Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ học của bệnh lở mồm long móng ở việt nam giai đoạn 2016 2018 luận văn thạc sĩ nông nghiệp

Phương pháp nghiên cứu Luận văn sử dụng phương pháp dịch tễ học hồi cứu retrospective cohort study để tổng hợp và phân tích đặc điểm dịch tễ về không gian, thời gian và đối tượng gia s

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

NGUYỄN THỊ LAN HƯƠNG

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ HỌC CỦA BỆNH LỞ MỒM LONG MÓNG Ở VIỆT NAM

GIAI ĐOẠN 2016 - 2018

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Bá Hiên

TS Nguyễn Văn Long

NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP - 2019

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từng dùng để bảo vệ lấy bất

kỳ học vị nào

Tôi cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cảm ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn này đều được chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày tháng năm 2019

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Lan Hương

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn này, ngoài sự cố gắng của bản thân, tôi luôn nhận được sự quan tâm giúp đỡ của các cơ quan, các tổ chức, các nhà khoa học, các thầy cô giáo, bạn

bè đồng nghiệp và những người thân trong gia đình

Trước tiên, tôi xin chân thành cảm ơn Ban Lãnh đạo Cục Thú y, các Phòng chức năng, các đơn vị liên quan thuộc Cục Thú y và các địa phương đã tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ, động viên và cho phép tôi tham gia triển khai, sử dụng số liệu, kết quả của các chương trình, dự án có liên quan

Tôi bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc về sự hướng dẫn rất có trách nhiệm và hết lòng vì khoa học của PGS.TS Nguyễn Bá Hiên và Tiến sĩ Nguyễn Văn Long

Nhân dịp này, tôi trân trọng cảm ơn sự giúp đỡ của Ban Quản lý đào tạo và Bộ môn Vi sinh vật Truyền nhiễm, Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và hoàn thành luận văn tại Học viện

Tôi bày tỏ lòng biết ơn chân thành nhất tới Quý thầy cô, các cơ quan, nhà khoa học cùng các đồng nghiệp đã giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới những người thân trong gia đình đã luôn quan tâm, động viên giúp tôi hoàn thành luận văn này

Hà Nội, ngày tháng năm 2019

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Lan Hương

MỤC LỤC

Lời cam đoan i

Lời cảm ơn ii

Mục lục iii

Danh mục chữ viết tắt vi

Danh mục bảng vii

Danh mục đồ thị, hình viii

Trích yếu luận văn ix

Thesis abstract xi

Phần 1 Mở đầu 1

1.1 Tính cấp thiết của đề tài 1

1.2 Mục tiêu của đề tài 2

1.3 Phạm vi nghiên cứu 2

1.4 Những đóng góp mới, ý nghĩa khoa học và thực tiễn 3

Phần 2 Tổng quan tài liệu 4

2.1 Thông tin chung về bệnh LMLM 4

2.2 Một số nghiên cứu về bệnh LMLM 4

2.2.1 Tình hình nghiên cứu về bệnh LMLM trên thế giới và khu vực 4

2.2.2 Tình hình nghiên cứu về bệnh LMLM tại Việt Nam 5

2.3 Tình hình dịch bệnh LMLM 6

2.3.1 Tình hình dịch bệnh LMLM trên thế giới và khu vực 6

2.3.2 Tình hình dịch bệnh LMLM tại Việt Nam 7

2.4 Vi rút gây bệnh LMLM 9

2.4.1 Hình thái vi rút LMLM 9

2.4.2 Cấu trúc vi rút LMLM 9

2.4.3 Các serotype của vi rút LMLM 10

2.4.4 Đặc tính nuôi cấy của vi rút LMLM 12

2.4.5 Sức đề kháng của vi rút LMLM 13

2.5 Một số đặc điểm cơ bản của bệnh LMLM 14

2.5.1 Loài vật mắc bệnh 14

2.5.2 Triệu chứng, bệnh tích 14

2.5.3 Cơ chế sinh bệnh 16

2.5.4 Phương thức truyền lây 17

2.5.5 Đường xâm nhập 18

2.5.6 Tình trạng mang trùng 19

2.6 Các phương pháp chẩn đoán bệnh 20

2.6.1 Chẩn đoán lâm sàng 20

2.6.2 Chẩn đoán vi rút học 20

2.6.3 Chẩn đoán huyết thanh học 21

2.6.4 Chẩn đoán bằng kỹ thuật RT-PCR 23

2.7 Một số phương pháp nghiên cứu dịch tễ học 23

2.7.1 Nghiên cứu cắt ngang (cross-sectional study) 23

2.7.2 Nghiên cứu thuần tập (cohort study) 24

Phần 3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 26

3.1 Địa điểm nghiên cứu 26

3.2 Thời gian nghiên cứu 26

3.3 Đối tượng và vật liệu nghiên cứu 26

3.3.1 Đối tượng nghiên cứu 26

3.3.2 Vật liệu nghiên cứu 26

3.4 Nội dung nghiên cứu 27

3.5 Phương pháp nghiên cứu 27

3.5.1 Phương pháp dịch tễ học hồi cứu (retrospective cohort study) 27

3.5.2 Phương pháp giải trình tự gien 28

3.5.3 Đánh giá mức độ tương đồng kháng nguyên giữa kháng nguyên của vắc xin và kháng nguyên của vi rút thực địa 29

3.5.4 Phương pháp đánh giá đáp ứng miễn dịch sau tiêm phòng vắc xin LMLM của trâu, bò tại một số tỉnh 30

3.6 Quản lý và phân tích số liệu 31

Phần 4 Kết quả và thảo luận 32

4.1 Một số đặc điểm dịch tễ học của bệnh LMLM ở Việt Nam giai đoạn từ năm 2016 - 2018 32

4.1.1 Các loài gia súc mắc bệnh LMLM 32

4.1.2 Tỷ lệ gia súc chết do bệnh LMLM 34

4.1.3 Đặc điểm dịch tễ học theo thời gian xuất hiện các ổ dịch LMLM 35

4.1.4 Đặc điểm dịch tễ theo không gian của các ổ dịch LMLM 40

4.2 Đặc điểm dịch tễ học phân tử của vi rút LMLM lưu hành ở Việt Nam giai đoạn từ năm 2016 - 2018 50

4.2.1 Kết quả xác định các topotype và lineage vi rút LMLM tại Việt Nam, giai đoạn từ năm 2016 - 2018 50

4.2.2 Đánh giá mức độ tương đồng kháng nguyên của vi rút vắc xin và vi rút lưu hành tại Việt Nam trong giai đoạn từ năm 2016 - 2018 57

4.3 Đánh giá đáp ứng miễn dịch sau tiêm phòng vắc xin LMLM của trâu, bò tại một số địa phương trong năm 2018 60

Phần 5 Kết luận và kiến nghị 65

5.1 Kết luận 65

5.2 Kiến nghị 65

Tài liệu tham khảo 67

Phụ lục 76

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

EDR Estimated Dissemination Ratio

ELISA Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay

FAO Food and Agriculture Organization of the United Nations

LPB-ELISA Liquid Phase Blocking-ELISA

NCBI National Center for Biotechnology Information

NN&PTNT Nông nghiệp và Phát triển nông thôn

OIE World Organisation for Animal Health

RT-PCR Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction

TCID 50 50% Tissue Culture Infectious Dose

DANH MỤC BẢNG

Bảng 4.1 Tỷ lệ gia súc mắc bệnh LMLM, giai đoạn từ năm 2016 - 2018 32 Bảng 4.2 Tỷ lệ loài gia súc chết do bệnh LMLM, giai đoạn 2016 - 2018 34 Bảng 4.3 Nguy cơ dịch bệnh LMLM theo vùng địa lý, giai đoạn từ năm 2016 -

2018 40 Bảng 4.4 Nguy cơ xuất hiện dịch LMLM tại các tỉnh Đồng bằng sông Hồng,

Đông Bắc Bộ và Tây Bắc Bộ, giai đoạn 2016 - 2018 43 Bảng 4.5 Nguy cơ xuất hiện dịch LMLM tại các tỉnh Bắc Trung Bộ và Nam

Trung Bộ, giai đoạn 2016 – 2018 45 Bảng 4.6 Nguy cơ xuất hiện dịch LMLM tại các tỉnh Tây nguyên, Đông Nam Bộ

và Đồng bằng sông Cửu Long, giai đoạn 2016 - 2018 46 Bảng 4.7 Các vi rút LMLM phân lập được ở Việt Nam, giai đoạn từ năm 2016 -

2018 51 Bảng 4.8 Kết quả đánh giá tương đồng kháng nguyên của vắc xin và vi rút

LMLM type O lưu hành tại Việt Nam giai đoạn từ năm 2016 - 2018 58 Bảng 4.10 Kết quả giám sát huyết thanh trên trâu, bò được tiêm vắc xin LMLM

năm 2018 tại một số địa phương 61

DANH MỤC ĐỒ THỊ, HÌNH

Hình 2.1 Bản đồ gien và cấu trúc của vi rút LMLM 9

Hình 2.2 Bản đồ phân bố 7 chủng vi rút LMLM trên thế giới, giai đoạn từ năm 2014 - 2018 11

Hình 2.3 Triệu chứng, bệnh tích của bệnh LMLM ở trâu, bò 15

Hình 2.4 Sơ đồ mô tả nghiên cứu cắt ngang 24

Hình 2.5 Sơ đồ mô tả nghiên cứu thuần tập hồi cứu và tịnh tiến 25

Hình 4.1 Biểu đồ dịch tễ dịch LMLM xảy ra trong giai đoạn 2016 - 2018 35

Hình 4.2 Biểu đồ dịch tễ các ổ dịch LMLM xảy ra năm 2016 36

Hình 4.3 Biểu đồ dịch tễ các ổ dịch LMLM xảy ra năm 2017 36

Hình 4.4 Biểu đồ dịch tễ các ổ dịch LMLM xảy ra năm 2018 37

Hình 4.5 Tỷ lệ lây lan ước tính (EDR) của dịch LMLM tính được cho năm 2018 so với số lượng ổ dịch thực tế xảy ra 38

Hình 4.6 Bản đồ phân bố các ổ dịch LMLM xảy ra từ năm 2016 - 2018 42

Hình 4.7 Bản đồ phân bố về không gian dịch LMLM năm 2018 50

Hình 4.8 Bản đồ phân bố các vi rút LMLM lưu hành tại Việt Nam, giai đoạn 2016 - 2018 51

Hình 4.9 Phả hệ vùng gien VP1 của vi rút LMLM O/SEA/Mya-98 phân lập tại Việt Nam (do Phòng thí nghiệm tham chiếu của OIE tại Pirbright, Vương quốc Anh phân tích) 53

Hình 4.10 Phả hệ của vi rút LMLM serotype O dòng PanAsia phân lập tại Việt Nam (do Phòng thí nghiệm tham chiếu của OIE tại Pirbright, Vương quốc Anh phân tích) 55

Hình 4.11 Phả hệ của vi rút LMLM serotype A/ASIA/Sea-97 phân lập tại Việt Nam (do Phòng thí nghiệm tham chiếu của OIE tại Pirbright, Vương quốc Anh phân tích) 56

TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Nguyễn Thị Lan Hương

Tên Luận văn: Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ học của bệnh Lở mồm long móng

ở Việt Nam giai đoạn 2016 - 2018

Phương pháp nghiên cứu

Luận văn sử dụng phương pháp dịch tễ học hồi cứu (retrospective cohort study)

để tổng hợp và phân tích đặc điểm dịch tễ về không gian, thời gian và đối tượng gia súc mắc bệnh LMLM từ năm 2016 - 2018; các phương pháp dịch tễ học phân tử, phân tích tương đồng kháng nguyên để hiểu rõ đặc điểm vi rút LMLM và vắc xin phòng bệnh; phương pháp LPB-ELISA để đánh giá sau tiêm phòng vắc xin

Kết quả chính và kết luận

- Về không gian: Nguy cơ trung bình các xã có bệnh LMLM là 5,95 (95% CI 5,51

- 6,39) xã có dịch/100 xã-năm Dịch LMLM xuất hiện tập trung tại các tỉnh Bắc Bộ, Tây Nguyên và Nam Trung Bộ

- Về thời gian: Bệnh LMLM xảy ra ở hầu hết các tháng trong năm ở giai đoạn từ năm 2016 - 2018, trầm trọng nhất vào 02 tháng cuối năm 2018

- Về đối tượng mắc bệnh: Bò có tỷ lệ mắc bệnh cao nhất, sau đó đến lợn, trâu và các loài gia súc khác; lợn có tỷ lệ chết cao nhất, đặc biệt vào cuối năm 2018

- Vi rút LMLM lưu hành tại Việt Nam trong giai đoạn từ năm 2016 - 2018 thuộc serotype O (Mya-98, Cathay, PanAsia và Ind -2001d, e) và serotype A (Sea- 97) Vi rút O/SEA/Mya-98 và O/Cathay lưu hành và gây bệnh trên lợn không tương đồng kháng nguyên với các loại kháng nguyên O1Manisa và O3039 có trong vắc xin LMLM; vắc xin chứa kháng nguyên A22 Iraq có tương đồng cao với vi rút LMLM A/ASIA/Sea-97 (r1 > 0,3)

- Gia súc (gồm bò, bò sữa và trâu) được tiêm phòng vắc xin LMLM có tỷ lệ dương tính với kháng thể kháng vi rút LMLM serotype O ở mức trên 70%; trong đó

bò sữa có tỷ lệ dương tính với kháng thể serotype O cao nhất là 89,3% (95% CI 71,8

- 97,7); tỷ lệ gia súc được tiêm phòng vắc xin có kháng thể dương tính với serotype

A là 74,0% (95% CI 70,6 - 77,2), đáp ứng yêu cầu bảo hộ đàn gia súc theo khuyến cáo của OIE

THESIS ABSTRACT Master candidate: Nguyen Thi Lan Huong

Thesis title: Research on some epidemiological characteristics of Foot and Mouth Disease occurred in Vietnam during the period from 2016 to 2018

Education organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA)

Research Objectives:

To identify the relationship and impact of spatial and temporal factors on frequency and distribution of FMD outbreaks, types and topotypes of FMD virus circulated and infected in cattle of Vietnam, and provide scientific basis for FMD prevention and control programs

Materials and Methods:

Methodologies employed include: approach and techniques of the retrospective cohort study were applied to identify some epidemiological characteristics of FMD outbreaks occurred in Vietnam during the period from 2016 to 2018; molecular analysis

of FMD virus and vaccine matching study; LPB-ELISA method was employed for vaccination evaluation

post-Main findings and conclusions:

- Spatial pattern: overall risk ratio for communes being infected with FMD was 5.95 (95% CI 5.51 - 6.39) per 100 commune-year at risk FMD outbreaks mostly occurred in high risk provinces in the North, Central Highland and South-Central regions of Vietnam

- Temporal pattern: FMD endemics occurred in Vietnam throughout the year and during the study period of 2016 - 2018, particularly in the last two months of 2018

- Infected species: bovines had the highest morbidity, followed by pigs, buffaloes and others; pigs had the highest mortality rate, especially at the end of 2018

- The FMD virus isolates circulated in Vietnam during the period of 2016 to 2018 belong to serotype O (Mya-98, Cathay, PanAsia and Ind -2001d, e) and serotype A (Sea-97) The FMD virus specifically O/SEA/Mya-98 and O/Cathay circulated and infected in domestic pigs were antigenically different from the O1Manisa and O3039 of FMD vaccines; there was a close antigenic relationship between the A/ASIA/Sea-97 FMD virus and the vaccine contains A22 Iraq (r1 > 0.3)

- More than 70% of vaccinated animals (cows, daily cows and buffaloes) had FMD serotype O antibody, of which dairy cows had the highest positive rate with serotype O with 89.3% (95% CI 71.8 - 97.7) The proportion of vaccinated cattle which had antibody positive for serotype A was 74.0% (95% CI 70.6 - 77.2), meeting the OIE’s recommendations on protecting vaccinated cattle herds

PHẦN 1 MỞ ĐẦU

1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Bệnh Lở mồm long móng (LMLM) là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm

của động vật móng guốc chẵn như: Trâu, bò, lợn, dê, hươu, nai (Geering et

al., 1995; Radostits et al., 2000; Knowles et al., 2005) Bệnh có khả năng lây

lan rất nhanh, mạnh, không chỉ do tiếp xúc giữa động vật khoẻ với động vật mắc bệnh mà còn qua nhiều đường khác nhau, kể cả qua không khí Bệnh thường phát thành dịch và gây thiệt hại nặng nề cho ngành chăn nuôi, ảnh hưởng đến kinh tế xã hội, môi trường của nhiều nước trên thế giới

Tổ chức Thú y thế giới (OIE) đã liệt kê bệnh LMLM vào danh mục các bệnh truyền nhiễm nguy hiểm ở nhiều loài động vật, có tầm quan trọng đối với thương mại quốc tế và bắt buộc các nước thành viên phải khai báo dịch bệnh (OIE, 2011) Các quốc gia trên thế giới đặc biệt quan tâm và có chương trình phòng chống bệnh LMLM; việc xuất khẩu gia súc, sản phẩm gia súc từ quốc gia có dịch bệnh LMLM thường bị tạm dừng hoặc cần chứng minh xuất phát từ vùng, chuỗi chăn nuôi an toàn dịch bệnh theo khuyến cáo của OIE Trên thế giới, nhất là từ khi Tổ chức Thương mại thế giới (WTO) bắt đầu hoạt động (01/01/1995) và các dịch vụ thương mại, du lịch phát triển,

bệnh LMLM cũng có xu thế lây lan khắp thế giới (Thurmond et al., 2007; Chen et al., 2010) Để ngăn chặn dịch bệnh lây lan qua biên giới, các nước

không những có chương trình phòng chống mà còn phải tăng cường hợp tác quốc tế Các nước khu vực Đông Nam Á đã và đang hợp tác tích cực triển khai thực hiện khung kế hoạch hành động phòng chống LMLM tại mỗi nước thành viên và giữa các nước (OIE Regional Commission for Asia, 2011) Tại Việt Nam, đến nay bệnh đã xuất hiện, lưu hành và gây bệnh ở gia súc trên 100 năm (Nguyễn Vĩnh Phước, 1978) Giai đoạn đầu, bệnh xuất hiện và gây dịch ở phạm vi nhỏ, nhưng sau đó lây rộng ra phạm vi cả nước Bệnh LMLM diễn biến có quy luật, thường 2 - 3 năm xuất hiện một đợt dịch trầm trọng, có tính chất mùa vụ, tại các vùng địa lý nguy cơ cao Trong những năm trước đây,

đã có nhiều công trình nghiên cứu về đặc điểm dịch tễ (Trần Hữu Cổn, 1996; Văn Đăng Kỳ, 2002; Thái Thị Thủy Phượng, 2008), đặc điểm của vi rút LMLM

và vắc xin LMLM tại Việt Nam (Tô Long Thành, 2004), sự phân bố và lưu hành

của vi rút LMLM tại các tỉnh Duyên hải miền Trung (Nguyễn Văn Hưng, 2012), đặc điểm dịch tễ bệnh LMLM giai đoạn 2006 - 2012 (Nguyễn Thu Thủy, 2018)

đã cung cấp các bằng chứng khoa học, góp phần vào việc xây dựng các giải pháp phòng chống dịch LMLM ở nước ta

Trên cơ sở phân tích các đặc điểm không gian và các yếu tố khác của dịch bệnh LMLM, Cục Thú y đã tham mưu cho Bộ NN&PTNT phê duyệt “Chương trình quốc gia khống chế bệnh LMLM, giai đoạn 2016 - 2020” (Bộ Nông nghiệp

và Phát triển nông thôn, 2016); trong đó đã phân vùng nguy cơ cao (bao gồm vùng khống chế và vùng đệm), vùng nguy cơ thấp và vùng an toàn dịch bệnh, với mức độ nguy cơ khác nhau, các giải pháp phòng, chống dịch bệnh cũng khác nhau Đặc biệt, Chương trình đã chỉ rõ cần tập trung các nguồn lực về tài chính, con người và sử dụng các chủng loại vắc xin ở những vùng nguy cơ cao, vùng trọng điểm và cần có sự tham gia trực tiếp của các cơ quan nhà nước vào công tác phòng, chống dịch bệnh; các vùng nguy cơ thấp, an toàn dịch bệnh chủ yếu

do người dân và doanh nghiệp triển khai các hoạt động phòng bệnh là chính và xây dựng vùng, cơ sở chăn nuôi an toàn dịch bệnh

Tuy nhiên, thời gian gần đây, bệnh có xu hướng gia tăng về phạm vi lưu hành,

số lượng, loại gia súc mắc bệnh và thời gian mắc bệnh Mặt khác, trong những năm gần đây, do tập trung các nguồn lực phòng chống dịch cúm gia cầm, tai xanh nên các hoạt động đầu tư nghiên cứu về bệnh LMLM đang có xu hướng bị chững lại, đặc biệt là các nghiên cứu dịch tễ học bệnh LMLM về mặt không gian, thời gian và đối tượng mắc bệnh Vì vậy, để có cơ sở phân tích, đưa ra những nhận định chính xác hơn nhằm có các biện pháp phòng, chống bệnh LMLM phù hợp và hiệu quả,

chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ học của bệnh Lở

mồm long móng ở Việt Nam giai đoạn 2016 - 2018”

1.2 MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI

Xác định mối quan hệ và ảnh hưởng của các yếu tố không gian, thời gian đến tần suất và phân bố ổ dịch LMLM, các type và topotype của vi rút LMLM lưu hành và gây bệnh trên gia súc tại Việt Nam, làm cơ sở cho các chương trình phòng, chống dịch LMLM cho các địa phương và cho cả nước

1.3 PHẠM VI NGHIÊN CỨU

Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ học của bệnh LMLM tại Việt Nam, giai đoạn từ năm 2016 - 2018

1.4 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI, Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN

Mô tả bức tranh tổng thể về tình hình dịch bệnh, sự phân bố của các chủng

vi rút LMLM ở Việt Nam giai đoạn từ năm 2016 - 2018 và đáp ứng miễn dịch sau tiêm phòng vắc xin; từ đó làm cơ sở đề xuất các giải pháp phòng, chống bệnh LMLM phù hợp, hiệu quả hơn trong giai đoạn tiếp theo

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU2.1 THÔNG TIN CHUNG VỀ BỆNH LMLM

Bệnh LMLM (LMLM), tên tiếng Anh là Foot and Mouth Disase (FMD), là bệnh truyền nhiễm cấp tính của các loài động vật móng guốc chẵn, bao gồm:

Trâu, bò, lợn, dê, hươu, nai (Geering et al., 1995; Radostits et al., 2000); Knowles et al., 2005) Bệnh do vi rút thuộc họ Picornaviridae gây ra (Carrillo

et al., 2005; Elliot et al., 2017) Đây là loài vi rút có tính hướng thượng bì, do đó

thường làm thủy hóa các tế bào thượng bì

Đặc trưng của bệnh LMLM là làm xuất hiện những mụn nước với các kích

cỡ không đồng đều ở niêm mạc miệng, kẽ móng, gờ móng, trên bầu vú, đầu vú con cái và cuống của dạ cỏ Khi mụn nước vỡ sẽ tạo ra các vết loét Bệnh LMLM có tính chất lây lan rất nhanh, rất mạnh và ở phạm vi rộng, do đó bệnh

có thể lây lan trong phạm vi một hoặc nhiều nước (Brito et al., 2015), gây ra

các đợt dịch lớn trong thời gian ngắn, ảnh hưởng đến kinh tế xã hội của nhiều

nước thuộc nhiều châu lục trên thế giới (Farsang et al., 2013) Bệnh LMLM có

tỷ lệ mắc bệnh cao, có thể tới 100% trong quần thể động vật cảm nhiễm (Cục Thú y, 2013)

2.2 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ BỆNH LMLM

2.2.1 Tình hình nghiên cứu về bệnh LMLM trên thế giới và khu vực

Năm 1514, bệnh LMLM lần đầu tiên được một nhà sư tên là Hieronymous Frascastorius phát hiện và mô tả tại một ổ dịch xảy ra trên bò ở vùng Verona của nước Ý, sau đó bệnh được phát hiện ở các vùng Bắc Ý, Pháp, Anh và nhiều nước châu Âu khác (Jamal and Belsham, 2013)

Năm 1897, hai nhà khoa học người Đức có tên là Loeffler và Frosch đã tìm

ra tác nhân gây bệnh LMLM, đó là vi rút LMLM thuộc giống Aphthovirus, họ

Picornaviridae Tác nhân này được chứng minh là có thể qua được màng lọc

(Loeffler and Frosch, 1898) Đến những năm đầu thế kỷ 20 (1920), nhiều công trình nghiên cứu chi tiết về bệnh này mới được thực hiện Năm 1922, hai nhà khoa học người Pháp là Valée và Carré phát hiện ra tính đa dạng của huyết thanh miễn dịch chống vi rút type O và A (Nguyễn Vĩnh Phước, 1978)

Năm 1926, Waldman và Trautwein - hai nhà khoa học người Đức đã khẳng định lại kết quả của hai nhà khoa học người Pháp và tìm ra vi rút type C Cũng trong năm này, các nhà khoa học Pháp đã xử lý vi rút bằng formaldehyd nhưng không thành công Sau đó Rimsovski (Nga) đã kết hợp hấp thụ vi rút bằng hydroxit nhôm, vô hoạt vi rút bằng formaldehyd và nhiệt độ để tạo vắc xin và cho kết quả tốt

Vài năm sau đó, 3 type khác được phát hiện ở miền Nam châu Phi và được đặt tên là SAT1, SAT2, SAT3, và các phòng thí nghiệm ở Anh thông báo đã phân lập được type thứ 7 và đặt tên là ASIA1

Theo thông tin của OIE, hiện nay trên toàn thế giới có 68 quốc gia và vùng lãnh thổ được công nhận là an toàn dịch bệnh đối với bệnh LMLM và không cần phải tiêm phòng vắc xin; tổng số có hai nước sạch bệnh có tiêm phòng vắc xin; hàng chục nước có vùng sạch bệnh có tiêm phòng vắc xin hoặc không tiêm phòng vắc xin Indonesia đã thanh toán được bệnh này từ năm 1983, Philippines

đã được OIE công nhận an toàn bệnh LMLM vào năm 2014 (OIE, 2019)

Nhiều nước trên thế giới không phát hiện hoặc đã thanh toán được bệnh dịch LMLM như Australia, New Zealand, Philippines, các nước thuộc quần đảo Thái Bình Dương, các nước trong Liên minh Châu Âu (EU), các nước thuộc vùng Bắc Trung Mỹ Các nước trên đều phải thực hiện một chương trình quốc gia về tiêm phòng nhiều năm, kiểm dịch và các biện pháp khác theo quy định của OIE

2.2.2 Tình hình nghiên cứu về bệnh LMLM tại Việt Nam

Bệnh LMLM được phát hiện lần đầu tiên ở Nha Trang năm 1898, sau đó bệnh lan rộng ra cả 3 miền Bắc, Trung, Nam (Nguyễn Vĩnh Phước, 1978; Đào Trọng Đạt, 2000) Cùng thời gian này bệnh xuất hiện ở các nước lân cận như Lào, Campuchia, Thái Lan,

Năm 2000, Nguyễn Đăng Khải và cộng sự đã sử dụng kỹ thuật ELISA để

chẩn đoán và định type vi rút LMLM ở nước ta (Nguyễn Đăng Khải và cs.,

2000); đồng thời Tô Long Thành đã phát triển vắc xin để chống lại bệnh LMLM (Tô Long Thành, 2000)

Năm 2002, Văn Đăng Kỳ đã tiến hành nghiên cứu dịch tễ học bệnh LMLM

ở lợn Việt Nam và biện pháp phòng chống (Văn Đăng Kỳ, 2002)

Năm 2003, Hồ Đình Chúc và Ngô Thanh Long đã sử dụng phương pháp 3ABC-ELISA để phát hiện kháng thể của trâu bò bị nhiễm vi rút LMLM, phân

biệt với kháng thể do vắc xin LMLM tạo nên (Hồ Đình Chúc và Ngô Thanh Long, 2013)

Năm 2004, Tô Long Thành đã nghiên cứu hoàn thiện công nghệ sản xuất vắc xin nhược độc, vô hoạt phòng bệnh cho gia súc, gia cầm và ứng dụng kỹ thuật gien để định type vi rút LMLM (Tô Long Thành, 2004)

Tô Long Thành và cộng sự năm 2005 đã tách dòng và giải trình tự thành công đoạn gien mã hóa cho serotype O vi rút LMLM phân lập tại Quảng Trị, sau khi thiết lập và sử dụng phương pháp RT-PCR để chẩn đoán và định type vi rút gây bệnh ở Quảng Trị (Tô Long Thành và cs., 2005)

Năm 2006, Nguyễn Viết Không và cộng sự đã phát hiện type Asia 1 virut

LMLM lần đầu tiên tại Khánh Hòa bằng kỹ thuật RT- PCR (Nguyễn Viết Không

và cs., 2006); và nhóm tác giả gồm Tô Long Thành và cộng sự đã tiến hành chẩn

đoán bệnh, giám sát sự lưu hành của vi rút và lựa chọn vắc xin phòng chống bệnh LMLM của Cục Thú y (1985 - 2006) (Tô Long Thành và cs., 2006)

Thái Thị Thủy Phượng năm 2008, đã khảo sát một số đặc điểm dịch tễ học

và biện pháp khống chế bệnh lở mồm long móng gia súc tại các tỉnh Bà Rịa Vũng Tầu, Cần Thơ, Đồng Tháp và Tiền Giang (Thái Thị Thủy Phượng, 2008) Nguyễn Văn Hưng năm 2012 đã tiến hành nghiên cứu sự phân bổ và lưu hành vi rút LMLM ở vùng duyên hải miền Trung (Nguyễn Văn Hưng, 2012) Năm 2013, Nguyễn Thu Thủy và cộng sự đã nghiên cứu đặc điểm dịch tễ không gian và thời gian của dịch LMLM tại Việt Nam, giai đoạn 2006 - 2012 (Nguyễn Thu Thủy và cs., 2013)

Đồng Văn Quyền và cộng sự năm 2013 đã giải mã và phân tích đặc điểm phân

tử gien VP1 của vi rút LMLM tpye O gây bệnh ở miền Bắc Việt Nam năm 2010 (Đồng Văn Quyền và cs., 2013)

Năm 2015, Lê Văn Phan và cộng sự đã nghiên cứu một số đặc điểm sinh học phân tử của vi rút gây bệnh LMLM type ) phân lập được ở Sơn Tây, Hà Nội năm

2013 (Lê Văn Phan và cs., 2015)

2.3 TÌNH HÌNH DỊCH BỆNH LMLM

2.3.1 Tình hình dịch bệnh LMLM trên thế giới và khu vực

Bệnh LMLM đã xuất hiện ở nhiều nước thuộc Châu Á, Châu Phi, Châu Mỹ

La tinh và Châu Âu Điển hình là trong những năm 1981 - 1985, dịch xuất hiện ở

80 nước, gây nên tổn thất lớn cho nền kinh tế của những nước này (OIE, 2019) Năm 1997, dịch xảy ra ở lợn trên toàn lãnh thổ Đài Loan, gây thiệt hại nặng nề

về kinh tế và để lại hậu quả xấu cho ngành chăn nuôi lợn trong nhiều năm Các nước Nhật Bản và Hàn Quốc là những nước từ lâu không có bệnh LMLM nhưng đến năm 2000 đã xuất hiện bệnh này Tại Châu Âu, năm 2001 dịch đầu tiên xảy

ra ở Anh, sau đó lan ra Pháp, Hà Lan, Ai-len qua con đường vận chuyển gia súc Trung Quốc là nước thường xuyên có bệnh LMLM, có chung đường biên giới rất dài với Việt Nam, hoạt động buôn bán trao đổi hàng hóa, nhất là tình trạng buôn bán vận chuyển trái phép động vật và sản phẩm động vật, nên nguy

cơ lây lan dịch bệnh giữa hai nước là rất cao

Ở khu vực Đông Nam Á, một số nước có dịch LMLM như Lào, Campuchia, Thái Lan, Myanmar, Philippines, Malaysia đã chịu những thiệt hại rất lớn do dịch gây ra Ví dụ: Ở Thái Lan, khi bị dịch này, Chính phủ đã chi mỗi năm hàng triệu USD để khống chế dịch Ngoài ra, Liên Hợp Quốc còn hỗ trợ thêm 36 triệu USD để thành lập Trung tâm Chẩn đoán LMLM để định type vi rút, nghiên cứu dịch tễ và sản xuất vắc xin

2.3.2 Tình hình dịch bệnh LMLM tại Việt Nam

Năm 1975, bệnh dịch này xảy ra liên tiếp ở 17 tỉnh phía Nam từ Quảng Nam - Đà Nẵng trở vào tới các tỉnh vùng Đồng bằng sông Cửu Long Từ năm

1976 đến 1983, có 98 ổ dịch ở các tỉnh phía Nam, làm 26.648 con trâu, bò và 2.919 con lợn bị bệnh

Trong những năm cuối thập kỷ 80, một số tỉnh phía Nam như An Giang, Tây Ninh, Sông Bé (nay là tỉnh Bình Phước), Đồng Tháp thường xuyên bị dịch LMLM do lây lan từ Campuchia sang

Năm 1990, dịch cũng xuất hiện ở 4 huyện thuộc tỉnh Thuận Hải (nay là tỉnh Ninh Thuận và Bình Thuận), làm hơn 7.500 con trâu, bò bị bệnh Dịch cũng xảy ra

ở huyện Lộc Ninh, tỉnh Sông Bé làm 100 con trâu, bò bị ốm, không cày kéo được Năm 1993, dịch đã lan rộng ra trên địa bàn 122 xã của 18 huyện thuộc 5 tỉnh, bao gồm Quảng Ninh, Hải Phòng, Hà Tĩnh, Quảng Bình và Thừa Thiên Huế

Năm 1995, bệnh LMLM đã xảy ra liên tiếp trên địa bàn 107 huyện của 26 tỉnh Điển hình như ở tỉnh Đồng Tháp, chỉ trong một thời gian rất ngắn, bệnh dịch đã lan rộng ra 10 huyện trong tổng số 11 huyện của tỉnh, làm cho 5.135 trâu,

bò và lợn bị bệnh, nhiều con bị chết

Giai đoạn từ năm 1996 - 1997, dịch xảy ra nặng một số tỉnh Duyên hải miền Trung và Tây Nguyên Năm 1998 và đầu năm 1999, dịch LMLM bùng phát tại Bình Thuận Đầu năm 1999, nguồn bệnh từ Trung Quốc theo con đường trao đổi, buôn bán gia súc xâm nhập vào Việt Nam và làm dịch phát ra ở huyện Trà Lĩnh tỉnh Cao Bằng, sau đó nhanh chóng lây lan sang các địa phương khác như Bắc Ninh, Bắc Giang, Hà Nội, Vĩnh Phúc, Hà Tây, Thừa Thiên Huế, Đà Nẵng, Quảng Nam, …

Đầu năm 2000, dịch tiếp tục lây lan mạnh Trong đợt dịch này tính đến cuối năm 2000, cả nước có 60 tỉnh thành có gia súc mắc bệnh, trừ tỉnh An Giang Năm 2001, dịch LMLM còn xảy ra và tái phát trên đàn trâu bò của 11 tỉnh, 23 huyện, 35 xã làm 2.072 con mắc bệnh (Cục Thú y, 2004)

Trước thời điểm 2001, các kết quả xét nghiệm đối với các mẫu bệnh phẩm tại Việt Nam chỉ phát hiện thấy có vi rút LMLM type O Sau đó, đã phát hiện vi rút LMLM type A trên các mẫu bệnh phẩm được lấy từ các tỉnh Quảng Ngãi, Bình Định, Bình Thuận, Ninh Thuận, Khánh Hoà, Long An, Đồng Nai và Lâm Đồng Nguyên nhân của sự xuất hiện vi rút LMLM type A có thể là do việc nhập lậu bò từ Campuchia (Cục Thú y, 2004)

Từ giữa tháng 10/2005, dịch LMLM type Asia1 đã xảy ra và lây lan cho đàn trâu, bò của 18 xã thuộc các huyện Vạn Ninh, Ninh Hòa (Khánh Hoà) và

huyện Si Ma Cai (Lào Cai) làm 1.823 con mắc bệnh (OIE, 2005) Đáng lưu ý

dịch LMLM type A có nguồn gốc từ Campuchia đã xuất hiện và lây lan ở nhiều tỉnh miền Trung và Tây Nguyên, LMLM type Asia 1 cũng đã xảy ra ở Khánh

Hòa và Lào Cai (Nguyễn Viết Không và cs., 2006)

Năm 2006 là năm dịch bùng phát và lây lan trong diện rộng với quy mô lớn, tập trung trên địa bàn các tỉnh Duyên hải miền Trung và Tây Nguyên, một số tỉnh miền núi phía Bắc, một số tỉnh thuộc Đồng bằng sông Hồng, Trung du phía Bắc và một số tỉnh phía Nam Vi rút LMLM lưu hành trong giai đoạn này chủ yếu là type O, A và Asia 1 Đến năm 2009 chỉ còn lại type O và type A được phát hiện tại Nghệ An Năm 2010, các ổ dịch bệnh LMLM đều do type O gây ra

Năm 2013 - 2015, dịch có xu hướng giảm dần về phạm vi (Cục Thú y, 2015) Trong giai đoạn 2016 - 2018, tình hình dịch bệnh LMLM được tổng hợp, phân tích chi tiết trong nghiên cứu của chúng tôi và được đề cập ở các phần sau

2.4 VI RÚT GÂY BỆNH LMLM

2.4.1 Hình thái vi rút LMLM

Vi rút LMLM thuộc giống Aphthovirus, họ Picornaviridae, có cấu trúc hình

đa diện gồm 20 mặt đều (Hình 2.1) Vi rút LMLM thuộc loại vi rút nhỏ nhất, kích thước khoảng 25 - 30 nm và có thể qua được các máy lọc Berkefeld, Chamberland, màng lọc Seizt (Bachrach, 1968) Trọng lượng phân tử của một vi rút hoàn chỉnh khoảng 6,9 KDa, 69% là protein và 31% là ARN

2.4.2 Cấu trúc vi rút LMLM

Hình 2.1 Bản đồ gien và cấu trúc của vi rút LMLM

Genome của vi rút LMLM có cấu trúc là ARN chuỗi đơn dương, bao gồm

8450 bazơ và có hệ số sa lắng là 146S, không có tính sinh kháng thể và đặc tính kháng nguyên nhưng có vai trò trong quá trình gây nhiễm (Grubman and Baxt, 2004) Vỏ capxit của vi rút có hơn 60 đơn vị hình thái (capxome) Mỗi capxome

có 4 loại protein cấu trúc giống nhau là VP1, VP2, VP3 và VP4 VP1, VP2 và

VP3 tạo nên một bề mặt của khối 20 mặt đối xứng với đường kính khoảng 23nm còn VP4 là protein ở bên trong capxit, kết dính ARN vi rút với mặt trong của

capxit (Hình 2.1) (Ayebazibwe et al., 2010)

VP1 ở ngoài cùng tham gia vào việc cố định vi rút trên tế bào, đóng vai trò quan trọng nhất trong việc gây bệnh, đồng thời là loại kháng nguyên chính tạo ra kháng thể chống lại vi rút LMLM (Bachrach, 1985) Vi rút LMLM thuộc loại không có vỏ bọc Cấu trúc của genome vi rút LMLM, với 2 đầu không mã hóa cho protein và phần giữa mang 1 khung đọc mở, bao gồm các vùng mã hóa cho

10 protein phi cấu trúc (NSP) gồm L (pro), 2A, 2B, 2C, 3A, 3B1-3, 3C (pro), và 3D (pol) và 4 protein cấu trúc

2.4.3 Các serotype của vi rút LMLM

Cho đến nay vi rút LMLM được phát hiện gồm 7 serotype (còn gọi là type) khác nhau đó là: O, A, C, SAT-1, SAT-2, SAT-3 và Asia1 (Grubman and Baxt, 2004) Các type này có tính kháng nguyên không giống nhau và giữa các type không gây miễn dịch chéo nhưng chúng gây các triệu chứng, bệnh tích ở động vật rất giống nhau Trong mỗi type lại có các type phụ (Samuel and Knowles, 2001) Đến nay đã phát hiện được trên 80 type phụ vi rút Các type phụ được ký hiệu gồm tên của type mẹ và đánh dấu theo thứ tự ngày tháng phát hiện ra chúng, ví dụ: A22, O11 Gần đây nhất, xuất hiện type phụ O từ Trung Quốc và được gọi là type phụ O thích nghi trên lợn (Hui and Leung, 2012) Type phụ này có đặc điểm là gây bệnh nặng cho lợn, đối với bò chúng thường không gây bệnh hoặc gây bệnh nhẹ hơn Hiện nay type phụ này vẫn đang lưu hành tại Trung Quốc, Đài Loan, Hồng

Kông và Việt Nam (Gleeson, 2002; Stenfeldt C et al., 2016)

Bảy serotype hiện đang lưu hành trên thế giới, do sự vận chuyển gia súc và thương mại, chúng được phân bố ở 3 châu lục và serotype mang tính địa lý, gộp nhóm theo 7 vùng được gọi là Tổ hợp vi rút gây bệnh Tổ hợp với type chỉ định trên Hình 2.2 được gộp trên cơ sở các ổ dịch xảy ra trong Tổ hợp có cùng type/type phụ Tuy nhiên, đôi khi các type phụ có thể lây truyền qua lại và xuất hiện ở Tổ hợp khác Từ những Tổ hợp này đôi khi vi rút cũng xâm nhập các nước sạch bệnh, làm dịch bùng phát và gây những thiệt hại kinh tế rất lớn Trong mỗi Tổ hợp, có những vùng dịch địa phương nhưng trên diện rộng, lây lan mạnh Ngược

lại, có vùng dịch ổn định chỉ xảy ra lẻ tẻ (Freimanis et al., 2016)

Hình 2.2 Bản đồ phân bố 7 chủng vi rút LMLM trên thế giới, giai đoạn từ

Long Thành và cs., 2006)

2.4.4 Đặc tính nuôi cấy của vi rút LMLM

Vi rút LMLM có thể được nuôi cấy: trên tổ chức da sống, như tổ chức da của thai lợn, thai bò, chuột con còn sống (giữ thai sống bằng phương pháp nhân tạo); trên các động vật thí nghiệm như: Thỏ, chuột lang, chuột nhắt đã trưởng thành (tuy nhiên vi rút thường bị biến đổi và mất đặc tính gây bệnh); trên màng niệu nang của phôi trứng (không ổn định, có khi được có khi không); trên tổ chức thượng bì lưỡi bò trưởng thành, đây là tổ chức thích hợp nhất để nuôi cấy vi rút LMLM Lưỡi bò phải được lấy ngay khi vừa mới mổ

bò, giữ lạnh ở nhiệt độ 2-3C và chỉ sử dụng được trong vòng 8 ngày Phương pháp này là phương pháp cho kết quả tốt, độc lực của vi rút vẫn cao đối với bò

và động vật thí nghiệm sau nhiều lần tiếp đời Do đó phương pháp này thường được dùng để chế vắc xin vô hoạt (Henderson and Galloway, 1953)

Ngoài các phương pháp trên, có thể nuôi cấy vi rút trên môi trường tế bào Tốt nhất là tế bào thận bê hoặc cừu non, tuyến yên của bò hoặc của lợn, hoặc các dòng tế bào mẫn cảm như tế bào BHK (Baby Hamster Kidney)

(Biswal et al., 2014) Sau khi cấy vi rút LMLM vào các môi trường tế bào nói

trên, để tủ ấm 37C trong khoảng 24-72 giờ, vi rút sẽ làm huỷ hoại tế bào nuôi Phòng thí nghiệm tham chiếu LMLM Pirbright năm 1973 đã nuôi cấy

140 chủng vi rút LMLM, khoảng 120 chủng đã sinh trưởng trong môi trường BHK21 Hiện nay môi trường này thường được sử dụng để phân lập vi rút (Botner and Belsham, 2012)

Cộng đồng chung châu Âu về phòng chống FMD chuẩn bị các thế hệ tế bào mới cho việc chẩn đoán phân lập vi rút bằng cách sử dụng tế bào chuyển gien làm tăng độ mẫn cảm với vi rút phân lập Hai cách tiếp cận được quan tâm (i) chuyển gien αvβ6 (thụ thể FMDV) và (ii) chuyển gien SV-5v làm giảm sức

kháng của tế bào, giúp vi rút nhân lên (King et al., 2004) Tế bào chuyển gien

có độ nhạy cao hơn trong phân lập vi rút và tăng sản lượng tạo kháng nguyên trong chế tạo vắc xin, như tế bào dòng thận bê mang αvβ6 integrin gien

2.4.5 Sức đề kháng của vi rút LMLM

Vi rút LMLM có sức đề kháng tương đối cao đối với ngoại cảnh (Grubman and Baxt, 2004; Nguyễn Bá Hiên và cs., 2012); ở điều kiện nhiệt độ cao, vi rút dễ

bị tiêu diệt, cụ thể: vi rút chết sau 5-15 phút ở 60 - 70C và chết ngay khi đun sôi

100C Ở nhiệt độ lạnh, vi rút tồn tại được lâu hơn: trong tủ lạnh, ở 0C vi rút sống được 425 ngày

Vi rút có thể tồn tại được khoảng 5 - 10 tuần ở những nơi thời tiết mát, đặc biệt là ở các mô bào hoặc ở các tổ chức ngoài cơ thể với điều kiện pH không thấp

hơn 6,5 và bị vô hoạt tại môi trường có pH < 2 và pH > 11 (Mason et al., 2003)

Tại chuồng của trâu, bò vi rút có thể duy trì khoảng 14 ngày, ở trong đồ phế thải của động vật được khoảng 39 ngày, trên bề mặt của phân ở mùa thu được 28 ngày và ở mùa đông được 67 ngày Vi rút có thể sống lâu hơn ở trong thức ăn, ở lông trâu, bò được 4 tuần, trong nước thải được trên 130 ngày Trong các sản phẩm của động vật, vi rút bị bất hoạt khi có sự axit hoá của sữa và thịt

Đối với ánh sáng tác động yếu: trên mặt đồng cỏ, vi rút sống ít nhất 2 tháng

về mùa đông, 3 ngày về mùa thu, vi rút còn hoạt lực 4 tuần lễ trên lông bò Trong đất ẩm, ướt vi rút có thể sống tới hàng năm

Sức đề kháng của vi rút phụ thuộc phần lớn vào chất chứa nó (Nguyễn Lương, 1997) Vi rút có sức đề kháng tương đối mạnh khi nó dính vào những chất khô hay những chất protein, ví dụ trong cỏ khô vi rút sống được 8 - 15 tuần, trong tuỷ xương dài, phủ tạng vi rút có thể sống 40 ngày Ở trong tổ chức và mô bào, vi rút có sức đề kháng mạnh cả với những chất sát trùng mà những chất này

có thể giết được vi khuẩn khác

Đối với hoá chất, chất sát trùng: do vi rút không có lớp vỏ bọc ngoài là lipit nên nó có khả năng đề kháng với các chất hữu cơ như cồn, ete… Tuy nhiên, vi rút lại mẫn cảm với axit, formol Vì vậy, có thể dùng các loại axit nhẹ để tiêu diệt

vi rút trên cơ thể con vật như: Dấm ăn, phèn chua, chanh, khế,… Nhưng để tiêu độc chuồng trại nên dùng NaOH 0,8% (Nguyễn Bá Hiên và cs., 2012) Trong thực tiễn, người ta thường dùng NaOH 0,5% để sát trùng thân thể gia súc và cho người, còn dung dịch 1% để sát trùng dụng cụ, khi dùng nên cho thêm dung dịch nước vôi 5%

2.5 MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CƠ BẢN CỦA BỆNH LMLM

2.5.1 Loài vật mắc bệnh

Trong tự nhiên, tất cả các động vật móng guốc chẵn đều mắc, trong đó loài trâu, bò mắc nhiều nhất rồi đến lợn, dê, cừu Động vật non mẫn cảm hơn động vật trưởng thành Các loài dã thú như voi, lạc đà, hươu, nai, lợn rừng, bò rừng, sơn dương, nhiều loài gặm nhấm và loài nhai lại hoang dã mẫn cảm với bệnh là nguồn bệnh trong thiên nhiên Loài vật một móng như ngựa và chim không cảm

nhiễm với bệnh (Andersen, 1981) Trâu nước (Bubalus bubalis) có thể bị nhiễm

bệnh và lây lan sang các loài khác Tại Châu Phi, trâu đóng vai trò chính trong việc mang trùng tại khu vực công viên quốc gia ở Uganda Các type vi rút LMLM gồm SAT1 và SAT2 đã được phát hiện từ các mẫu bệnh phẩm, còn các type O và SAT3 được phát hiện từ mẫu huyết thanh của đàn trâu nuôi tại công

viên này (Ayebazibwe et al., 2010)

Trong thí nghiệm tiêm vi rút cho bê mới đẻ chưa bú sữa mẹ sẽ gây bệnh và

có thể làm chết bê trong vòng 38 giờ, phủ tạng bê chứa nhiều vi rút Ngoài ra trong phòng thí nghiệm người ta có thể dùng chuột nhắt trắng, chuột xám, thỏ, chuột lang (Andersen, 1981)

có vẻ khó khăn, nặng nề, chậm chạp (DAH, 2013) Bệnh thường được mô tả rất kinh điển với các tổn thương mụn nước ở miệng, lưỡi, nước bọt, móng chân và đầu vú (Hình 2.3) Ngoài ra, có thể gặp các tổn thương đường ruột và phổi (do kế phát), ở tim (Andersen, 1981)

Các triệu chứng khác: ngoài những triệu chứng như mô tả ở trên, có trường hợp sau khi mụn nước ở miệng, móng vỡ thì con vật đi tháo trong 2 - 3 ngày, trong phân có chất nhầy và có khi lẫn máu Có trường hợp thấy mụn mọc ở những vùng da mỏng như ở âm hộ, nách, ngực, bụng, trong đùi Một số trường hợp khác ở gia súc non hoặc gia súc nuôi nhốt trong chuồng ẩm thấp, thiếu vệ

sinh, chăm sóc kém thì mầm bệnh nhiễm vào bộ máy tuần hoàn, vào tim và gây suy tim Cũng có khi bệnh nhiễm vào bộ máy tiêu hóa, hô hấp làm con vật viêm ruột, viêm phổi

Hình 2.3 Triệu chứng, bệnh tích của bệnh LMLM ở trâu, bò

Triệu chứng ở lợn

Thời gian nung bệnh trung bình từ 2 - 12 ngày Lợn sốt cao 40 - 410C, ủ rũ, kém ăn, chảy nhiều nước bọt màu trắng Mụn mọc ở quanh mũi, sống mũi, niêm mạc miệng, lưỡi, đầu vú hay quanh bầu vú, kẽ móng, vành móng Lợn đi lại khó khăn, khập khiễng, hoặc không muốn di chuyển, di chuyển bằng đầu gối, hay nằm Sau vài ngày mụn vỡ tạo thành các vết loét, kẽ móng nứt, có khi long mất móng, da đỏ loét Ở đầu vú lợn nái đang nuôi con cũng có mụn nước Lợn con đang bú và lợn con cai sữa có hiện tượng ỉa chảy gầy yếu hoặc chết đột ngột, lợn choai một số ít có mụn nước còn hiện tượng loét kẽ móng thường xuyên xảy ra (Grubman and Baxt, 2004; Botner and Belsham, 2012; DAH, 2013) Triệu chứng lâm sàng bệnh LMLM trên lợn khó phân biệt với các bệnh mụn nước khác như: Viêm miệng mụn nước, ngoại ban có mụn nước

2.5.2.2 Bệnh tích

- Ở tim: màng bao tim xuất huyết từng điểm có khi từng đám, vùng tổn thương nhỏ, từng ổ xám, kích thước không đều, nó làm cơ tim có sọc vằn (gọi là tim rằn ri, da hổ) do mắc bệnh nhiều lần Xét nghiệm vi thể cơ tim bị thoái hoá

và hoại tử cùng với sự xâm nhập lan tràn lymphô bào và đôi khi cả bạch cầu trung tính Tổn thương ở cơ tim không phải là một đặc trưng của nhiễm vi rút LMLM và là nguyên nhân dẫn đến tử vong của gia súc non (DAH, 2013)

Các bệnh tích cơ tim tương tự ở chuột con đang bú được gây nhiễm thực nghiệm với vi rút LMLM nhưng trầm trọng hơn (Andersen, 1981) Ở đường hô hấp: viêm khí quản, phế quản, màng phổi và phổi; ở lách: sưng đen

- Ở cơ vân: các biến đổi ở cơ vân giống như biến đổi ở cơ tim Những vùng

bị hoại tử có ranh giới rõ Về đại thể có các ổ màu xám có kích thước khác nhau

Về vi thể có các bó cơ bị hoại tử và có sự xâm nhập bạch cầu

2.5.3 Cơ chế sinh bệnh

Thời kỳ nung bệnh phụ thuộc vào loài động vật, số lượng vi rút, đường xâm nhập và type vi rút, trong một số trường hợp có thể kéo dài 2 - 10 ngày (Donaldson, 1988) Vi rút LMLM có tính hướng thượng bì, nhân lên ở nơi nhiễm, đi vào máu và các cơ quan phủ tạng Khi vi rút vào máu sẽ gây sốt, mụn nước thứ phát thường thấy ở niêm mạc xoang miệng, vành móng, kẽ móng, núm

vú bò sữa, mõm lợn Mụn vỡ, tổn thương thượng bì được lấp đầy, không để lại sẹo Mụn nước chỉ loét khi nhiễm khuẩn kế phát Con vật có thể suy yếu và chết Nhìn chung, quá trình sinh bệnh LMLM gồm ba giai đoạn, gồm: (i) Giai đoạn vi rút nhân lên ở những điểm “cửa vào”, trước khi xuất hiện trong máu; (ii) giai đoạn vi rút xuất hiện trong máu, ở các mô đích có các mụn nước (do nhiễm

vi rút thứ cấp); (iii) giai đoạn hồi phục và lành bệnh (hoặc lành bệnh mang trùng)

(Arzt J et al., 2011)

Sau khi xâm nhiễm vào bò, bê, vi rút LMLM trước hết nhân lên ở mô mũi - hầu, tại vách tế bào biểu mô lympho ở hạch hạnh nhân Đây là những tế bào sản sinh keratin nội bào trong khi đó những tế bào tầng dưới (nội biểu mô) và tế bào võng lưới nội mô (mang 2 phân tử đánh dấu MHCII/CD11c, thường là tế bào trình diện kháng nguyên) vẫn không nhiễm vi rút Khi vi rút xuất hiện trong máu, chúng cũng

đồng thời tăng lên ở mô phổi nhưng giảm ở mô mũi - hầu (Arzt J et al., 2010)

Quá trình bệnh lý tế bào tại các mô cảm thụ liên quan đến tương tác của vi rút và tế bào cảm thụ, tùy thuộc vào (i) độc lực và đường gây nhiễm hay tế bào cảm thụ mang sẵn thụ thể (integrin αVβ6) để nhận biết vi rút, (ii) sự cân bằng giữa vi rút nhân lên và đáp ứng miễn dịch bẩm sinh của tế bào với sự sản sinh

IFN type 1 (Zhu et al., 2013), type 3 và lượng lớn interferon trong huyết thanh (Arzt J et al., 2014), và cuối cùng là (iii) sự tiêu diệt tế bào nhiễm vi rút của

động vật chủ với sự tham gia của thụ thể “tín hiệu diệt” dẫn truyền đến mô cảm thụ và sự tăng thải tiết interferon ngoại bào, gây tăng tín hiệu kích thích sản sinh

IL-1 (Zhu et al., 2013) Tại mô nhân lên đầu tiên, tùy tương tác của vi rút với tế

bào chủ mà một bộ phận thuộc vùng tăng sinh biệt hóa của hạch lympho có thể

thiết lập tình trạng mang trùng lâu dài (Robinson L et al., 2016)

Trong đa số các trường hợp bệnh ở cừu là ẩn tính, tuy nhiên vi rút LMLM type O Myanmar98 có độc lực cao với cừu và cho kết quả gây nhiễm ổn định ở cừu, gây nhiễm bằng 1 trong 4 cách (i) qua đường bờ lợi móng (ii) tiếp xúc tự nhiên với cừu bệnh (iii) nhỏ mũi hầu và (iv) khí dung mũi hầu đều có thể gây bệnh LMLM Sau khi xâm nhiễm vi rút LMLM cũng chọn điểm nhân lên đầu tiên là khu vực hầu họng Phương pháp sát bờ lợi móng và nhỏ mũi - hầu gây biểu hiện triệu chứng sớm hơn so với 2 phương pháp khí dung và tiếp xúc tự nhiên, có thể dùng trong đánh giá hiệu lực vắc xin, thử thách cường độc ở cừu

thay cho phương pháp tiếp xúc tự nhiên (Stenfeldt C et al., 2015)

Ở lợn, cơ chế sinh bệnh, miễn dịch có những điểm khác ở bò, dẫn đến những

hệ lụy rất lớn khi dịch xảy ra ở vùng nuôi có mật độ cao Bệnh LMLM ở lợn thường diễn biến cấp tính ở với tỷ lệ chết rất cao Ngoài những triệu chứng đặc thù, các trường hợp bệnh á cấp tính thường có dấu hiệu viêm cơ tim, giảm tăng

trọng và sốt mạn tính (Arzt J et al., 2011) Lợn mẫn cảm với vi rút LMLM hơn bò

khi gây nhiễm bằng đường hô hấp trên Về đường xâm nhập, lợn nhiễm vi rút qua đường trong miệng-hầu, đôi khi qua đường trong mũi-hầu Sau khi xâm nhập, vi rút nhân lên đầu tiên ở khu vực miệng-hầu, đặc biệt tại hạch hạnh nhân (Stenfeldt

C et al., 2014b) Sau khi xâm nhiễm 6 đến 12 giờ có thể tìm thấy vi rút nhân lên ở

dây thanh quản và hạch hạnh nhân, một phân dòng tế bào biểu mô hạch lympho hầu họng lợn, đồng thời, vi rút còn nhân lên ở tế bào biểu mô tế bào biểu mô sừng (CD172a+) vòm khẩu cái, tạo ra một lượng lớn vi rút thải vào môi trường Sau 18 -

24 giờ vi rút xuất hiện trong máu, khoảng 24 giờ sau, mụn nước hình thành

(Stenfeldt C et al., 2014a; Stenfeldt C et al., 2016) Lợn có đáp ứng miễn dịch

interferon và kháng thể loại trừ vi rút ra khỏi cơ thể Vi rút thường lây lan nhanh trong đàn nhưng chỉ cần cách ly lợn là ngăn cản được sự truyền lây Khác với trâu,

bò, lợn không có tình trạng miễn dịch mang trùng (Stenfeldt C et al., 2016)

2.5.4 Phương thức truyền lây

Vi rút gây bệnh LMLM có thể lây truyền trực tiếp giữa con mắc bệnh và con khoẻ khi nhốt chung hoặc chăn thả chung trên đồng cỏ Vi rút từ nước bọt, dịch mụn nước, các chất bài xuất, bài tiết của con vật mắc bệnh xâm nhập vào con khoẻ Bệnh cũng có thể truyền lây gián tiếp thông qua thức ăn, nước uống,

máng ăn, máng uống, nền chuồng, dụng cụ chăn nuôi, tay chân, quần áo người chăn nuôi bị nhiễm vi rút Bệnh LMLM được coi là bệnh điển hình do con người làm lây lan Tại các nước Châu Âu, với phương tiện hiện đại, công nhân có thể mang mầm bệnh đi rất xa do quần áo của mình (Lubroth J and Brown, 1995) Lịch sử cũng đã ghi nhận ổ dịch đã xảy ra sau chuyến đi kiểm tra của các bác sĩ

thú y (Donaldson and Kitching, 1989; Gurhan et al., 1991)

Chó, mèo, gà, chim muông, hoang thú, côn trùng không mắc bệnh nhưng

có thể truyền bệnh theo con đường cơ học từ nơi này đến nơi khác Những con vật đã khỏi bệnh nhưng vẫn mang vi rút trong móng chân, máu, nước tiểu là nguồn gốc gây ra các ổ dịch mới Gió cũng là một yếu tố quan trọng trong việc làm lây lan bệnh qua không khí Vi rút từ con vật mang bệnh có thể được gió

chuyển xa tới 250 km (Sorensen et al., 2001)

Loài nhiễm bệnh có thể có những ảnh hưởng đáng kể đến sự lây lan Ví dụ một con lợn có khả năng thải tiết ra môi trường 400 triệu đơn vị lây nhiễm vi rút trong một ngày Loài nhai lại bài tiết 120.000 đơn vị lây nhiễm trong một ngày (Donaldson, 1988)

Một đặc điểm quan trọng là vi rút LMLM thường được bài xuất ra ngoài trước khi con vật có biểu hiện bệnh Phòng thí nghiệm tham chiếu LMLM quốc

tế Pirbright đã chứng minh với type O, lợn bài xuất vi rút trước khi có dấu hiệu lâm sàng đầu tiên là 10 ngày, bò và cừu là 5 ngày, trung bình là 2,5 ngày

(Sorensen et al., 2001)

Vi rút LMLM có thể lây truyền qua đường cấy chuyển phôi nhưng nguy cơ

là rất thấp (1/16.000/năm) (Asseged et al., 2012) Côn trùng này dường như không có khả năng truyền bệnh (Van Vuuren et al., 1993)

Bê bị nhiễm vi rút LMLM thải vi rút qua dịch miệng, hơi thở, nước tiểu, phân làm ô nhiễm môi trường Nhốt gia súc cảm thụ vào môi trường đã ô nhiễm trước đó 3 - 6 ngày, có đến 44% gia súc cảm thụ bị nhiễm vi rút LMLM và phát bệnh Kết quả này cảnh báo vệ sinh môi trường là một khâu quan trọng trong

phòng chống LMLM (Bravo de Rueda et al., 2015)

2.5.5 Đường xâm nhập

Trong tự nhiên, vi rút xâm nhập qua đường tiêu hoá là chủ yếu Vi rút vào

cơ thể qua niêm mạc miệng, ngoài ra vi rút LMLM có thể xâm nhập vào cơ thể qua các vết thương trên da, nhất là da ở vú Đường hô hấp và sinh dục cũng có

thể là đường xâm nhập của vi rút nhưng ít, tuy nhiên, đường xâm nhập chính lại

là đường hô hấp (Grubman and Baxt, 2004) Bò là loại mẫn cảm qua đường hô hấp, chỉ cần 20 TCID50 là có thể nhiễm bệnh nhưng qua đường tiêu hóa thì lượng

Động vật (kể cả hoang dã, gia súc, ngoại trừ lợn) mắc bệnh sau khi hồi phục thường mang trùng (50% bò, cừu, dê mang trùng) (Anni McLeod và cs., 2013) Các tiểu gia súc giữ vai trò quan trọng trong việc mang trùng Cừu có thể mang trùng (ở vùng hầu) tới 05 tháng và duy trì sự nhân vi rút ở mức độ thấp (Salt, 1993) Trước đây người ta cho rằng lợn nhà không phải là loài vật mang trùng, tuy nhiên sau 35 - 60 ngày, vẫn phát hiện RNA và protein vi rút ở hạch/dịch lâm

ba (Stenfeldt C et al., 2016) Không thể phân lập được vi rút có khả năng gây

nhiễm từ lợn; vi rút tồn tại ở vùng tăng sinh của hạch lâm ba nhưng không nhân lên Bằng thực nghiệm, người ta đã phục hồi vi rút và truyền bệnh qua động vật thí nghiệm (các mô bào từ 3 - 7 tuần; mũi, họng, tuyến vị khoảng 6 tháng)

Vai trò mang trùng của động vật nhai lại trong việc lây lan nguồn bệnh vẫn còn là vấn đề tranh cãi Chỉ có trâu Châu Phi là mắt xích dịch tễ “nguồn dịch thiên nhiên” duy nhất được biết đến, tàng trữ các vi rút SAT 1, SAT 2 và SAT 3, truyền lây cho trâu, bò nuôi tại lục địa này (Bachrach, 1968) Động vật bị stress

do vận chuyển và được nhốt chung với bò mang trùng cũng sẽ là nguyên nhân gây ra ổ dịch mới do tiếp xúc với vi rút đào thải ra môi trường (Salt, 1993)

Trâu, bò được tiêm vắc xin thải tiết vi rút ít hơn và trong thời gian ngắn hơn

so với trâu, bò không được tiêm vắc xin và không phụ thuộc vào tình trạng chúng

có trở thành mang trùng hay không Trình tự nucleotit genome của vi rút được

bảo tồn khi ở tình trạng mang trùng (Parthiban et al., 2015)

Thời gian mang trùng khác nhau tùy theo các loài nhiễm bệnh, chủng vi rút và tình trạng miễn dịch: 3,5 năm trên bò và tới 5 năm ở trâu Châu Phi (Moonen P and Schrijver, 2000) Ở trâu, bò tơ, vi rút LMLM các type O, A và SAT2 được tàng trữ ở vòm trên của mũi hầu họng trong 80,89% trường hợp và 71,43% ở vòm khẩu cái, ít thấy vi rút khu trú ở dịch thanh quản, hầu và hạch lympho dọc hầu họng Một phần vi rút được tái sinh ở tế bào biểu mô vùng hỗn hợp lympho-niêm mạc Ở những tế bào (tổ chức) mang vi rút, giảm sinh tổng

hợp 14 loại cytokine (Pacheco et al., 2015) Tế bào võng lưới nội mô, nơi mà tế bào B cũng được tạo thành là nơi dự trữ kháng nguyên (Heesters et al., 2013)

2.6 CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN BỆNH

2.6.1 Chẩn đoán lâm sàng

Chẩn đoán lâm sàng bệnh LMLM có thể thực hiện khi bệnh xảy ra tại khu vực đã được xác định là có dịch bệnh LMLM (Salt, 1993; Botner and Belsham, 2012) Hoặc căn cứ các đặc điểm dịch tễ như: Bệnh đại lưu hành, tốc độ lây lan nhanh, tỷ lệ mắc cao, tỷ lệ chết thấp, động vật móng guốc chẵn đều mắc bệnh Các biểu hiện thường gặp là con vật sốt cao, chảy nước bọt nhiều, có biểu hiện què, có các mụn nước ở niêm mạc miệng, lợi, chân răng, lưỡi, kẽ móng, gờ móng, ở vú Những gia súc mới khỏi bệnh thì trên niêm mạc miệng, lợi, chân răng, lưỡi, kẽ móng, có các vết sẹo Đối với lợn da trắng, có thể xuất hiện các vệt đen trên móng chân màu trắng, thông thường lợn mắc bệnh dễ bị tụt móng chân hơn bò Tuy nhiên, việc chẩn đoán lâm sàng thường bị nhầm với các bệnh khác như: Viêm miệng mụn nước, bệnh mụn nước ở lợn, bệnh dịch tả trâu bò, bệnh tiêu chảy do vi rút của bò Khi trâu bò mắc bệnh, chẩn đoán thông qua triệu chứng lâm sàng là tương đối chính xác, ở lợn thì cần phải chẩn đoán phân biệt với các bệnh mụn nước (Donaldson and Kitching, 1989)

2.6.2 Chẩn đoán vi rút học

Huyễn dịch bệnh phẩm cần chẩn đoán phải được ly tâm trước khi cấy vào tế

bào nuôi hoặc tiêm cho động vật thí nghiệm Phương pháp thường sử dụng hiện nay là nuôi cấy vi rút trên môi trường tế bào Các tế bào nhạy cảm với vi rút LMLM bao gồm tế bào tuyến giáp trạng sơ cấp của bò, tế bào thận sơ cấp của cừu, bê hoặc lợn, các tế bào dòng, như tế bào BHK Nếu bệnh phẩm có vi rút LMLM, sau khi gây nhiễm 24 giờ sẽ thấy bệnh tích tế bào

Ngoài ra, có thể tiêm huyễn dịch bệnh phẩm cần chẩn đoán vào nội bì lưỡi

bò hoặc da gan bàn chân chuột lang, chuột nhắt trắng 2 - 7 ngày tuổi và bôi huyễn dịch bệnh phẩm vào Nếu bệnh phẩm có chứa vi rút LMLM thì sau 12 - 48 giờ, xuất hiện mụn nước hoặc mụn nhỏ màu đỏ ở chỗ tiêm hoặc bôi bệnh phẩm

2.6.3 Chẩn đoán huyết thanh học

2.6.3.1 Phản ứng trung hoà vi rút

Phản ứng trung hòa vi rút hiện nay được coi là “tiêu chuẩn vàng” để phát hiện kháng thể đến protein cấu trúc của vi rút LMLM và cũng là xét nghiệm bắt buộc đối với chứng nhận xuất nhập khẩu của động vật và sản phẩm động vật (OIE, 2019) Phản ứng này dùng chẩn đoán trong các trường hợp bị bệnh nhẹ, không điển hình, phải lấy máu chắt huyết thanh để tìm kháng thể Phản ứng trung hòa có tính đặc hiệu cao, nhạy và nhanh chóng

Phản ứng trung hoà vi rút thực hiện trên môi trường tế bào IB-RS2,

BHK-21, tế bào thận lợn hoặc thận cừu được nuôi trong các đĩa nhựa giếng nhỏ đáy bằng Để xác định type gây bệnh, cho huyết thanh của gia súc nghi mắc bệnh vào

7 ống nghiệm, sau đó cho vào mỗi ống nghiệm từng type vi rút LMLM đã biết với hiệu giá vi rút đã được xác định là 100 TCID50 (50% Tissue Culture Infectious Dose) một lượng tương đương với huyết thanh nghi, rồi cho vào tủ ấm

37oC trong khoảng 1 giờ để kháng nguyên và kháng thể tác động với nhau Sau

đó dùng hỗn dịch của từng ống nghiệm cấy vào các dãy giếng nhựa đã nuôi cấy

tế bào, đồng thời các giếng đối chứng âm không cấy hỗn dịch mà để tế bào tiếp tục phát triển và các giếng đối chứng dương cấy các type vi rút LMLM tiếp tục

để tủ ấm 37C trong vòng 2 - 3 ngày

2.6.3.2 Phản ứng ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)

ELISA là một phản ứng dùng để chẩn đoán nhanh bệnh LMLM và để giám định type huyết thanh của vi rút Phản ứng này được sử dụng thay thế phản ứng kết hợp bổ thể (CFT) vì nó có độ đặc hiệu và độ nhạy cao hơn, không bị ảnh

hưởng của các yếu tố tăng cường hoặc ức chế bổ thể (Nguyễn Đăng Khải và cs.,

2000) Phản ứng này được xác nhận có độ nhạy gấp 125 lần so với phản ứng CFT và có độ đặc hiệu cao khi dùng với một kháng thể đơn dòng, phản ứng cũng

có độ nhạy cao trong chẩn đoán và định type vi rút Tuy nhiên, ELISA cho kết quả dương tính khoảng 70 - 80% đối với mẫu biểu mô của gia súc nghi mắc bệnh

do thiếu độ nhạy Do vậy, vi rút cần được nhân lên trong môi trường tế bào và sau đó xét nghiệm bằng ELISA để phát hiện vi rút và xác định chắc chắn type

huyết thanh (Hamblin et al., 1987)

Phản ứng 3ABC-ELISA

Hiện nay, trong xét nghiệm chẩn đoán thường sử dụng phản ứng ELISA để chẩn đoán phân biệt huyết thanh dương tính là do nhiễm vi rút thực địa hay do vắc xin Cơ sở khoa học của phương pháp này là khi vi rút LMLM nhiễm vào cơ thể gia súc, quá trình nhân lên của vi rút sẽ diễn ra Trong quá trình nhân lên của vi rút trong tế bào gây nhiễm tạo ra 2 loại protein, loại protein sớm được tổng hợp trước, đó là các enzym dùng trong quá trình sinh tổng hợp như ARN polymeraza, protein ức chế… loại protein này không tham gia vào cấu trúc của hạt

3ABC-vi rút nên gọi là protein phi cấu trúc (non-structure protein) Loại protein thứ 2 được sinh ra muộn hơn nó chính là các đơn vị cấu trúc để tạo nên các capxom và hình thành capxit vi rút, nên được gọi là protein cấu trúc (structure protein)

Trong các protein phi cấu trúc của vi rút LMLM thì kháng nguyên 3ABC

có tính kháng nguyên rất cao, nó kích thích cơ thể gia súc tạo ra kháng thể đặc hiệu với số lượng lớn và tồn tại nhiều tháng trong huyết thanh trâu bò bị nhiễm

Do đó, việc phát hiện kháng thể đặc hiệu 3ABC cho phép kết luận gia súc đã bị nhiễm vi rút LMLM Đây là phản ứng có độ đặc hiệu và độ nhạy cao để nhận diện kháng huyết thanh dương tính

Tuy nhiên, trong các loại vắc xin vô hoạt LMLM của các hãng Intervet (Hà Lan) và Merial (Pháp) những kháng nguyên phi cấu trúc đã được loại bỏ (gọi là vắc xin tinh khiết) Sau khi tiêm cho gia súc chỉ kích thích cơ thể sản sinh ra kháng thể chống lại kháng nguyên cấu trúc (hạt vi rút) chứ không có kháng thể chống lại kháng nguyên phi cấu trúc 3ABC

Một số loại vắc xin khác (ví dụ: vắc xin đơn giá type O và hai type O-Asia1 của Trung Quốc) là vắc xin không tinh khiết, do đó, dùng phản ứng 3ABC ELISA sẽ không xác định chắc chắn gia súc nhiễm vi rút LMLM thực địa hay do tiêm vắc xin không tinh khiết Việc kết luận gia súc mắc bệnh hay do tiêm vắc

xin phải kết hợp với xét nghiệm bằng phản ứng trung hòa vi rút và điều tra lịch

sử tiêm phòng vắc xin (Tô Long Thành, 2000)

Phản ứng LPB-ELISA (Liquid Phase Blocking-ELISA)

Phản ứng LPB-ELISA được dùng để phát hiện kháng thể Đây là một phản ứng nhanh, nhạy và đặc hiệu có thể cho kết quả trong vòng 24 giờ Phản ứng này có thể định tính và định lượng kháng thể của gia súc bị nhiễm bệnh tự nhiên hay tiêm phòng vắc xin LMLM So với phản ứng trung hòa thì phản ứng LPB-ELISA có nhiều ưu điểm hơn và được áp dụng nhiều hơn, thay thế cho phản ứng trung hòa

2.6.4 Chẩn đoán bằng kỹ thuật RT-PCR

Phương pháp RT-PCR được coi là công cụ hữu hiệu trong chẩn đoán xác định sự có mặt của RNA vi rút LMLM trong các mẫu biểu mô, sữa và huyết thanh với tính năng vượt trội như nhanh, nhạy và chính xác trong chẩn đoán Trong những năm gần đây có nhiều phương pháp RT-PCR đã được xây dựng để phát hiện sớm RNA của vi rút LMLM trong biểu mô, tế bào phân lập và tế bào

khác bằng áp dụng cặp mồi phổ thông cho 07 type huyết thanh (Meyer et al.,

1991) So sánh kỹ thuật chẩn đoán bệnh LMLM tại WRL cho biết dương tính PCR có 70 - 80% mẫu bệnh phẩm có kết quả dương tính bằng kỹ thuật ELISA (Ferris and Dawson, 1988) và 20 - 30% mẫu dương tính sau khi nuôi cấy trên tế bào Để phát hiện gia súc nhiễm bệnh, đồng thời xác định type vi rút gây bệnh LMLM trên thực địa, kỹ thuật RT-PCR nhanh, chính xác thường được dùng bổ

RT-sung hoặc thay thế cho phương pháp huyết thanh học (Domingo et al., 2002; Clavijo et al., 2004) Gần đây, phương pháp Real time RT-PCR (rRT-PCR) đã

được xậy dựng dùng để xác định DNA của vi rút mà không yêu cầu các trình tự như PCR (như phân tích gien) và các chỉ số được ghi nhận trực tiếp như DNA đích thì được nhân lên Ngoài ra, rRT-PCR còn có ưu thế khác bao gồm khả năng định

lượng vật liệu di truyền trong mẫu ban đầu (Reid et al., 2002; Reid et al., 2003)

2.7 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU DỊCH TỄ HỌC

2.7.1 Nghiên cứu cắt ngang (Cross-sectional study)

Khái niệm: Nghiên cứu cắt ngang là loại hình nghiên cứu được tiến hành

tại một thời điểm Trong nghiên cứu cắt ngang, việc lựa chọn các mẫu trong một quần thể được tiến hành tại một khoảng thời gian ngắn Các cá thể được lựa chọn

để kiểm tra tình trạng bệnh với mối liên quan đến sự xuất hiện hoặc không xuất

hiện của yếu tố phơi nhiễm nhất định Nghiên cứu cắt ngang thường bao gồm các cuộc điều tra để thu thập số liệu Các cuộc điều tra có thể được tiến hành một cách đơn giản (một bảng câu hỏi ngắn gọn thu thập một vài biến số đơn giản) hoặc phức tạp (thiết kế nghiên cứu với nhiều thông tin cần thu thập)

Hình 2.4 Sơ đồ mô tả nghiên cứu cắt ngang

Nguồn: Stevenson (2013)

Ưu điểm: Dễ tiến hành nhanh chóng, dễ thực hiện và chi phí thấp hơn so

với các loại hình nghiên cứu khác vì không cần phải theo dõi các chủ thể nghiên cứu trong thời gian dài

Nhược điểm: Nghiên cứu cắt ngang không thể cung cấp thông tin về tỷ lệ mới mắc bệnh trong một quần thể mà chỉ có thể ước tính được tỷ lệ lưu hành Loại hình nghiên cứu này không phù hợp đối với các loại dịch bệnh xảy ra trong thời gian ngắn Kết quả thu được từ loại hình nghiên cứu này cũng không xác định rõ ràng được mối quan hệ nhân - quả do khó khăn trong việc xác định yếu tố phơi nhiễm xuất hiện trước đầu ra hay ngược lại

2.7.2 Nghiên cứu thuần tập (Cohort study)

Khái niệm: Nghiên cứu thuần tập được sử dụng nhằm so sánh tỷ lệ mới

mắc theo thời gian giữa các nhóm động vật có sự phơi nhiễm khác nhau với một yếu tố nguy cơ Nghiên cứu thuần tập có thể là nghiên cứu hồi cứu hoặc nghiên cứu tịnh tiến

Nghiên cứu tịnh tiến bắt đầu với việc lựa chọn hai nhóm động vật không bị bệnh, một nhóm có phơi nhiễm với yếu tố được cho là có thể gây bệnh và một nhóm không phơi nhiễm Hai nhóm động vật được theo dõi theo thời gian và mọi

sự thay đổi tình trạng bệnh của chúng đều được ghi chép trong khoảng thời gian nghiên cứu

Nghiên cứu hồi cứu bắt đầu khi tất cả các ca bệnh đã được xác định Lịch

sử của mỗi chủ thể tham gia nghiên cứu được xem xét cẩn thận nhằm phát hiện bằng chứng phơi nhiễm đối với tác nhân được điều tra

Hình 2.5 Sơ đồ mô tả nghiên cứu thuần tập hồi cứu và tịnh tiến

Nguồn: Stevenson (2013)

Ưu điểm: Do các chủ thể tham gia nghiên cứu được quan sát theo thời gian

về tình trạng bệnh nên nghiên cứu thuần tập có thể cung cấp thông số về tỷ lệ mới mắc của bệnh trong nhóm phơi nhiễm và nhóm không phơi nhiễm

Ở loại hình thiết kế nghiên cứu này, tình trạng phơi nhiễm được ghi nhận trước khi xuất hiện bệnh Vì vậy trong phần lớn các trường hợp sẽ thu được thông tin rõ ràng về việc có phơi nhiễm trước khi bị bệnh hay không

Nghiên cứu thuần tập rất phù hợp đối với việc nghiên cứu các trường hợp phơi nhiễm hiếm gặp do số lượng chủ thể phơi nhiễm và không phơi nhiễm là tương đương; hơn nữa, trong nghiên cứu không nhất thiết phản ánh tỷ lệ lưu hành thực của sự phơi nhiễm trong toàn bộ quần thể động vật

Nhược điểm: Nghiên cứu tịnh tiến yêu cầu thời gian theo dõi dài Trong

trường hợp các dịch bệnh hiếm gặp sẽ cần số lượng lớn đối tượng tham gia nghiên cứu Các chủ thể tham gia gián đoạn hoặc không tiếp tục tham gia quá trình nghiên cứu cũng là một trở ngại đối với loại hình nghiên cứu theo thời gian này Nghiên cứu thuần tập thường yêu cầu nguồn kinh phí lớn

PHẦN 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU

Ở các địa phương báo cáo bệnh LMLM trên phạm vi cả nước trong 03 năm

từ 2016 - 2018 và một số địa phương tiêm phòng vắc xin LMLM phòng bệnh cho gia súc năm 2018

Các hoạt động nghiên cứu trong phòng thí nghiệm được thực hiện tại các phòng thí nghiệm của các đơn vị thuộc Cục Thú y, trong đó Phòng thí nghiệm thuộc Cơ quan Thú y vùng VI được phân công là phòng thí nghiệm chủ đạo quốc gia; sau đó các mẫu vi rút LMLM được gửi và phân tích tại Phòng thí nghiệm tham chiếu của FAO và OIE tại Pirbright, Anh và Senasa, Argentina

3.2 THỜI GIAN NGHIÊN CỨU

Đề tài nghiên cứu được tiến hành từ tháng 12/2018 đến tháng 09/2019

3.3 ĐỐI TƯỢNG VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

3.3.1 Đối tượng nghiên cứu

- Các ổ dịch và loài gia súc mắc bệnh LMLM tại các địa phương trong thời gian từ 2016 - 2018

- Các chủng vi rút LMLM phân lập được tại các địa phương trong phạm vi

cả nước trong giai đoạn 2016 - 2018

- Gia súc (trâu, bò) được tiêm phòng vắc xin LMLM trong năm 2018 tại một số địa phương

3.3.2 Vật liệu nghiên cứu

- Số liệu dịch bệnh LMLM chi tiết đến cấp xã do Chi cục Thú y/Chăn nuôi

và Thú y các tỉnh, thành phố báo cáo Cục Thú y từ năm 2016 - 2018

- Kết quả xét nghiệm, xác định serotype và topotype LMLM do các Chi cục Thú y vùng tổng hợp và báo Cục Thú y từ năm 2016 - 2018

- Dữ liệu địa lý và phần mềm vẽ bản đồ dịch tễ, phân tích thống kê R và các gói phân tích tương ứng như epiR (Stevenson, 2012a) và Spatstat (Baddeley and Turner, 2005)

3.4 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

- Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ học của bệnh LMLM ở Việt Nam giai đoạn từ năm 2016 - 2018

- Nghiên cứu đặc điểm dịch tễ học phân tử của vi rút LMLM lưu hành ở Việt Nam giai đoạn từ năm 2016 - 2018

- Đánh giá đáp ứng miễn dịch sau tiêm phòng vắc xin LMLM của trâu, bò tại một số tỉnh trong năm 2018

3.5 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.5.1 Phương pháp dịch tễ học hồi cứu (retrospective cohort study)

Phương pháp phân tích theo đối tượng mắc bệnh

Tỷ lệ các loài gia súc (trâu, bò, lợn, dê, cừu) mắc bệnh trong tổng số gia súc mắc bệnh LMLM được tổng hợp cho mỗi tỉnh nghiên cứu Tương tự, tỷ lệ các loài gia súc bị chết trong các ổ dịch bệnh LMLM

Phương pháp phân tích dịch bệnh theo thời gian

- Phương pháp xây dựng biểu đồ dịch tễ: tổng số ổ dịch (xã có gia súc mắc bệnh, chết vì LMLM) được đếm cho mỗi ngày xuất hiện ca bệnh đầu tiên của ổ dịch và thể hiện ở dạng biểu đồ dịch tễ

- Tỷ số lây lan ước tính (Estimated Dissemination Ratio, EDR): là số ổ dịch bệnh LMLM đếm được cho một giai đoạn (ví dụ: 05 ngày tương ứng với khoảng thời gian ủ bệnh trung bình của bệnh LMLM) chia cho số ổ dịch đếm được trong một khoảng thời gian tương tự (05 ngày), nhưng liền kề trước đó Ví dụ: số ổ dịch đếm được từ ngày 11-15/1/2016 (05 ngày) là 17, chia cho số ổ dịch đếm được trong khoảng thời gian tương tự, liền kề trước đó từ 06-10/1/2016 (05 ngày)

là 3 Như vậy, chỉ số EDR = 17/3 > 1 cho thấy dịch có chiều hướng lây lan mạnh Ngược lại nếu chỉ số EDR <1 cho thấy dịch có chiều hướng giảm dần EDR = 1 cho thấy dịch ổn định (không tăng, không giảm)

Phương pháp phân tích dịch bệnh theo không gian

- Nguy cơ mới mắc (Incidence Risk): là số xã có dịch bệnh LMLM/tổng số

xã có nguy cơ của mỗi tỉnh cho mỗi năm và cho cả giai đoạn 2016 - 2018

- Tọa độ địa lý X và Y được ghi chép cho từng ổ dịch bệnh LMLM (xã có dịch bệnh LMLM) Do các ổ dịch bệnh LMLM thường xảy ra với số lượng lớn