Nghiên cứu nuôi cấy callus cà gai leo solanum hainanense hance và ảnh hưởng của chất kích ứng đến sự tích lũy hợp chất thứ cấp trong callus luận văn thạc sĩ nông nghiệp

TRÍCH YẾU LUẬN VĂNTên tác giả: Đoàn Ngọc Hân Tên luận văn: "Nghiên cứu nuôi cấy callus cà gai leoSolanum hainanense Hance và ảnh hưởng của chất kích ứng đến sự tích lũy hợp chất thứ cấp

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Nguyễn Thị Lý Anh

NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2018

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan: Số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác, các thông tin trích dẫn trong luận văn đều được ghi rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày 01 tháng 10 năm 2017

Tác giả luận văn

Đoàn Ngọc Hân

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn này, ngoài sự cố gắng nỗ lực của bản thân, tôi đã nhận được rất nhiều quan tâm giúp đỡ nhiệt tình của các thầy cô, cán bộ kĩ thuật, bạn bè và người thân

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy, cô, cán bộ nhân viên Phòng Công nghệ Sinh học Thực vật – Viện Sinh học Nông Nghiệp – Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tạo điều kiện tốt nhất cho tôi hoàn thành luận văn này

Tôi xin cảm ơn ThS Nguyễn Thị Thanh Phương - cán bộ của Viện Sinh học Nông nghiệp, người đã luôn sát cánh bên tôi, nhiệt tình giúp đỡ, chỉ bảo tôi trong suốt thời gian thực tập trên Viện

Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS TS Nguyễn Thị Lý Anh – Viện trưởng Viện Sinh học Nông nghiệp tận tình hướng dẫn giúp đỡ, động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình, người thân, bạn bè, những người luôn bên cạnh động viên giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và thực hiện

đề tài

Xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 01 tháng 10 năm 2017

Tác giả luận văn

Đoàn Ngọc Hân

MỤC LỤC

Lời cam đoan ii

Lời cảm ơn iii

Mục lục iv

Danh mục chữ viết tắt vii

Danh mục bảng viii

Danh mục hình x

Trích yếu luận văn xii

Phần 1 Mở đầu 1

1.1 Tính cấp thiết của đề tài 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 2

1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 2

Phần 2 Tổng quan tài liệu 3

2.1 Sản xuất các hợp chất thứ cấp từ nuôi cấy mô tế bào thực vật 3

2.1.1 Vai trò của hợp chất thứ cấp ở thực vật 3

2.1.2 Tầm quan trọng của nuôi cấy tế bào thực vật đối với sản xuất các hợp chất thứ cấp 3

2.1.3 Phương pháp nuôi cấy mô tế bào để sản xuất các hợp chất thứ cấp 4

2.1.4 Các nghiên cứu sản xuất hợp chất thứ cấp bằng nuôi cấy mô tế bào thực vật 6

2.2 Ứng dụng chất kích ứng để cải thiện tích lũy hợp chất thứ cấp trong nuôi cấy tế bào thực vật 8

2.2.1 Giới thiệu về chất kích ứng 8

2.2.2 Cơ chế tác động 8

2.2.3 Một số nghiên cứu ứng dụng chất kích ứng trong nuôi cấy tế bào thực vật 10

2.3 Cây cà gai leo 11

2.3.1 Giới thiệu chung về cây cà gai leo 11

2.3.2 Một số nghiên cứu khác trên cà gai leo 13

2.4 Đánh giá sự tích lũy hợp chất thứ cấp qua thử nghiệm hoạt tính sinh học của chiết xuất dược liệu 14

2.4.1 Xác định hoạt tính chống oxy hóa in vitro thông qua quá trình peroxy hóa

lipit tế bào gan chuột 14

2.4.2 Đánh giá tác dụng bảo vệ gan của chiết xuất dược liệu trên chuột bị nhiễm độc CCl4 in vivo 15

2.4.3 Một số nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan của các chiết xuất cây dược liệu 15

Phần 3 Đối tượng, nội dung và phương pháp nghiên cứu 17

3.1 Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu 17

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 17

3.1.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 17

3.2 Nội dung nghiên cứu 17

3.2.1 Xác định môi trường thích hợp nhất cảm ứng tạo callus cà gai leo 17

3.2.2 Nhân sinh khối callus 18

3.2.3 Đánh giá sự tích lũy các hoạt chất thứ cấp thông qua thử nghiệm hoạt tính sinh học dịch chiết callus, dịch chiết cây cà gai leo tự nhiên 20

3.3 Phương pháp nghiên cứu 22

3.3.1 Phương pháp nuôi cấy in vitro 22

3.3.2 Nuôi cấy cây in vitro 22

3.3.3 Nuôi cấy callus, nhân sinh khối callus 23

3.3.4 Đánh giá hoạt tính sinh học dịch chiết callus 23

3.3.5 Xử lý số liệu 24

Phần 4 Kết quả và thảo luận 25

4.1 Kết quả 25

4.1.1 Xác định môi trường thích hợp nhất cảm ứng tạo callus cà gai leo 25

4.1.2 Nhân sinh khối callus 33

4.1.3 Đánh giá sự tích lũy các hợp chất thứ cấp qua thử nghiệm hoạt tính sinh học dịch chiết callus, dịch chiết cà gai leo tự nhiên 45

4.2 Thảo luận 49

4.2.1 Cảm ứng tạo callus 49

4.2.2 Nhân sinh khối callus 50

4.2.3 Đánh giá sự tích lũy các hợp chất thứ cấp qua thử nghiệm hoạt tính sinh học dịch chiết callus 52

Phần 5 Kết luận và đề nghị 54

5.1 Kết luận 54

5.2 Đề nghị 54

Tài liệu tham khảo 55

Phụ lục 59

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

BA

CT

DAM

Benzyl adenine Công thức Dialdehyt malonyl

HCTC

HTCO

Hợp chất thứ cấp Hoạt tính chống oxy hóa

DANH MỤC BẢNG

Bảng 4.1 Ảnh hưởng của tổ hợp BA và α-NAA đến khả năng tạo callus từ đoạn

thân cà gai leo 25 Bảng 4.2 Ảnh hưởng của tổ hợp BA và α-NAA đến khả năng tạo callus từ

mảnh lá cà gai leo 26 Bảng 4.3 Ảnh hưởng của tổ hợp BA và 2,4-D đến khả năng tạo callus từ đoạn

thân cà gai leo 28 Bảng 4.4 Ảnh hưởng của tổ hợp BA và 2,4-D đến khả năng tạo callus từ mảnh

lá cà gai leo 29 Bảng 4.5 Ảnh hưởng của tổ hợp BA và 2,4-D đến khả năng tạo callus từ đoạn

thân cà gai leo 30 Bảng 4.6 Ảnh hưởng của tổ hợp BA và 2,4-D đến khả năng tạo callus từ mảnh

lá cà gai leo 31 Bảng 4.7 Ảnh hưởng của môi trường đến nhân sinh khối callus từ đoạn thân cà

gai leo 33 Bảng 4.8 Ảnh hưởng của môi trường đến nhân sinh khối callus từ mảnh lá cà

gai leo 34 Bảng 4.9 Ảnh hưởng của thời gian chiếu sáng đến nhân sinh khối callus từ đoạn

thân cà gai leo 35 Bảng 4.10 Ảnh hưởng của thời gian chiếu sáng đến nhân sinh khối callus từ

mảnh lá cà gai leo 36 Bảng 4.11 Ảnh hưởng của chiếu sáng đèn LED đến khả năng nhân sinh khối

callus từ đoạn thân 37 Bảng 4.12 Ảnh hưởng của chiếu sáng đèn LED đến khả năng nhân sinh khối

callus từ mảnh lá 38 Bảng 4.13 Ảnh hưởng của acid salisylic đến khả năng nhân sinh khối 40 Bảng 4.14 Ảnh hưởng của acid salisylic đến khả năng nhân sinh khối callus trên

Bảng 4.16 Ảnh hưởng của chất chiết nấm men đến khả năng nhân sinh khối

Bảng 4.17 Tổng hợp kết quả các yếu tố ảnh hưởng đến nhân sinh khối callus 45 Bảng 4.18 Hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết cà gai leo 46 Bảng 4.19 Hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết callus nhân sinh khối trên môi

Bảng 4.20 Hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết callus nhân sinh khối trên môi

Bảng 4.21 Hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết callus nhân sinh khối trên môi

Bảng 4.22 So sánh hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết callus, dịch chiết cà

gai leo tự nhiên 49

DANH MỤC HÌNH

đoạn thân cà gai leo 26

mảnh lá cà gai leo 27

thân cà gai leo 28

lá cà gai leo 29

thân cà gai leo 31

mảnh lá cà gai leo 32

từ đoạn thân cà gai leo 33

từ mảnh lá cà gai leo 34

nguồn gốc đoạn thân cà gai leo 35 Hình 4.10 Ảnh hưởng của thời gian chiếu sáng đến nhân sinh khối callus có

nguồn gốc mảnh lá cà gai leo 36 Hình 4.11 Ảnh hưởng của chiếu sáng đèn LED đến khả năng nhân sinh khối

callus từ đoạn thân 38 Hình 4.12 Ảnh hưởng của chiếu sáng đèn LED đến khả năng nhân sinh khối

callus có nguồn gốc mảnh lá 39 Hình 4.13 Ảnh hưởng của acid salisylic đến khả năng nhân sinh khối callus

Hình 4.14 Ảnh hưởng của acid salisylic đến khả năng nhân sinh khối callus

Hình 4.15 Ảnh hưởng của nấm men đến khả năng nhân sinh khối callus trên

Hình 4.16 Ảnh hưởng của nấm men đến khả năng nhân sinh khối callus trên

TRÍCH YẾU LUẬN VĂNTên tác giả: Đoàn Ngọc Hân

Tên luận văn: "Nghiên cứu nuôi cấy callus cà gai leo(Solanum hainanense Hance) và ảnh hưởng của chất kích ứng đến sự tích lũy hợp chất thứ cấp trong callus"

Phương pháp nghiên cứu

Các thí nghiệm cảm ứng tạo callus cà gai leo được thực hiện trên đối tượng là đoạn thân và mảnh lá cà gai leo in vitro Môi trường nuôi cấy sử dụng là môi trường MS (Murashige and Skoog, 1962) có bổ sung thêm các chất điều tiết sinh trưởng Các tổ hợp

BA + α-NAA và BA + 2,4-D được sử dụng để đánh giá khả năng cảm ứng tạo callus Callus có nguồn gốc đoạn thân và mảnh lá sau 4 tuần tuổi được sử dụng cho các thí nghiệm nhân sinh khối callus, các nhân tố: môi trường nuôi cấy, chế độ chiếu sáng, các elicitor được đánh giá ảnh hưởng đến khả năng nhân sinh khối callus Callus được nhân sinh khối trên các môi trường cho khả năng nhân callus tốt nhất sau 3 tuần tuổi được sấy

tính chống oxy hóa cùng với dịch chiết của cây cà gai leo trồng tự nhiên thông qua quá trình peoxy hóa lipit tế bào gan chuột theo phương pháp của Blagodorov (1987)

Kết quả chính và kết luận

BA + 1 mg/l 2,4-D) là thích hợp để cảm ứng tạo callus

3 Chế độ chiếu sáng 16 giờ sáng/8 giờ tối thích hợp để nhân nhanh callus hơn chế độ không chiếu sáng Dưới điều kiện chiếu sáng đèn LED, tỉ lệ B/R: 30/70 thích hợp

sung 3 g/l nấm men kích thích sự tăng trưởng khối lượng khô TB callus từ 1,81đến 3,35

lần so với đối chứng không bổ sung elicitor

5 Nồng độ 20 mg/100 ml dịch chiết callus có hiệu quả chống oxy hóa cao nhất

so với các nồng độ thử nghiệm khác Ở nồng độ này HTCO của dịch chiết callus cao gấp 1,83 lần so với dịch chiết của cây trồng tự nhiên

6.Bổ sung elicitor vào môi trường nuôi cấy làm tăng hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết callus từ 1,26-1,49 lần so với đối chứng không bổ sung elicitor; tăng từ 2,31-2,73 lần so với dịch chiết cây tự nhiên

THESIS ABSTRACT Master candidate: Doan Ngoc Han

Thesis title: “Study on callus culture on Solanum hainanense Hance and effect of some elicitors on generating secondary compounds in callus”

Educational organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA) Research Objectives

To find a suitable culture medium, to multiply callus of Solanum hainanense Hance and to analysis the generation of sencondary compounds by testing biological activation of extracted callus from Solanum hainanense Hance

Materials and Methods

Callus induction experiments are carried out on in vitro cells extracted from leaf part and body part of Solanum hainanense Hance The culture medium used in the research is MS medium (Murashige and Skoog, 1962) which is provided growth accomodating elements The BA + α-NAA and BA + 2,4-D combinations are used to analysis the callus induction 4-week old callus cells from body and leaf part are used for experiments Culture medium, light regimen and elicitors affect the ability to multiply living mass of callus The best results are obtained after 3 weeks, which after that is dried to fixed weight then extract with 70% alcohol liquid They later are analysised the antioxidant quality, which is compared to normal Solanum hainanense Hance extracts by the Blagodorov method (1987)

Main findings and conclusions

mg/l BA + 1 mg/l 2,4-D) are suitable for the callus induction process

2 When being lightened by fluorescent light, the A2 medium is more predominant

in multiplying living mass of leaf tissues and body tissues than the A1 medium

3 In the 16-hour bright, 8-hour dark light regimen, the callus stem happens faster than in normal condition When being lightened by LED light, the 30/70 B/R ratio

is the best rate for multiplying callus from leaf part while 40/60 ratio is more suitable for multiplying callus from body part

1,81 to 3,35 times in comparision to not providing elicitors

5 20mg/100ml is the best callus extract concentration to be antioxidant At this concentration, the HTCO of callus extracts is 1,83 time higher than natural ones

6 Providing elicitors into culture medium help increase the antioxidant quality

of callus extracts from 1,26 to 1,49 time compared to not providing elicitors and from 2.31 to 2.73 time compared to natural ones

PHẦN 1 MỞ ĐẦU

1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Cà gai leo còn có tên khác là cà gai dây, cà vạnh, cà quýnh, cà lù, gai cườm, tên khoa học là Solanum hainanense Hance Cà gai leo phân bố ở các tỉnh miền Bắc cho đến Huế tại Việt Nam và một số nước như Lào, Campuchia, Trung Quốc (Viện Dược liệu, 1993) Cà gai leo được đánh giá cao về tác dụng giải độc gan Theo kinh nghiệm từ dân gian, cây cà gai leo có tác dụng hiệu quả đối với người bệnh mắc các bệnh lý về gan như: vàng da, vàng mắt, mụn nhọt, mẩn ngứa Trong cây cà gai leo có chứa các chất alkaloid, glycoalkaloid có tác dụng ức chế sự sao chép và làm âm tính virus viêm gan B, chống oxy hóa, ngăn ngừa xơ gan hiệu quả (Nguyễn Bích Thu và cs., 2000) Cà gai leo là cây thuốc quý có tiềm năng lớn cho việc sản xuất dược phẩm chữa bệnh

Tuy nhiên, hiện nay cà gai leo chủ yếu được khai thác từ nguồn tự nhiên

nhưng hệ số nhân giống không cao do cây ít quả, quả nhỏ và ít hạt Hơn nữa, cây nhân giống bằng hạt có chất lượng không đồng đều, gây khó khăn cho việc tiêu chuẩn hóa nguyên liệu

Nuôi cấy mô và tế bào thực vật với những ưu điểm vượt trội và ứng dụng

để tăng thu sinh khối trong thời gian ngắn, hàm lượng hợp chất thứ cấp (HCTC) cao, chủ động dễ điều khiển quy trình sản xuất trên quy mô công nghiệp, tạo nguồn vật liệu ổn định và tập trung, góp phần giải quyết những khó khăn nói trên (Misawa, 1994)

Chất kích ứng là một chất mà khi đưa với nồng độ nhỏ vào hệ thống tế bào sống thì khởi động hoặc cải thiện sự sinh tổng hợp các HCTC trong tế bào đó (Namdeo, 2007) Chất kích ứng thực vật báo hiệu việc hình thành các HCTC, bổ sung chất kích ứng vào môi trường nuôi cấy là phương thức để thu được các sản phẩm HCTC có hoạt tính sinh học một cách hiệu quả nhất Sử dụng các chất kích ứng sinh học và phi sinh học để kích thích hình thành các HCTC trong nuôi cấy

tế bào vừa có thể rút ngắn thời gian lại đạt năng suất cao (Discosmo et al., 1995)

Hiện nay đã có một số nghiên cứu về sự tích lũy hợp chất thứ cấp trong callus cà gai leo Các nghiên cứu đều thu được kết quả là hàm lượng glycoalkaloid toàn phần trong callus và tế bào đều cao hơn so với cây tự nhiên,

tuy nhiên hiệu suất vẫn chưa cao Sử dụng các chất kích ứng thực vật có thể cải thiện được vấn đề này Ngoài ra chưa có nhiều nghiên cứu đánh giá hoạt tính sinh học của các hợp chất thứ cấp tích lũy trong callus cà gai leo

Xuất phát từ đó, chúng tôi tiến hành đề tài: Nghiên cứu nuôi cấy callus

cà gai leo(Solanum hainanense Hance) và ảnh hưởng của chất kích ứng đến

sự tích lũy hợp chất thứ cấp trong callus

1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

Tìm được môi trường nuôi cấy thích hợp và nhân nhanh sinh khối callus

Các kết quả đạt được sẽ bổ sung thêm nguồn tài liệu khoa học phục vụ công tác nghiên cứu, giảng dạy về sản xuất hợp chất thứ cấp bằng nuôi cấy tế bào thực vật, một lĩnh vực còn chưa được phổ biến ở nước ta

1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn

Đưa ra được giải pháp tạo nguồn dược liệu chủ động, dồi dào, có chất lượng đồng đều, góp phần khắc phục những hạn chế về nguồn dược liệu cà gai leo khai thác trong tự nhiên

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 SẢN XUẤT CÁC HỢP CHẤT THỨ CẤP TỪ NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT

2.1.1 Vai trò của hợp chất thứ cấp ở thực vật

Ở thực vật, quá trình trao đổi chất tạo ra nhiều loại hợp chất hữu cơ hoặc các chất chuyển hóa, được xếp thành nhóm các chất trao đổi sơ cấp và thứ cấp Các hợp chất sơ cấp được tìm thấy trong hầu hết các loài trong khi đó các hợp chất thứ cấp tìm thấy chỉ trong một số loài thực vật (Taiz and Zeiger, 2006) Những bằng chứng từ thực nghiệm và thực tế cho thấy, các hợp chất thứ cấp ở thực vật có các chức năng cơ bản sau: bảo vệ cơ thể chống lại các loài động vật

ăn cỏ; kháng nấm, vi khuẩn, virus; chống lại sự cạnh tranh về ánh sáng, nước và chất dinh dưỡng; thu hút các loài động vật trong quá trình thụ phấn và phát tán hạt; tạo ra các tín hiệu trong giao tiếp giữa thực vật với các loài vi sinh vật cộng sinh; chống lại tia tử ngoại và các tác nhân vật lý bất lợi khác (Wink, 1999) Thực vật sản xuất hơn 80.000 hợp chất khác nhau thông qua con đường trao đổi thứ cấp Các sản phẩm thứ cấp được dự trữ chủ yếu trong các cấu trúc đặc biệt hoặc các cơ quan dự trữ như rễ, các tế bào dự trữ, không bào, hệ thống màng…(Arnason et al., 1995) Ngày nay các hợp chất thứ cấp ở thực vật được dùng trong dược phẩm, hóa chất nông nghiệp, thuốc nhuộm, gia vị, chất tạo mùi, thuốc trừ sâu; chúng đã đóng góp giá trị lớn trong sản xuất công nghiệp (Gautam

Ưu điểm của sản xuất HCTC bằng nuôi cây mô, tế bào in vitro là có thể cung cấp sản phẩm một cách liên tục và đáng tin cậy dựa trên cơ sở:

- Tổng hợp các HCTC có giá trị được thực hiện dưới sự điểu khiển các yếu tố môi trường nuôi cấy, độc lập với khí hậu và thổ nhưỡng

- Loại bỏ các ảnh hưởng sinh học đến sản xuất HCTC trong tự nhiên

- Chọn được cây trồng cho nhiều loại HCTC với sản lượng cao hơn

- Với việc tự động hóa, điều khiển sinh trưởng và điều hòa quá trình chuyển hóa của tế bào, chi phí có thể giảm và lượng sản phẩm tăng lên

- Kiểm soát chất lượng và hiệu suất của sản phẩm

- Một số sản phẩm trao đổi chất từ dịch nuôi cấy huyền phù có chất lượng cao hơn chiết rút từ cây tự nhiên (Mulabagal and Tsay, 2004)

2.1.3 Phương pháp nuôi cấy mô tế bào để sản xuất các hợp chất thứ cấp 2.1.3.1 Nuôi cấy callus

Nuôi cấy tế bào thực vật được khởi đầu bằng việc hình thành các tế bào không phân hóa, được gọi là callus Các mẫu mô được tách từ thực vật trên môi trường dinh dưỡng cơ bản có chất làm rắn là agar hình thành nên callus Môi trường dinh dưỡng cơ bản này chứa các chất dinh dưỡng khoáng đa lượng, vi lượng, nguồn carbon và nhiều loại chất điều hòa sinh trưởng thực vật Ảnh hưởng của thành phần môi trường dinh dưỡng hoặc chất điều hòa sinh trưởng là các chỉ tiêu quan trọng để xác định môi trường tối ưu cho nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng của callus Các thông số phổ biến nhất dùng trong đánh giá sinh trưởng trong nuôi cấy callus bao gồm khối lượng tươi, khối lượng khô và chỉ số sinh trưởng (Loyola-Vargas and Vázquez-Flota, 2006) Do trong nuôi cấy callus, các tế bào của callus có thể trải qua biến dị dòng soma trong quá trình cấy chuyển nên các dòng tế bào ổn định di truyền được lựa chọn để tránh

sự sản xuất thất thường các chất trao đổi thứ cấp Thông thường, trên cùng một loại môi trường nuôi cấy, sau một số lần cấy chuyển, callus có thể được xem là dòng tế bào đồng nhất khi các thông số sinh trưởng của dòng tế bào được lặp lại trong quá trình cấy chuyển (Davey and Anthony, 2010) Bouque et al (1998)

đã nghiên cứu nuôi cấy 217 dòng callus khác nhau từ các loài của chi Psoralea nhận thấy, sau 16 lần cấy chuyển (48 tuần), có khoảng 90% số dòng callus sinh trưởng ổn định

2.1.3.2 Nuôi cấy huyền phù tế bào

Để nuôi cấy huyền phù tế bào, các khối callus được chuyển vào nuôi cấy trong môi trường lỏng được khuấy bởi máy lắc, quay hoặc màng lọc xoay Mô callus nuôi cấy nên là loại mô dễ vỡ vụn để có thể phân tán cao nhất thành dịch huyền phù tế bào So với nuôi cấy callus, nuôi cấy huyền phù sản xuất ra lượng lớn sinh khối tế bào, có thể dễ dàng chiết tách các chất chuyển hóa thứ cấp (Davey and Anthony, 2010) Trong quá trình nuôi cấy, nhờ những chuyển động xoáy của môi trường, các tế bào sẽ dần dần tách ra khỏi callus Sau một thời gian ngắn nuôi cấy, trong dịch huyền phù là hỗn hợp các tế bào đơn, các khối tế bào với kích thước khác nhau và các tế bào chết Dịch huyền phù tốt là dịch huyền phù chứa tỷ lệ cao các tế bào đơn và tỷ lệ nhỏ các cụm tế bào Có thể cải thiện khả năng tách rời của các tế bào trong môi trường bằng cách thay đổi thành phần môi trường nuôi cấy (Misawa, 1994) Sự kết khối của tế bào có thể được loại bỏ bởi sự thay đổi điều kiện môi trường nuôi cấy, nhưng thường trong cuối pha lag của quá trình nuôi cấy, các tế bào trở nên kết dính với nhau Để thu được dịch huyền phù gồm phần lớn các tế bào đơn, người ta thường sử dụng các enzyme phá hủy thành tế bào hoặc dùng các sàng (rây) Tuy nhiên, các dịch huyền phù đồng nhất đã được thiết lập thường chúng có xu hướng quay trở lại tình trạng kết khối ban đầu (Misawa, 1994)

Nuôi cấy huyền phù tế bào là tiến hành nuôi tế bào trong môi trường lỏng có dung tích nhất định để thiết lập hệ huyền phù tế bào Nhìn chung, có ba phương thức nuôi cấy huyền phù tế bào là nuôi cấy mẻ, nuôi cấy mẻ có bổ sung chất dinh dưỡng và nuôi cấy liên tục Trong quá trình nuôi cấy, bình nuôi cấy không chỉ thường xuyên có sự tăng lên của các sản phẩm trao đổi chất mà còn luôn luôn diễn ra sự trao đổi không khí với bên ngoài Nhìn chung, môi trường thích hợp cho nuôi cấy callus thì cũng thích hợp cho nuôi cấy huyền phù tế bào Tuy nhiên, trong một số trường hợp, nồng độ của các auxin và cytokinin đòi hỏi cao hơn (Davey and Anthony, 2010) Khi các chất dinh dưỡng của môi trường nuôi cấy bị tiêu hao, cùng với sự tạo thêm một số sản phẩm trao đổi chất có hại, thì sự phân chia và sinh trưởng của tế bào sẽ bị ức chế Khi đó, thông qua cấy chuyển hoặc thay đổi môi trường nuôi cấy sẽ kích thích sự sinh trưởng mạnh

mẽ trở lại của huyền phù tế bào (Nguyễn Quang Thạch và cs., 2009)

2.1.4 Các nghiên cứu sản xuất hợp chất thứ cấp bằng nuôi cấy mô tế bào thực vật

2.1.4.1 Các nghiên cứu trong nước

Một số dược liệu ở nước ta như nghệ đen, dừa cạn, đinh lăng, cà gai leo, sâm Ngọc Linh cũng được nghiên cứu tách chiết hợp chất thứ cấp từ tế bào thực vật nuôi cấy in vitro

Cây dừa cạn (Catharanthus roseus) là một trong những loài cây dược liệu chứa nhiều alkaloid Từ dừa cạn người ta chiết được các chất chữa ung thư như vinblastin, vincristin và chữa cao huyết áp như ajmalicin, serpentin Tuy nhiên, hàm lượng của những chất này trong cây tự nhiên rất thấp Bùi Văn Lệ và Nguyễn Ngọc Hồng (2006) đã nghiên cứu khảo sát sơ bộ ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng lên quá trình tạo sinh khối tế bào và tích lũy alkaloid toàn phần có trong dịch nuôi cấy

Cây đinh lăng (Polyscias fruticosa) là một loài thực vật chứa nhiều saponin Phạm Thị Tố Liên và Võ Thị Bạch Mai (2007) đã tạo callus từ các mẫu cây con trên môi trường MS bổ sung 2 mg/L 2,4-D Callus tạo thành sau 14 tuần được chuyển sang nuôi cấy trên môi trường lỏng bổ sung 1,0 mg/L 2,4-D và 20% nước dừa để thu sinh khối và chiết rút saponin

Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis) có tác dụng phòng chống ung thư, bảo vệ tế bào gan, kích thích hệ miễn dịch, chống stress và trầm cảm, chống oxy hóa, lão hóa Thanh et al (2007) đã nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần môi trường lên sản xuất sinh khối và ginsenoside trong nuôi cây huyền phù tế bào cây sâm Ngọc Linh Kết quả cho thấy, môi trường ½MS và MS thích hợp cho cả sản xuất sinh khối cũng như ginsenoside, sinh khối và ginsenoside đạt lần lượt là 9,8 g/L và 6,81 mg/g khối lượng khô Nồng độ sucrose tăng từ 20-50 g/L đã tăng sản xuất sinh khối, tuy nhiên khi sucrose tăng đến 70 g/L thì ức chế cả sinh trưởng và tích lũy ginsenoside của tế bào Nồng độ nitrogen thích hợp cho cả sinh trưởng

và tích lũy ginsenoside là 30 mM

Củ cây nghệ đen (Curcuma zedoaria Roscoe) có chứa các hoạt chất sinh học chủ yếu là curcumin, terpenoid và tinh dầu Các nghiên cứu cho thấy, curcumin có khả năng chống được sự phát sinh khối u; một số dạng ung thư ở chuột như ung thư ruột kết, ung thư dạ dày, ung thư vú và ung thư buồng trứng

Võ Châu Tuấn và cs (2014) đã nghiên cứu thiết lập các điều kiện và môi trường

nuôi cấy thích hợp để sản xuất nhanh sinh khối tế bào, đồng thời xác định được khả năng tích lũy và hoạt tính sinh học một số hợp chất trong tế bào nghệ đen nuôi cấy huyền phù trong hệ lên men 10 L.Kết quả cho thấy môi trường cơ bản

MS có 20 g/L sucrose, 0,8% agar, bổ sung thêm 0,5 mg/L BA và 0,5 mg/L 2,4-D thích hợp cho nuôi cấy callus từ bẹ lá cây nghệ đen in vitro Môi trường cơ bản

MS có 30 g/L sucrose, bổ sung thêm 0,5 mg/L BA và 1,5 mg/L 2,4-D, tốc độ khuấy 150 vòng/phút, tốc độ sục khí 2,5 L/phút thích hợp cho sinh trưởng của tế bào nghệ đen trong hệ lên men 10 L Sinh khối đạt cực đại là 603 g tươi (53,25 g khô) sau 14 ngày nuôi cấy với cỡ mẫu là 200 g Hàm lượng tinh dầu trong tế bào đạt cao nhất là 2,57% khối lượng khô sau 14 ngày nuôi cấy, gấp khoảng 1,6 lần tinh dầu ở củ cây nghệ đen tự nhiên 1 năm tuổi Hàm lượng curcumin trong tế bào đạt cao nhất là 1,16% sau 14 ngày nuôi cấy, gấp khoảng 2,7 lần curcumin ở

củ cây nghệ đen tự nhiên 1 năm tuổi

2.1.4.2 Các nghiên cứu ngoài nước

Rễ của cây nhân sâm (Panax ginseng) là một loại dược phẩm quý giá, có tác dụng chữa bệnh rối loạn tiêu hóa, bệnh đái đường, suy nhược cơ thể Trong

rễ của nó chứa nhiều loại saponin và sapogenin khác nhau Trong đó, ginsenoside-Rb có hoạt tính an thần, còn Rg có hoạt tính kích thích Furuya et al (Đại học Kitasato, Nhật) đã nghiên cứu nuôi cấy mô callus Panax ginseng từ những năm 1970 Kaisha (1990) đã nghiên cứu quy trình sản xuất trên quy mô lớn, sử dụng nhiều kiểu hệ lên men khác nhau Năm 1990, Staba (Đại học Minnesota, Mỹ) cũng đã thu được các tế bào nuôi cấy Panax ginseng chứa ginsenoside Choi (1993) đã nghiên cứu nuôi cấy Panax ginseng trên quy mô công nghiệp, tác giả nhận thấy 2,4-D và KIN ảnh hưởng tới hàm lượng saponin trong callus và các tế bào nuôi cấy huyền phù; 3,62% saponin tổng số được tìm thấy trong callus nuôi cấy trên môi trường cơ bản MS bổ sung 5,00 mg/L 2,4-D

và 1,00 mg/L KIN, nhưng lại thu được 8,78% khi nuôi cấy trên môi trường có 10,00 mg/L 2,4-D và 1,00 mg/L KIN (Misawa, 1994)

Callus Taxus mairei được tạo ra từ mảnh lá và thân trên môi trường B5 bổ sung 2 mg/L 2,4-D hoặc NAA Dòng tế bào được tạo ra từ callus có nguồn gốc từ thân và lá Một trong những dòng tế bào này sau khi bổ sung các tiền chất và nuôi trong 6 tuần thì cứ một lít dịch huyền phù tế bào sẽ sản xuất khoảng 200 mg taxol (Mulabagal and Tsay, 2004)

Với việc sử dụng chất kích kháng polysaccharide của nấm men, Sarin (2005) đã thành công trong việc sản xuất với mức tương đối cao của berberine trong nuôi cấy tế bào cây Thalictrum rugosum Ảnh hưởng của permidine lên sản

bởi Hara et al (1993)

2.2 ỨNG DỤNG CHẤT KÍCH ỨNG ĐỂ CẢI THIỆN TÍCH LŨY HỢP CHẤT THỨ CẤP TRONG NUÔI CẤY TẾ BÀO THỰC VẬT

2.2.1 Giới thiệu về chất kích ứng

Chất kích ứng (elicitor) được định nghĩa là một chất mà khi đưa với nồng

độ nhỏ vào hệ thống tế bào sống thì khởi động hoặc cải thiện sự sinh tổng hợp các HCTC trong tế bào Sự kích kháng thực vật là quá trình cảm ứng hoặc tăng cường sinh tổng hợp các chất chuyển hóa thứ cấp do sự bổ sung theo hàm lượng của elicitor (Namdeo, 2007) Trên cơ sở bản chất tự nhiên, elicitor có thể được phân thành 2 nhóm là: elicitor phi sinh học và elicitor sinh học

- Elicitor phi sinh học là các chất có nguồn gốc không thuộc sinh vật học, gồm các muối vô cơ, các kim loại nặng và các tác nhân vật lý như sóng siêu âm,

Ngoài ra, có thể phân loại elicitor dựa trên nguồn gốc của chúng Có 2 loại elicitor là elicitor ngoại sinh và elicitor nội sinh

- Elicitor ngoại sinh là các chất có nguồn gốc bên ngoài tế bào như các polysaccharide, polyamine và các acid béo

- Elicitor nội sinh là các chất có nguồn gốc bên trong tế bào, được hình thành thông qua các phản ứng thứ cấp, được cảm ứng bằng tín hiệu sinh học hay phi sinh học, chẳng hạn như galacturonide hoặc hepta-β-glucoside v.v (Namdeo, 2007)

2.2.2 Cơ chế tác động

Elicitor thực vật là các hóa chất có nguồn gốc khác nhau, có khả năng gây

nên các đáp ứng về mặt hình thái, sinh lý và tích lũy phytoalexin (chất được sinh

ra ở thực vật khi chịu tác động của các tác nhân gây bệnh) Việc thực vật bị xử lý bằng chất kích ứng hoặc bị tấn công bằng mầm bệnh gây ra một loạt các phản ứng phòng vệ, bao gồm sự tích lũy các HCTC bảo vệ ở cả trong cây tự nhiên cũng như trong nuôi cấy in vitro Mặc dù đã có những nghiên cứu sâu về cơ chế ảnh hưởng của elicitor lên sự sản xuất HCTC trong các thực vật, tuy nhiên cơ chế tác động của elicitor vẫn chưa được hiểu đầy đủ Có nhiều giả thuyết đã được đưa ra như cơ chế truyền tin bởi Ca2+, các yếu tố ảnh hưởng đến sự nguyên vẹn của màng tế bào, các con đường ức chế hay hoạt hóa nội bào hoặc sự thay đổi áp suất thẩm thấu (Namdeo, 2007)

Những nghiên cứu bước đầu về sự tác động của các elicitor sinh học ở hệ thống thực vật được nghiên cứu dựa vào cơ chế cảm ứng trên tế bào động vật Ở

tế bào động vật, các thụ quan (receptor) định vị ở màng tế bào sẽ hoạt hóa kênh ion và protein kinase Tương tự như thế, các bằng chứng chứng minh sự hiện diện của các thụ quan ở màng tế bào thực vật đã được ghi nhận Cơ chế cảm ứng này dựa trên sự tương tác giữa elicitor-thụ quan Khi tế bào thực vật được xử lý với elicitor thì một loạt các phản ứng sinh hóa xảy ra, bao gồm:

- Elicitor gắn vào thụ quan ở màng tế bào

- Thay đổi dòng ion vào thông qua màng tế bào thực vật như kênh Cl- , K+ , …, ở thực vật, Ca2+ hoạt động như chất truyền tin thứ hai với các đáp ứng khác nhau từ tín hiệu của môi trường kể cả mầm bệnh Ví dụ, ở tế bào cây ngò tây, người ta từng phát hiện ra kênh canxi đáp ứng cảm ứng và một kênh vận chuyển vào của calci được tìm thấy trong vòng vài phút sau khi thêm vào elicitor từ nấm

- Gia tăng hoạt tính của phospholipase thực vật được tìm thấy ở một vài

mô thực vật và nuôi cấy tế bào thực vật sau khi xử lý với elicitor, tổng hợp các tín hiệu thứ cấp như InsP3 và deacylglycerol (DAG), giải phóng tín hiệu nội bào trung gian Ca2+, nitric oxyde và con đường tín hiệu octadecanoid

- Sự thay đổi nhanh trong việc phosphoryl hóa protein được quan sát dựa trên việc bổ sung elicitor của các nuôi cấy tế bào khác nhau Những nghiên cứu gần đây chứng minh rằng sự phosphoryl hóa đóng một vai trò quan trọng trong sự chuyển tín hiệu thực vật chống lại mầm bệnh và stress, hoạt hóa protein kinase

- Hoạt hóa protein G (là một phần trong việc đáp ng tín hiệu với elicitor)

- Hoạt hóa NADPH oxydase đáp ứng AOS (active oxide specie), acid hóa cytosol

- Tái sắp xếp lại bộ xương tế bào

- Tạo các oxy hoạt động

- Tích lũy các protein có liên quan đến mầm bệnh như chitinase và glucanase, endopolygalacturonase… các nhân tố ngăn cản protease

- Sự chết tế bào ở vị trí bị xâm nhiễm

- Sự thay đổi cấu trúc ở màng tế bào (lignin hóa màng tế bào, tích tụ mô sẹo)

- Hoạt hóa phiên mã các gen đáp ứng kháng

- Các phân tử đề kháng của thực vật như tanin, phytoalexin được phát hiện 2- 4 giờ sau khi xử lý với elicitor

- Tổng hợp jasmonic và acid salicylic như một thông tin thứ cấp

- Đáp ứng tập nhiễm SAR (systemic acquired resistance) Không phải tất

cả các elicitor đều diễn ra theo chuỗi sự kiện phía trên, những nghiên cứu về trật

tự thời gian của những sự kiện này và sự kết nối bên trong giữa chúng còn nhiều phức tạp và vẫn đang được nghiên cứu (Angelova et al., 2006)

2.2.3 Một số nghiên cứu ứng dụng chất kích ứng trong nuôi cấy tế bào thực vật

Lê Thị Thủy Tiên và cs (2010) nghiên cứu ảnh hưởng metheyl jasmonate đến tích lũy taxol trong mô sẹo và dịch treo tế bào hình thành từ sự phân chia của các tế bào nhu mô vỏ thân cây thông đỏ Lâm Đồng Taxus wallichiana Zucc Kết quả cho thấy methyl jasmonate hầu như không ảnh hưởng ñến sự tăng trưởng của dịch treo tế bào Tuy nhiên, hàm lượng taxol trong dịch treo tế bào tăng cao khi methyl jasmonate được bổ sung vào môi trường nuôi cấy Hàm lượng taxol cao nhất trong tế bào dịch treo với methyl jasmonate 10 mg/l là 0,74 mg/l

Loc và Giang (2012) nghiên cứu ảnh hưởng của 2-hydroxybenzoic acid và dịch chiết nấm men đến việc tăng khả năng sinh tổng hợp asiaticoside trong nuôi cấy tế bào cây rau má (Centella asiatica) Kết quả nhận thấy khi bổ sung ở ngày thứ 10 của nuôi cấy lần lượt 100 µM 2-hydroxybenzoic acid và 4 g/L dịch chiết nấm men, hàm lượng asiaticoside tích lũy trong tế bào rau má tăng gấp 5 và 3,5 lần

so với đối chứng không cảm ứng

Nuôi cấy tế bào huyền phù cây nghệ đen (Curcuma zedoaria Roscoe) có

bổ sung chất kích kháng là biện pháp có nhiều triển vọng trong việc tăng hiệu quả sản xuất cucumin Trần Vũ Ngọc Thi (2014) nghiên cứu bước đầu cho thấy

tế bào nghệ đen sinh trưởng trong bình nuôi cấy huyền phù 250 mL đạt sinh khối cực đại sau 14 ngày nuôi cấy tăng 2,74 lần so với ban đầu Dịch chiết nấm men nồng độ từ 0,5-4,0 g/L có tác dụng ức chế sự tích lũy sinh khối của tế bào nghệ đen nuôi cấy huyền phù trong bình 250 mL Sinh khối khô thấp nhất tại nồng độ 4,0 g/L chỉ đạt 6,2 g tươi (0,51 g khô), giảm 29,17% so với đối chứng Hàm lượng curcumin tăng dần khi bổ sung từ 0,5-1,0 g/L dịch chiết nấm men vào môi trường nuôi cấy Hàm lượng curcumin tích lũy cao nhất tại nồng độ dịch chiết nấm men là 1,0 g/L, đạt 31,69 µg/g khô, tăng 32,04 % so với đối chứng Ở các nồng độ cao hơn 1,0 g/L, hàm lượng curcumin giảm dần

2.3 CÂY CÀ GAI LEO

2.3.1 Giới thiệu chung về cây cà gai leo

2.3.1.1 Nguồn gốc, phân bố và phân loại

Cây cà gai leo (Solanum hainanense Hance) thuộc họ Cà (Solanaceae), còn có tên khoa học khác là Solanum procumbens Ngoài ra, cà gai leo còn có nhiều tên gọi địa phương khác như: cà quánh, cà quạnh, cà quýnh, cà bò, cà cạnh,

cà hải nam, cà gai dây (Vũ Văn Hợp và Vũ Xuân Phương, 2003)

Cà gai leo mọc rải rác ven rừng, lùm bụi, bãi hoang, ven đường, ở độ cao dưới 300 m Phân bố ở Bắc Giang (Yên Thế), Phú Thọ (Việt Trì), Hà Nội (Bưởi), Hải Phòng, Ninh Bình, Thanh Hóa, Nghệ An, Quảng Trị, Thừa Thiên Huế, Khánh Hoà, Gia Lai (An Khê, Kon Hà Nừng) Ngoài ra, còn có ở Trung Quốc (Hải Nam, Quảng Đông, Quảng Tây) (Vũ Văn Vụ, 2005)

Về phân loại cây CGL (Vũ Văn Vụ, 2005)

Tên khoa học : Solanum hainanense Hance

Solanum procumbens Lour Giới (kingdom): Plantae

Ngành(divison):

Lớp (class):

Magnoliophyta Magnoliopsida

2.3.1.2 Đặc điểm hình thái và thành phần hóa học

Cà gai leo thuộc loại cây leo, thân dài 0,6-1,0 m hay dài hơn, rất nhiều gai dẹp, cành xoè rộng, trên phủ lông hình sao Lá hình trứng hay thuôn, phần gốc lá hình rìu hay hơi tròn, mép nguyên hay lượn và khía thùy, hai mặt nhất là mặt dưới phủ lông trắng nhạt, phiến dài 3-4 cm, rộng 12-20 mm, có gai, cuống dài 4-

5 mm Hoa tím nhạt, nhị vàng họp thành xim gồm 2-4 hoa Quả hình cầu, khi chín có màu vàng bóng, nhẵn, đường kính 5-7 mm Hạt màu vàng, hình thận, có mang dài 4 mm, rộng 2 mm (Vũ Văn Vụ, 2005)

Thành phần hoá học: toàn cây và đặc biệt ở rễ có chứa alkaloid, thành phần chính là solasodine, solasodinine Ngoài ra, còn chứa tinh bột, saponoside, flavonoside và diosgenine (Vũ Văn Hợp và Vũ Xuân Phương, 2003)

2.3.1.3 Tác dụng dược lý

Theo Đông y, cà gai leo có vị hơi the, đắng, tính ấm, hơi có độc có tác dụng tán phong thấp, tiêu độc, trừ ho, giảm đau, cầm máu, trị rắn cắn Bộ phận dùng là rễ, cành lá và cả quả, thu hái quanh năm, rửa sạch, thái nhỏ, phơi hay sấy khô, cũng có khi dùng tươi

Theo sách “ những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam” của cố GS.TS Đỗ Tất Lợi thì cà gai leo có tác dụng chữa say rượu, khi đi uống rượu chỉ cần chà răng hoặc ngậm rễ cà gai leo sẽ tránh được say rượu, khi say rượu thì chỉ cần sắc rễ cà gai leo uống sẽ nhanh chóng tỉnh rượu

Đặc biệt, cà gai leo có tác dụng vô cùng to lớn trong việc chữa bệnh gan

và hỗ trợ rất tốt trong việc điều trị viêm gan, xơ gan, gan nhiễm mỡ Đã có nhiều nghiên cứu chứng minh tác dụng của cà gai leo trong việc chống viêm gan và ức chế xơ gan

Phạm Kim Mãn và cs (1999) đã nghiên cứu tác dụng chống ung thư của

cà gai leo và kết luận rằng, chế phẩm dịch chiết từ cây cà gai leo nồng độ 5 mg/100 mL có tác dụng hủy diệt tế bào ung thư 180 Sarcoma với tỷ lệ tế bào chết

Ngoài ra tác dụng chống oxy hóa của cà gai leo cũng được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu Nguyễn Thị Bích Thu và cs (2001) đã khảo sát tác dụng chống oxy hóa của cà gai leo Kết quả khảo sát sơ bộ cho thấy dịch chiết glycoalkaloid toàn phần có hoạt tính chống oxy hóa mạnh Những kết quả thu được góp phần giải thích cơ chế tác dụng kháng viêm, bảo vệ gan của chế phẩm Haina

2.3.2 Một số nghiên cứu khác trên cà gai leo

Lê Thị Hà Thanh và cs (2009) đã nghiên cứu sản xuất glycoalkaloid từ tế bào cây cà gai leo Kết quả cho thấy, môi trường MS rắn có 30 g/L sucrose, bổ sung thêm 0,1 mg/L BAP và 1,0 mg/L 2,4-D thích hợp nhất để tạo callus Huyền phù tế bào cà gai leo sinh trưởng tốt nhất trên môi trường MS có 40 g/L sucrose; 1,0 mg/L BAP và 1,0 mg/L 2,4-D, với tốc độ lắc 150 vòng/phút Hàm lượng glycoalkaloid toàn phần tích lũy cao nhất trong tế bào sau 4 tuần nuôi cấy đạt 48,41 mg/g khối lượng khô, cao gấp 5,9 lần hàm lượng glycoalkaloid trong rễ cây cà gai leo tự nhiên 1 năm tuổi Loc và cs (2010) cũng đã khảo sát sự tích lũy glycoalkaloid trong nuôi cấy callus của cây cà gai leo

Solasodine là một hợp chất chính trong cây cà gai leo có nhiều tác dụng dược lý đã được nghiên cứu và công bố Solasodine được tách chiết từ cây tự nhiên nhưng hàm lượng chưa cao và nguồn nguyên liệu ngày càng khan hiếm Nguyễn Hoàng Lộc và cs (2010) đã nghiên cứu sản xuất solasodine từ callus cây

cà gai leo in vitro và thu được kết quả cho thấy, hàm lượng solasodine tích lũy trong callus cao hơn khoảng 8,5 lần so với tách chiết từ rễ cây tự nhiên 1 năm tuổi Loc và Thanh (2011) nghiên cứu nuôi cấy tế bào cà gai leo trong bình tam giác để thu solasodine và nhận thấy, solasodine tích lũy trong tế bào cao hơn trong callus

Nguyễn Hữu Thuần Anh (2016) nghiên cứu ảnh hưởng của một số elicitor đến khả năng tích lũy solasodine trên tế bào in vitro của cây cà gai leo Kết quả cho thấy, Sự sinh trưởng và tích lũy solasodine trong tế bào huyền phù cà gai leo đạt cao nhất sau 4 tuần nuôi cấy, sinh khối tươi đạt 4,98 g/bình, sinh khối khô đạt 0,45 g/bình và hàm ượng solasodine đạt 123,5 mg/g khối ượng khô, cao hơn trong rễ tự nhiên khoảng 5,3 lần Hàm ượng solasodine tích lũy cao nhất khi tế bào cà gai leo được xử lý 150 µM salicylic acid ở thời điểm bắt đầu nuôi cấy (245 mg/g khối ượng khô) Khi bổ sung các elicitor riêng lẽ hay phối hợp, solasodine tăng dần từ tuần thứ 2-3, đạt cực đại ở tuần thứ 4 và sau đó giảm dần

từ tuần 5-7 Solasodine từ tế bào huyền phù cà gai leo có khả năng kháng viêm, thể hiện qua khả năng ức chế collagenase của chúng

Phùng Thị Thu Hà và cs (2017) nghiên cứu đặc điểm thực vật học và một

số biện pháp kỹ thuật trồng cà gai leo tại Gia Lâm, Hà Nội, góp phần hoàn thiện

dữ liệu khoa học về đặc điễm thực vật học của cà gai leo cho danh lục các loài thực vật ở Việt Nam, làm cơ sở nhận biết cho người thu mẫu đồng thời cũng đưa

ra biện pháp kỹ thuật trồng cà gai leo tại Gia Lâm, Hà Nội Nghiên cứu còn cho thấy: cà gai leo sinh trưởng tốt nhất vào vụ xuân - hè tại Gia Lâm, Hà Nội, giá thể trồng phù hợp là đất phù sa; mùn vỏ keo (1:1), khoảng cách trồng 0,25 x 0,25

m, nhân giống bằng giâm cành bánh tẻ đáp ứng được nhu cầu tạo cây giống nhanh, số lượng lớn, vào mọi thời điểm trong năm

Cho đến nay, chúng tôi chưa thấy có tài liệu ngoài nước về nuôi cấy in vitro cà gai leo để sản xuất HCTC

2.4 ĐÁNH GIÁ SỰ TÍCH LŨY HỢP CHẤT THỨ CẤP QUA THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CHIẾT XUẤT DƯỢC LIỆU

Để đánh giá sự tích lũy hợp chất thứ cấp trong chiết xuất dược liệu ngoài các phương pháp tách chiết và phân tích định lượng, còn có các phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học như: đánh giá tác dụng chống oxy hoá thông qua quá trình peroxyd hóa lipit tế bào gan chuột (POL), đánh giá tác dụng bảo vệ gan trên

2.4.1 Xác định hoạt tính chống oxy hóa in vitro thông qua quá trình peroxy hóa lipit tế bào gan chuột

Bằng các thí nghiệm in vitro hoặc in vivo để đánh giá khả năng chống oxy hoá của một chất nào đó thông qua quá trình peroxy hoá lipit tế bào gan chuột dựa trên nguyên tắc: các gốc tự do của oxy sinh ra trong gan chuột là những tác nhân chính gây ra phản ứng peroxy hóa các chất hữu cơ (chủ yếu là các axit béo chưa no ở màng tế bào) Một trong những sản phẩm của quá trình này là dialdehyt malonyl (DAM) Chất này phản ứng với axit thiobarbituric tạo ra phức

có màu hồng bền ở λ =532 nm Đo cường độ màu của phức (OD) có thể biết lượng DAM sinh ra nhiều hay ít Hoạt tính chống oxy hóa (HTCO) là tỷ lệ % lượng DAM giảm đi ở mẫu thử so với mẫu đối chứng (Blagodorov, 1987)

Các tác nhân gây viêm gan mãn, xơ gan, ung thư gan như: các hoá chất, virus thường có đặc điểm chung là làm tăng các dạng oxy hoạt động ở gan, tức

là các gốc tự do sẽ tăng lên Đồng thời với sự tăng gốc tự do hoạt động, quá trình

POL ở gan cũng tăng mạnh Các chất (thuốc) có tác dụng bảo vệ gan hay khả năng điều trị dự phòng phải có tác dụng làm giảm quá trình này (Nguyễn Quang Trường, 1995)

2.4.2 Đánh giá tác dụng bảo vệ gan của chiết xuất dược liệu trên chuột bị

(2) (3) Các dạng trung gian này (2), (3) làm tăng quá trình peroxy hoá lipit mãnh liệt, dẫn đến phá vỡ màng tế bào và gây viêm hoại tử gan

Một chất có tác dụng bảo vệ gan trước hết phải có hoạt tính chống oxy hoá cao, có khả năng kìm hãm quá trình POL và quá trình gây hoại tử gan (biểu hiện thông qua: hàm lượng DAM giảm, điều chỉnh hàm lượng enzyme AST và ALT huyết thanh)

Các enzyme AST (Alanin amino transferase) và ALT (Aspartate amino transferase) – là 2 loại enzym tranrferase trong huyết thanh, xúc tác cho quá trình chuyển nhóm Amin của axit amin sang những axit xetonic Các enzyme này tập trung nhiều ở tế bào gan và tim Khi có tổn thương hoại tử ở những tổ chức này thì chúng đổ vào máu nhiều hơn và làm tăng nồng độ trong máu Trong viêm gan do nhiễm độc, xơ gan AST và ALT tăng rất nhiều Định lượng enzyme trong quá trình điều trị sẽ giúp tiên lượng mức độ rối loạn chức năng gan (Đỗ Trung Đàm, 2006)

2.4.3 Một số nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan của các chiết xuất cây dược liệu

Đào Thị Kim Nhung và cs (2006) nghiên cứu một số hoạt tính sinh học của flavonoid chiết xuất từ lá vải (Litchi chinesis Sonn) và lá nhãn (Dimocarpus longan Lour) Kết quả cho thấy Cả hai chế phẩm FV (Flavonoid chiết xuất từ lá cây vải - Litchi chinesis) và FN (Flavonoid chiết xuất từ lá cây nhãn - Dimocarpus longan) đều thể hiện hoạt tính chống oxy hoá (HTCO) tốt thông qua phản ứng oxy hoá indigocarmin bởi enzym peroxydase của 4 nhóm máu người

và quá trình peroxy hoá lipit (POL) tế bào gan chuột Trong quá trình POL tại nồng độ 50 µg/ml chế phẩm FV có HTCO = 95,8 %; còn tại nồng độ 30 µg/ml chế phẩm FN có HTCO = 91,56%

Nguyễn Ngọc Hồng và cs (2010) nghiên cứu và thử nghiệm hoạt tính bảo

vệ tế bào gan ex vivo của cao chiết cây râu mèo (Orthosiphon aristatus Blume)

quả cho thấy ở nồng độ 0,1 và 0,25 mg/ml của cao chiết methanol có khả năng làm giảm 60% nồng độ ALT so với nhóm chứng độc, đưa nồng độ ALT về còn 104% so với đối chứng trắng

Phí Thị Cấm Miện và cs (2017) đánh giá tác dụng bảo vệ gan của dịch chiết trùm ngây (Moringa oleifera) trên chuột gây tổn thương gan bằng carbon tetrachloride (CCl4) Chuột thuần chủng BALB/c bị gây độc gan cấp bằng carbon tetrachloride (CCl4) sau đó được cho uống dịch chiết chùm ngây để đánh giá khả năng bảo vệ gan Trong các thí nghiệm, dịch chiết rễ chùm ngây được thử nghiệm ở liều 0,5 ml/kg khối lượng cơ thể/ngày (tương ứng với 2 g bột rễ/kg thể trọng) và silymarin (50 mg/kg khối lượng cơ thể/ngày) Kết quả cho thấy sau

14 ngày cho uống hoạt độ AST, ALT, LDH và bilirubin toàn phần trong huyết thanh giảm xuống tương tự so với các lô chuột uống silymarin Kết quả phân tích

vi thể và đại thể gan chuột cho thấy dịch chiết chùm ngây có hiệu quả bảo vệ tích cực tương tự như silymarin

Trên cơ sở tổng quan các kết quả nghiên cứu nêu trên cho thấy tiềm năng

to lớn của nuôi cấy in vitro callus, tế bào các cây dược liệu nói chung và cà gai leo nói riêng để sản xuất các HCTC Bên cạnh đó, vai trò quan trọng của các chất kích ứng (elicitors) trong tăng trưởng sinh khối và tích luỹ các chất có hoạt tính của mô nuôi cấy cũng đã được minh chứng rõ ràng Trong khi đó, đến nay nuôi cấy callus và xác định HCTC trong callus cà gai leo chỉ mới được tác giả Nguyễn Hoàng Lộc và cs Do vậy, đề tài "Nghiên cứu nuôi cấy callus cà gai leo(Solanum hainanense Hance) và ảnh hưởng của chất kích ứng đến sự tích lũy hợp chất thứ cấp trong callus" rất cần thiết được thực hiện nhằm làm sáng tỏ hơn, phong phú hơn cơ sở khoa học và khả năng ứng dụng thực tiễn của hướng

đi này

PHẦN 3 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 ĐỐI TƯỢNG, ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Callus cà gai leo (Solanum hainanense Hance) được tạo ra từ cây cà gai leo nuôi cấy in vitro, cây cà gai leo giống từ Yên Bái được trồng tại khu nhà lưới Viện Sinh học Nông Nghiệp (khoảng 2 năm tuổi)

Mẫu sử dụng là các đoạn thân và mảnh lá (1 cm) được lấy từ cây cà gai leo nuôi cấy in vitro và cây cà gai leo trồng ngoài tự nhiên

3.1.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

- Địa điểm nghiên cứu: Phòng công nghệ Sinh học Thực vật – Viện Sinh học Nông nghiệp - Học viện Nông nghiệp Việt Nam

- Địa điểm phân tích HTCO: Phòng thí nghiệm Trung tâm nghiên cứu và phát triển Công nghệ Hóa sinh

- Thời gian nghiên cứu: 1-8/2017

3.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

3.2.1 Xác định môi trường thích hợp nhất cảm ứng tạo callus cà gai leo

- Loại mẫu: mô thân và mô lá cây nuôi cấy in vitro 4 tuần tuổi

- Môi trường nuôi cấy nền: môi trường MS cơ bản (Đ/C)

- Các công thức thí nghiệm: môi trường MS bổ sung thêm các chất điều tiết sinh trưởng với nồng độ tương ứng theo các bảng sau:

Thí nghiệm 1 Ảnh hưởng của tổ hợp BA và α-NAA đến khả năng tạo callus

Thí nghiệm 2 Ảnh hưởng của tổ hợp BA và 2,4-D đến khả năng tạo callus

3.2.2 Nhân sinh khối callus

- Loại mẫu:callus từ mô thân và mô lá cây nuôi cấy in vitro

Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng nhân sinh khối callus

Chọn 2 môi trường tạo callus tốt nhất ở các thí nghiệm 1, 2 và 3 để nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng nhân sinh khối callus (

Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng của chiếu sáng đèn LED đến khả năng nhân sinh khối callus

Thí nghiệm 7: Ảnh hưởng của acid salisylic đến nhân sinh khối callus

Thí nghiệm 8: Ảnh hưởng của chất chiết nấm men đến nhân sinh khối

- Cây cà gai leo trồng ngoài tự nhiên (khoảng 2 năm tuổi) được chiết bằng

trình peroxy hóa lipit tế bào gan chuột

Công thức Nồng độ cà gai leo

Thí nghiệm 10: Đánh giá ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết callus trên tế bào gan chuột

đánh giá hoạt tính chống oxy hóa thông qua quá trình peroxy hóa lipit tế bào gan chuột

- Chọn môi trường nuôi cấy có bổ sung chất chiết nấm men với nồng độ thích hợp nhất tới khả năng nhân sinh khối callus

được đánh giá hoạt tính chống oxy hóa thông qua quá trình peroxy hóa lipit tế bào gan chuột

Thí nghiệm 12: Đánh giá ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy có bổ sung acid salisylic đến hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết callus trên tế bào gan chuột

- Chọn môi trường nuôi cấy có bổ sung acid salisylic với nồng độ thích hợp nhất tới khả năng nhân sinh khối callus

được đánh giá hoạt tính chống oxy hóa thông qua quá trình peroxy hóa lipit tế bào gan chuột

3.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.3.1 Phương pháp nuôi cấy in vitro

- Sử dụng phương pháp nuôi cấy in vitro trên môi trường cơ bản MS (Murahige & Skoog, 1962: 6g/l saccarose và 100 mg/l innositol), pH môi trường 5,8; thể tích dung dịch trong mỗi bình nuôi cấy là 40 - 50ml

- Điều kiện thí nghiệm: Các thí nghiệm tiến hành trong điều kiện nhân tạo, ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm luôn được giữ ổn định:

+ Cường độ ánh sáng: 2500 - 2800 Lux

+ Thời gian chiếu sáng: 16h sáng/8h tối

+ Độ ẩm: 70 - 80%

3.3.2 Nuôi cấy cây in vitro

Hạt cà gai leo được rửa sạch bằng xà phòng dưới vòi nước chảy trong 5 phút và được làm khô Sau đó đưa vào box cấy vô trùng, mẫu cho vào tráng rửa

bằng cồn 700 trong thời gian 1-2 phút Sau đó rửa lại bằng nước cất vô trùng 1-2 lần, mỗi lần 1 phút Tiếp theo, mẫu được ngâm lắc trong dung dịch dung dịch NaDCC (Sodium dichloroisocyanurate) nồng độ 5g/l trong thời gian 10 phút và rửa lại 3 lần bằng nước cất vô trùng, mỗi lần 1 phút Mẫu sau khử trùng được cấy vào môi trường MS + 25 g/l saccarose + 4,3 g/l agar, pH= 5,8 (môi trường nền) Cuối cùng, mẫu được đưa vào ủ tối để hạt nảy mầm và để loại nhiễm

Cây in vitro sau khi nảy mầm được cấy chuyển trên môi trường nền để nuôi cây lớn Các đoạn thân có mắt lá của cây in vitro tiếp tục được cấy trên môi trường nền để nhân cây tạo nguyên liệu

3.3.3 Nuôi cấy callus, nhân sinh khối callus

Các bộ phận khác nhau của cây cà gai leo in vitro: cuống lá, mảnh lá, đoạn thân có kích thước khoảng 1cm được nuôi cấy trên môi trường nền có bổ sung thêm các chất điều tiết sinh trưởng để đánh giá khả năng cảm ứng tạo callus Callus sau 4 tuần tuổi được cắt thành những khối nhỏ khoảng 250 mg sử dụng để nhân sinh khối callus, theo dõi ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy, điều kiện chiếu sáng và các chất kích ứng đến khả năng nhân sinh khối callus

Callus được nhân sinh khối sau 3 tuần tuổi được theo dõi các chỉ tiêu như: khối lượng tươi, khối lượng khô, hình thái callus

Khối lượng tươi trung bình 1 mẫu callus (mg) = Khối lượng tươi trung bình callus của 1 bình (mg) / số mẫu 1 bình (mg)

Khối lượng khô trung bình 1 mẫu callus (mg) = Khối lượng khô trung bình callus của 1 bình (mg) / số mẫu 1 bình (mg)

3.3.4 Đánh giá hoạt tính sinh học dịch chiết callus

ở cùng một điều kiện nuôi cấy được sấy khô rồi chiết trong dung môi thích hợp 3.3.4.1 Phương pháp chiết callus cà gai leo nuôi cấy in vitro và chiết cây cà gai leo trồng ngoài tự nhiên

- Callus thu được theo từng công thức thí nghiệm và mô thân, mô lá của cây trồng tự nhiên (2 năm tuổi) được sấy khô đến khối lượng không đổi và nghiền mịn

- Lọc lấy dịch chiết, chiết tiếp lần 2 trong dung môi cồn 700 ở 60-700C

chính xác khối lượng thu được

pha thành các dung dịch có nồng độ khác nhau dùng trong nghiên cứu

3.3.4.2 Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học dịch chiết callus

Xác định hoạt tính chống oxy hóa in vitro thông qua quá trình peroxy hóa lipit tế bào gan chuột theo phương pháp của Blagodorov (1987)

-Nguyên liệu động vật: Gan tươi của chuột nhắt trắng chủng Swiss khoẻ mạnh, nặng 22 ± 2 g

-Tiến hành: Mổ lấy gan chuột nhắt Cân chính xác 100mg gan chuột làm

M và dịch chiết callus, dịch chiết cà gai leo tự nhiên với nồng độ tùy từng công

ml dung dịch axit thiobacbituric 0,25% Đun sôi cách thuỷ khoảng 15 phút, để nguội Đo màu ở bước sóng 532 nm

Lượng DAM được tính theo công thức:

Trong đó:

C: số mol DAM D: mật độ quang học

số tiêu chuẩn CV(%)

PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 KẾT QUẢ

4.1.1 Xác định môi trường thích hợp nhất cảm ứng tạo callus cà gai leo

4.1.1.1 Ảnh hưởng của tổ hợp BA và α-NAA đến khả năng tạo callus

Kết quả thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp BA và α-NAA đến

khả năng tạo callus đối với mẫu sử dụng là đoạn thân và mảnh lá cây cà gai leo in

vitro được thể hiện ở bẳng 4.1 và 4.2

Bảng 4.1 Ảnh hưởng của tổ hợp BA và α-NAA đến khả năng

tạo callus từ đoạn thân cà gai leo

CT

Nồng độ

BA (mg/l)

Nồng độ α-NAA (mg/l)

Khối lượng tươi

TB (mg/mẫu)

Khối lượng khô TB (mg/mẫu)

Hình thái callus