạnh 40852 242582107 23126 143936475

Như vậy hàng năm trên thể giới nói chung và nước ta nói riêng đã thải ra một lượng lớn phế liệu tôm Lượng phế liệu này chủ yếu dùng làm thức ăn chăn nuôi gia súc mang lại hiệu quả không cao mà còn gây ô nhiễm môi trường Vì dưới tác dụng của các vi khuẩn có trong môi trường và các enzyme nội tại trong phế liệu sẽ phân hủy các hợp chất phức tạp như protit, lipit, gỉuxit ừong điều kiện hiếu khí, kị khí tạo các chất khí có mùi hôi thối như: axit béo không no, mercaptan, CH4, H2S, indol, NH3, methylamine nếu không xử lý kịp thời Chính vì vậy, cần có những biện pháp tích cực để tận dụng có hiệu quả nguồn phế liệu từ tôm này

1.1.3.1 Tình hình nghiên cún trong nước

Từ trước đến nay, ở Việt Nam, đã có nhiều đề tài nghiên cửu chiết xuất chitin- chitosan, những polyme sinh học được ứng dụng trong nhiều ngành công nghiệp từ

phế liệu tôm (Giáo sư - Tiến sĩ Trần Thị Luyến, giảng viên chính Đỗ Minh Phụng, Trường Đại học Nha Trang cùng nhóm các nhà khoa học chuyên nghiên cứu về polyme sinh học biển và tập trung về chitin-chitozan)[16][17] Tuy nhiên, hiện nay các quy trình sản xuất chitin-chitosan quy mô lớn tại Việt Nam chủ yếu là quy trình hóa học, việc sử dụng hóa chất với nồng độ cao dẫn đến lượng chitin-chitosan thu được chưa cao và nhiều tạp chất Mặt khác, các quy trình này chỉ tập trung vào việc thu nhận chitin-chitosan, chứ chưa chú trọng đến việc tận thu các sản phẩm khác của phế liệu tôm như protein, chất màu Việc sử dụng các hóa chất và chất hữu cơ chưa được tận thu thải ra gây ô nhiễm môi trường Vì vậy, chúng phải được xử lý trước khi thải bỏ

Những năm gần đây, các nhà nghiên cứu cũng đã bắt đầu nghiên cứu việc tận thu protein, tận thu một số chất có hoạt tính sinh học như báo cáo đề tài khoa học về nghiên cứu chiết suất Astaxanthin từ phế liệu vỏ tôm (2003) Tràn Thị Luyến và Đồ

Thị Bích Thủy, 2006 cũng đã nghiên cứu sử dụng Lactobacillus plantarum lên men

đầu tôm sú để thu hồi chitin Lên men đầu tôm có tác dụng bảo quản và cho phép thu hồi một số sản phẩm có giá trị: chitin, protein, lipid, sắc tố Trong quá trình này sự khử protein là do sự hoạt động của hệ protease trong đầu tôm, hệ protease từ các vi khuẩn trong phế liệu ở giai đoạn đầu và hoạt tính protease yếu của vi khuẩn Lactic Ngoài ra acid lactic sinh ra cũng có tác dụng làm mềm protein, hoạt hóa protein, và thúc đẩy quá trình thủy phân tạo điều kiện cho một số protease hoạt động Sau 24 giờ phần trăm protein còn lại trong phế liệu tôm so với mẫu chưa xử lý là 12,99%[18] Vũ Ngọc Bội đã sử dụng protease ở đầu tôm sú để thủy phân phế liệu tôm nhằm thu được dịch chiết và chất mùi từ phế liệu tôm Đặng Thị Hiền (2008) đã sử dụng enzyme Alcalase

để tiến hành thuỷ phân phế liệu tôm và tận thu protein và astaxanthin trong công nghệ sản xuất Chitin - chitosan Tại nhiệt độ 54°c, 8 giờ, tỷ lệ enzyme bổ sung là 0,22%, pH

8, tỷ lệ nước/nguyên liệu là 1/1 thì thu hồi được 52,7% protein so với ban đầu

Nguyễn Minh Trí cùng cộng sự đã nghiên cứu “ Ép tách protein từ đầu tâm thẻ (Panaeits Vannamei) trong sản xuất Chitin và bổ sung vào chượp trong quả trình sản xuất nước mẳm'\ Kêt quả cho thấy, quá trình sản xuất chitin từ đầu tôm chưa ép tách

protein có thể áp dụng cho sản xuất chitin công đoạn ép tách Công đoạn ép tách protein trước khi xử lý HC1 và NaOH trong sản xuất chitin đã giảm 37% lượng hóa chẩt (NaOH HC1) sử dụng Bước đầu cho thẩy cỏ thể đưa dịch protein này vào sản xuất nước mắm [6]

Trần Thị Luyến đã kết hợp sử dụng enzyme papain, bromelin để khử protein trong sản xuất chitin, nhưng hiệu quả không cao Viện nghiên cứu Hải sản cũng đã tiển

hành “Nghiên cứu chế độ thủy phân phế liệu đầu tôm bằng enzyme” Trang Sĩ Trung

và cộng sự (2006-2008) đã thực hiện đề tài: “Nghiên cứu kết hợp phương pháp sình học đê nâng cao hiệu quả quy trình sản xuât chỉtin-chỉtosan từ phế liệu vỏ đầu tôm"

Kết quả là ngoài chitin-chitosan, còn thu hồi được hỗn hợp protein và astaxanthin - một loại chất màu có hoạt tính sinh học cao, được ứng dụng rộng rãi trong nuôi trồng thủy sản và thực phẩm chức năng[13] Đây là một hướng đi cho phương pháp sản xuất sạch hơn Bên cạnh đó, việc kết hợp sinh học và hóa học còn đảm bảo vấn đề giá thành sản xuất hợp lý, cơ hội cho mở rộng sản xuất với quy mô lớn Theo phương pháp này, nguyên liệu vỏ đầu tôm được xay nghiền và khử protein bằng enzym Flavourzyme rồi tiến hành thủy phân protein Sau khi thủy phân, phần dịch và phần vỏ được tách ép riêng Phàn dịch được thu lại để tận thu hỗn hợp protein và astaxanthin [10]

1.1.3.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Phế liệu thủy sản, nhất là phế liệu tôm thải ra từ các cơ sở chế biển thủy sản nếu không xử lý đúng cách sẽ gây ô nhiễm môi trường lớn.Công nghệ chế biến tôm tạo ra một lượng lớn phế thải rắn bao gồm đầu và vỏ tôm, thường chiếm 50-70% nguyên liệu ban đầu (Đỗ Vãn Nam và cs, 2005, Shahidi và Synowiecki, 1991)

Cỏ nhiều nghiên cứu về thành phần của tôm, ví dụ tôm càng xanh

Macrobrachium rosenbergii, đầu tôm chiếm tới 60% trọng lượng tôm Đầu tôm sú Penaeus monodon cũng chiếm tới 40% trọng lượng tôm Với sản phẩm tôm lột vỏ, rút

chỉ lưng, lượng đuôi và vỏ đuôi của tôm chiếm khoảng 25% trọng lượng tôm Đối với tôm thẻ, phần còn lại sau quá trình chế biến như lượng đầu tôm chiếm 28% và vỏ chiếm 9% như vậy tổng lượng phế liệu vỏ đầu tôm thẻ là 37% Phần còn lại này có thể giảm ít nhiều bằng cách nâng cao hiệu quả lột vỏ nhờ các thiết bị và công nghệ chế biển tốt hơn Giảm lượng phế liệu từ khâu chế biến hoặc tìm giải pháp tái sử dụng chúng đang trở nên phổ biến như một phương cách giúp làm tăng lợi nhuận cho ngành thuỷ sản Nhiều công trình nghiên cứu cho thấy tỷ lệ của PLT từ 30-70% Watkin và cộng sự, 1982 ; Evers và Carroll, 1996 , tmng bình khoảng 50% so với khối lượng tôm chưa chế biến Halanda và Netto (2006) cho rằng PLT có thể chiếm 50-70% so với nguyên liệu Phần lớn tôm được đưa vào chế biến dưới dạng bóc vỏ, bỏ đầu Phần đầu thường chiếm khối lượng 34-45%, phần vỏ, đuôi và chân chiếm 10-15% trọng lượng

của tôm nguyên liệu Tuy nhiên, tỉ lệ này tuỳ thuộc vào giống loài và giai đoạn sinh trưởng của chúng.

Trong công nghệ sản xuất chitin thường bao gồm quá trình khử protein, khử khoáng và tẩy trắng Theo phương pháp truyền thống, vỏ đầu tôm được khử protein bằng dung dịch kiềm mạnh (Gilderg và Stenberg 2001; Synowiecki và Al-Khateeb 2003), điều này dẫn tới các vấn đề ô nhiễm môi trường, khi nước thải có chứa kiềm, protein, và các sản phẩm thủy phân protein Hơn nữa, protein bị hạn chế sử dụng do các phản ứng không mong muốn giữa các amino acid trong môi trường kiềm mạnh, ngoài ra còn có sự kết tụ của các amino acid (Nashef và cộng sự, 1977); Gagnes và Simpson, 1993; Synowiecki và Al-Khateed, 2003) Việc thu hồi một phần protein từ phế liệu tôm bằng enzyme thủy phân đã được nghiên cứu rộng rãi (Simpson và Haard, 1985; Cano-Lopezandothers, 1987; Synowiecki và Al-Khateeb, 2000; Gildberg và Stenberg, 2001; Mizani và cộng sự, 2005) Gagne và Simpson, 1993, đầu tư ứng dụng chymotrypsin và papain để khử protein của phế liệu tôm Nghiên cứu chỉ ra hàm lượng protein còn lại trong phế liệu sau khi thủy phân là 1,3% và 2,8% với các mẫu được xử

lý bằng enzyme chymotrysin và papain

Protease là enzyme xúc tác thủy phân liên kết peptid (CO - NH) trong phân tử protein và các cơ chất tương tự Hiệu suất xúc tác của nó có thể gấp hàng trăm, hàng nghìn hoặc hàng triệu làn so với các chất xúc tác vô cơ khác Quan trọng hơn nữa là nó

có khả năng xúc tác cho phản ứng hóa học xảy ra trong điều kiện nhẹ nhàng, nhiệt độ

và áp suất bình thường, pH môi trường gần như pH sinh lý và có khả năng xúc tác đặc hiệu cao đối với kiểu phản ứng cũng như cơ chất mà nó tác dụng, sản phẩm tạo ra thuần khiết, ít tạp chất Do những ưu điểm này mà ngày nay việc nghiên cửu ứng dụng enzyme trong đời sống mang nhiều ý nghĩa khoa học lẫn thực tiễn

Protein thủy phân.

Protein là một chuỗi polymer bao gồm các nhóm amino gắn với nhau bởi các liên kểt peptid Phản ứng liên quan đến việc phá vỡ chuỗi các nhóm amino này thành các mạch, nhánh nhỏ hơn sử dụng nước được gọi là sự thủy phân protein Trong môi trường nước sự thủy phân protein sẽ xảy ra như trong hình:

Hình 1.1: Phản ứng thủy phân protein.

Trong suốt quá trình phản ứng, liên kết peptid sẽ được bẻ gãy ra do sự tấn công neucleophilic bởi phân tử nước, tạo thành acid carboxylic và amin Nhóm carboxyl và

nhóm amino tự do hình thành sau quá trình thủy phân sẽ nhiều hơn hay ít ion hóa hơn,

phụ thuộc vào pH của phản ứng thủy phân Từ đây sẽ hình thành anion RCOO- và cation R-NH3+

Theo Alder - Nissen, thêm nước vào trong quá trình thủy phân protein có liên quan đến sự tấn công nucleophilic, các nhóm amino tự do (-NH2) cỏ thể cũng hoạt động như nucleophilic phản ứng trực tiếp với protein để tách các liên kết peptid Phản ứng này cũng được xem như sự vận chuyển các peptid sinh ra anion RCOO- và cation R-NH3+ Vì vậy, trong quá ừình thủy phân protein, các nhóm amino tự do hình thành cũng hỗ trợ cho sự phá vỡ, cắt mạch protein Sự thủy phân protein diễn ra rất chậm ở điều kiện bình thường, ví dụ pH trung tính và nhiệt độ phòng Sử dụng enzyme chắc chắn sẽ thúc đẩy phản ứng thủy phân, dẫn tới việc cắt mạch chuỗi peptid triệt để hơn, hình thành nhiều phân tử nhỏ hơn như acid amin

Các đặc tính của protein thủy phân được đánh giá thông qua độ thủy phân và cấu trúc của các peptid tạo thành Điều này phụ thuộc vào tính chất tự nhiên của protein và tính đặc hiệu của enzyme sử dụng, cũng như việc kiểm soát các thông số của quá trình thủy phân như nhiệt đô, pH, nó sẽ làm giảm các phụ phẩm của quá trình thủy phân và cải thiện các tính chất và chức năng như: khả năng tạo nhũ, khả năng tạo bọt, độ nhớt, sự tạo gel và khả năng hấp thụ nước, Giá trị dinh dường của protein thường được giữ nguyên hay tăng lên bởi enzyme thủy phân, khi mà tiến hành dưới các điều kiện phản ứng nhẹ nhàng Protein bị cắt mạch thành các đơn vị nhỏ hơn như peptid hay acid amin

Ngoài ra còn có một vài nghiên cứu so sánh hiệu quả tách protein giữa enzyme

và vi khuẩn Bustos và Michael, 1994, tìm thấy Pseudomonas maltophiỉia khử được

82% protein sau 6 ngày thủy phân, còn protease từ vi khuẩn thấp hơn 64% trong cùng điều kiện thủy phân Wang & Chio, Legarraeta và cộng sự (1996) đã sử dụng enzyme protease và vi khuẩn có khả năng tạo protease để tách protein nhằm thay thế cho phương pháp hoá học Quá trình này giúp tận dụng tối đa giá trị của nguồn phế liệu và hạn chế ảnh hưởng đến môi trường Hall & De Silva (1994) đã đề xuất một phương pháp khử khoáng đơn giản bằng việc sử dụng lên men lactic như là một phương pháp bảo quản phế liệu Phương pháp này là dạng ủ chua ban đầu được phát triển cho bảo quản phế liệu tôm pandan trước quá trình chế biến ở khí hậu nhiệt đới ủ chua là một quá trình đơn giản của việc bảo quản nguyên liệu tránh vi sinh vật gây thối và đã được ứng dụng cho bảo quản cá trong nhiều năm (Hall & De Silva, 1994) Năm 1998 công

bố việc khử protein phế liệu giáp xác bằng Pseudomonas aeruginosa K -187 Sau 5

ngày thủy phân khử được 82% protein từ vỏ và đầu tôm Kểt quả này cũng rất gần với

82% sau 6 ngày thủy phân bang Pseudomonas maltophilia ghi nhận bởi Bustos và Michael (1994) Shimahara và Takiuchi, 1998 đã sử dụng p.matophilỉa vào việc tách

protein từ các mảnh vỏ đã tách khoáng từ các nguồn khác nhau và thấy rằng hàm lượng protein còn lại trên vỏ tôm đã tách khoáng vào khoảng 1% Đối với vỏ tôm và cua đã tách khoáng, protein còn lại 5% và 8% sau 8 ngày tách protein

Joszef Synowiecki và cộng sự (1999) nghiên cứu ứng dụng Alcalase để khử

protein của phế liệu vỏ tôm Crangon crangon nhằm thu hồi chitin và protein Ban đầu

vỏ tôm Crangon crangon được khử khoáng sơ bộ bằng dung dịch HC1 10% ở 20°c

trong 30 phút và khử protein bởi enzyme thương mại Alcalase ở 55°c và pH 8,5 Dịch thuỷ phân thu được chứa 63% protein so với vật chất khô, 6,24% lipid, 23,4% NaCl

Để hiểu thêm về khả năng khử protein của enzyme protease, Jen-Kuo Yang và cộng sự

(1999) sử dụng protease từ Bacillus subtilis (ở nhiệt độ 50°c, pH 8,0) để khử protein

từ vỏ tôm, vỏ ghẹ và vỏ tôm hùm trong công nghệ sản xuất chitosan Kết quả đã loại

bỏ được 88%, 67%, 83% protein theo thứ tự Yi-Su Oh và cộng sự (1999) cho biết sử

dụng protease từ Pseudomonas aeruginosa có thể loại bỏ được 73% protein sau 7 ngày

thủy phân vỏ tôm, vỏ ghẹ Việc khử protein phế liệu giáp xác đã được công bố với

việc sử dụng protease sản xuất từ vi khuẩn như Pseudomonas maltophiỉia LC-102 (Shimahara cộng sự, 1984) và Bacillus subtỉlis (Yang và cộng sự, 2000) Đầu tôm và

vỏ tôm chứa hàm lượng protein cân bằng và khoáng như Ca, p, Na, và Zn (Ibrahim et

al 1999) Holanda và Netto, 2006 nghiên cứu thu hồi 3 thành phần chính của phế liệu

tôm, protein, Chitin, asthaxanthin bằng việc sử dụng enzyme Alcalase và pancreatin

Theo tác giả trong phế liệu tôm Xỉphopenaeus kroyeri có chứa 39,42% protein, 31,98

% tro, và 19,92 % chitin Tiến hành thủy phân khử protein bằng enzyme Alcalase tại

các điều kiện: tỷ lệ enzyme/nguyên liệu (E/S) 3%, nhiệt độ 60°c, pH=8,5 Kết quả cho

thấy khi tăng độ thủy phân (DH) từ 6% tới 12% thì thu được 26% và 28% protein tương ứng Alcalase có ảnh hưởng nhiều hơn pancreatin, có thể thu hồi protein từ 57,5% đến 64,6% và asthaxanthin từ 4,7 đến 5,7 mg asthaxanthin /lOOg phế liệu khô tại DH 12% Gần đây nhất, năm 2011, Krushna Chandra Dora đã tiến hành so sánh hiệu quả thủy phân của bốn enzyme Alcalase, Protamex, Flavourzyme và Neutrase thông qua độ thủy phân và hiệu suất thu hồi protein, kết quả cho thấy rằng sau 90 phút thủy phân thì Alcalase cho độ thủy phân là 32.88%, kết quả này cao hẳn hơn ba loại enzyme còn lại, hiệu suất thu hồi protein bằng Alcalase (58%) cũng cao hơn so với Protamex (53%), Flavourzyme (52%)và hiệu quả thấp nhất là Neutrase (50%) Điều này chứng tỏ Alcalase đặc hiệu với protein tôm

Thành phần của protein thủy phân gồm các peptid và các axit amin khi sự phân giải protein được gây ra bởi protease nội tại và enzyme bổ sung Nó dường như là thành phần ứng dụng khoa học dinh dưỡng của protein thủy phân không tinh chế, nó

có thể giúp ích chút ít hơn peptid tinh chế từ sự hút của Oligopeptid được tăng lên sự

do có mặt của nó đường và axit amin

Peptid từ thực phẩm được coi là hợp chất an toàn và có lợi cho sức khỏe, chúng

có cấu trúc đơn giản, có nhiều tính chất ổn định Chúng có giá trị dinh dưỡng cao và nhiều chức năng sinh học như chống tăng huyết áp, điều hòa miễn dịch [26] trong đó

có chức năng chống oxi hóa cỏ sự ức chế quá trình peroxid lipid, lọc sạch các gốc tự

do và kiềm hãm sự chuyển đổi ion kim loại của các peptid chống oxi hóa Khả năng chống oxi hóa của các peptid có liên quan tới kết cấu của chúng, cấu trúc và tính không ưa nước Sự hiện diện ở vị trí thích hợp của các axit amin cấu thảnh các peptid trong chuỗi peptịd giữ một vai trò quan trọng trong chức năng chống oxi hóa của peptid Liên kết peptid phản ánh cấu trúc rõ ràng, cụ thể của peptid, đồng thời cũng được khẳng định là có ảnh hưởng đến phạm vi chất chống oxi hỏa của peptid Khối lượng phân

tử của peptid cũng ảnh hưởng đến hoạt động chống oxi hóa của nó, peptid có khối lượng phân tử trong khoảng 500 - 1500 Da là có hoạt động chống oxi hóa tốt nhất

Bên cạnh đó, trên thế giới cũng đã có nhiều nghiên cửu về xác định, đánh giá độ thủy phân như pH-stat, đánh giá hàm lượng nitơ hòa tan, phương pháp sử dụng axit trinitobenzene sulfonic (phương pháp TNBS), phương pháp ophthaldialdehyde (OPA)

Theo Jens Adler-Nissen đã xác định độ thủy phân của protein bằng axit trinitrobenzensulfonic.[24] Frank c Church và cộng sự đã sử dụng phương pháp OPA để xác định độ thủy phân protein của sữa.[23] Ngoài ra còn có nhiều nghiên cửu

về phương pháp OPA như: Church, Porter, Catignamp, & Swaisgood,1985; Fisher, Meisel, &Schlimme, 1986; Garcia AlvarezCoque, Medina Hernandez, Villanueva Camanas, &Mongay Fernandez, 1989a,b; Nielsen, Petersen, & Dambmann, 2001.[33][36].1.2 Tổng quan về enzyme và quá trình thủy phân

Enzyme hay còn gọi là men, là chất xúc tác sinh học có bản chất protein Enzyme có trong tế bào của mồi cơ thể sinh vật Enzyme không những làm nhiệm vụ xúc tác đặc hiệu cho phản ứng hóa học nhất sinh trong cơ thể sinh vật (phản ứng của các quá trình trao đổi chất trong cơ thể sống) mà còn xúc tác cho các phản ứng ngoài

tế bào Vì cỏ nguồn gốc sinh vật do đó enzyme thường được gọi là xác tác sinh học nhằm phân biết với các chất xúc tác hóa học khác Chính nhờ sự có mặt của enzyme

mà nhiều phản ứng hóa học rất khó xảy ra trong điều kiện bình thường ở ngoài cơ thể (để tiến hành cần có nhiệt độ cao, áp suất cao, acid mạnh hay kiềm mạnh ) nhưng trong cơ thể, nó xảy ra hết sức nhanh chóng, liên tục và nhịp nhàng [4]

Enzyme xúc tác cho sự thủy phân protein là protease hay proteinase

Thông thường, enzyme tác dụng và chuyển hoá cơ chất trải qua ba giai đoạn: Giai đoạn I: Enzyme kết hợp với cơ chất bằng liên kết yếu tạo thành phức hợp enzyme - cơ chất (ES) không bền, phản ứng xảy ra nhanh và đòi hỏi năng lượng thấp, các liên kết yếu tạo thành giữa enzyme và cơ chất trongphức họp ES là: tương tác tĩnh điện, liên kết Hydrogen, liên kết Vandecvan

Giai đoạn II: là giai đoạn tạo phức chất hoạt hoá xảy ra sự biến đổi cơ chất, dưới tác dụng của một số nhóm chức trong trung tâm hoạt động của enzyme làm cho

cơ chất từ chỗ không hoạt động trở thành hoạt động, một số liênkết trong cơ chất bị kéo căng ra và mật độ electron trong cơ chất bị thay đổi

Giai đoạn III: là giai đoạn tạo ra sản phẩm của phản ứng và giải phóng enzyme Đây là giai đoạn cuối của quá trình phản ứng từ cơ chất sẽ hình thành sản phẩm và enzyme được giải phóng ra dưới dạng tự do như ban đầu

Enzyme Alcalase là một loại enzyme endoprotease có hoạt độ cao, thu được từ

Bacillus licheniformis, Đây là enzyme được phân tách và tinh sạch từ nguồn vi sinh

vật Sử dụng enzyme Alcalase cho phép điều chỉnh dễ dàng độ thủy phân, tính toán được lượng base yêu cầu để duy trì pH không đổi trong suốt quá trình thủy phân Chọn enzyme này cũng dựa trên đặc trưng của nó cho khả năng không hút nước của các axit amin vào giai đoạn cuối, dẫn đến sản phẩm thủy phân không có vị đắng (Adler-Nissen, 1986), đồng thời sản phẩm có sự cân bằng tốt các axit amin thiết yểu (Kristinsson và Rasco, 2000)

Nhiệt độ bảo quản tốt nhất là 0+10°c.

Điều kiện hoạt động tối ưu cho enzyme Alcalase AF 2.4 L: pH = 8

Nhiệt độ: 50 + 60°c (122 + 140°F)

DH (%) tối đa 15 + 25

Đe kiểm soát đặc tính chức năng của sản phẩm thủy phân thì nên dừng phản ứng enzyme gần với DH % xác định Tất cả protease có thể bị bất hoạt bằng cách xử lý

nhiệt ở 85°c, thời gian 10 phút hoặc protease Alcalase bị bất hoạt tại pH = 4 hay thấp

hơn trong khoảng 30 phút Phản ứng có thể dừng tức thời bằng cách thêm vào các acid thích hợp như: acid hydrochloric, phosphoric, malic, lactic, acetic Tăng nhiệt độ tức thời khó đạt được dưới các điều kiện công nghiệp và nó có thể khó để kiểm soát DH %

do sự thủy phân vẫn tiếp tục trong suốt giai đoạn bất hoạt

1.3 Tổng quan về protein, tính chất và phương pháp thu hồi protein.

1.3.1 Tổng quan về protein, tính chất hòa tan của protein.

Quá trình hòa tan của phân tử protein trong nước bắt đầu từ sự tiếp xúc giữa các phân tử nước với phân tử protein Khi đó các phân tử nước có độ phân cực cao bị hấp phụ bởi các nhóm phân cực trên bề mặt các phân tử protein Kế đến sự phân tán các phân tử protein trong môi trường nước sẽ góp phần làm tăng bề mặt tiếp xúc liên pha, dẫn đến hình thành lóp vỏ hydrate bao quanh bề mặt phân tử protein, làm cho protein hòa tan vào trong môi trường nước (bằng phương pháp nhiễu xạ tia X người ta đã xác định được lớp vỏ hydrate này là lớp nước đơn phân từ, cỏ bề dày khoảng 3A°, đúng bằng kích thước của phân tử nước) Khi đó trạng thái hòa tan của các phân tử protein trong nước sẽ được duy trì bởi 2 yếu tố: độ bền của lớp vỏ hydrate bao quanh bề mặt phân tử và khả năng tích điện cùng dấu của các phân tử protein (lực đẩy tĩnh điện giữa các phân tử)

Do vậy, yếu tố đầu tiên ảnh hưởng đến tính chất hòa tan của protein là cấu tạo của phân tử protein Trật tự sắp xếp và tỷ lệ giửa các nhóm phân cực (nhóm ưa nước)

và các nhóm không phân cực (nhóm kỵ nước) trong phân tử protein sẽ đặc trưng cho khả năng hòa tan của phân tử protein Cụ thể là với các nhóm như -OH, -SH, -COOH,

-NH2) có tính ưa nước sẽ làm tăng độ hòa tan của phân tử protein trong nước trong khi

đó các nhóm có tính kỵ nước như -CH3, -C2H5, -C3H7 sẽ làm giảm tính tan của protein trong nước Các phân tử protein có cấu trúc không gian dạng sợi như keratin, fibroin, miozin, tan kém trong nước, còn các phân tử protein dạng hình cầu như albumin, mioglobin, hemoglobin, lại tan tốt trong nước

Ngoài ra, dưới tác dụng cộng họp của các yếu tố môi trường như: pH, nhiệt độ, nồng độ muối trumg tính trong dung dịch, dung môi hữu cơ thì khả năng hòa tan của protein cũng thay đổi rất nhiều[3][7][10]

Phương pháp thu hồi protein hòa tan

Giới thiệu về công nghệ sấy và sẩy phun:

1.3.2 Thu hồi protein bằng phương pháp sấy phun

- Sẩy là quá trình làm bốc hơi nước ra khỏi vật liệu dưới tác dụng của nhiệt Trong quá trình sấy, nước được tách ra khỏi vật liệu nhờ sự khuếch tán do:

+ Chênh lệch độ ẩm giữa bề mặt và bên trong vật liệu

+ Chênh lệch áp suất hơi riêng phần của nước tại bề mặt vật liệu và môi trường xung quanh

Mục đích của quá trình sấy là làm giảm khối lượng vật liệu, tăng độ bền và bảo quản sản phẩm được lâu hơn

- Sấy phun là một trong những công nghệ sấy công nghiệp chỉnh do khả năng sấy một bậc nguyên liệu từ dạng lỏng sang dạng bột khá đơn giản, dễ dàng kiểm soát nhiệt độ và định dạng hạt sản phẩm một cách chính xác

Thiết bị sẩy phun dùng để sấy các dạng dung dịch và huyền phù trong trạng thái phân tán nhằm tách ẩm ra khỏi vật liệu giúp tăng độ bền và bảo quản sản phẩm được lâu hơn

Sản phẩm của quá trình sấy phun là dạng bột mịn như bột đậu nành, bột trứng, bột sữa, hoặc các chế phẩm sinh học, dược liệu

1.3.2.1 Nguyên lý của phương pháp sấy phun.

Một hệ phân tán mịn của nguyên liệu từ chất lỏng hòa tan, nhũ tương, huyền

phù đã được cô đặc trước (40 - 60% ẩm) được phun để hình thành những giọt mịn, rơi vào trong dòng khí nóng cùng chiều hoặc ngược chiều ở nhiệt độ khoảng 150 - 300°c

trong buồng sấy lớn Kết quả là hơi nước được bốc đi nhanh chóng Các hạt sản phẩm được tách ra khỏi tác nhân sấy nhờ một hệ thống thu hồi riêng

1.3.2.2 Cấu tạo và nguyên lý hoạt động của máy sấy phun.

a Cấu tạo chung.

Tất cả các thiết bị sấy phun đều bao gồm:

+ Cơ cấu phun: Có chức năng đưa nguyên liệu (dạng lỏng) vào buồng dưới dạng hạt mịn (sương mù) Quá trình tạo sương mù sẽ quyết định kích thước các giọt lỏng và sự phân bố của chúng trong buồng sấy, do đó sẽ ảnh hưởng đến giá trị bề mặt truyền nhiệt và tốc độ sấy Cơ cấu phun cỏ các dạng như: cơ cấu phun áp lực, cơ cấu phun bằng khí động, đầu phun ly tâm

+ Buồng sấy: Là nơi hòa trộn mẫu sấy (dạng sương mù) và tác nhân sấy (không khí nóng) Buồng sấy phun có thể có nhiều hình dạng khác nhau nhưng phổ biến nhất

là buồng sấy hình trụ đứng, đáy côn Kích thước buồng sấy (chiều cao, đường kính ) được thiết kế phụ thuộc vào kích thước các hạt lỏng và quỹ đạo chuyển động của chúng, tức phụ thuộc vào loại cơ cấu phun sương sử dụng

+ Tác nhận sấy: Không khí nóng là tác nhân sấy thông dụng nhất Hơi là tác nhân gia nhiệt phổ biến nhất Nhiệt độ hơi sử dụng thường dao động trong khoảng 150-250°c Nhiệt độ trung bình của không khí nóng thu được thấp hơn nhiệt độ hơi sử dụnglàlO°C

+ Hệ thống thu hồi sản phẩm: Bột sau khi sấy phun được thu hồi tại cửa đáy buồng sấy Đe tách sản phẩm ra khỏi khí thoát, người ta có thể sử dụng nhiều phương pháp khác nhau: lắng xoáy tâm, lọc, lắng tĩnh điện

Phổ biến nhất là phương pháp lắng xoáy tâm, sử dụng cyclon

+ Quạt: Để tăng lưu lượng tác nhân sấy, người ta sử dụng quạt ly tâm ở quy

mô công nghiệp, các thiết bị sấy phun được trang bị hệ thống hai quạt Quạt chính được đặt sau thiết bị thu hồi bột sản phẩm từ dòng khí thoát Còn quạt phụ đặt trước thiết bị gia nhiệt không khí trước khi vào buồng sấy Ưu điểm của việc sử dụng hệ thống hai quạt là người ta có thể kiểm soát dễ dàng áp lực trong buồng sấy

Trong trường họp chỉ sử dụng một quạt ly tâm đặt sau cyclon thu hồi sản phẩm, buồng sấy sẽ hoạt động dưới áp lực chân không rất cao Chính áp lực chân không này

sẽ ảnh hưởng đến lượng bột sản phẩm bị cuốn theo dòng khí thoát, do đó sẽ ảnh hưởng đến năng suất hoạt động và hiệu quả thu hồi bột sản phẩm của cyclon

b Các yếu tố ảnh hưỏmg đến quá trình sấy.

- Nồng độ chất khô của nguyên liệu

Nồng độ cao: Giảm được thời gian bốc hơi nhưng lại tăng độ nhớt của nguyên liệu, gây khó khăn cho quá trình sấy phun

Nồng độ thấp: Tốn nhiều thời gian và năng lượng cho quá trình

Thực tế nồng độ vào khoảng: 45- 52%

- Nhiệt độ tác nhân sẩy:

Đây là yếu tố ảnh hưởng quyết định đến độ ẩm của sản phẩm sau khi sấy phun Khi cố định thời gian sấy, độ ẩm của bột sản phẩm thu được sẽ giảm đi nếu ta tăng nhiệt độ tác nhân sấy

Tuy nhiên, việc gia tăng nhiệt độ cao có thể gây phân hủy một số cấu tử trong nguyên liệu mẫn cảm vói nhiệt và làm tăng mức tiêu hao năng lượng cho toàn bộ quá trình

- Kích thước, số lượng và quỹ đạo chuyển động của các hạt nguyên liệu trong buồng sấy

Các yếu tố khác cũng ảnh hưởng đến quá trình sấy phun là tốc độ bơm đưa dòng nguyên liệu vào cơ cấu phun sương, lưu lượng không khí nóng vào buồng sấy, cấu tạo và kích thước buồng sấy

1.3.2.3 Ưu và nhược điểm của công nghệ sấy phun.

* ưu điểm:

- Quá trình sây nhanh

- Có thể điều khiển được tỷ trọng sản phẩm

- Bột sau khi sấy có độ hòa tan cao (90- 100%), độ ẩm thấp (3- 4%)

- Vận hành liên rục và có thể tự động hóa hoàn toàn

- Chi phí nhân công thấp

- Vận hành và bảo dưỡng đơn giản

- Thiết kế đa dạng cho từng loại sản phẩm, từng loại qui mô nhà máy

- Áp dụng được cho các sản phẩm bền nhiệt và không bền nhiệt, nguyên liệu ở dạng dung dịch, gel, paste, hồ vữa, huyền phù

- Chất lượng bột được bảo đảm trong suốt quá trình sấy.

- Vật liệu hầu như không tiếp xúc với bề mặt kim loại của thiết bị

* Nhược điểm:

- Chi phí đầu tư cao

- Yêu cầu độ ẩm ban đầu cao để đảm bảo nguyên liệu cỏ thể bơm đển thiết bị tạo giọt lỏng

- Chi phí năng lượng cao hơn (để tách ẩm)

- Thất thoát các chất dễ bay hơi cao hơn

1.4 Tổng quan về mantodextrin - Chất ứng dụng bổ sung trong quá trình thu hồi protein hòa tan.

Mantodextrin được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực chể biển thực phẩm

và dược phẩm Theo dược điển Mỹ ƯSP 27[2],

Mantodextrin là một polysaccharide được sử dụng như một phụ gia thực phẩm,

là chất không ngọt, là sản phẩm thủy phân tinh bột không hoàn toàn bằng acid hoặc enzyme hoặc bằng acid và enzyme là hỗn hợp các polyme có đơn vị là D-glucoza có đương lương dextroza DE dưới 20 Đương lượng Dextroza Equivelent viết tắt là DE là đại lượng chỉ khả năng khử đối với chuẩn là 100% ở đường glucoza (dextrose), hay là

số gam tương đương D-glucoza trong 100 gam chất khô của sản phẩm[2][39] Sản phẩm có DE 4-7 được sử dụng để tạo màng mỏng dễ tan và tự hủy được dùng để bọc kẹo, bọc trái cây khi bảo quản, đưa vào kem, làm phụ gia cho các loại nước sốt, làm chất độn tạo viên trong công nghiệp dược

Sản phẩm DE từ 9-12 được dung trong công nghệ sản xuất đồ uống, đặc biệt là

đồ uống dành cho trẻ em, cho vận động viên thể thao, làm kẹo mềm, gum, chất trợ sấy, chất giữ hương, yếu tố tạo hình

Sản phẩm DE từ 15-18 được làm chất kết dính, chất tăng vị cho đồ uống, đưa vào thành phần bơ, sữa bột, cà phê hòa tan, làm vật mang các thành phần không phải đường [20], làm tá dược chính trong công nghệ thực phẩm

1.5 Tổng quan về gốc tự do và khả năng chống oxy hóa.

1.5.1 Tổng quan về gốc tự do.

Theo định nghĩa, gốc tự do ( Free radical ).là bất cử phân tử hóa chất nào chỉ

có một điện tử duy nhất (electron mang điện âm) hay một số lẻ điện tử

v ề khía cạnh hóa học, phần nhỏ nhất của vật thể gọi là nguyên tử Mỗi nguyên

tử có một nhân với một số chẵn điện tử xoay chung quanh, giống như các hành tinh quay chung quanh mặt trời Phân tử gồm một số nguyên từ dính với nhau do tác dụng của các đôi điện tử

Một vài khi, trong diễn tiến hóa học, một điện tử bị tách rời khỏi nhóm và phân

tử đó trở thành một gốc tự do, với số lẻ điện tử Do đó, nó không cân bằngvà không đày đủ nên không ổn định, dễ tạo ra phản ứng Nó luôn luôn tìm cách chiếm đoạt điện

tử mả nó thiếu từ các phân tử khác, và lần lượt tạo ra một chuỗi nhừng gổc tự do mới, gây rối loạn cho sinh hoạt bình thường của tế bào Trong cuộc đời của một người sống tới 70 tuổi, thì có chừng 17 tấn gốc tự do được tạo ra như vậy

Gốc tự do có tác dụng không tốt cho cơ thể ngay từ lúc con người mới sanh ra

và mỗi tế bảo chịu sự tấn công của cả chục ngàn gốc tự do mỗi ngày Ở tuổi trung niên, cơ thể mạnh, nên chúng không thể hiện, nhưng tới tuổi cao, sức yểu, gốc tự do lấn át, gây thiệt hại nhiều gấp mười lần ở người trẻ Nếu không bị kiểm soát, kiềm clìể, gốc tự do gây ra các bệnh thoái hóa như ung thư, xơ cứng động mạch, làm suy yếu hộ thống miễn dịch gây dễ bị nhiễm trùng, làm giảm trí tuệ, teo cơ quan bộ phận người cao niên

Các gốc tự do này phá rách màng tế bào khiến chất dinh dưỡng thất thoát, tế bào không tăng trưởng Nó tạo ra chất lipofuscin tích tụ dưới da khiến ta có những vết đồi mồi trên mặt, trên mu bàn tay Nó tiêu hủy hoặc ngăn cản sự tổng hợp các phân tử chất đạm, đường bột, mỡ, enzyme trong tế bào Nỏ gây đột biến ở gene, ở nhiễm thể, ở DNA, RNA Nó làm chất collagen, elastin mất đàn tính, dẻo dai khiến da nhăn nheo,

cơ khớp cứng nhắc

Theo các nhà nghiên cứu, gốc tự do hủy hoại tế bào theo diễn tiến sau đây: Trước hết, gốc tự do oxy hóa màng tể bào, gây trở ngại trong việc thải chất bã và tiếp nhận thực phẩm, dưỡng khí; rồi gốc tự do tẩn công các ty lạp thể, phá vỡ nguồn cung cấp năng lượng Sau cùng, bằng cách oxy hóa, gốc tự do làm suy yếu kích thích tố, enzym khiến cơ thể không tăng trưởng được

Trong tiến trình lão hóa, gốc tự do cũng dự phần và có thể là nguy cơ gây tử vong Lão hóa được coi như một tích tụ những đổi thay trong mô và tế bào Theo bác

sĩ Denham Harman, các gốc tự do là một trong nhiều nguyên nhân gây ra sự hoá già và sự chết cuả các sinh vật ông ta cho là gốc tự do phản ứng lên ty lạp thể, gây

tổn thương các phân tử bằng cách làm thay đổi hình dạng, cấu trúc, khiến chúng trở nên bất khiển dụng, mất khả năng sản xuất năng lượng.

Theo các nhà khoa học thì gốc tự do có thể là thủ phạm gây ra tới trên 60 bệnh, đáng kể nhất gồm có: bệnh vữa xơ động mạch, ung thư, Alzheimer, Parkinson, đục thuỷ tinh thể, bệnh tiểu đường, cao huyết áp không nguyên nhân, xơ gan

Tuy nhiên, không phải là gốc tự do nào cũng phá hoại Đôi khi chúng cũng có một vài tác động hữu ích Nếu được kiềm chế, nó là nguồn cung cấp năng lượng cho

cơ thể; tạo ra chất mầu melanine cần cho thị giác; góp phần sản xuất prostaglandins có công dụng ngừa nhiễm trùng; tăng cường tính miễn dịch; làm dễ dàng cho sự truyền đạt tín hiệu thần kinh, co bóp cơ thịt

Trong cơ thể cỏ rất nhiều loại gốc tự do, mà các gốc nguy hiểm hơn cả là superoxide, ozone, hydrogen peroxide, lipid peroxy nhất là hydroxyl radical, một gốc rất phản ứng và gây ra nhiều tổn thương

Gốc tự do được tạo ra bằng nhiều cách Nó có thể là sản phẩm của những căng thẳng tâm thần, bệnh hoạn thể xác, mệt mỏi, ô nhiễm môi trường, thuốc lá, dược phẩm, tia phóng xạ mặt trời, thực phẩm có chất mầu tổng họp, nước có nhiều chlorine

và ngay cả oxygen

1.5.2 Cơ chế hoạt động chống oxy hóa.

1.5.2.1 Sự hình thành các gốc tự do.

Nguồn gốc hình thành các gốc tự do (OR, 0 { , NO-, ) như tia ƯV, bức xạ ion hóa, ô

nhiễm không khí, hút thuốc, trao đổi chất, sự cháy, căng thẳng, Các gốc tự do là nguyên

nhân gây tổn thương tế bào, protein, axit nucleic, DNA, và dẫn tới các căn bệnh nguy hiểm như ung thư, lão hóa, tiểu đường, tim mạch Do đó, để tránh sự gây hại của các gốc tự do thì cần thiết phải loại bỏ chúng bằng cách sử dụng các chất chống ôxi hóa bổ sung như vitamin

A, c , E, polyphenol,

(Nguồn: www.amazing-glutathione.com/what-are-antioxidants.html)

Hình 1.3: Sự chống ôxi-hóa

Có nhiều chỉ tiêu để đánh giá quá trình chống ôxi-hóa, trong đó mồi chỉ tiêu thể hiện một khía cạnh của hoạt động chống ôxi-hóa, như vậy nhiều chỉ tiêu sẽ phán ánh một quá trình chống ôxi-hóa tổng thể Một số chỉ tiêu thường được sử dụng để đánh giá quá trình chống ôxi-hóa như sau:

a Hoạt động khử gốc tự do DPPH (2,2-diphenyl-l-picrylhydrazyl)

Cơ chế của hoạt động quét gốc tự do DPPH là sự ghép đôi hydro và đình chỉ quá trình ôxi-hóa bàng sự chuyển các gốc tự do sang trạng thái ổn định hơn Như vậy, khi có mặt của chất chống ôxi hóa nó sẽ khử gốc tự do DPPH và làm cho dung dịch bị giảm màu sắc, do đó độ hấp thụ của dung dịch sẽ giảm đi

Z' + AH = ZH + A‘ (1)Trong đó: Z': là gốc tự do DPPH, AH là chất chống ôxi hóa

b Hoạt động khử ion Fe3+

Cơ chế của hoạt động khử ion sắt 3+ là sự ghép đôi electron và đình chỉ phản ứng ôxi-hóa dây chuyền bằng sự khử dạng ôxi-hóa thành dạng tự do Nguồn gốc chính của gốc tự do hydroxyl là phản ứng Haber-Weiss, trong đó gốc tự do superoxit khử Fe3+ thành Fe2+, sau đó nó xúc tác cho phản ứng Fenton giữa Fe2+và H20 2 Như vậy, khi

có mặt của chất chống ôxi hóa nó sẽ khử gốc tự do superoxit nên hạn chế sự khử Fe3+thành Fe2+ và làm cho dung dịch giữ màu sắc, do đó độ hấp thụ của dung dịch sẽ tăng lên

Fe2+ + H20 2 = Fe3+ + OH' + OH (4)

d Hoạt động chuyển ion sắt 2+

Nguồn gốc của các gốc tự do hydroxyl là phản ứng Fenton giữa Fe2+và H20 2 Như vậy, khi có mặt của chất chổng ôxi hóa sẽ hạn chế sự chuyển Fe2+thành Fe3+ nên màu của dung dịch phản ứng sẽ nhạt hơn, do đó độ hấp thụ sẽ giảm đi

Fe2+ + H20 2 = Fe3+ + OH' + 'OH (5)

CHƯƠNG2 NGUYÊN YẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u

2.1 Nguyên vật liệu dùng trong nghiên cứu.

2.1.1 Nguyền liệu đầu tôm thẻ chân trắng.

Đẩu tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) được chọn là đối tượng nghiên

cứu Đầu tôm được lấy từ nguyên liệu tôm Thẻ chân trắng chế biến tại Công ty c ổ phần Nha Trang Seafoods (F17), Khánh Hòa Nguyên liệu sau khi lấy được vận

chuyển ngay bằng thùng xốp cách nhiệt có bảo quản nước đá, nhiệt độ < 5°c về phòng

thí nghiệm Nguyên liệu trước khi sử dụng được rửa sạch, để ráo trong thời gian 5

phút Trong trường họp chưa làm ngay thì rửa sạch —*■ bao gói —*■ bảo quản đông ở

điều kiện nhiệt độ -20°c tại phòng thí nghiệm Trung tâm Công nghệ sinh học và Môi trường

Enzyme thủy phân thương mại Alcalase 2.4L (Novozymes, Bagsvaerd, Denmark), là

serine endopeptidase, được thu nhận từ Bacillus licheniformis, hoạt độ 2.4AƯ/g.

2.1.2 Dụng cụ, hóa chất, dụng cụ chuyên dụng.

Hóa chất: một số hóa chất pha thuốc thử, các hóa chất sử dụng trong nghiên

cứu đều thuộc loại hóa chất tinh khiết dung cho phân tích được sản xuất tại các hang Merck hoặc Sigma

Thiết bị chuyên dụng: Máy hút chân không, máy cô quay chân không, hệ

thống chưng cất Kjeldahl bán tự động, bể ổn nhiệt, máy ly tâm lạnh, máy đo quang phổ protein UV-VIS, Cân phân tích, bếp điện, máy đo pH, tủ sấy, lò nung, thiết bị sấy phun, sấy chân không, đông khô

Dụng cụ: pipet, micropipette, ống nghiệm, ống ly tâm eppendorff, bình tam

giác, cốc thủy tinh, bình định mức, phễu

2.2 Phưong pháp nghiên cửu

2.2.1 Bố trí thí nghiệm tổng quát.

Sơ đồ 1: Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát

2.2.2 Bo trí thí nghiệm xác định ảnh hưỏ'ng của công đoạn xủ’ lý nhiệt trước thủy phân đến chất lượng dịch thủy phân.

Sơ đồ 2: Bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của công đoạn xử lý nhiệt trước

thủy phân đến chất lượng dịch thủy phân.

Mục tiêu của thí nghiệm này là xác định công đoạn xử lý nhiệt đối với nguyên liệu trước khi thủy phân có ảnh hưởng đên chất lượng và độ thủy phân của dịch thủy phân hay không.

Cách tiên hành: Chuẩn bị 12 bình tam giác 250ml, cho vào mỗi bình lOOg đầu

tôm đã được rã đông qua đêm trong ngăn lạnh 4°c, bổ sung tỉ lệ nguyên liệu/ nước = 1/1 Mang 6 bình đi gia nhiệt ở 90°c trong 10 phút, làm nguội nhanh Bổ sung enzyme

vào 6 bình tỷ lệ enzyme/nguyên liệu là 0.2% được bố trí như sơ đồ trên, tương ứng mỗi mẫu 3 bình thủy phân Kiểm tra giá trị pH ở mỗi bình, so sánh thống kê sự khác nhau có ý nghĩa hay không Nếu sự khác nhau có ý nghĩa thì chỉnh về cùng pfb=8 rồi tiến hành thủy phân, nếu sự khác nhau không có ý nghĩa thì không cần chỉnh về cùng

pH Thủy phân ở 60°c trong 6 giờ, sau đó bất hoạt enzyme ở 90°c trong 10 phút Lọc

tách riêng phần dịch và phần bã Phần dịch được ly tâm, lấy phàn hòa tan, xác định các chỉ tiêu: hàm lượng protein hòa tan, khả năng khử gốc tự do DPPH, tổng năng lực khử Phần bã: xác định hàm lượng protein còn lại trên bã để đánh giá hiệu suất khử protein của quá trình thủy phân

2.2.3 Bố trí thí nghiệm xác định chế độ thủy phân tối ưu.

Mục đích: trên cơ sở kết quả thực hiện của thí nghiệm nghiên cửu ảnh hưởng của công đoạn xử lý nhiệt sơ bộ đầu tôm đến quá trình thủy phân, tiến hành thủy phân đầu tôm theo quy hoạch thực nghiệm Phương pháp quy hoạch thực nghiệm được sử dụng là phương pháp hàm đáp ứng bề mặt-thiết kế có cấu trúc tâm (RSM-CCD), đây cũng là tính mới của đề tài, nhằm mục đích thu được dịch thủy phân có chất lượng tốt như hàm lượng protein hòa tan cao, và đặc biệt là khả năng chống oxy hóa của dịch thủy phân hòa tan là tổt nhất

Phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) là một phương pháp thống kê sử dụng các

dữ liệu định lượng từ các thí nghiệm để xác định và giải thích nhiều biến phương trình RSM khám phá các mối quan hệ giữa các biến giải thích và một hay nhiều biến phản ứng Phương pháp này đã được giới thiệu bởi GEP Box và KB Wilson vào năm 1951

Ý tưởng chính của RSM là sử dụng một chuỗi các thỉ nghiệm được thiết kế để

có được một phản ứng tối ưu Để làm điều này, Box và Wilson đã sử dụng một mô hình đa thức bậc hai Mô hình này chỉ là xấp xỉ, nhưng lại tương đối dễ dàng áp dụng

Trong trường hợp chung, người ta gọi là bề mặt đáp ứng, đại diện hình học hàm mục tiêu của một quá trình vật lý không gian - thời gian ngẫu nhiên cho những biến

kích thích Đặc tính được nghiên cứu, hay hàm mục tiêu Y là kết quả của sự chuyển đôi băng một chức năng đáp ứng rõ ràng (hay còn gọi là chức năng chuyển đổi) Sự thay đôi giá trị của các biên đâu vào sẽ kéo theo sự thay đổi chức năng của hàm mục tiêu Những mô hình thí nghiệm của mặt đáp ứng lưu ý đến sự lựa chọn các biển kích thích, xác định các giai đoạn quan sát và tính toán sai số Những biến đầu vào Xi (i =

1, .,n) cũng được gọi là những biến cơ sở Chúng được đặc trưng bởi một loạt các

thông tin thống kê ụj (j = l, ,p) (chức năng phân phối độc lập hoặc tương quan, cơ

hội chuẩn hóa ) Trong trường họp chung, những biến Xi là những biến thay đổi theo không gian - thời gian

Nói chung, hình thức rõ ràng của chức năng chuyển đổi này tùy thuộc vào các biển cơ sở là không được biết đến, và việc nghiên cứu về tính xấp xỉ được gọi là chức năng đáp ứng trở nên cần thiết Thông thường hơn, nó xuất hiện trong một họ chức năng thường là tuyến tính hoặc phi tuyến tính và được đặc trưng hóa bởi những thông

số x k (k=l, ,l) một cách ngẫu nhiên hay xác định Việc điều chỉnh mục tiêu phải dựa

trên một cơ sở của những số liệu thí nghiệm (thí nghiệm vật lý hay số học) và một hệ

mét cho việc tính toán các sai số, nó cho phép ta suy ra được các thông số x k Sự biểu

diễn hình học của chức năng đáp ứng dưới dạng một đường cong, một mặt phẳng hoặc một mặt phẳng gia tăng được gọi là bề mặt đáp ứng

Phương án có cấu trúc tâm (CCD) là một trường họp đặc biệt trong các nhóm

mô hình quy hoạch thực nghiệm Nó được cấu thành từ ba thành phân:

-Nhân: là một phương án tuyến tính với 2k đỉnh của một hình khối đều trong không gian k chiều Nếu k>5, có thể giảm bớt số thí nghiệm bằng cách sử dụng phương án yếu tổ từng phàn 2k’\

-2k điểm sao (*) nằm trên các trục tọa độ của không gian yếu tố Các tọa độ điểm sao là (±a, 0,0, ,0), (0,±a,0,0 ), (0,0, ,0,±a) a là khoảng cách từ tâm phương án đến điểm sao gọi là cánh tay đòn sao Các diêm sao là cân thiêt đê mở rộng không gian nghiên cứu khảo sát tác động của một yếu tố đơn để cỏ thể tìm được các ước lượng của hệ số bjj và bii trong phương trình hôi quy bậc 2

-no thí nghiệm ở tâm phương án đê tìm phương sai tái hiện

Cánh tay đòn sao a và bố ưí thí nghiệm n0 ở tâm được chọn phụ thuộc vào tiêu

chuẩn tối ưu, thường là phương án hực giao hay phương án quay

Phương trình hồi quy ( mô hình hóa) được biểu diễn bằng phương trình sau:

Y=bo+b1X 1+b2X2+b3X3+b12X 1X2+b23X2X3+bi3X1X3+b11X12+b22X22+b33X32

Trong đó:

b0: là hệ số tự dobi,b2,b3: là hệ số bậc 1

bu, b22, b33: là hệ số bậc 2bj2, b23, b]3: hệ số của từng cặp yếu tố

Xi,X2jX3: là các biến

Y : là hàm mục tiêu

Đe xác định bài toán tối ưu hóa thực nghiệm, cần phân tích các thông số đầu vào, các thông số đàu ra cần nghiên cứu các thông số quá trình thủy phân và hàm mục tiêu

Nguyên liệu đầu tôm, được bổ sung'tỷ lệ nước/nguyên liệu = 1/1 Gia nhiệt ở 90°c

trong 10 phút Sau đó được thủy phân theo mô hình qui hoạch thực nghiệm Composit

Các yếu tố cố định: Tỷ lệ nước/ nguyên liệu= 1/1, pH tự nhiên.

Các yếu tố cần tối ưu:

Tỷ lệ enzyme Alcalase/ nguyên liệu (Xi) trong khoảng [0.1 -0.5%]

Nhiệt độ thủy phân (X2) trong khoảng [50°C-70°C]

Thời gian thủy phân (X3) trong khoảng [2-8 giờ]

- Hàm mục tiêu: Hàm lượng protein hòa tan (mg/tổng dịch) (Yi) càng cao càng tốt,