Đánh giá tác dụng kháng khuẩn của màng axit polylactic nisin và khả năng ứng dụng trong bảo quản thực phẩm

5 Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Hướng nghiên cứu tạo vật liệu từ các polymer sinh học và chất kháng khuẩn nguồn sinh học, để tạo ra sản phẩm bao bì thực

Trang 1

1

Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

BỘ GIÁO DỤC

VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

Trang 2

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS TS LÊ THANH BÌNH

Trang 3

3

Hà Nội – 2014

Trang 4

ưu tiên trong xu hướng “đóng gói tích cực, active packaging” Đóng gói tích cực là giải pháp trong đó có sự tương tác giữa vật liệu bao gói, thực phẩm và môi trường để gia tăng thời gian bảo quản, độ an toàn, trong khi vẫn bảo đảm chất lượng, các tính chất cảm quan, độ tươi ngon của thực phẩm

Trong hơn thập kỷ vừa qua, đã có nhiều công trình nghiên cứu, tìm kiếm, các loại chất bảo quản có nguồn gốc sinh học và vật liệu thay thế các polymer dầu mỏ, giảm thiểu ô nhiễm môi trường Sử dụng các chất kháng khuẩn có nguồn gốc sinh học như bacteriocin, trong đó, đặc biệt là nisin trong bảo quản, chế biến thực phẩm đang được quan tâm nhiều Nisin có khả năng kìm hãm sự sinh trưởng của một số nhóm vi sinh vật gây bệnh, gây hỏng thối hỏng thực phẩm được xem là an toàn (GRAS) Hiện nay, nisin nằm trong danh mục các chất phụ gia an toàn có ký hiệu quốc tế E234, đã và đang được dùng để bảo quản thực phẩm ở hơn 50 quốc gia Sử dụng nisin để bảo quản thực phẩm đã khắc phục các nhược điểm của các phương pháp bảo quản bằng hoá chất, chất kháng sinh, chiếu xạ Ngoài ra, nisin có nhiều tính chất ưu việt như có bản chất protein, không độc, hoạt tính cao, phổ kháng khuẩn tương đối rộng, khả năng chịu được nhiệt độ và chịu áp suất cao Vì vậy, nisin là ứng cử viên hàng đầu cho hướng nghiên cứu này

Trong số các polymer phân hủy sinh học, axit polylactic (PLA) được tổng hợp

từ axit L-lactic, một loại axit được sản xuất từ quá trình lên men vi sinh vật Vì thế, PLA được xem là lựa chọn hàng đầu trong số các polymer sinh học có khả năng thay

thế các polymer từ dầu mỏ Hiện nay, một số loại sản phẩm nhựa sinh học PLA đã ra đời như BiotaTM-Chai đựng nước bằng nhựa PLA, NobleTM- Bình đựng nước hoa quả bằng nhựa PLA, DannonTM

-hộp đựng sữa chua bằng nhựa PLA

Trang 5

5

Hướng nghiên cứu tạo vật liệu từ các polymer sinh học và chất kháng khuẩn nguồn sinh học, để tạo ra sản phẩm bao bì thực phẩm có khả năng kháng khuẩn và phân hủy sinh học- rõ ràng là một giải pháp “thân thiện môi trường” và là lựa chọn căn

cơ cho sự phát triển bền vững

Xuất phát từ những thực tiễn trên chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “ Đánh

giá tác dụng kháng khuẩn của màng axit polylactic – nisin và khả năng ứng dụng trong bảo quản thực phẩm” với mục tiêu :

- Đánh giá khả năng kháng khuẩn của màng axit polylactic – nisin

- Đánh giá khả năng phân hủy sinh học của màng axit polylactic – nisin

- Nghiên cứu điều kiện, thời gian bảo quản màng axit polylactic – nisin

- Ứng dụng màng axit polylactic – nisin để bảo quản thực phẩm lên men (nem chua)

và bánh cốm

Trang 6

6

PHẦN I TỔNG QUAN 1.1 HIỆN TRẠNG VÀ XU HƯỚNG NGHIÊN CỨU BAO BÌ THỰC PHẨM KHÁNG KHUẨN VÀ PHÂN HỦY SINH HỌC

Tình trạng thực phẩm hiện nay đang đứng trước các nguy cơ mất an toàn vệ sinh cao trong khi lại phải đáp ứng các nhu cầu tiêu dùng các loại thực phẩm đảm bảo chất lượng, tươi, ngon và cung cấp toàn cầu Xu hướng đó đã dẫn tới những thay đổi mạnh mẽ của ngành công nghiệp bao bì và đóng gói thực phẩm [18; 71] Các loại bao

bì an toàn và thân thiện môi trường được phát triển Các loại chất bảo quản có nguồn gốc sinh học đang dần thay thế các chất bảo quản hóa học và chất kháng sinh Hướng nghiên cứu tạo ra các loại bao bì có khả năng kháng khuẩn, có khả năng ức chế, tiêu diệt vi khuẩn gây bệnh, gây ngộ độc thực phẩm, bảo đảm chất lương, độ tươi ngon của thực phẩm, an toàn cho người sử dụng và thân thiện với môi trường đang thu hút nhiều

nghiên cứu [12; 46; 47; 48; 51; 56; 58; 82] Trong thập kỷ vừa qua, đã có nhiều công

trình nghiên cứu, tìm kiếm, sử dụng các vật liệu có nguồn gốc sinh học để dần thay thế các polyme dầu mỏ và giảm thiểu ô nhiễm môi trường Hiện nay, các loại vật liệu phân hủy sinh học như axit polylactic (PLA), polyhydroxybutyrate (PHB) được xem là các ứng cử viên cho hướng phát triển này Bởi vì, PLA, PHB có khả năng phân hủy trong

tự nhiên, không gây ô nhiễm môi trường, không phụ thuộc vào tăng giá do quá trình khan hiếm của dầu mỏ Trong số các polymer phân hủy sinh học, PLA là loại được tổng hợp từ axit L-lactic, loại axit được sản xuất từ quá trình lên men vi sinh vật từ các nguồn nguyên liệu rẻ, có sẵn như ngô, khoai, sắn hoặc từ sinh khối thực vật Vì thế, PLA được xem là lựa chọn hàng đầu trong số các polyme sinh học có khả năng thay thế các polyme từ dầu mỏ

Sử dụng các chất kháng khuẩn có nguồn gốc sinh học như bacterocin, trong đó, đặc biệt là nisin trong quá trình bảo quản, chế biến thực phẩm đang được quan tâm nhiều Nisin có khả năng kìm hãm sự sinh trưởng của một số nhóm vi sinh vật gây bệnh, gây thối hỏng thực phẩm và được xem là an toàn (GRAS) Nisin là một bacteriocin, cấu tạo gồm 34 axit amin, có khối lượng phân tử 3,5 kDa, được tổng hợp

bởi một số chủng thuộc loài Lactococcus lactis Nisin được Tổ chức Nông Lương và Y

tế thế giới (FAO/WHO), cơ quan quản lý thuốc và thực phẩm (FDA) của Mỹ cho phép

Trang 7

7

sử dụng trong bảo quản và làm phụ gia thực phẩm Hiện nay, nisin nằm trong danh mục các chất phụ gia có ký hiệu quốc tế E234, đã và đang được dùng để bảo quản thực phẩm ở hơn 50 quốc gia Phạm vi ứng dụng của nisin khá rộng, từ các sản phẩm tươi sống đến các loại thực phẩm lên men, đóng hộp, dạng rắn cũng như dạng nước Sử dụng nisin không làm thay đổi cảm quan, không làm biến đổi chất lượng, không để lại

dư lượng trong thực phẩm Sử dụng nisin để bảo quản thực phẩm đóng hộp, sẽ làm giảm nhiệt độ và thời gian thanh trùng Nisin đã trở thành chất chuyên biệt dùng để bảo quản thực phẩm, là chất bảo quản nguồn gốc sinh học có giá trị, khắc phục được nhược điểm của các phương pháp sử dụng hoá chất, chất kháng sinh, chiếu xạ Nisin

có nhiều tính chất ưu việt như có bản chất protein, không độc, hoạt tính cao, phổ kháng khuẩn tương đối rộng, khả năng chịu được nhiệt độ và chịu áp suất cao [18]

Hướng nghiên cứu tạo vật liệu từ các polyme sinh học và chất kháng khuẩn, để tạo ra sản phẩm bao bì bảo quản thực phẩm có khả năng kháng khuẩn và phân hủy sinh học đang là mục tiêu của nhiều nhóm nghiên cứu Trong công trình của Kritos và cộng

sự [51], đã sử dụng màng natri – casein kết hợp với nisin để tạo ra màng kháng khuẩn Trong khi đó, Xu và cộng sự [81] lại tạo màng từ glucomana – gellan - nisin, Millette và cộng sự [58] tạo ra màng kháng khuẩn sinh học bản chất alginate - nisin Gần đây, trong công bố của Liu và cộng sự [56], các tác giả đã sử dụng 80 % PLA, 20 % pectin

và kết hợp với 200 IU nisin/g để tạo ra loại polyme sinh học có tính kháng khuẩn

An toàn vệ sinh thực phẩm ở Việt nam là một vấn đề vô cùng cấp bách, đang gây nhiều bức xúc, vấn nạn cho xã hội Các loại thực phẩm được chế biến, bảo quản

và vận chuyển hầu hết trong điều kiện không an toàn Thực phẩm chủ yếu chỉ được đựng và bao gói bằng bao giấy và các màng polyme có nguồn gốc dầu mỏ Những loại màng này được tạo ra từ các loại polyme như polyethylene (PE), polypropylene (PP), polyvinylclorua (PVC) Nhược điểm của các loại màng này và bao giấy là, ngoài việc gây tổn thất chất dinh dưỡng trong quá trình bảo quản, lại không có tác dụng đối với vi sinh vật gây bệnh thực phẩm nội tại hay xâm nhập từ bên ngoài Mặt khác, các màng này không có khả năng tự phân hủy, nên lại là nguyên nhân gây ô nhiễm môi trường Ngoài ra, việc bảo quản thực phẩm thường lạm dụng quá mức các chất hóa học và đặc biệt là việc sử dụng các chất kháng sinh trong y học vào bảo quản, chế biến thực

Trang 8

8

phẩm, đây là một nguyên nhân dẫn đến tình trạng phát tán nhanh tính kháng thuốc, là nguy cơ lớn đối với sức khỏe con người

Việt Nam chưa có nghiên cứu về bao bì có tính kháng khuẩn và tự phân huỷ Tuy đã có một số nghiên cứu về polyme sinh học như là chitosan, tinh bột biến tính và một số polymer được tách từ tự nhiên nhưng những nghiên cứu về chất kháng khuẩn

có nguồn gốc sinh học đầu tiên phải kể đến nhóm nghiên cứu của Lê Thanh Bình và cộng sự [3; 9] Tuy nhiên, hầu hết các công trình trên chủ yếu tập trung vào vấn đề tạo chủng giống, năng suất, công nghệ sản xuất, sản phẩm, hướng nghiên cứu tạo vật liệu bao bì thực phẩm chưa được đề cập

1.2 NISIN

1.2.1 Lịch sử nghiên cứu về nisin

Năm 1877, Pasteur và Joubert đã lần đầu tiên ghi nhận hiện tượng ức chế lẫn

nhau giữa các chủng Bacillus anthracis, một loại vi khuẩn thường được tìm thấy có

mặt trong nước tiểu [73] Những nghiên cứu tiếp theo của Florey và cộng sự cũng khám phá ra bệnh than (anthrax) và bệnh bạch hầu (diphtheria) bằng các vi sinh vật không gây bệnh, có tính đối kháng Năm 1925, Gratia đã phát hiện đã ra sự ảnh hưởng

lẫn nhau của hai chủng E coli Đến năm 1928, Roges là người đầu tiên phát hiện ra

nisin, một polypeptide do chủng Lactococcus tổng hợp có khả năng ức chế chủng L

lactis Năm 1946, Gratia và Frederic đã phân lập thành công một chất sinh ra từ chủng

E coli V có khả năng ức chế E coi và gọi tên là “colicine” Vào năm 1953, Jacob và

cộng sự đã sử dụng “bacteriocin” làm thuật ngữ chung cho các chất kháng khuẩn có bản chất protein được sinh ra từ vi sinh vật Năm 1982 theo Konisky thì thuật ngữ colicine ngày nay được dùng để chỉ các bacteriocin được sản xuất bởi một số chủng

thuộc loài E coli và có quan hệ gần họ với họ Enterobacteriaceae Chính vì thế mà ý

nghĩa ban đầu của thuật ngữ bacteriocin có đặc trưng phổ biến của colicine như: có phổ kháng khuẩn hẹp và có khả năng bám lên các thụ thể trên bề mặt tế bào [18] Sau

đó, phát hiện bổ sung về mối liên quan giữa sự tổng hợp bacteriocin và plasmid Tại đây cho thấy có sự khác nhau giữa colicine và bacteriocin được sinh ra bởi các chủng

vi khuẩn Gram dương [18; 73] Bateriocin được tổng hợp từ các vi khuẩn Gram dương không có thụ thể đặc biệt để bám trên bề mặt tế bào, thường có khối lượng thấp hơn

Trang 9

9

colicine, có thể có cơ chế tiêu diệt khác so với colicine, có phổ tác dụng rộng hơn và khác nhau về cách vận chuyển và giải phóng trong tế bào và nó có thể có trình tự đầu được phân chia trong giai đoạn thành thục [18; 45]

Trong suốt 2 thập kỷ gần đây, bacteriocin – một sản phẩm do vi sinh vật sinh ra

có khả năng giết hoặc ức chế sự phát triển của các vi sinh vật khác đã được nghiên cứu rất nhiều về các đặc tính sinh hóa cũng như các đặc điểm về di truyền ở cấp độ phân tử bởi vai trò của nó trong vấn đề bảo quản Bacteriocin có đặc tính giống như một kháng sinh vì nó có khả năng kháng khuẩn nhưng bacteriocin không phải là kháng sinh Bacteriocin khác với các kháng sinh bởi quá trình tổng hợp, cơ chế tác dụng, phổ tác dụng, tính miễn dịch của chủng sản, đích tấn công… [19] Bacteriocin có bản chất protein, được tổng hợp ở ribosome và có phổ kháng khuẩn hẹp, có khả năng ức chế các vi khuẩn có quan hệ họ hàng với nó [21; 25; 73] Theo Joger và cộng sự năm 2000, bacteriocin là một polypeptide được tổng hợp ở ribosome và bị phân hủy rất nhanh bởi enzym phân hủy protein trong hệ tiêu hóa của người Vì vậy, để nghiên cứu bản chất protein của những bacteriocin mới người ta thường thử khả năng nhạy cảm của chúng với các enzym phân hủy protein

1.2.2 Cấu trúc của nisin

Nisin có công thức C143H230N42O37S7, là một bacteriocin thuộc nhóm I- còn gọi là nhóm lantibiotic trong hệ thống phân loại 4 nhóm Nisin cấu tạo gồm 34 axit amin, có khối lượng phân tử 3,5 kDa, được tổng hợp bởi một số chủng thuộc dưới loài

L lactis subsp lactis , thường được viết là L lactis [18; 44; 77] Nisin được phát hiện từ

năm 1928 Tuy nhiên, phải mãi tới năm 1957 mới xuất hiện nisin đầu tiên trong các phân xưởng sản xuất pho mát quy mô nông trại, để bảo quản các sản phẩm làm ra Cũng trong năm này, hãng Aplin và Barrett đã đưa ra chế phẩm nisin thương mại sử dụng trong thực phẩm Mặc dù vậy, giá trị của nisin trong bảo quản thực phẩm cũng chỉ được xác lập trong khoảng ba thập kỷ lại đây Trong khi những nghiên cứu cơ bản và công nghệ ngày càng được quan tâm nhiều hơn [18; 67; 77; 85] Dạng chế phẩm của nisin sẵn

có nhất hiện nay trên thị trường là Nisaplin, với thành phần 2,5 % nisin

Cấu trúc của nisin được Gross và Morell làm sáng tỏ năm 1971 Nisin là một chuỗi polypeptide gồm 34 axit amin tạo thành 5 vòng cấu trúc A, B, C, D, E, được nối

Trang 10

10

với nhau bằng cầu nối disulfide (hình 1.1) Có ít nhất 6 dạng nisin đã được phát hiện,

ký hiệu từ A đến E và Z Đến nay, 4 loại nisin đã được nghiên cứu đặc tính là nisin A,

Z, Q và nisin U Trừ trường hợp nisin U được tổng hợp bởi loài Streptococcus uberis, tất cả các nisin còn lại đều do loài L lactis sinh ra

Phân tử nisin không chứa các axit amin thơm, nên không hấp thụ ở bước sóng

280 nm Các axit amin dị thường đóng vai trò như một nhóm ái nhân (nucleophile), được xác định thông qua khả năng phản ứng với các mercaptan Có thể vì các nhóm này rất quan trọng để đảm bảo nisin có khả năng xâm nhập vào màng tế bào đích Cấu trúc gồm 5 vòng của nisin giúp cho nó có độ vững chắc, đồng thời góp phần đề kháng lại các tác dụng của enzym proteinase và sự biến tính do nhiệt

Phân tử nisin có thể tồn tại ở dạng monome với khối lượng phân tử 3500 Dal Tuy nhiên, do các phân tử nisin có thể tương tác, liên kết với nhau thông qua các nhóm axit dehydroamin và các nhóm amin Vì vậy, nisin có thể tồn tại ở dạng dime hay tetrame, với khối lượng phân tử tương ứng là 7000 Dal và 14000 Dal

Hình 1.1 C ấu trúc phân tử nisin

Những thành tựu nghiên cứu sinh học phân tử gần đây, chứng minh nisin bao

gồm một số peptide có tính kháng khuẩn, một sản phẩm dị gen, bao gồm 11 gen như sau: Nis A, Nis B, Nis T, Nis C, Nis I, Nis P, Nis R, Nis K, Nis F, Nis E và Nis Z

Trong tự nhiên, tồn tại chủ yếu 2 dạng nisin là A và Z, chúng khá bền vững

Cấu tạo của nisin A và Z chỉ khác nhau bởi một axit amin ở vị trí thứ 27, histidine trong cấu trúc của nisin A, trong khi axit aspartic ở nisin Z

Do có bản chất là một protein, nên hầu hết các đặc điểm hóa lý của nisin phụ thuộc nhiều vào pH của môi trường xung quanh Mức độ hoà tan của nisin phụ thuộc

Trang 11

11

rất nhiều vào pH Nisin kém bền vững và dễ dàng mất hoạt tính ở pH cao

Nisin là một bacteriocin bền nhiệt Sau 60 phút xử lý ở 100 o

C, nisin vẫn còn

50 % hoạt tính Ở 121 o

C, sau 10 phút, hoạt tính còn 46 %, sau 60 phút còn 22 % Độ bền nhiệt của nisin phụ thuộc vào pH, pH càng thấp thì độ bền nhiệt càng cao So với các bacteriocin khác, nisin có độ bền nhiệt hơn hẳn

Nisin không có khả năng tác động đối với vi khuẩn Gram âm, nấm men và nấm mốc Trong điều kiện thông thường, nisin chỉ tác động được đối với vi khuẩn Gram

dương, trong đó có vi khuẩn lactic, một số vi khuẩn gây bệnh như Listeria,

Staphylococcus, Mycobacterium và các vi khuẩn sinh bào tử Bacillus, Clostridium

Nisin tác động có hiệu quả cao hơn ở trong các sản phẩm thực phẩm có độ pH thấp, có

trải qua giai đoạn gia nhiệt, như các sản phẩm rau quả, thực phẩm đóng hộp Một trong những cơ chế giải thích tác động của nisin đối với tế bào nhạy cảm là do sự tạo thành các lỗ thủng, các kênh trên màng nguyên sinh chất, nguyên nhân gây thất thoát các phân tử, các ion có kích thước nhỏ trong nội bào, làm giảm lực vận chuyển proton PMF (Proton Motive Force), ảnh hưởng tới quá trình tổng hợp ATP, dẫn tới sự chết tế bào [43; 59; 68]

Cơ chế tác động của nisin đối với tế bào nhạy cảm được nghiên cứu nhiều hơn

Phần lớn các quan điểm cho rằng, để tác động đối với vi khuẩn, nisin phải trải qua hai bước chính:

- Ban đầu bám trên thành tế bào vi khuẩn nhạy cảm thông qua các thụ thể

- Sau đó xâm nhập qua thành tế bào và tạo các lỗ trên màng nguyên sinh chất và thông qua các cơ chế theo mô hình “kiểu chèn”, theo kiểu nêm và cơ chế tạo mao quản

có sự tham gia của lipide II [18; 35; 43]

1.2.3 Cơ chế tác dụng của nisin

Nisin có tác dụng ức chế vi khuẩn Gram (+), đặc biệt là các vi khuẩn gây bệnh, gây hỏng thực phẩm như Clostridium butiricum và Cl Tyrobutiricum, Staphylococcus

aureus, Bacillus cereus [17; 26; 30; 44] Đối với bào tử, nisin có khả năng ức chế sự

nảy mầm của chúng Mặc dù không có khả năng ức chế và tiêu diệt vi khuẩn Gram (-) nhưng khi kết hợp với EDTA hoặc một vài nhân tố khác như nhiệt độ, axit thì nisin

có khả năng ức chế sự phát triển của vài loại vi khuẩn này [15]

Trang 12

12

Nisin được xem là một chất kháng khuẩn có khả năng ức chế hoặc tiêu diệt vi khuẩn Gram (+) Tác dụng của nisin lên tế bào tại pha sinh trưởng thường mạnh hơn

rất nhiều so với tế bào tại pha cân bằng [26] Nguyên nhân do sự phá vỡ các tổ chức cục bộ trên màng tế bào nhạy cảm với nisin, sau đó phá vỡ màng tế bào, xâm nhập vào tế bào chất và làm chết tế bào vi sinh vật đó [34; 73]

Nisin cũng như phần lớn các bacteriocin khác không có khả năng ức chế và tiêu

diệt vi khuẩn Gram (-), trừ Salmonella typhimurium, E coli bị ức chế khi có mặt của

EDTA Ngoài ra bất kỳ sự ức chế nào của vi khuẩn lactic đối với vi khuẩn Gram (-) đều do các nguyên nhân khác chẳng hạn như pH thấp, H2O2, cạnh tranh về dinh dưỡng, hay do tính kỵ nước của chúng Điều này được giải thích là do sự khác nhau của thành tế bào của vi khuẩn Gram (+) và Gram (-) Bacteriocin chỉ tạo được lỗ

thủng trên thành tế bào Gram (+) mà không tạo được lỗ thủng trên thành tế bào Gram (-) [26]

Tác dụng của nisin lên vi sinh vật nhạy cảm bao gồm 2 kiểu hình Kiểu tác dụng không đặc trưng: nisin bám dính lên bề mặt của tế bào nhạy cảm mà không

cần phải có bất kỳ một thụ thể đặc biệt nào của vi khuẩn Gram (+) và phá thủng màng

tế bào làm thoát các thành phần nội bào dẫn đến tiêu diệt vi khuẩn [30] Kiểu hình thứ 2: nisin tương tác đặc hiệu với lipid II tiền tố peptidoglucan để phá thủng màng tế bào đích và sự tương tác đặc hiệu có sự tham gia của 2 peptide và lipid II tiền tố thành tế bào [79]

Mức độ tác động của nisin lên các loại vi khuẩn rất khác nhau, phụ thuộc vào thành phần của màng phospholipid của tế bào vi khuẩn Ở vi khuẩn Gram (+), peptidoglycan chiếm 90% khối lượng thành tế bào, số lớp peptidoglycan có thể lên tới 25 lớp Trong khi đó ở vi khuẩn Gram (-) lượng peptidoglycan chỉ chiếm 10% tổng khối lượng thành tế bào, ngoài ra chúng còn có một lớp màng ngoài quan trọng (outer membrane – OM) Lớp màng ngoài này có cấu tạo lipid kép tương

tự màng nguyên sinh chất nhưng không chỉ có phospholipids hình thành nên cấu trúc

mà còn có polysaccharide và protein Lipid và polysaccharide liên kết chặt chẽ

với nhau tạo thành một cấu trúc lipopolysaccharide đặc biệt bên ngoài thành tế bào Vi

Trang 13

13

khuẩn Gram (-) có thể chống chịu lại nhiều tác nhân gây hại đối với tế bào là nhờ vào

lớp màng ngoài OM có khả năng ngăn chặn các tác nhân đó một cách có hiệu quả

Lớp màng OM không cho phép các phân tử lượng lớn thẩm thấu qua mà chỉ cho phép các hợp chất kỵ nước khuếch tán một cách hạn chế qua màng Lớp ngoài cùng

của màng OM không có glycerophospholipid do vậy tăng cường được sự khuếch tán

với bacteriocin nhằm tiêu diệt vi khuẩn Gram (-) EDTA là hợp chất được nghiên cứu nhiều nhất về tác động kết hợp nisin đối với vi khuẩn Gram (- ) Stevens

và các cộng sự (1991) đã nghiên cứu sử dụng nisin kết hợp EDTA để tiêu diệt

một số chủng Salmonella Kết quả cho thấy với nồng độ nisin 50 mg/ml và EDTA 20

nM thì sau 1 giờ xử lý ở 37oC, số lượng tế bào các chủng vi khuẩn nghiên cứu đều

giảm từ 10 3,2đến 10 6,9 CFU/ml Trong khi đó khi sử dụng chỉ một trong hai tác nhân EDTA hoặc nisin thì số lượng tế bào giảm không đáng kể

1.2.4 Kh ả năng diệt khuẩn của nisin

Khả năng diệt vi khuẩn Gram (+)

Nisin thuộc bacteriocin nhóm I, có tác dụng diệt những vi khuẩn Gram (+) gồm

những loài vi khuẩn có quan hệ họ hàng, các vi sinh vật gây bệnh như B cereus,

Enterococus, Lactobaccillus, Lactococcus, Leuconostoc, Pediococus, L monocytogens, L innocua, L grayi, L ivanovii, L murrayi, L seeligeri, L welchimeri, Staphylococus spp, Mycobacterium. Giá trị quan trọng của nisin đối với

việc bảo quản thực phẩm được thể hiện ở tác động của nó lên các vi khuẩn sinh bào tử

như là Clostridium và Bacillus là tác nhân chính gây thối thực phẩm

Khả năng diệt vi khuẩn Gram (-)

Trong một số điều kiện nhất định như khi kết hợp với các tác nhân chelate (ví dụ EDTA), nisin có thể tiêu diệt Salmonella Trong điều kiện đông lạnh, xử lý nhiệt, pH

Trang 14

14

thấp, nisin có thể ức chế một số vi khuẩn Gram âm như Salmonella, Shigella,

Klebsiella, E coli.

Khả năng diệt nấm mốc

Sử dụng nisin để bảo quản phomat người ta thấy rằng nisin làm giảm đáng kể vi sinh vật sinh bào tử bao gồm nấm mốc và Bacillus

Tác dụng của nisin lên nấm men

Nghiên cứu mới đây cho thấy sử dụng nisin với nồng độ50 IU/g đã kéo dài thời gian bảo quản phomat Galotyri của Hy lạp đến 42 ngày Các vi sinh vật chiếm ưu thế

trong phomat như lactobacilli, lactoccoci và các nấm men đã giảm một cách đáng kể

1.2.5 Ứng dụng của nisin trong bảo quản thực phẩm

Việc ứng dụng bacteriocin vào bảo quản thực phẩm, không chỉ do có tác dụng kháng khuẩn rõ rệt, mang tính thời sự cao mà còn do con người nhận thức rõ hơn về hậu quả của ô nhiễm môi trường, do việc sử dụng hóa chất và chất kháng sinh trong bảo quản [18; 43; 59; 68] Phạm vi ứng dụng của nisin khá rộng, từ các sản phẩm tươi sống đến các loại thực phẩm lên men, đóng hộp, dạng rắn cũng như dạng nước [18;

77] Sử dụng nisin không làm thay đổi cảm quan, không làm biến đổi chất lượng, không để lại dư lượng trong thực phẩm Dùng nisin để bảo quản thực phẩm đóng hộp,

sẽ làm giảm nhiệt độ và thời gian thanh trùng Nisin đã trở thành chất chuyên biệt dùng để bảo quản thực phẩm, là chất bảo quản nguồn gốc sinh học có giá trị, khắc phục được nhược điểm của các phương pháp sử dụng hoá chất, chất kháng sinh, chiếu

xạ [18; 43] Sử dụng nisin trong các loại đồ uống có cồn có thể ngăn cản sự lên men axit lactic Bổ sung nisin vào quá trình thanh trùng bia có thể kéo dài quá trình cất giữ bia Nisin còn được sử dụng để bảo quản các thực phẩm chế biến từ đậu tương và chế biến từ ngũ cốc, các loại thức ăn đóng gói Để bảo quản thực phẩm, nisin có thể bổ sung với hàm lượng 100 mg/kg- 200 mg/kg và tối đa là 500 mg/kg

Do đặc tính bền nhiệt, bền vững trong điều kiện pH axit hoặc trung tính, bacteriocin là một giải pháp hay trong bảo quản thực phẩm lên men cũng như không lên men

Đối với thực phẩm lên men, người ta bổ sung vào đó các chủng vi khuẩn lactic phân lập từ thịt có khả năng sinh bacteriocin như là giống khởi động [34] Các vi

Trang 15

15

khuẩn lactic này sinh trưởng tạo ra pH thấp và sinh tổng hợp bacteriocin ức chế các vi sinh vật gây thối cũng như các vi sinh vật gây bệnh vốn có trong các sản phẩm tự nhiên Do đó, sản phẩm lên men vừa có hương vị thơm ngon lại vừa an toàn cho người

Theo tác giả B Ten Brink thì bacteriocin của vi khuẩn lactic còn được sử dụng trong các nghiên cứu phân loại

Một loại bacteriocin của vi khuẩn lactic được sử dụng như một sản phẩm thương mại trong bảo quản thực phẩm là nisin Nisin đầu tiên được sản xuất dưới dạng thương phẩm là nisin A với tên thương mại là Nisaplin Nisin được quan tâm nghiên cứu nhiều cả ở trong phòng thí nghiệm cũng như trong công nghiệp Nisin được chứng minh là an toàn cho con người khi sử dụng từ năm 1962 bởi hai tác giả Frazer và Hara FAO/WHO cho phép sử dụng nisin trong bảo quản thực phẩm từ năm 1969 Năm

1988, tổ chức FDA của Mỹ công nhận nisin là an toàn cho sử dụng và nó được sử

dụng làm chất bảo quản thực phẩm

Theo Linda J Harris và cộng sự (1992), H Chen và D.G Hoover năm 2003 [18, 40], nisin rất nhạy cảm với enzym α – Chymotrypsin và không bị phân hủy bởi enzym trypsin, elastase, carboxypeptidase A, pepsin và erepcin Nisin có chứa axit amin lanthionine (Ala-S-Ala) và β – methyllanthionine (Abu-S-Ala), axit amino butyric (Abu), dehydroalanin (Dha), dehydrobutyrin (Dhb)

Nisin là một bacteriocin duy nhất được cho phép sử dụng trong bảo quản thực phẩm Nó được sử dụng trong rất nhiều loại thực phẩm, đặc biệt lĩnh vực áp dụng chính của nisin vẫn là các sản phẩm thực phẩm thông dụng hàng ngày (nhất là phomat

Trang 16

16

và các sản phẩm thực phẩm đóng hộp) Năm 1969, theo JECFA (the Join FAO/WHO Expert Committee on Food Additive) ngưỡng cho phép sử dụng nisin đầu vào (ADI – Acceptable Daily Intake) là 0,13 mg/kg thể trọng/ngày nhưng ngưỡng này là quá cao

và đến năm 1988, FDA (Food and Drug Administration) dựa trên liều lượng tính toán

đã đưa ra ADI là 0,049 mg/kg thể trọng/ngày tương ứng với một lượng là 2,9 mg/kg/1 người/ 1 ngày Đến năm 1992, SCF (the Scientific Committee on Food) cho phép được

sử dụng 0,13 mg nisin tinh khiết/kg thể trọng (với hoạt tính là 40.000 IU/mg) Năm

2001 FDA công nhận tính an toàn của nisin trong việc sử dụng nisin để bảo quản sản phẩm thịt lợn và thịt gia cầm đã chế biến với hàm lượng nisin có mặt tối đa là 0,0025

% ở trong sản phẩm hoàn thiện Theo FSANZ [32] thì nisin ngày nay đã được phê chuẩn cho phép sử dụng như một chất kháng khuẩn an toàn ở hơn 50 quốc gia trên thế giới bao gồm: Mỹ, Anh, EU, Trung Quốc, MERCOSUR (bao gồm Argentina, Brasil, Urugoay, Paragoay, Venezuela)…

Ở Việt Nam, vi khuẩn lactic đã được nghiên cứu, ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm để chế biến cũng như bảo quản thực phẩm Nhiều nông trường quốc doanh

đã sử dụng biện pháp ủ chua thức ăn xanh cho gia súc nhờ quá trình lên men lactic [2] Nhiều cơ sở chế biến thực phẩm đã sử dụng vi khuẩn lactic để chế biến thực phẩm dạng: thịt, cá hun khói, tôm chua, cá muối chua, xúc xích, sữa chua… Nhiều chế phẩm

có nguồn gốc từ các vi khuẩn lactic sống được sản xuất ứng dụng trong việc chữa các bệnh rối loạn đường ruột cho người, các loại sữa có bổ sung khoáng và vi lượng như

Fe, Ca, Mn, Cr… để làm thức ăn bổ sung cho trẻ nhỏ và những bệnh nhân suy nhược

cơ thể Cùng với sự phát triển của công nghệ chế biến các sản phẩm trong nước thì nhu cầu sử dụng bacteriocin mà cụ thể là nisin trong bảo quản thực phẩm là rất lớn Tuy nhiên, các sản phẩm bảo quản nhập ngoại có giá thành tương đối cao Thị trường các chất bảo quản sinh học có nguồn gốc trong nước như bacteriocin còn đang là vấn đề

mở cho các nhà sản xuất

1.2.6 Công nghệ sản xuất và các hướng nghiên cứu về nisin

Nisin là chất diệt khuẩn sinh học được thương mại hóa với mức độ lớn nhất trong số các bacteriocin Cho đến nay, nisin đã và đang được sản xuất công nghiệp

bằng việc lên men chủng L lactis tự nhiên, thông qua việc tối ưu hoá môi trường, điều

Trang 17

17

kiện lên men, hoàn thiện công nghệ lên men, thu hồi và tinh sạch sản phẩm [18; 37; 49; 85] Nhiều công trình nghiên cứu về việc nâng cao hoạt tính sinh tổng hợp nisin từ

vi khuẩn L lactis đã được công bố Jozala và đồng tác giả đã chứng minh, môi trường

MRS và M17 là môi trường gia tăng sự sinh trưởng và tổng hợp nisin từ các chủng L lactis Một số tác giả khuyến cáo rằng, các môi trường tổng hợp thường không làm tăng tổng hợp nisin [37] Tuy nhiên, việc phối hợp các chất bổ sung khác để giảm 50

% lượng môi trường MRS và M17 lại giúp giảm giá thành sản xuất Li và đồng tác giả (2001) đã nghiên cứu tối ưu hóa, ảnh hưởng của đường saccarose, pepton đậu tương, chiết nấm men, K2HPO4 , NaCl, MgSO4 đến sự sinh tổng hợp nisin [49] Khi lên men trong môi trường được tối ưu, năng suất tổng hợp nisin đã nâng lên từ 1074 IU/ml đến

2150 IU/ml Taniguchi Mashayuki và cộng sự đã nghiên cứu nâng cao năng suất nisin

của L lactis trong điều kiện nuôi cấy yếm khí với môi trường có thành phần gồm

đường, các muối khoáng, các nguồn nitơ và sử dụng màng siêu lọc polycrylonitride để thu nhận nisin trên quy mô công nghiệp [74] Hiroshi Shmizu và cộng sự lại sử dụng

hệ thống nuôi cấy hỗn hợp loài L lactis với Kluyveromyces marxianus Các tác giả nhận thấy, K marxianus đã sử dụng lactat sinh ra trong quá trình nuôi cấy L lactis và

vì vậy đã có tác dụng kiểm soát được pH trong môi trường lên men Kết quả là, sản lượng nisin trong nuôi cấy hỗn hợp đạt 9,8 mg/l, cao hơn trong môi trường nuôi cấy

đơn chủng L lactis (5,8 mg/l) [69] Tại Trung quốc, sau khoảng gần 6 † 7 năm nghiên

cứu ở Viện Hàn lâm, việc sản xuất nisin ở quy mô công nghiệp trên nồi lên men 100

m3, đã bắt đầu từ khoảng năm 1995

Ngày nay, bên cạnh những nghiên cứu lý thuyết về cơ chế phân tử sự liên quan giữa cấu trúc và chức năng, cơ chế tác dụng của nisin, cơ chế miễn dịch của chủng sản cũng như vai trò của những enzym cải biên, thì hướng áp dụng kỹ thuật di truyền, kỹ thuật protein nhằm cải tiến hoạt tính, độ hoà tan, tính bền vững, tăng cường tác động của nisin đối với vi sinh vật thuộc nhóm Gram âm dành được sự quan tâm đặc biệt Ngoài ra, xu hướng nghiên cứu sử dụng nisin để chế tạo các màng bao gói thực phẩm, thay thế phương pháp bổ sung trực tiếp nisin vào thực phẩm, đang hình thành bên cạnh các nghiên cứu về năng suất và công nghệ tinh sạch cũng như công nghệ lên men

1.3 AXIT POLYLACTIC

Trang 18

18

Axit polylactic (PLA)/polylactide là một loại polyme nhiệt dẻo bán tinh thể, giòn và rắn, có nhiệt độ thủy tinh hóa tương đối thấp (~ 60 oC) và có nhiệt độ chảy mềm 175 ÷ 180 oC Vì thế PLA dễ dàng được gia công trong các thiết bị gia công chất dẻo thông thường và PLA bị phân hủy theo con đường sinh học [10] Hiện nay, trong

số các loại nhựa phân hủy sinh học, PLA là đối tượng được quan tâm nghiên cứu và phát triển nhiều nhất trên thế giới do PLA rất thích hợp để chế tạo ra các bao bì, màng bao gói thực phẩm, các sản phẩm sử dụng một lần nhằm thay thế các sản phẩm có nguồn gốc polyme dầu mỏ gây ô nhiễm môi trường [31]

Mặc dù thời gian phát triển mới chỉ khoảng một thập kỷ, nhưng chỉ riêng tại châu Âu tốc độ phát triển của nhựa phân hủy sinh học đã tăng gấp 10 lần Điều này cho thấy tiềm năng chiếm lĩnh thị trường rất lớn của loại sản phẩm này Một số sản phẩm đã được thương mại như túi sách, dụng cụ ăn uống sử dụng một lần của Công ty Mater - Bỉ, các loại móc phát bóng golf, đĩa DVD, đinh tự tiêu trong phẫu thuật của Công ty Vegemat Từ năm 2005, công ty đóng gói bao bì Coopbox của Ý đã sử dụng PLA làm khay đựng và màng film bao gói bảo quản các loại thịt tươi, rau quả cho phân phối và sử dụng khắp trong các nước thành viên của liên minh châu Âu [24]

Năm 2002 tập đoàn hóa chất DowChemical và tập đoàn thực phẩm Cargill của

Mỹ đã liên kết đầu tư 300 triệu USD xây dựng nhà máy sản xuất PLA với công suất 140.000 tấn/năm Cargill Dow đã sử dụng PLA như là nguyên liệu đáng tin cậy thay

cho các chất dẻo truyền thống [16]

Hình 1.2 Sơ đồ quy trình sản xuất PLA của hãng Cargill Dow, Mỹ

Tại Nhật Bản, PLA được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực Một số hãng điện tử như NEC, Panasonic, Fujisu sử dụng PLA làm thẻ điện thoại, bàn phím máy tính, vỏ điện thoại và một số thành phần linh kiện máy tính Ngoài ra, một số hãng ô tô như

Đường, tinh bột và

sinh khối thực vật L-lactic

L- Polylactic Phân tử lương thấp

Trang 19

19

Toyota, Honda sử dụng PLA làm một số thành phần và nội thất của xe PLA còn được

sử dụng chế tạo các dụng cụ văn phòng, đồ chơi trẻ em, giầy dép trẻ em, vỏ chai, khay đựng và màng film bao gói thực phẩm [62]

1.3.1 Sản xuất axit L-lactic

Axit lactic có lịch sử lâu đời và được áp dụng phổ biến trong lên men và bảo quản thực phẩm Axit lactic được khám phá lần đầu tiên bởi Scheele vào năm 1780, như là một thành phần của sữa Năm 1789, Lavoisier đặt tên nó là axit sữa Đến năm 1857, Pasteur là người phát hiện, axit lactic còn được tạo ra từ quá trình trao đổi chất của các vi sinh vật khác [13] Hiện nay, axit lactic được sản xuất theo hai con đường: tổng hợp hóa học từ nguyên liệu dầu mỏ, khí đốt và lên men vi sinh vật từ các nguyên liệu có thể tái tạo (đường, tinh bột và sinh khối thực vật) (Hình 1.2) [78]

Tổng hợp axit lactic theo con đường hóa học đòi hỏi các thiết bị công nghiệp chịu nhiệt, chịu áp và axit, đồng thời sản phẩm tạo ra theo con đường này thường là hỗn hợp hai dạng đồng phân D và L-lactic, dẫn đến chi phí cao do việc phân tách hai loại đồng phân này [22] Theo cơ quan quản lý Thuốc và Thực phẩm của Mỹ (FDA), axit D(–)-lactic, không được ứng dụng trong thực phẩm, bởi vì nó không được cơ thể con người đồng hóa dẫn đến tích lũy axit D(–)-lactic, gây rối loạn axit và làm thất thoát canxi trong

cơ thể [42] Đồng thời, tổng hợp theo con đường hóa học lại bị giới hạn bởi hai vấn đề chính đó là sự khan hiếm nguyên liệu dầu mỏ và vấn đề môi trường tạo ra Để khắc phục

các vấn đề trên, sản xuất axit lactic theo con đường lên men vi sinh vật được cho là một lựa chọn tối ưu [42]

Nguồn dầu mỏ

Acetaldehyde (CH3CHO) HCN, xúc tác Lactonitrile(CH 3 CHOHCN)

Tạo ra L- lactic hoặc D-lactic axit

Tiền xử lý bằng axit hoặc enzyme

Lên men vi sinh v ật

Thu hồi và tinh sạch

(a) tổng hợp hóa học (b) Lên men vi sinh vật

- Các v ấn đề về môi trường

- Cạn kiệt dầu mỏ

- Giải pháp thay thế

Trang 20

20

Hình 1.3 Sơ đồ sản xuất axit lactic (a): bằng con đường hóa học; (b): con đường lên men vi sinh vật

Những vi sinh vật có thể sản sinh ra axit lactic được chia thành hai nhóm: nhóm

vi khuẩn và nhóm vi nấm

Hiện nay, sản xuất axit lactic bằng lên men vi khuẩn thường sử dụng các loài

Lactobacillus rhamnosus, L helveticus, L bulgaricus, L casei, L plantarum, L pentosus, L amylophilus, L delbrueckii

Vi khuẩn lactic có khả năng lên men đường glucose và lactose thành axit lactic với hiệu suất cao Axit lactic tạo ra theo con đường lên men vi khuẩn thường không phải chỉ có axit L-lactic mà còn có thêm sản phẩm phụ là D - lactic Tỷ lệ giữa hai đồng phân này phụ thuộc vào bản chất sinh học của từng loài và từng chủng [54; 83] Hiện nay, nhiều nghiên cứu đã sử dụng kỹ thuật di truyền để bất hoạt gen D-lactate dehydrogenase tổng hợp ra D-lactic, để điều khiển tổng hợp ra 100 % axit L-lactic [17; 27; 28]

Sản xuất axit L-lactic từ vi nấm khác với ở vi khuẩn lactic Một số loài vi nấm

như Rhizopus oryzae và Rhizopus arrhizus, có thể thủy phân, đồng hóa tinh bột và tạo

ra 100 % đồng phân axit L-lactic Quá trình này diễn ra trong điều kiện hiếu khí nghiêm ngặt [50; 75] Nếu như quá trình lên men vi khuẩn lactic đòi hỏi môi trường

giàu dinh dưỡng thì quá trình lên men của Rhizopus chỉ cần môi trường muối khoáng

thông thường Vi nấm trong quá trình sinh trưởng trong môi trường dịch thể, sợi dinh dưỡng bó lại thành dạng pellet, vì thế dễ dàng loại bỏ sinh khối trong quá trình thu hồi sản phẩm sau lên men [82] Mặc dù, quá trình sản xuất axit L-lactic từ vi nấm có nhược điểm là tạo ra lượng nhỏ axit fumaric và ethanol Tuy nhiên, hai dạng sản phẩm phụ này có thể bị hạn chế sinh ra bằng cách điều khiển quá trình lên men và loại bỏ hoàn toàn thông qua quá trình trưng cất thu hồi axit L-lactic [61]

Như vậy, việc sử dụng lên men R oryzae và R arrhizus có thể thu nhận được

axit L-lactic có phần dễ dàng hơn so với sử dụng các vi khuẩn lactic

1.3.2 Tách và thu hồi axit L-lactic từ dịch lên men

Trang 21

21

Hiện nay, axit L-lactic sau lên men được tách và thu hồi theo những cách sau:

Sử dụng phương pháp hóa học: Trong quá trình lên men và sau lên men L-lactic được kết tủa bằng CaCO3 hoặc Ca(OH)2 để tạo ra L-lactate-Ca Hợp chất này được tách ra khỏi dung dịch và hoàn nguyên trở thành L-lactic bằng cách cho L-lactate-Ca phản ứng với H2SO4 Nhược điểm của phương pháp này là đòi hỏi thiết bị chịu axit cao và không thu hồi L-lactic một cách triệt để [60]

Sử dụng phương pháp điện thẩm tách-electrodialysis: Hiện nay trong sản xuất quy mô công nghiệp phương pháp này được sử dụng để tách L-lactic ra khỏi dịch lên men Nguyên tắc của phương pháp điện thẩm tách được mô tả trong sơ đồ hình 1.3 Thiết bị gồm điện trường một chiều và hai màng cation và anion Dịch lên men đi vào điện trường các ion dương (Ca2+ hoặc Na +) được đi qua màng cation và về phía cực

âm Các điện tích âm L-lactic đi qua màng anion và về cực dương Dựa trên nguyên lý này dịch L-lactic được tách và thu ở phía đầu cực dương của thiết bị Ưu điểm của

phương pháp là hiệu suất thu hồi, độ tinh sạch cao và tốn ít năng lượng [38]

1.3.3 Tổng hợp polylactic

Polylactic được tổng hợp từ L-lactic theo hai con đường:

+ Con đường thứ 1 (dựa trên phản ứng trùng ngưng của axit L-lactic): từ monome ban đầu là L-lactic được trùng ngưng loại nước để tạo ra PLA Quá trình này được tiến hành đơn giản trong thiết bị gia nhiệt và bay hơi Tuy nhiên, sản phẩm PLA tạo ra

thường có phân tử lượng không cao với Mn và Mw từ 1000 ÷ 10.000 [36; 41]

+ Con đường thứ 2 (dựa trên phản ứng trùng hợp cộng mở vòng của L-lactide): từ monomer là L-lactide dưới tác động của chất xúc tác và nhiệt độ L-lactide được trùng hợp để tạo ra PLA Phương pháp cộng mở vòng thường thu được PLA có phân tử lượng cao với Mn và Mw > 100.000 Hiện nay, chủ yếu các PLA được sử dụng làm vật liệu phân hủy sinh học được tổng hợp theo con đường này [57]

Để tổng hợp PLA bằng phản ứng cộng mở vòng từ monome axit L-lactic phải tiến hành qua hai giai đoạn sau:

Giai đoạn I: Tổng hợp dime vòng (lactide) từ axit L- lactic bằng phương pháp trùng ngưng chọn lọc có xúc tác:

H C C O

Trang 22

H C

O H

CH3L-A-xit lactic

n

T, vacuum

-H2O

HO C O

H C

O H

CH3n

oligome PLA B- í c 1: Ph¶n øng ng- ng tô kh«ng xóc t¸ c

HO

C O

H C

O H

CH3n

B- í c 2: Ph¶n øng vßng ho¸ Unzipping

Giai đoạn II: Trùng hợp mở vòng L-lactide thành PLA:

Ở Việt Nam đã có một số nghiên cứu về khả năng sản xuất bao bì dễ phân hủy

từ các vật liệu như tinh bột biến tính, vật liệu blend của polyetylen với các loại polyme

dễ phân hủy có nguồn gốc tự nhiên như PHB [5] Tuy nhiên, đến nay chưa có loại bao

bì nào thuộc dạng này được đưa ra thị trường Một số công ty TNHH tại Tp Hồ Chí Minh, Vĩnh phúc đã nhập nguyên liệu để sản xuất bao bì dễ phân hủy, nhưng không

phải là polylactic và không có các chất kháng khuẩn nên chỉ đóng vai trò làm bao gói

1 3.4 Khả năng phân hủy sinh học của polylactic

Bước 1: phản ứng ngưng tụ không xúc tác

Bước 2: phản ứng vòng hóa Unzipping

Trang 23

23

Rất nhiều nghiên cứu đã chứng minh khả năng phân hủy sinh học của PLA Do PLA là polyeste, cho nên nó dễ dàng bị thủy phân bởi các loại enzym của vi sinh vật Nghiên cứu của Sawada và cộng sự (2007) đã tiến hành thủy phân PLA bằng

proteinase và lipase tách từ Bacillus subtilis và Bacillus lichenformis [65] Tại Nhật

Bản công ty SAIDA đã phát triển hệ thống đánh giá khả năng phân hủy sinh học của các loại nhựa sinh học (Bioplastic) theo tiêu chuẩn ISO 14855-2 có tên là MODA (MODA-4, MODA-6 và MODA-B) Trong nghiên cứu của Kunioka và cộng sự 2009,

đã sử dụng hệ thống MODA-B để nghiên cứu khả năng phân hủy PLA ở điều kiện kỵ khí thông qua việc xác định hàm lương CH4 tạo ra Kết quả là sau 60 ngày 90 % PLA

đã bị phân hủy [53] Cũng trong nghiên cứu của Kunioka và cộng sự 2006, khi sử dụng hệ thống MODA-4 để nghiên cứu khả năng phân hủy bột PLA ở điều kiện hiếu khí và đánh giá khả năng phân hủy thông qua lượng CO2 tạo ra, sau 56 ngày 80 % bột PLA bị phân hủy [52] Ở Việt Nam, trong nghiên cứu của Trần Đình Mấn và cộng sự (2008), đã sử dụng phương pháp chôn lấp màng PLA để đánh giá khả năng phân hủy của PLA, kết quả thu được là sau 3 tháng chôn lấp 90 % màng PLA đã bị phân hủy [76]

1.4 NGHIÊN CỨU TẠO BAO BÌ BẢO QUẢN THỰC PHẨM

1.4.1 Nghiên cứu tạo và ứng dụng khay đựng thực phẩm sử dụng một lần

Năm 2007, công ty Sealed Air lần đầu tiên giới thiệu nhãn hiệu Cryovac® NatureTRAY™- sản phẩm khay đựng thực phẩm, được sản xuất từ nhựa

PL [80] Loại khay này được sử dụng để đựng các loại thịt, cá và rau quả tươi Theo khuyến cáo nhà sản xuất loại khay từ nhựa PLA không làm mất hương vị và chất lượng của thực phẩm Loại khay này được bổ sung chất kháng khuẩn sinh học nhằm kéo dài thêm thời gian sử dụng an toàn của thực phẩm Tại Thái Lan Kasetsart, đã tạo thành công các khay đựng thực phẩm bằng nhựa PLA, để thay thế cho các loại khay đựng thực phẩm sản xuất từ dầu mỏ [72] Ở Việt nam, phần lớn các hay đựng thực

phẩm được sản xuất hoặc được tái chế từ các polyme dầu mỏ

1.4.2 Tạo màng, bao bì giấy PLA- Nisin và ứng dụng trong bảo quản thực phẩm

Sự kết hợp PLA - nisin có thể tạo ra nhiều dạng sản phẩm có thể ứng dụng trong bảo quản thực phẩm như là màng film PLA - nisin, bao bì giấy tráng phủ PLA -

Trang 24

24

nisin Các sản phẩm này có tính chất tương tự như các sản phẩm sử dụng polyme dầu

mỏ

Tạo màng PLA - nisin

Màng polylactic được tạo ra theo phương pháp cán gia nhiệt hoặc tạo màng sử dụng dung môi Trong nghiên cứu của Liu và cộng sự, đã đề xuất phương pháp sử dụng nisin bao lên màng film polylactic và sử dụng màng đã gắn nisin để đánh giá khả năng kháng khuẩn của màng cũng như các tính chất cơ lý của màng [56] Jin và cộng

sự, đã tạo ra màng film cố định nisin bằng cách hòa nisin vào dung dịch PLA đã được hòa tan trong dung môi, tạo ra màng film có độ dày 0,15 mm với lượng nisin được bổ sung vào là 0,04 mg/cm2 Đánh giá khả năng kháng L monocytogenes Scott A 724, E

colii 0157:H7, Salmonella của màng PLA - nisin cho thấy, sử dụng màng có khả năng tiêu diệt các vi khuẩn gây bệnh trên có trong thực phẩm, và có thể dùng để bảo quản các thực phẩm tươi ở 4 o

C trong 21 ngày [46] Trong nghiên cứu của Tipayanate và cộng sự, các tác giả đã sử dụng hỗn hợp 2 % PLA, 2 % axit L-lactic và nisin có nồng

độ 200 IU/ml để tạo màng bao bọc thịt bò tươi Thịt bò sau khi được bao gói bằng hỗn hợp trên có thể bảo quan ở 4 o

C trong 5 ÷ 6 ngày [12]

Tại Nhật Bản, nhiều loại thực phẩm ăn nhanh được bảo quản bằng màng polyme sinh học có chứa chất kháng khuẩn sinh học mà không làm thay đổi cảm quan, hương vị và màu sắc của thực phẩm Những loại màng bao gói dạng như vậy, đang từng bước thay thế dần cho các phương pháp truyền thống sử dụng các loại lá bao gói

có trong tự nhiên

Các nhà khoa học Nhật Bản đã chứng minh rằng, các polyme sinh học có khả

năng kháng khuẩn có thể kìm hãm rất tốt vi khuẩn E coli trên bề mặt polyme Tuy

nhiên, việc sử dụng loại chất kháng khuẩn nào vẫn là bí mật của các hãng sản xuất

Ở Việt nam, hướng tạo ra màng film PLA - nisin kháng khuẩn là nghiên cứu đầu tiên, tạo sản phẩm sử dụng trong bao gói thực phẩm, nhằm khắc phục các vấn đề

về bảo quản, vệ sinh an toàn thực phẩm và về môi trường

Tạo bao bì PLA - nisin

Trên thực tế, để tăng khả năng chịu nước, các bao bì giấy được tráng phủ các loại polyme như polyethylen, polypropylene sau khi sử dụng chỉ có phần giấy bị

Trang 25

25

phân hủy còn phần polyme vẫn tồn tại trong đất Để khắc phục vấn đề này, hãng Nano Filber Tech đã đưa ra các sản phẩm như hộp đựng, cốc, bao bì giấy có tráng phủ PLA [80] Vì thế, các sản phẩm của hãng sau khi sử dụng có thể phân hủy hoàn toàn trong

tự nhiên Joerger và cộng sự đã thành công trong việc kết hợp PLA và nisin để tráng phủ bề mặt giấy gói thực phẩm giúp tăng cường an toàn vệ sinh và kéo dài thời gian bảo quản thực phẩm [48]

Vì vậy, ý tưởng phát triển hệ thống đóng gói kháng khuẩn dựa trên vật liệu phân hủy sinh học PLA và nisin giải quyết hai vấn đề: an toàn thực phẩm và bảo vệ môi trường Vật liệu bao gói là rào cản đối với sự xâm nhập của vi sinh vật Chất kháng khuẩn (CKK) có mặt trong thành phần vật liệu đóng gói sẽ không chỉ ngăn cản

sự xâm nhập từ bên ngoài mà còn kìm hãm sự sinh trưởng của vi sinh vật nội tại ở thực phẩm trong quá trình bảo quản

Tuy nhiên, do CKK nisin tráng phủ trực tiếp trên bề mặt màng film PLA có thể

bị giảm hoạt tính kháng khuẩn do bề mặt kỵ nước hoặc do bề mặt nhẵn đặc trưng của màng PLA, sẽ ngăn cản khả năng bám kết của nisin Bởi vậy, việc nghiên cứu các phương pháp để gắn kết, phối trộn nisin vào PLA để tăng cường khả năng bám kết của nisin vào PLA là vô cùng cần thiết và có tính quyết định [11; 20; 39; 63; 70; 84]

CKK được pha trộn vào bao bì có thể di chuyển, xâm nhập vào thực phẩm qua cơ chế khuyến tán và phân cắt Ngoài ra, có thể thông qua cơ chế hấp phụ cân bằng [11; 63] Bao bì kháng khuẩn có thể được tạo thành bằng cách phối trộn và cố định CKK, hoặc bằng cách cải biến bề mặt và tráng phủ (coating) được đề cập [11; 63; 70]

Tạo màng film thực phẩm với bacteriocin (nisin, lactacin) bằng cách pha trộn trực tiếp (direct incorporation) bacteriocin vào polyme Trong khi có hai phương pháp tạo màng film là ép nhiệt (heat press) và cán (casting)

Màng film sử dụng để đóng gói thực phẩm tạo ra từ các vật liệu có nguồn gốc sinh học như axit polylactic và nisin thể hiện tính kháng khuẩn và khả năng phân giải sinh học, là một lựa chọn đạt hai mục tiêu và là giải pháp thân thiện môi trường Phương pháp này không những bảo quản thực phẩm an toàn mà còn kéo dài thời gian

sử dụng, giữ được chất lượng, các đặc điểm cảm quan và tính tự nhiên của thực phẩm

Theo Sunil [70] có ba cách tạo ra bao bì đóng gói kháng khuẩn gồm:

Trang 26

26

- Phối trộn (incorporation) chất kháng khuẩn vào túi để từ đó các chất kháng khuẩn

là những chất có thể bay hơi được giải phóng ra trong quá trình bảo quản thực phẩm

- Trộn trực tiếp (direct incorporation) các chất kháng khuẩn vào màng đóng gói

- Tráng phủ (coating) trên vật liệu bao gói

Những chất kháng khuẩn không có khả năng bốc hơi phải tiếp xúc với bề mặt thực phẩm để chất kháng khuẩn có thể khuyếch tán vào bề mặt và bên trong thực phẩm Bởi vậy, việc khuyếch tán của CKK tham gia trong thành phần của vật liệu đóng gói vào bề mặt thực phẩm là cực kỳ quan trọng, đảm bảo hoạt tính kháng khuẩn [20] Tốc độ khuếch tán của CKK còn đóng một vai trò duy trì bền vững hoạt tính kháng khuẩn đối với thực phẩm Vì vậy, việc nghiên cứu các tác động ảnh hưởng tới

việc giải phóng CKK rất được quan tâm

PHẦN II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 V ẬT LIỆU

2.1.1 Ch ủng giống vi sinh vật

Chủng sử dụng để lên men sản xuất nisin là L lactis subsp lactis PD15, nisin

sử dụng để tạo màng PLA – nisin là sản phẩm dạng bột có hoạt lực 1000 IU/mg

Chủng sử dụng để sản xuất axit lactic là R oryzae VLSH01, từ axit L-lactic nhờ

phản ứng cộng mở vòng tổng hợp nên PLA, sản phẩm PLA thu được có phân tử lượng trung bình Mn và phân tử lượng Mw đạt > 100.000

Trang 27

27

Những sản phẩm này thu được từ nghiên cứu của Phòng Công nghệ vật liệu sinh học, VCNSH, VHLKH&CNVN Ngoài ra, các chủng sử dụng làm kiểm định là

Lactobacillus plantarum JCM1149 (Nhật Bản), B cereus, S aureus, L

monocytogenes Tất cả đang được lưu giữ tại bộ phận giống của Phòng

2.1.2 Môi trường nuôi cấy, hóa chất

Sữa gầy (Skim milk) có xuất xứ Australia Môi trường nghiên cứu được sử dụng là môi trường MRS và CM có các thành phần hóa chất như sau:

Môi trường MRS (g/l): Cao thịt (10), cao men (5), peptone (10), glucose (20),

CH3COONa (5), K2HPO4 (2), Amonicitrat (2), MgSO4.7H2O (0,2), MnSO4 (0,04), Tween 80 (1ml), agar (20) pH 6,8 Bổ sung nước cất cho đủ 1 lít

Môi trường CM (g/l): Saccarose (40), cao nấm men (10), peptone (10), KH2PO4 (0,2), NaCl (2), MgSO4.7H2O (0,2) pH 6.8 ± 0,2 Bổ sung nước cất đến 1 lít

2.1.3 Các thi ết bị thông dụng dùng cho nghiên cứu

- Lò vi sóng (Sumsung, LG-Intellowave, 220V-50Hz, Max: 1150W);

- Bình phản ứng 500 ml, bình cầu nhám 500 ml, bộ chưng cất áp suất thường; thiết bị chưng cất chân không quay, máy khuấy từ, thiết bị tạo áp suất; tủ sấy chân không

- Nhớt kế Ubellohde

- Kính hiển vi quang học Olympius, Model CHD, Nhật Bản

- Kính hiển vi quang học Olympius CH2, Model CHS, Nhật Bản

- Máy đo pH (320 pH Metter) Mettler Toledo, Thuỵ Sĩ

- Máy so màu (Spectophotometer pharmacia, Biotech, Model 80-2088 -64), Anh

- Cân điện tử AB 204, Mettler Toledo, Thuỵ Sỹ

- Máy li tâm Micro Centaur MSE, Anh

- Phân cực kế Model WXG-4, Trung Quốc

- Digital Micropipette Model 5000 DG, Nichipet, Nhật Bản

- Lên men và thu hồi nisin: Sử dụng hệ thống bình lên men 5, 10 l, 100 l và các thiết bị

sấy phun, ly tâm, lọc tiếp tuyến của Viện Công nghệ sinh học, VHLKH&CNVN

Trang 28

28

2 2 PHƯƠNG PHÁP

2.2.1 Phương pháp xác định hoạt tính nisin

Để lựa chọn chủng có hoạt tính tổng hợp nisin cao trong bộ sưu tập của Phòng,

dựa trên đánh giá tác dụng ức chế chủng kiểm định L plantarum JCM1149 [8] Hoạt

tính kháng khuẩn của nisin được xác định bằng phương pháp khuếch tán trong môi trường thạch có cải tiến theo Phan K.H và cs [8], gồm một số bước:

Bước 1: Chủng kiểm định L plantarum JCM 1149 được nuôi tĩnh qua đêm (12 giờ)

trong môi trường MRS lỏng ở 30 °C (OD600 = 1,28)

Bước 2: Môi trường MRS bán lỏng (có chứa 0,6 % thạch) được khử trùng ở 121 °C,

15 phút Sau khi làm lạnh đến nhiệt độ khoảng 37 ÷ 40 °C, bổ sung 0,5 % (v/v) dịch huyền phù vi khuẩn chủng kiểm định, lắc đều và đổ ra đĩa petri có đường kính 15 cm (20 ml/đĩa) Đợi thạch nguội, đục giếng Mỗi giếng có đường kính 7 mm

Bước 3: Hút 25 µl dịch nisin đã được pha loãng nhỏ vào các giếng thạch và giữ ở nhiệt

độ 4 oC trong khoảng 4 giờ, sau đó ủ ở 37 oC qua đêm Quan sát và đo đường kính vòng vô khuẩn được hình thành Trong đó, đường kính vòng vô khuẩn của mẫu nghiên cứu bằng hiệu của đường kính vòng vô khuẩn đo được và đường kính giếng thạch (D-d) Căn cứ vào việc xuất hiện vòng vô khuẩn và kích thước đường kính vòng vô khuẩn

để xác định hoạt tính nisin của chủng nghiên cứu

Hoạt tính của nisin thường được xác định bằng đơn vị quốc tế IU (International Unit)

Việc xác định cơ bản dựa theo phương pháp của Fowler và cộng sự đề xuất 1975

Chủng kiểm định là L plantarum JCM1149 một chủng kháng axit và nhạy cảm với

nisin Nisin chuẩn của hãng Sigma với hoạt tính 1000000 IU/g được pha thành các nồng độ khác nhau Xác định hoạt tính của những mẫu này bằng cách đo đường kính

vùng ức chế đối với L plantarum Từ đó lập phương trình đường chuẩn tương quan

giữa nồng độ nisin (tính bằng IU/ml hoặc IU/mg) và đường kính vòng ức chế bằng phần mềm Excel của Microsoft, phương trình có dạng hàm số mũ: Y = 102.5 x e 0.281x

,

hệ số hồi quy R2 = 0.994 Trong công thức này: x = D-d (mm), D: là đường kính vòng

vô khuẩn (mm) , d: là đường kính lỗ khoan (mm);, Y: Hoạt tính chế phẩm (IU/ml hoặc IU/mg)

Trang 29

29

Với đường cong chuẩn đã dựng được, việc xác định hoạt tính các mẫu chứa nisin rất

thuận lợi và nhanh chóng (hình 2.1)

Hình 2.1 Đường cong chuẩn xác định nồng độ nisin (IU)

2.2.2 Phương pháp tạo màng PLA - nisin

Màng PLA - nisin được chuẩn bị theo phương pháp của T Jin và cộng sự [46] Cân 0,75 g PLA bổ sung vào bình tam giác nút nhám chứa 25ml DMCL Dung dịch được khuấy cho đến khi tan hoàn toàn Khi dung dịch trong suốt bổ sung 0,25 g nisin

và tăng khuấy Sau đó, hỗn hợp trên được đổ ra đĩa petri có đường kính 15 cm Dung dịch methylene chloride được bay hơi ở nhiệt độ phòng trong tủ hút

2.2.3 Xác định nồng độ nisin trên 1 cm 2 màng PLA – nisin

Đĩa petri để tạo màng có đường kính 15 cm, vậy diện tích đĩa là 176,625 cm2

Theo công thức tạo màng mục 2.2.2 nisin nồng độ 1000 IU/mg bổ sung vào là 0,25 g tương đương 250000 IU Vậy 1 cm2 màng sẽ có nồng độ nisin là 1415 IU

2.2.4 Xác định hoạt tính kháng khuẩn của màng

Hoạt tính kháng khuẩn của màng được xác định theo 2 cách:

 Phương pháp khuếch tán trên thạch bán lỏng: Chủng kiểm định L plantarum JCM

1149 được nuôi tĩnh qua đêm (12 giờ) trong môi trường MRS lỏng ở 30 °C (OD600 = 1,28) Môi trường MRS bán lỏng (có chứa 0,6 % thạch) được khử trùng ở 121 °C, 15 phút Sau khi làm lạnh đến nhiệt độ khoảng 37 † 40 °C, bổ sung 0,5 % (v/v) dịch

Trang 30

30

huyền phù vi khuẩn chủng kiểm định, lắc đều và đổ ra đĩa petri Đợi thạch nguội, đặt các miếng màng PLA – nisin lên bề mặt thạch, tiếp theo giữ ở nhiệt độ 4 o

C trong khoảng 4 giờ, sau đó ủ ở 37 oC qua đêm Quan sát và đo đường kính vòng vô khuẩn được hình thành

 Phương pháp xác định số lượng chủng kiểm định bị tiêu diệt trong môi trường dịch thể: Cắt màng PLA - nisin ra làm các miếng khác nhau, mỗi miếng màng có diện tích bằng 2 cm2 Các miếng màng được cho vào các ống nghiệm có chứa 2 ml môi trường MRS dịch thể Bổ sung 0.5 % dịch huyền phù chủng vi khuẩn kiểm định vào các ống, mẫu đối chứng cũng bổ sung 0,5 % chủng kiểm định nhưng không cho màng PLA – nisin Các mẫu nuôi ở 37 o

C, lấy mẫu trải đĩa kiểm tra số lượng tế bào vi khuẩn theo các mốc thời gian: 0; 4; 8; 12; 16; 20; 24; 36; 48 giờ

Ảnh hưởng của tỷ lệ methylene chloride lên hoạt tính nisin của màng PLA - nisin:

Tỷ lệ methylene chloride được sử dụng trong nghiên cứu này là 10, 15, 20, 25 và 30

ml Sau khi màng PLA - nisin được tạo ra theo các tỉ lệ dung môi methylene chloride ở trên, xác định hoạt tính kháng khuẩn của màng

Ảnh hưởng của tỷ lệ PLA: Màng PLA - nisin được tạo ra như mô tả ở mục 2.2.2

Nhưng PLA được bổ sung với các lượng khác nhau: 0,5 g; 0,75 g; 0,9 g và 1 g Sau khi màng PLA - nisin được tạo ra với các tỉ lệ PLA ở trên, xác định hoạt tính kháng khuẩn của màng

Ảnh hưởng của nhiệt độ trong quá trình tạo màng: Màng PLA - nisin được tạo ra

như mô tả ở mục 2.2.2, nhưng được đặt tại các nhiệt độ khác nhau: 37, 60, 70 và 80

°C Sau 15 phút, lấy hỗn hợp dung dịch trên đổ ra đĩa petri để tạo màng Xác định hoạt tính kháng khuẩn của màng

2.2.5 Xác định khả năng phân hủy của màng PLA - nisin

Màng được chôn lấp một cách tự nhiên trong đất vườn, sau 1 tháng tiến hành lấy mẫu cân trọng lượng và quan sát dưới hiển vi điện tử quét Thí nghiệm được tiến hành kéo dài đến 6 tháng

2.2.6 Phương pháp thí nghiệm bảo quản thực phẩm

2.2.6 1 Phương pháp bảo quản nem chua

Trang 31

31

Mẫu nem chua thí nghiệm là nem đã chín được mua tại làng Vẽ, Đông Ngạc,

Từ Liêm, Hà Nội Các mẫu thí nghiệm được thay lớp nilon bằng màng PLA – nisin sau đó lại bọc lá như ban đầu, mẫu đối chứng để nguyên, các mẫu được để ở nhiệt độ thường (30 oC) Đánh giá cảm quan mẫu thí nghiệm và mẫu đối chứng theo ngày

2.2.6 2 Phương pháp bảo quản bánh cốm

 Kiểm tra thành phần và số lượng vi sinh vật có trong bánh cốm bằng phương pháp pha loãng tới hạn [4]:

Lấy 10 gam mẫu bánh cốm cho vào 90 ml nước muối sinh lý 0,85 % nghiền mịn (thìa dung để nghiền được khử vô trùng) Dịch thu được đã có độ pha loãng là 10 -1

Hút 1ml dịch này chuyển vào 1 ống nghiệm sạch đã chứa 9 ml nước muối sinh lý khử trùng, được độ pha loãng 10 -2 Tiếp tục pha loãng cho tới khi đạt độ pha loãng 10 -8hoặc cao hơn Dịch đã pha loãng ở mỗi nồng độ được cấy vô trùng và trải đều trên đĩa Petri đã có sẵn môi trường phân lập thích hợp Các đĩa đã cấy được nuôi trong tủ ấm 37 o

C và theo dõi trong khoảng 1- 2 tuần Đếm số lượng khuẩn lạc và nhận dạng các vi sinh vật

 Phương pháp bảo quản bánh cốm

Mẫu bánh cốm thí nghiệm sử dụng màng PLA – nisin để bọc thay cho nilon, mẫu đối chứng để nguyên, các mẫu được bảo quản ở nhiệt độ phòng (30 oC) Đánh giá cảm quan mẫu theo ngày

Trang 32

32

PHẦN III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 LỰA CHỌN CÁC CHẤT THÀNH PHẦN TẠO MÀNG

Axit polylactic là một trong số các polymer phân hủy sinh học, một loại axit được sản xuất từ quá trình lên men vi sinh vật, axit này tan trong một số dung môi như chloroform, methylene chloride (hay còn gọi là dichloromethane) Với mục đích tạo màng để ứng dụng trong bảo quản thực phẩm thì màng tạo ra cần phải dai, mịn, cảm quan phải đẹp mắt, chính vì thế cần lựa chọn được thành phần như thế nào để tạo màng theo yêu cầu Kết quả trình bày dưới bảng 3.1 và hình 3.1

Bảng 3.1 So sánh màng PLA tạo từ chloroform và methylene chloride

Cảm quan màng Màng cứng, đục, giòn Màng dẻo, trong, dai

Hình 3.1 Ảnh màng PLA tạo từ chloroform và methylene chloride

a/ màng tạo từ methylene chloride; b/ màng tạo từ chloroform

Kết quả bảng 3.1 và hình 3.1 cho thấy sử dụng dung môi methylene chloride đạt kết quả tốt hơn, màng dẻo và trong, nisin trải đều khắp bề mặt màng, hoạt tính kháng khuẩn của màng tốt, vòng ức chế đạt 9 mm Khi sử dụng chloroform thì nisin bị vón cục khó giải phóng ra thực phẩm khi bao gói bảo quản, màng đục, cứng và giòn, hoạt tính kháng khuẩn thấp, vòng ức chế là 5 mm Quan trọng hơn, methylene chloride được cơ quan quản lý thuốc và thực phẩm (FDA) của Mỹ cho phép sử dụng làm chất

Tiêu đề	Đánh Giá Tác Dụng Kháng Khuẩn Của Màng Axit Polylactic – Nisin Và Khả Năng Ứng Dụng Trong Bảo Quản Thực Phẩm
Tác giả	Phạm Thị Thu Phương
Người hướng dẫn	PGS. TS. Lê Thanh Bình
Trường học	Đại Học Thái Nguyên
Chuyên ngành	Vi Sinh Vật Học
Thể loại	Luận văn thạc sĩ
Năm xuất bản	2014
Thành phố	Hà Nội

Định dạng
Số trang	64
Dung lượng	865,88 KB

Đánh giá tác dụng kháng khuẩn của màng axit polylactic nisin và khả năng ứng dụng trong bảo quản thực phẩm​

Đánh giá tác dụng kháng khuẩn của màng axit polylactic nisin và khả năng ứng dụng trong bảo quản thực phẩm