Tóm tắt Luận án Tiến sĩ kỹ thuật: Nghiên cứu điều chế alginate khối lượng phân tử thấp dùng làm thực phẩm chức năng hỗ trợ phòng chống đông máu

Mục đích nghiên cứu của Luận án nhằm điều chế được alginate khối lượng phân tử thấp từ rong nâu thu mẫu tại vịnh Nha Trang, có hoạt tính chống đông máu dùng làm nguyên liệu để sản xuất thực phẩm chức năng. Mời các bạn cùng tham khảo!

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

NGUYỄN VĂN THÀNH

NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ ALGINATE KHỐI LƯỢNG PHÂN

TỬ THẤP DÙNG LÀM THỰC PHẨM CHỨC NĂNG HỖ TRỢ

PHÒNG CHỐNG ĐÔNG MÁU

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT

Chuyên ngành: Công nghệ chế biến thủy sản

Mã số : 9540105

KHÁNH HÒA - 2019

Công trình được hoàn thành tại Trường Đại học Nha Trang

Người hướng dẫn khoa học: 1 PGS TS Vũ Ngọc Bội

2 PGS TS Trần Thị Thanh Vân

Phản biện 1: PGS.TS Ngô Đăng Nghĩa

Phản biện 2: PGS.TS Ngô Đại Nghiệp

Phản biện 3: PGS.TS Nguyễn Hữu Đại

Luận án được bảo vệ tại Hội đồng đánh giá luận án cấp Trường họp tại Trường Đại học Nha Trang vào hồi… giờ, ngày……tháng……năm 2019

Có thể tìm hiểu luận án tại: Thư viện Quốc gia

Thư viện Trường Đại học Nha Trang

TÓM TẮT NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN

Đề tài luận án: Nghiên cứu điều chế alginate khối lượng phân tử thấp dùng làm thực

phẩm chức năng hỗ trợ phòng chống đông máu

Chuyên ngành: Công nghệ Chế biến Thủy sản Mã số: 9540105

Nghiên cứu sinh: Nguyễn Văn Thành Khóa: 2012

Người hướng dẫn: 1 PGS TS Vũ Ngọc Bội

1) Luận án đã xác định được 3 loài rong mơ S mcclurei, S polycystum và T ornata

có hàm lượng fucoidan cao nhất khi thu hoạch vào các tháng 4 và tháng 5 Ngoài ra, 2 loài rong nâu S mcclurei và T ornata có hàm lượng alginate đạt cao nhất khi thu hoạch vào tháng 4 và loài S polycystum có hàm lượng alginate đạt cao nhất khi thu hoạch vào tháng 5 Trong số 3 loài rong đã nghiên cứu thì T ornata là loài thích hợp dùng làm nguyên liệu cho quá trình sản xuất đồng thời cả fucoidan và alginate

2) Luận án đã xác định được điều kiện tối ưu cho quá trình nấu chiết sodium alginate có độ nhớt cao từ rong mơ T ornata: dung dịch nấu chiết có pH thích hợp là

11 (điều chỉnh bằng Na 2 CO 3 ), nhiệt độ nấu chiết thích hợp là 59 o C và thời gian nấu chiết là 1,5 giờ, nồng độ ethanol thích hợp để kết tủa sodium alginate từ dịch chiết là 70% Sodium alginate sản xuất từ rong mơ T ornata có độ tinh sạch cao, có tỷ lệ M/G

là 1,06 và có khối lượng phân tử trung bình 648,32 kDal, độ polymer hóa phân tử trung bình là 1037, chỉ số đa phân tán là 3,56 với hiệu suất nấu chiết đạt 87,93% Sản phẩm sodium alginate sản xuất theo quy trình đạt tiêu chuẩn cảm quan, hóa học và vi sinh vật theo quy định hiện hành của Bộ Y tế

3) Luận án đã điều chế được sodium alginate khối lượng phân tử thấp bằng phương pháp thủy phân bằng acid Sản phẩm sodium alginate khối lượng phân tử thấp thu được bao gồm sodium guluronate chiếm 49,17 ± 1,21%, sodium mannuronate chiếm 38,13 ± 1,16% và sodium guluronate - mannuronate chiếm 3,96 ± 1,08% Sodium guluronate và sodium mannuronate thu được đều có độ tinh sạch cao, có khối lượng

phân tử trung bình tương ứng là 21,661 kDa và 33,759 kDa, độ polymer hóa phân tử trung bình tương ứng là 89 và 128, chỉ số đa phân tán tương ứng là 1,38 và 1,49 4) Luận án đã xác định được các điều kiện thích hợp cho quá trình điều chế SGS như sau: các điều kiện của phản ứng điều chế tác nhân sulfate hóa là: tỷ lệ NaHSO 3 /NaNO 2 là 4,25/1 mol/g, nhiệt độ phản ứng 90 o C và thời gian phản ứng 90 phút; các điều kiện của quá trình tổng hợp SGS là: pH = 9, tỷ lệ nồng độ tác nhân sulfate hóa/sodium guluronate là 2/198 mol/g, nhiệt độ phản ứng là 40 o C và thời gian phản ứng tổng hợp là 4 giờ Từ đó, xây dựng được quy trình sản xuất SGS từ sodium alginate của rong nâu T ornata Chế phẩm SGS sản xuất theo quy trình có độ tinh sạch cao, có khối lượng phân tử trung bình 25,408 kDa, độ polymer hóa phân tử trung bình là 107, chỉ số đa phân tán là 1,35

5) Kết quả đánh giá hoạt tính chống đông máu của SGS cho thấy hoạt tính chống đông máu phụ thuộc vào khối lượng phân tử trung bình và nồng độ của SGS Chế phẩm SGS có tác dụng kéo dài thời gian đông máu nội sinh (APTT) và thời gian đông máu chung (TT), nhưng tác dụng kéo dài thời gian đông máu ngoại sinh (PT) không đáng kể Bên cạnh đó, SGS không độc đối với chuột thí nghiệm Do vậy, SGS có thể sử dụng làm nguyên liệu để sản xuất thực phẩm chức năng hỗ trợ phòng chống đông máu ở người

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN NGHIÊN CỨU SINH

PGS TS Vũ Ngọc Bội PGS TS Trần Thị Thanh Vân Nguyễn Văn Thành

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CÓ

LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

1 Nguyễn Văn Thành, Vũ Ngọc Bội,Trần Thị Thanh Vân và Nguyễn Đình Thuất

(2017), “Tối ưu hóa các điều kiện phản ứng tổng hợp polyguluronat sulfat”, Tạp chí

Khoa học – Công nghệ Thủy sản, số 1/2017, Trường Đại học Nha Trang, trang 82-90

2 Nguyễn Văn Thành, Bùi Văn Nguyên,Nguyễn Đình Thuất, Trần Thị Thanh Vân và Vũ Ngọc Bội (2017), “Tối ưu hóa quá trình nấu chiết alginate từ bã rong nâu

Turbinaria ornata (TURNER) J AGARDH”, Tạp chí Đại học Cần Thơ, 49B, Trường

Đại học Cần Thơ, trang 116-121

3 Nguyễn Văn Thành, Đỗ Thị Thanh Xuân, Ngô Văn Quang, Vũ Ngọc Bội, Bùi

Minh Lý, Trần Thị Thanh Vân và Thành Thị Thu Thủy (2014), “Cấu trúc và hoạt tính

kháng vi sinh vật kiểm định của alginate từ rong nâu Turbinaria ornata”, Tạp chí Hóa

học, T.52 (6A), Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, trang 149-152

4 Đỗ Thị Thanh Xuân, Nguyễn Văn Thành, Đặng Vũ Lương, Bùi Minh Lý,

Trần Thị Thanh Vân và Thành Thị Thu Thủy (2014), “Nghiên cứu phân lập và cấu trúc

hóa học của alginate và phân đoạn của chúng từ rong nâu Turbinaria ornata (TURNER)

J AGARDH”, Tạp chí Khoa học và Công nghệ, 52(5A), Viện Hàn lâm Khoa học và

Công nghệ Việt Nam, trang 35-41

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của Luận án

Alginate là một trong những hợp chất hydrocolloid (dịch keo) có ứng dụng rộng rãi trong rất nhiều ngành công nghiệp, đặc biệt là các ngành công nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm

và dược phẩm Trong những năm gần đây, nhiều nghiên cứu trên thế giới cho thấy các alginate trọng lượng phân tử thấp thể hiện nhiều hoạt tính sinh học quý như hoạt tính chống oxy hóa, kháng viêm, khả năng chống dị ứng, kháng khuẩn, chống béo phì, kháng ung thư, ngăn ngừa các bệnh tăng huyết áp, giảm cholesteron và giảm lượng đường trong máu, … Alginate không có hoạt tính chống đông tụ máu, tuy nhiên alginate sulfate (alginate được sulfate hóa) thì có khả năng tương thích cao với máu bởi vì cấu trúc của nó cũng tương tự như cấu trúc của heparin và hoạt tính chống đông máu của nó đã được thế giới nghiên cứu Alginate có hàm lượng sulfur khoảng 10 % (w/w) được dùng làm chất kết dính đặc hiệu và điều khiển tạo ra các chất kháng đông do kết hợp với protein Tuy nhiên, hoạt tính chống đông máu của alginate sulfate phụ thuộc vào trọng lượng phân tử, tỷ lệ

M/G, trình tự sắp xếp các uronic, loài rong, hàm lượng sulfur, … Chính vì vậy, các

alginate sulfate trọng lượng phân tử thấp đã và đang mở ra tiềm năng ứng dụng mạnh mẽ trong các ngành công nghiệp dược phẩm và thực phẩm chức năng

Luận án “Nghiên cứu điều chế alginate khối lượng phân tử thấp dùng làm thực phẩm

chức năng hỗ trợ phòng chống đông máu” từ nguồn nguyên liệu rong mơ sau khi rong

được chiết fucoidan là yêu cầu hết sức cần thiết, nhằm tăng cường khai thác và sử dụng hiệu quả nguồn lợi rong mơ, hoàn chỉnh thêm những nghiên cứu về alginate của rong mơ Việt Nam theo định hướng tìm kiếm, phát hiện hoạt tính chống đông máu của nó Từ đó

khơi mở các nghiên cứu ứng dụng alginate khối lượng phân tử thấp vào lĩnh vực sản xuất

thực phẩm chức năng hỗ trợ tích cực chăm sóc sức khỏe cộng đồng và phát triển kinh tế xã hội trong tương lai

2 Mục đích của Luận án

Điều chế được alginate khối lượng phân tử thấp từ rong nâu thu mẫu tại vịnh Nha Trang, có hoạt tính chống đông máu dùng làm nguyên liệu để sản xuất thực phẩm chức năng

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

3.1 Đối tượng nghiên cứu: Alginate từ rong mơ thu tại vùng biển Nha Trang, tỉnh Khánh Hòa

quy trình sản xuất sodium guluronate sulfate (SGS) từ alginate của rong nâu T ornata và

đánh giá các đặc tính của SGS; (5) Đánh giá in vitro hoạt tính chống đông máu và đánh giá

độc tính của SGS dùng làm nguyên liệu để sản xuất thực phẩm chức năng

4 Phương pháp nghiên cứu

Sử dụng các phương pháp phân tích hiện đại: Phân tích hàm lượng các nguyên tố kim loại nặng Hg, As, Cd và Pb bằng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử - lò graphite

- chất cải biến hóa học (CM-GF-AAS); Xác định khối lượng phân tử trung bình của alginate bằng phương pháp sắc ký thẩm thấu gel (Gel Permeation Chromatography - GPC) tại Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh; Xác định hàm lượng sulfate theo phương pháp sulfate bari nephtlometry (dùng ánh sáng phản chiếu

để đo mật độ các hạt trong chất lỏng); Các phương pháp xác định cấu trúc của alginate: xác định phổ hồng ngoại (IR) bằng máy FT-IR Brucker và phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) được đo ở nhiệt độ 70 ºC với dung môi D2O trên máy Brucker AVANCE 500 MHz tại Viện Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam; Đồng thời, luận

án cũng sử dụng phương pháp toán học trong tối ưu hóa quá trình thí nghiệm và xử lý thống

kê dữ liệu thu thập nhằm đảm bảo kết quả thí nghiệm có độ tin cậy cao

5 Kết cấu của luận án

Luận án bao gồm 148 trang, trong đó có 3 trang mở đầu, 35 trang tổng quan, 21 trang phương pháp nghiên cứu, 87 trang kết quả nghiên cứu, kết luận 2 trang, 22 bảng số liệu,

63 hình, 246 tài liệu tham khảo (tiếng Việt 27 tài liệu, tiếng Anh 219 tài liệu) và phụ lục

52 trang

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 NGUỒN LỢI RONG NÂU TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM

Trên thế giới đã tìm thấy khoảng 2.060 loài rong nâu và trên 95 % rong nâu có nguồn gốc ở biển Trong đó bộ Fucales là đối tượng phổ biến và kinh tế nhất của rong nâu, đại

diện là họ Sargassaceae với hai chi Sargassum và Turbinaria Trung Quốc là nước có sản

lượng rong nâu lớn nhất thế giới với trên 667.000 tấn rong khô/ năm Tiếp theo là Hàn Quốc, Nhật Bản, Na Uy và Chile có sản lượng rong nâu tương ứng khoảng 96.000, 51.000, 40.000 và 27.000 tấn rong khô/ năm

Việt Nam đã phát hiện trên 120 loài rong nâu Mùa vụ khai thác chủ yếu từ tháng 4 đến tháng 6 hàng năm Sản lượng thu hoạch hằng năm khoảng 15.000 - 35.000 tấn rong

khô Trong đó, các loài rong nâu thuộc chi Sargassum có trữ lượng lớn nhất với khoảng 68

loài, sản lượng thu hoạch khoảng 10.000 tấn rong khô/năm Riêng vùng biển Khánh Hòa

có hơn 39 loài rong nâu thuộc chi Sargassum đã được phân loại, nhưng tập trung và có trữ

lượng lớn nhất là ở vịnh Nha Trang với hơn 21 loài phổ biến và sản lượng ước tính hơn 4.800 tấn rong khô/năm

Trong thành tế bào rong nâu, thành phần chính là các anionic polysaccharide như algin, fucoidin, fucin Trong đó, alginate chiếm hàm lượng cao nhất, có thể đạt đến 40 % khối lượng rong khô; Fucoidan chiếm hàm lượng có thể đến 8% khối lượng rong khô; Hàm lượng mannitol có thể đến 30 % khối lượng rong khô; Hàm lượng Laminaran có thể đến

30 % khối lượng rong khô; Hàm lượng các chất khoáng trong rong nâu cao gấp từ 10 – 20 lần so với thực vật trên cạn, trong đó đặc biệt rất giàu canxi, kali, phốtpho, magiê và iod; Ngoài ra, rong nâu còn chứa nhiều hợp chất sinh học khác như sắc tố, vitamin, các hợp chất phenolic, … Nhìn chung, hàm lượng các thành phần hóa học của rong nâu thay đổi tùy theo loài rong, mùa vụ, thời tiết, điều kiện môi trường sống, vị trí địa lý, …

Ở nước ta, rong nâu chủ yếu được sử dụng cho sản xuất fucoidan thô với sản lượng vào khoảng 400 ÷ 800 tấn fucoidan thô mỗi năm Bên cạnh đó nguồn nguyên liệu này được bán dưới dạng nguyên liệu thô cho Trung Quốc với giá trị kinh tế thấp hoặc dùng làm phân bón, thức ăn gia súc Rong mơ sau khi được sử dụng cho sản xuất fucoidan, phần còn lại được dùng làm phân bón hoặc bỏ đi Như vậy, có thể thấy chúng ta đã lãng phí nguồn tài nguyên alginate hầu như còn nguyên vẹn trong rong sau chiết rút fucoidan Do vậy, việc nghiên cứu thu nhận alginate từ rong nâu sau khi đã chiết rút fucoidan là hết sức cần thiết, góp phần nâng cao giá trị cho nguồn tài nguyên rong nâu Chính vì vậy luận án sẽ tiếp cận

theo hướng nghiên cứu thu nhận alginate từ rong nâu sau khi đã dùng rong để chiết rút fucoidan với mong muốn góp phần làm tăng hiệu quả khai thác và sử dụng nguồn lợi rong nâu của Việt Nam

1.2 TỔNG QUAN VỀ ALGINATE

Alginate là tên gọi chung cho các muối của acid alginic, là anionic polysaccharide, là co-polymer mạch thẳng được tạo thành từ liên kết (1 4) glycosid của β-D-mannuronic acid (M) và α-L-guluronic acid (G) Alginate được tách chiết từ rong nâu Ngoài ra, alginate còn được sản xuất từ một số loài vi khuẩn

Tính chất lý học, hóa học và sinh học của alginate thay đổi tùy thuộc vào khối lượng phân tử, độ nhớt và tỷ lệ M/G cũng như trình tự sắp xếp các uronic trong mạch polymer Khả năng hòa tan của alginate phụ thuộc vào dạng tồn tại muối với ion kim loại, ở dạng muối với các ion kim loại hóa trị I thì chúng tan trong nước, còn ngược lại với các ion kim loại hóa trị II thì chúng không tan trong nước

Công nghệ chiết tách alginate từ rong nâu đã được nhiều nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu Các kết quả nghiên cứu cho thấy tùy theo từng loài rong nâu mà có sự khác nhau về chế độ xử lý rong Hiệu suất tách chiết alginate từ rong nâu phụ thuộc vào các yếu

tố công nghệ như nhiệt độ nấu chiết, pH nấu chiết, và chế độ nấu chiết sẽ ảnh hưởng đến

độ nhớt của alginate Độ nhớt của alginate là một trong những thông số quan trọng phản ánh chất lượng của sodium alginate thu nhận và ảnh hưởng đến hiệu suất thu nhận alginate Nếu độ nhớt của alginate thấp tức alginate ngắn mạch Khi cấu trúc mạch alginate bị cắt ngắn trong quá trình nấu chiết thì hiệu suất thu hồi alginate thấp Sở dĩ có hiện tượng này

là do alginate mạch phân tử ngắn khó bị kết tủa bởi cồn Hiệu suất tách chiết và độ nhớt của alginate có liên quan mật thiết với nhau trong quá trình nấu chiết alginate từ rong nâu

Ở Việt Nam, các nghiên cứu về công nghệ chiết tách alginate chưa được quan tâm đúng mức và hiện không còn cơ sở nào ở Việt Nam sản xuất alginate Alginate có trên thị trường Việt Nam chủ yếu là được nhập khẩu từ nước ngoài

Nghiên cứu tách chiết alginate từ bã rong nâu từ qui trình sản xuất fucoidan đã được nghiên cứu trong nước trong thời gian từ năm 2008 – 2010 của Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang Tuy nhiên, nhận thấy còn một số điểm hạn chế như sau: (1)

Bã rong sau khi tách chiết fucoidan tiến hành phơi khô, sau đó mới chiết tách alginate Việc làm khô sau đó lại ngâm chiết sẽ dẫn đến tốn kém năng lượng, dung môi chiết rút, trong khi bã thải rong có thể sử dụng ngay cho việc chiết tách alginate (2) Sử dụng formol

để khử màu của bã rong 24 giờ trước khi tách chiết alginate sẽ có nhiều ảnh hưởng đến sức khỏe và vệ sinh môi trường cũng như có ảnh hưởng đến độ nhớt, trọng lượng phân tử của alginate (3) Sản phẩm thu được là alginate canxi không tan trong nước, để chuyển về dạng natri alginate hòa tan được trong nước cũng khá phức tạp và quy trình sản xuất thêm nhiều công đoạn (4) Quy trình sản xuất alginate chưa quan tâm đến độ nhớt của alginate, chưa đánh giá được chất lượng alginate và cũng chưa xác định được các đặc tính cấu trúc của alginate

1.3 ĐIỀU CHẾ ALGINATE KHỐI LƯỢNG PHÂN TỬ THẤP

Alginate khối lượng phân tử thấp có thể được điều chế bằng nhiều phương pháp khác nhau như: phương pháp vật lý, phương pháp hóa học hay phương pháp sử dụng enzyme Phương pháp vật lý (phổ biến là sử dụng phương pháp chiếu xạ) đòi hỏi phải có thiết bị mà các phòng thí nghiệm thông thường không có Phương pháp sử dụng enzyme thủy phân alginate thành alginate khối lượng phân tử thấp có ưu điểm là không gây ô nhiễm môi trường, sản phẩm sản xuất theo công nghệ “sạch” nên dễ tinh chế và thu nhận Tuy nhiên phương pháp sử dụng enzyme hiện nay vẫn còn khá mới mẻ ở Việt Nam Mặt khác hiện chưa có chế phẩm enzyme thủy phân alginate ở dạng thương mại nên việc nghiên cứu và

sử dụng enzyme trong thủy phân alginate gặp nhiều khó khăn Phương pháp hóa học sử dụng trong thủy phân alginate có ưu điểm là giá thành không cao nhưng có nhược điểm sau thủy phân cần phải tinh chế sản phẩm Tuy nhiên sử dụng phương pháp hóa học trong thủy phân alginate dễ thực hiện và khả năng thành công khá cao, phù hợp với điều kiện nghiên cứu trong nước Alginate khối lượng phân tử thấp được điều chế bằng phương pháp thủy phân hóa học (acid) trong nước tuy còn chưa được nghiên cứu nhiều, nhưng trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu

Việc ứng dụng alginate khối lượng phân tử thấp có liên quan tới phương pháp điều chế alginate khối lượng phân tử thấp Kết quả tổng quan tài liệu nghiên cứu cho thấy alginate khối lượng phân tử thấp điều chế bằng phương pháp chiếu xạ chủ yếu được ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp (cây trồng, vật nuôi), chưa có nghiên cứu ứng dụng trong lĩnh vực sản xuất thực phẩm Trong khi đó, các alginate khối lượng phân tử thấp điều chế bằng phương pháp hóa học và phương pháp sử dụng enzyme thủy phân hiện đã bắt đầu được nghiên cứu ứng dụng trong thực phẩm, mỹ phẩm và y dược Chính vì vậy để điều chế

alginate khối lượng phân tử thấp dùng làm nguyên liệu cho sản xuất thực phẩm chức năng, luận án định hướng lựa chọn phương pháp thủy phân alginate bằng tác nhân hóa học (acid)

1.4 ỨNG DỤNG CỦA ALGINATE VÀ ALGINATE KHỐI LƯỢNG PHÂN TỬ THẤP

Alginate là polymer sinh học, được xem là vật liệu mới sử dụng rộng rãi trong các ngành công nghiệp khác nhau Tiềm năng ứng dụng alginate trong nước cũng như trên thế giới còn rất lớn, đặc biệt trong lĩnh vực thực phẩm, mỹ phẩm và dược phẩm Khả năng ứng dụng của alginate tương đối rộng rãi, thể hiện không chỉ ở khối lượng phân tử cao mà còn thể hiện mạnh mẽ hơn khi chúng có khối lượng phân tử thấp Với các alginate khối lượng phân tử thấp đã thể hiện nhiều hoạt tính sinh học quý giá và hoàn toàn có khả năng ứng dụng vào lĩnh vực thực phẩm chức năng và y dược

Ở Việt Nam đến thời điểm hiện tại vẫn chưa có một công trình nghiên cứu khoa học nào công bố nghiên cứu alginate khối lượng phân tử thấp có hoạt tính chống đông máu dùng làm nguyên liệu cho sản xuất thực phẩm chức năng Dựa trên kết quả tổng quan tài liệu nghiên cứu cho thấy tính khả thi cao trong việc nghiên cứu sản xuất alginate khối lượng phân tử thấp từ nguồn lợi rong nâu nước ta Do vậy việc định hướng nghiên cứu alginate khối lượng phân tử thấp có hoạt tính hỗ trợ phòng chống đông máu ở con người

là lĩnh vực mới và có nhiều triển vọng

1.5 QUÁ TRÌNH ĐÔNG MÁU VÀ HOẠT TÍNH CHỐNG ĐÔNG MÁU CỦA ALGINATE

Bình thường, trong máu và trong các mô có các chất gây đông máu và chất chống đông, nhưng các chất gây đông máu tồn tại ở dạng tiền chất, không có hoạt tính Khi các yếu tố gây đông máu được hoạt hóa thì sẽ thúc đẩy các phản ứng theo kiểu dây chuyền làm cho máu đông lại Sự đông máu có thể phát động bằng đường nội sinh do sự tiếp xúc của máu với bề mặt mang điện tích âm, hoặc bằng đường ngoại sinh do sự can thiệp của yếu

tố tổ chức Cả hai đường đều dẫn đến sự hoạt hóa yếu tố X thành Xa, là yếu tố tác động biến prothrombin thành thrombin xúc tác cho quá trình chuyển fibrinogen thành fibrin Fibrin như cái lưới chứa các đám dính tiểu cầu gây đông máu

Alginate không có hoạt tính chống đông máu nhưng các dẫn xuất alginate sulfate (alginate được sulfate hóa) có tính chất và cấu trúc tương tự như chất chống đông máu được sản sinh trong tế bào gan (heparin) Alginate khối lượng phân tử thấp khi được sulfate hóa sẽ có hoạt tính chống đông máu Tuy nhiên, hoạt tính chống đông máu của alginate khối lượng phân tử thấp phụ thuộc phụ thuộc vào khối lượng phân tử trung bình và nồng

độ của nó Các nghiên cứu trên thế giới đều cho thấy alginate sulfate có tác dụng chủ yếu kéo dài thời gian đông máu nội sinh (APTT) và thời gian đông máu chung (TT) và ít có tác dụng kéo dài thời gian đông máu ngoại sinh (PT)

CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

Nguyên liệu rong nâu gồm 2 loài thuộc chi Sargassum C Agardh 1821 (S mcclurei Setchell và S polycystum C Agardh) và 01 loài thuộc chi Turbinaria Lamouroux 1828 (T

ornata (Turner) J Agardh) Địa điểm thu mẫu: ở Hòn Tre, Hòn Rùa và Bãi Nam thuộc

vùng biển Nha Trang, Khánh Hòa

Tiến hành thu mẫu rong nâu tươi theo từng loài rong Khi thu, dùng liềm cắt sát gốc cây rong, rửa sạch các tạp chất bám trên rong bằng nước biển Sau đó, rong được vận chuyển về phòng thí nghiệm của Viện nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang Tại phòng thí nghiệm, rong được sấy khô bằng phương pháp sấy lạnh ở nhiệt độ 450C, tốc độ gió 2m/s cho đến khi rong đạt độ ẩm 14-15% thì ngừng quá trình sấy Sau đó rong khô được bao gói bằng bao bì PA hút chân không và bảo quản ở nhiệt độ thường, nơi cao ráo, thoáng mát, để sử dụng làm nguyên liệu trong quá trình nghiên cứu

Chuột thí nghiệm: chuột lang (Cavia porcellus), có khối lượng trung bình 300 ÷ 350

g/con, số lượng 80 con

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Cách thức tiếp cận các nội dung nghiên cứu: theo sơ đồ hình 2.1

2.2.2 Các phương pháp phân tích

+ Xác định hàm lượng fucoidan thô: theo phương pháp của Usov và cs (2001); Xác định hàm lượng alginate và acid alginic: theo phương pháp của Haug và cs (1968); Xác định độ ẩm theo TCVN 4326:2001; Xác định hàm lượng protein thô: theo TCVN 3705 -1990; Xác định hàm lượng chất béo thô: theo CVN 3703 - 1990; Xác định hàm lượng hàm lượng tro: theo TCVN 5611 - 1991; Xác định hàm lượng các nguyên tố kim loại nặng Hg,

As, Cd và Pb bằng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử - lò graphite - chất cải biến hóa học (CM-GF-AAS) theo AOAC999.11:2011

+ Xác định hàm lượng vi sinh vật bằng phương pháp đếm khuẩn lạc: Xác định tổng

số vi khuẩn hiếu khí theo TCVN 4884: 2005; Xác định tổng số bào tử nấm men, nấm mốc

theo TCVN 4993: 1989; Xác định Coliforms theo TCVN 4882: 2007; Xác định Salmonella

theo TCVN 4829:2005

+ Phương pháp xác định độ nhớt: dung dịch alginate 1% ở 22oC được đo độ nhớt trên nhớt kế Brookfield, spindle LV-02, tốc độ quay 50 rpm (vòng/phút)

Hình 2.1 Sơ đồ cách thức tiếp cận các nội dung nghiên cứu

Rong nâu

Nghiên cứu sàng lọc loài

rong nâu dùng cho sản

xuất fucoidan và alginate

Xác định thời điểm thu hoạch rong nâu

Lựa chọn loài rong nâu cho nghiên cứu

Chiết fucoidan theo

quy trình của Viện NC

& ƯDCN Nha Trang

Nghiên cứu chế độ nấu chiết sodium alginate

Xác định nồng độ ethanol dùng để kết tủa dịch chiết

Đánh giá chất lượng sodium alginate

Đề xuất quy trình tách chiết sodium alginate Thủy phân sodium

Đánh giá chất lượng các alginate KLPTT

Nghiên cứu điều chế

sodium guluronate

sulfate (SGS)

Xác định điều kiện phản ứng điều chế tác nhân sulfate hóa

Xác định điều kiện phản ứng tổng hợp SGS

Tách chiết sodium

alginate

Đề xuất quy trình sản xuất SGS và đánh giá các đặc tính của SGS

Đánh giá hoạt tính

chống đông máu và

độc tính của SGS Đánh giá độc tính của SGS

Đánh giá hoạt tính chống đông máu của SGS

* Thời gian thu mẫu: từ tháng 1/2013 ÷ 7/2013

* Hàm lượng fucoidan và sodium alginate cao nhất

* pH (8÷12), nhiệt độ (50 o C

÷ 80 o C), thời gian (1÷4 giờ)

* Hàm lượng và độ nhớt của sodium alginate đạt đồng thời lớn nhất

* Nồng độ ethanol (50 ÷ 80%)

* Hàm lượng sodium alginate cao nhất

* Nhiệt độ (30 o C÷90 o C); thời gian (15÷120 phút), tỷ

* Quan sát lâm sàng; khối lượng; xét nghiệm nước tiểu; xét nghiệm huyết học và sinh hóa máu; giải phẩu và quan sát

vi thể

+ Xác định khối lượng phân tử trung bình của alginate: bằng phương pháp sắc ký thẩm thấu gel (Gel Permeation Chromatography - GPC) tại Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh

+ Phương pháp đánh giá chất lượng alginate: theo QCVN 4-16: 2010/BYT: “Quy chuẩn kỹ thuật Quốc gia về phụ gia thực phẩm - Chất độn

+ Phương pháp xác định độ thay thế (DS): theo phương pháp sulfate bari nephtlometry (dùng ánh sáng phản chiếu để đo mật độ các hạt trong chất lỏng) của Dodgson

và cs (1962)

+ Phương pháp phân tích cấu trúc: Phổ hồng ngoại (IR) đo trên máy FT-IR Bruker; Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) được đo ở nhiệt độ 70 ºC với dung môi D2O trên máy Bruker AVANCE 500 MHz tại Viện Hóa học–Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam + Phương pháp khảo sát hoạt tính chống đông tụ máu của natri guluronate sulfate (SGS): theo phương pháp Fan và cs (2011) Thí nghiệm được tiến hành ở Học viện Quân

Y - Bệnh viện Trung ương Quân đội 108, Hà Nội

+ Phương pháp xác định độc tính của sodium guluronate sulfate: theo đường uống, với 3 mức độ: liều cao (2 mg/ngày/chuột), liều trung bình (1 mg/ngày/chuột và liều thấp (0,5 mg/ngày/chuột), nhóm đối chứng (nước muối sinh lý) Mỗi mức độ nghiên cứu (cho uống với hàm lượng 1 ml/ngày/chuột) trên 1 nhóm chuột 20 con và được đánh giá thành 2 đợt, mỗi đợt 10 con Đợt 1 xác định độc tính cấp, thực hiện ngay sau kết thúc điều trị (main group) Đợt 2 xác định mức độ hồi phục hay những biểu hiện độc tiềm tàng có thể xảy ra sau khi kết thúc điều trị 3 tuần (recovery group)

2.3 PHƯƠNG PHÁP THU THẬP VÀ XỬ LÝ SỐ LIỆU

Số liệu thực nghiệm được thu thập bằng phương pháp thống kê, quan sát Mỗi thí nghiệm tiến hành lặp lại 3 lần độc lập và số liệu là kết quả trung bình của các lần lặp lại Kiểm tra sự khác biệt giữa các số liệu thống kê bằng phần mềm Statgraphics Centurion XVII trial

Tối ưu hóa thí nghiệm theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm Sự khác nhau của các hệ số phương trình hồi quy được kiểm định theo chuẩn t- Student với mức ý nghĩa α = 0,05 và bậc tự do là 2 Kiểm định sự phù hợp của phương trình hồi quy theo chuẩn fisher

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1 SÀNG LỌC LOÀI RONG NÂU DÙNG CHO SẢN XUẤT FUCOIDAN VÀ SODIUM ALGINATE

3.1.1 Đánh giá hàm lượng fucoidan và sodium alginate ở một số loài rong nâu 3.1.1.1 Đánh giá hàm lượng fucoidan ở 3 loài rong nâu

Hình 3.1 Sự biến đổi hàm lượng fucoidan ở 3 loài rong nâu theo thời gian thu mẫu

Kết quả phân tích hình 3.1 cho thấy thời điểm thu hoạch rong mơ thích hợp để dùng

làm nguyên liệu sản xuất fucoidan đối với cả 3 loài rong (S mcclurei, S polycystum và T

ornata) ở vùng vịnh Nha Trang, tỉnh Khánh Hòa là vào tháng 4 và tháng 5 Trong số 3 loài

rong nâu đã nghiên cứu, loài rong T ornata có hàm lượng fucoidan cao hơn so với 2 loài

S mcclurei và S polycystum

3.1.1.2 Đánh giá hàm lượng sodium alginate ở 3 loài rong nâu

Kết quả phân tích hình 3.2 cho thấy hàm lượng sodium alginate của cả 2 loài rong S

mcclurei và T ornata có thời điểm thu hoạch vào tháng 4, còn đối với loài rong S polycystum là vào tháng 5 Hàm lượng sodium alginate có trong loài rong T ornata cao

hơn loài S mcclurei và S polycystum Do vậy nếu xét theo khía cạnh dùng làm nguyên liệu sản xuất sodium alginate thì loài rong T ornata có ưu thế hơn và nên được lựa chọn làm

nguyên liệu sản xuất sodium alginate

Hình 3.2 Sự biến đổi hàm lượng sodium alginate ở 3 loài rong nâu theo thời gian

thu mẫu

Từ những phân tích về hàm lượng fucoidan và sodium alginate ở 3 loài rong nâu S

mcclurei, S polycystum và T ornata cho thấy loài T ornata có hàm lượng fucoidan và

alginate cao hơn so với 2 loài rong S mcclurei và S polycystum Do vậy, luận án quyết định lựa chọn loài rong T ornata để dùng làm nguyên liệu thu nhận fucoidan và đồng thời

thu nhận sodium alginate

3.1.2 Một số thành phần hóa học cơ bản của rong nâu Turbinaria ornata

Kết quả phân tích thể hiện ở Bảng 3.1

Kết quả phân tích cho thấy rong nâu T ornata thu mẫu tại vịnh Nha Trang, tỉnh Khánh

Hòa có hàm lượng fucoidan và alginate tương đối cao hơn so với các loài rong nâu trên thế

giới Như vậy, loài rong T ornata là nguồn nguyên liệu khá thích hợp cho sản xuất fucoidan

và alginate Do đó luận án sẽ tiến hành tách chiết đồng thời fucoidan trước khi tiến hành nghiên cứu chiết rút alginate để tránh lãng phí nguồn tài nguyên thiên nhiên từ rong nâu Bên cạnh đó, hàm lượng kim loại nặng có trong rong nâu Khánh Hòa lại thấp hơn rất nhiều

so với các loài rong nâu trên thế giới và hoàn toàn đạt tiêu chuẩn của Bộ Y tế Kết quả này

cho thấy luận án hoàn toàn có thể sử dụng loài rong T ornata thu mẫu tại vịnh Nha Trang,

tỉnh Khánh Hòa làm nguyên liệu thu nhận đồng thời fucoidan và sodium alginate

Bảng 3.1 Thành phần hóa học của nguyên liệu rong nâu Turbinaria ornata

Stt Chỉ tiêu Đơn vị tính Hàm lượng

1 Độ ẩm % khối lượng rong khô 10,26 ± 0,06

2 Protein % khối lượng rong khô 8,65 ± 0,08

3 Lipid % khối lượng rong khô 0,91 ± 0,03

4 Tro % khối lượng rong khô 18,85 ± 0,23

5 Alginate % khối lượng rong khô 38,93 ± 0,03

6 Fucoidan % khối lượng rong khô 2,73 ± 0,01

3.2 NGHIÊN CỨU TỐI ƯU HÓA CÔNG ĐOẠN NẤU CHIẾT ALGINATE TỪ

RONG NÂU TURBINARIA ORNATA

* Tối ưu hóa để hàm lượng sodium alginate thu được lớn nhất

Kết quả phân tích cho thấy điều kiện tối ưu cho quá trình nấu chiết alginate để thu được hàm lượng alginate cao nhất, đó là: nồng độ dung dịch kiềm có pH=10,7, nhiệt độ nấu chiết 68oC và thời gian nấu chiết 2,7 giờ Khi đó, hàm lượng alginate tách chiết được

là 37,379 ± 0,129% khối lượng rong khô

* Tối ưu hóa để độ nhớt của sodium alginate thu được lớn nhất

Kết quả phân tích cho thấy điều kiện tối ưu cho quá trình nấu chiết alginate để thu được alginate có độ nhớt cao nhất, đó là: dung dịch kiềm có pH=11, nhiệt độ nấu chiết 57,6oC và thời gian nấu chiết 1,5 giờ Khi đó, độ nhớt của alginate đạt 720±5,508 cP

* Tối ưu hóa để đạt đồng thời hàm lượng và độ nhớt của sodium alginate lớn nhất

Kết quả phân tích cho thấy điều kiện tối ưu để thực hiện quá trình nấu chiết alginate

từ rong nâu Turbinaria ornata nhằm đạt đồng thời hai mục tiêu hàm lượng và độ nhớt của

alginate cao nhất, đó là: Dung dịch Na2CO3 có pH = 11; Nhiệt độ nấu chiết là 59oC; Thời

gian nấu chiết là 1,5 giờ Với điều kiện này, hàm lượng alginate tách chiết từ rong nâu T

ornata đạt 34,231 ± 0,21% khối lượng rong khô, hiệu suất quy trình sản xuất sodium

alginate đạt 87,93% Độ nhớt của alginate tách chiết từ rong nâu T ornata là 743 ± 6,245

cP nên được xếp vào loại alginate có độ nhớt tương đối cao nên được ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm và dược phẩm

3.3 NGHIÊN CỨU THU NHẬN SODIUM ALGINATE TỪ RONG NÂU VÀ ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG SODIUM ALGINATE

3.3.1 Nghiên cứu xác định nồng độ ethanol kết tủa thu nhận sodium alginate

Kết quả phân tích ở hình 3.3 cho thấy nồng độ ethanol 70% là thích hợp cho kết tủa

hoàn toàn sodium alginate có trong dịch chiết rong nâu T ornata Do vậy luận án quyết

định chọn nồng độ ethanol sử dụng để kết tủa sodium alginate từ dịch chiết là 70%

Hình 3.3 Ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến hàm lượng sodium alginate

thu được sau kết tủa

3.3.2 Đề xuất quy trình tách chiết sodium alginate từ rong nâu T ornata

Quy trình sản xuất sodium alginate theo sơ đồ hình 3.4

Thuyết minh quy trình:

+ Xử lý nguyên liệu: Rong nâu nguyên liệu được cắt nhỏ (0,5 ÷ 1 cm) rồi ngâm rong

với hỗn hợp dung môi (Ethanol 96%/Chloroform/H2O = 89/1/10 (v/v)) theo tỉ lệ 1/10 (w/v) trong thời gian 10 ÷ 15 ngày Sau đó, rong được lọc tách và được rửa 3 lần bằng nước RO

đến pH trung tính và để ráo

+ Chiết fucoidan: Rong nâu được chiết fucoidan qua 3 lần, mỗi lần chiết đều sử dụng

dung dịch HCl 0,1N (pH 2 ÷ 2,5), tỷ lệ rong/dịch chiết là 1/20 (w/v), nhiệt độ chiết 60oC trong thời gian 2 giờ Dịch chiết được lọc thô qua vải lọc để thu nhận dịch chiết fucoidan

Rong được thu hồi để tiếp tục thu nhận sodium alginate

+ Rửa: Rong được rửa qua 3 lần bằng nước sạch đến pH trung tính và để ráo

27.143 a

29.137 b 30.247 c 32.153 d

34.150 e 34.177 e 34.190 e

0 5 10 15 20 25 30 35 40