Nghiên cứu đặc tính sinh học của canine parvovirus phân lập được ở phía bắc việt nam luận văn thạc sĩ nông nghiệp

Ngành: Thú y Mã số: 8640101 Tên cơ sở đào tạo: Học Viện Nông nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu Phân lập được các chủng Parvovirus gây bệnh cho chó tại một số tỉnh phía Bắc trên môi

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

KHAM NING BUN PHA XAY

NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA CANINE

PARVOVIRUS PHÂN LẬP ĐƯỢC Ở

PHÍA BẮC VIỆT NAM

Ngành: Thú y

Mã số: 8640101

Người hướng dẫn khoa học: GS.TS Nguyễn Thị Lan

NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP - 2019

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan.Tôi xin cam đoan rằng mọi

sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cảm ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn này đều được chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày tháng năm 2019

Tác giả luận văn

Kham Ning Bun Pha Xay

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn, tôi đã nhận được sự hướng dẫn, sự giúp đỡ, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo Học viện Nông Nghiệp Việt Nam, sự động viên của bạn bè, đồng nghiệp và gia đình Nhân dịp hoàn thành luận văn, cho phép tôi đươc bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc GS.TS Nguyễn Thị Lan đã tận tình hướng dẫn, và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới các thầy cô giáo Khoa Thú Y, Bộ môn Bệnh lý thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo, cán bộ viên chức Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ sinh học Thú y đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong quá trình thực hiện đề tài

Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tôi hoàn thành luận văn./

Hà Nội, ngày tháng năm 2019

Tác giả luận văn

Kham Ning Bun Pha Xay

MỤC LỤC

Lời cam đoan i

Lời cảm ơn ii

Mục lục iii

Danh mục chữ viết tắt vi

Danh mục bảng vii

Danh mục hình viii

Danh mục biểu đồ ix

Trích yếu luận văn x

Thesis abstract xii

Phần 1 Mở Ðầu 1

1.1 Tính cấp thiết của Ðề tài 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu của Ðề tài 2

1.2.1 Mục tiêu chung 2

1.2.2 Mục tiêu cụ thể 2

1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của Ðề tài 2

1.3.1 Ý nghĩa khoa học 2

1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn 2

Phần 2 Tổng quan tài liệu 4

2.1 Tình hình nghiên cứu bệnh do parvovirus gây ra trên thế giới và Việt Nam 4

2.1.1 Tình hình nghiên cứu bệnh do Parvovirus gây ra trên thế giới 4

2.1.2 Tình hình dịch bệnh do Parvovirus gây ra tại Việt Nam 5

2.2 Ðặc điểm sinh học của parvovirus 6

2.2.1 Đặc điểm hình thái, cấu trúc hệ gen của Parvovirus 6

2.2.2 Phân loại và phân bố các type Parvovirus 7

2.2.3 Sức đề kháng của Parvovirus 8

2.2.4 Đặc tính nuôi cấy 9

2.2.5 Đặc tính kháng nguyên 9

2.2.6 Khả năng miễn dịch 9

2.2.7 Đường xâm nhập và cách truyền bệnh 10

2.2.8 Triệu chứng 11

2.2.9 Các phương pháp chẩn đoán 14

2.3 Tổng quan về nuôi cấy tế bào 18

2.3.1 Một số đặc điểm của tế bào động vật 18

2.3.2 Thành phần dinh dưỡng của môi trường nuôi cấy tế bào 19

2.3.3 Điều kiện nuôi cấy 20

2.3.4 Sự tạp nhiễm và cách hạn chế 21

2.4 Phân lập virus 21

2.4.1 Khái quát về phân lập virus 21

2.4.2 Phân lập Parvovirus phục vụ nghiên cứu sản xuất vacxin vô hoạt 22

Phần 3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 23

3.1 Ðịa Ðiểm nghiên cứu 23

3.2 Thời gian nghiên cứu 23

3.3 Ðối tượng/vật liệu nghiên cứu 23

3.3.1 Đối tượng nghiên cứu 23

3.3.2 Vật liệu nghiên cứu 23

3.4 Nội dung nghiên cứu 24

3.4.1 Thu thập mẫu chó mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy do Parvovirus 24

3.4.2 Nghiên cứu phân lập Parvovirus trên môi trường tế bào CRFK 24

3.4.3 Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của những chủng parvovirus phân lập được 24

3.5 Phương pháp nghiên cứu 24

3.5.1 Phương pháp mổ khám 24

3.5.2 Phương pháp tách chiết DNA 25

3.5.3 Phương pháp PCR 26

3.5.4 Phương pháp phân lập Parvovirus 26

3.5.5 Phương pháp xác định hiệu giá virus 27

3.5.6 Xử lý số liệu 28

3.5.7 Phương pháp test kit xét nghiệm nhanh bệnh parvovirus trên chó 28

Phần 4 Kết quả và thảo luận 31

4.1 Kết quả thu thập mẫu chó mắc parvovirus 31

4.2 Kết quả phân lập virus trên môi trường tế bào CRFK 35

4.2.1 Kết quả phân lập Parvovirus 35

4.2.2 Kết quả kiểm tra sự có mặt của virus trong mẫu phân lập bằng phương pháp

PCR 37

4.3 Xác định một số đặc tính sinh học vủa parvovirus 38

4.3.1 Kết quả nghiên cứu khả năng gây bệnh tích tế bào của Parvovirus 38

4.3.2 Kết quả xác định hiệu giá của các chủng Parvovirus nghiên cứu 40

4.3.3 Xác định quy luật nhân lên của virus Parvo trên môi trường tế bào CRFK 40

Phần 5 Kết luận và kiến nghị 45

5.1 Kết luận 45

5.2 Kiến nghị 45

Tài liệu tham khảo 46

Phụ lục 49

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt

µl Microlit

CPE Cyto Pathogenic Effect

DMEM Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium

DNA Deoxyribonucleic acid

ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay

FAO Food and Agriculture Organization

FBS Fetal Bovine Serum

MOI Multiplicity of Infection

PBS Phosphate buffered saline

RNA Ribonucleoic acid

RT-PCR Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction TCID 50 50% Tissue Culture Infective Dose

PCR Polymerase chain reaction

MDCK Madin Darby Canine kidney

CRFK Crandell Rees Feline Kidney

MOI Multiplicity of infection

PFU Plaque forming unit

DANH MỤC BẢNG

Bảng 4.1 Thông tin mẫu thu thập chó mắc Parvovirus trong thời gian nghiên cứu 31

Bảng 4.2 Kết quả của phản ứng PCR chẩn đoán chó mắc Parvovirus 32

Bảng 4.3 Các triệu chứng điển hình ở chó mắc bệnh do virus Parvo (n = 40 con) 33

Bảng 4.4 Các tổn thương đại thể ở chó mắc bệnh do Parvovirus 34

Bảng 4.5 Kết quả phân lập Parvovirus trên môi trường CRFK 36

Bảng 4.6 Thông tin các chủng Parvovirus gây bệnh tích tế bào trên môi trường CRFK 37

Bảng 4.7 Kết quả xác định khả năng gây bệnh tích tế bào của các chủng Parvovirus phân lập được 39

Bảng 4.8 Hiệu giá của các chủng Parvovirus phân lập 40

Bảng 4.9 Hiệu giá virus của chủng VNUA-C17 trong và ngoài tế bào theo thời gian 40

Bảng 4.10 Hiệu giá virus của chủng VNUA-C31 trong và ngoài tế bào theo thời gian 41

Bảng 4.11 Hiệu giá virus của chủng VNUA-C32 trong và ngoài tế bào theo thời gian 42

Bảng 4.12 Hiệu giá virus của chủng VNUA-C35 trong và ngoài tế bào theo thời gian 42

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Cấu tạo của Parvovirus 6

Hình 2.2 Sự phân bố của CPV-2a\2b\2c trên thế giới 7

Hình 2.3 Tỷ lệ phần trăm và sự xuất hiện của các chủng 2/2-like, CPV-2a, CPV-2b, và CPV-2c 8

Hình 2.4 Cơ chế sinh bệnh của Parvovirus trên chó 11

Hình 2.5 Triệu chứng lâm sàng của chó bị Parvovirus 12

Hình 2.6 Chó bị tiêu chảy cấp, nôn mửa do Parvovirus 13

Hình 2.7 Kit thử nhanh Canine Parvovirus (CPV) Ag 17

Hình 4.1 Kết quả điện di sản phẩm PCR phát hiện Parvovirus 32

Hình 4.2 Tế bào CRFK được gây nhiễm sau 24h, 48h, 72h, 96h 36

Hình 4.3 Tế bào CRFK bình thường 37

Hình 4.4 Bệnh tích tế bào do Parvovirus gây ra 37

Hình 4.5 Hình ảnh bệnh tích tế bào do Parvovirus gây ra trên tế bào CRFK tại các thời điểm khác nhau 39

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 4.1 Đường biểu diễn sự nhân lên của virus VNUA-C17 41

Biểu đồ 4.2 Đường biểu diễn sự nhân lên của virus VNUA-C31 41

Biểu đồ 4.3 Đường biểu diễn sự nhân lên của virus VNUA-C32 42

Biểu đồ 4.4 Đường biểu diễn sự nhân lên của virus VNUA-C35 43

TRÍCH YẾU LUẬN VĂN

Tên tác giả: Kham Ning Bun Pha Xay

Tên luận văn: Nghiên cứu đặc tính sinh học của Canine Parvovirus phân lập được ở

Phía Bắc Việt Nam

Ngành: Thú y Mã số: 8640101 Tên cơ sở đào tạo: Học Viện Nông nghiệp Việt Nam

Mục đích nghiên cứu

Phân lập được các chủng Parvovirus gây bệnh cho chó tại một số tỉnh phía Bắc trên môi trường tế bào, xác định được các đặc tính sinh học của các chủng virus Parvo

Phương pháp nghiên cứu

- Phương pháp quan sát, thống kê sinh học;

- Phương pháp mổ khám, quan sát bệnh tích đại thể;

- Phương pháp phân lập virus Parvo trên môi trường tế bào CRFK

- Phương pháp xác định hiệu giá virus (TCID50/ml);

- Phương pháp xác định đường biểu biễn sự nhân lên của virus;

- Phương pháp PCR

Kết quả chính và kết luận

1 Nghiên cứu đã thu thập được 40 mẫu bệnh phẩm của chó mắc Parvovirus tại các phòng khám chó mèo trên địa bàn một số tỉnh phía Bắc Việt Nam Sau đó, sử dụng phương pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu (555forc/555revc) để xác định sự có mặt của Parvovirus trong các mẫu thu thập được, kết quả có 40 mẫu cho kết quả dương tính với Parvovirus, chiếm tỷ lệ 100%

2 Tiến hành phân lập 40 mẫu Parvovirus trên dòng tế bào CRFK Đây là dòng tế bào thích hợp cho sự nhân lên của Parvovirus Mẫu dương tính được xử lý và gây nhiễm vào tế bào CRFK, sau đó quan sát bệnh tích trong vòng 96h Kết quả tại đời gây nhiễm thứ nhất không thấy xuất hiện bệnh tích tế bào Kết quả sau khi gây nhiễm đời thứ 2 có

04 mẫu virus đã gây bệnh tích tế bào

3 Kết quả xác định các đặc tính sinh học của Parvovirus trên dòng tế bào CRFK: Phân tích đường biểu diễn sự nhân lên và phát triển của 4 chủng virus nghiên cứu VNUA - C17, VNUA - C31, VNUA – C32 và VNUA – C35, các chủng virus nghiên cứu xâm nhập và nhân lên nhanh trong tế bào, đạt mức cao nhất tại thời điểm 60-72 giờ

sau khi gây nhiễm Tại thời điểm này, thu virus trong tế bào của từng chủng virus nghiên cứu đem xác định hiệu giá thấy giá trị log TCID 50 của chủng VNUA – C32 đạt tới 4,16; chủng VNUA - C17 và VNUA – C35 đạt 3,83; chủng VNUA - C31 đạt 3,5 Sau đó hàm lượng virus trong tế bào sẽ giảm dần Đến thời điểm 96 giờ sau gây nhiễm giá trị log TCID 50 còn đạt ở mức 2,5 và 3,83

THESIS ABSTRACT

Master candidate: Kham Ning Bun Pha Xay

Thesis title: Research on biological properties of Canine Parvovirus isolated in Northern

Vietnam

Major: Veterinary Code: 8640101 Educational organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA) Research Objectives

Isolation of strains of Parvovirus that cause disease in dogs in some Northern provinces

on cell environment, identify the biological characteristics of Parvovirus strains

Materials and Methods

- Methods of observation, biological statistics;

- Methods of surgery, observation of gross lesions;

- Method of isolating Parvo virus on CRFK cell environment

- Methods of determining viral titre (TCID50 / ml);

- Methods of determining the line of virus replication;

- PCR method

Main findings and conclusions

1 The study collected 40 specimens of parvovirus dogs at cats and dogs clinics in some northern provinces of Vietnam Then, using PCR method with specific primers (555forc / 555revc) to determine the presence of Parvovirus in the collected samples, the result has 40 samples giving positive result with Parvovirus, accounting for 100%

2 Isolation of 40 Parvovirus samples on CRFK cell line This is a suitable cell line for the replication of Parvovirus Positive samples are treated and infect CRFK cells, then observe lesions within 96 hours Results in the first infection caused no cell lesions As a result, after the second infection, there were 04 virus samples causing cell lesions

3 Results of identifying biological characteristics of Parvovirus on CRFK cell lines: Analysis of lines showing the multiplication and development of 4 researched virus strains VNUA - C17, VNUA - C31, VNUA - C32 and VNUA - C35, the virus strains invade and multiply rapidly in the cell, peaks at 60-72 hours after infection At this time, virus collection in the cell of each studied virus strain has determined that the log value of TCID50 of VNUA - C32 strain reaches 4.16; strains VNUA - C17 and VNUA - C35 reached 3.83; strain VNUA - C31 reached 3.5 Then the virus content in the cell will decrease Up to 96 hours after infection, TCID50 log values were still at 2.5 and 3.83

PHẦN 1 MỞ ĐẦU

1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Ở nước ta, chó là loài vật được nuôi phổ biến bởi sự thông minh, nhanh nhẹn và rất trung thành Chó đang dần trở thành một thành viên, một người bạn trong các gia đình Chó ngày càng được quan tâm chăm sóc, nuôi dưỡng và khám chữa bệnh Ngoài các giống chó nội có sẵn, người dân còn nhập các giống chó ngoại từ khắp nơi trên thế giới về nuôi làm cho số lượng, chủng loại giống chó gia tăng Đồng thời các bệnh thường gặp trên chó cũng xảy ra, gây thiệt hại cho chủ nuôi

Bệnh viêm ruột tiêu chảy do Canine Parvovirus (CPV) là bệnh truyền nhiễm cao và thường gây tử vong cao ở chó, đặc biệt chó con dưới 1 năm tuổi Canine Parvo virus (CPV) phát hiện vào năm 1978, nhưng chỉ trong vòng hai năm sau đó

đã trở thành bệnh mới ở chó trên toàn thế giới CPVs là những virus nhỏ, không

vỏ được nhân lên bằng cách phân chia tế bào rất nhanh CPVs có 3 chủng: CPV 2a (phân lập 1984), 2b (phân lập 1984), 2c (phân lập 2000) Qua phân lập từ năm

1979 đến 1984, các nhà khoa học đã xác định phần lớn chó nhiễm hai chủng virus CPV2a và CPV2b Hiện tại, CPV2a là chủng gây bệnh chủ yếu tại Ý và

Đức, trong khi CPV-2b phổ biến ở Mỹ, Đài Loan và Nhật Bản (Battilani et al., 2001; Martella et al., 2004) Chủng CPV-2c có sự thay đổi (Asp426Glu) trên

protein VP2, đây là protein chịu trách nhiệm về tính kháng nguyên của chủng CPV-2b, đã được phát hiện ở Việt Nam, Ý, Tây Ban Nha, Đức, Anh và Nam Mỹ

(Nakamura et al., 2004; Decaro et al., 2007)

Bệnh lây trực tiếp từ chó sang chó hoặc qua phân thải có virus phát tán trong môi trường qua các nhân tố trung gian truyền lây: dụng cụ chăn nuôi, chuồng nuôi, chim, gậm nhấm, côn trùng ruồi nhặng mang mầm bệnh gây nhiễm cho chó khỏe Khi nhiễm virus, giai đoạn ủ bệnh trên 80% chó không hề có triệu chứng lâm sàng Giai đoạn phát bệnh sau 3-10 ngày nhiễm virus, các dấu hiệu: mệt mỏi, ủ rũ, nôn khan ra bọt dãi nhớt màu vàng xanh, sốt và tiêu chảy thường

có máu Tỷ lệ nhiễm bệnh cao, khoảng 45% (Trần Ngọc Bích và cs., 2013) Chó

bị nhiễm bệnh, không được điều trị kịp thời, tỷ lệ tử vong rất cao trên 80% Hiện nay chưa có những chế phẩm sinh hay thuốc đặc trị đối với chó bị nhiễm Parvovirus Trên thực tế, để phòng chống bệnh do Parvovirus, người nuôi phải sử dụng vacxin để phòng bệnh

Tại Việt Nam, những nghiên cứu về Parvovirus gây bệnh trên chó còn rất hạn chế, cho đến thời điểm hiện tại chưa có nghiên cứu chuyên sâu xác định đặc tính sinh học của các chủng Parvovirus gây bệnh tại thực địa trên môi trường tế bào Nhận thấy sự cần thiết nghiên cứu phát triển chế phẩm điều trị và vacxin phòng bệnh do Parvovirus trên chó từ chính các chủng virus thực địa, chúng tôi đặt vấn đề

thực hiện đề tài: “Nghiên cứu đặc tính sinh học canine parvovirus (CPV) phân

lập được ở phía bắc Việt Nam” Nhằm nghiên cứu quy trình phân lập Parvovirus;

làm rõ đặc tính gây bệnh tích tế bào, thời gian sinh trưởng của các chủng Parvovirus phân lập từ thực địa trên môi trường tế bào thích hợp Kết quả nghiên cứu sẽ góp phần làm cơ sở cho việc chọn chủng Parvovirus có đặc tính sinh học phù hợp dùng

để chế tạo kit chẩn đoán, chế tạo kháng nguyên dùng trong chẩn đoán, chế phẩm sinh học ứng dụng trong điều trị và phát triển vacxin phòng bệnh hiệu quả

1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI

1.2.1 Mục tiêu chung

- Phân lập được các chủng Parvovirus gây bệnh cho chó tại một số tỉnh phía Bắc trên môi trường tế bào, xác định được các đặc tính sinh học của các chủng Parvovirus

1.2.2 Mục tiêu cụ thể

- Phân lập được các chủng Parvovirus trên môi trường tế bào CRFK

- Xác định được đặc tính sinh học (khả năng gây bệnh tích tế bào, hiệu giá virus và đường cong sinh trưởng) của các chủng Parvovirus gây bệnh cho chó

1.3 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI

1.3.1 Ý nghĩa khoa học

Kết quả nghiên cứu là tài liệu tham khảo dùng trong nghiên cứu về bệnh

do Parvovirus ở chó trong viện nghiên cứu, các trường có chuyên ngành thú y Đây cũng là tư liệu khoa học cần thiết cho những người làm công tác thú y cơ sở

về bệnh do Parvovirus Đồng thời, thông tin chi tiết của các chủng giống Parvo virus phân lập được có ý nghĩa trong việc xây dựng ngân hàng hồ sơ chủng giống gốc, phục vụ cho các bước đăng ký chủng giống với ngân hàng bảo tồn nguồn gen quốc gia

1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn

Đề tài đã thu thập, sàng lọc và đánh giá các đặc tính sinh học của chủng

Parvovirus đang gây bệnh tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam Chủng Parvovirus phân lập được có tiềm năng cho chọn giống để sản xuất vacxin hoặc chế tạo Kit, làm kháng nguyên cho chẩn đoán hoặc làm giống để công cường độc đánh giá hiệu quả bảo hộ và kiểm nghiệm vacxin Kết quả nghiên cứu tạo tiền đề giúp thúc đẩy các nghiên cứu phát triển sản xuất vacxin trong nước từ chính các chủng virus đang lưu hành tại thực địa, từ đó nâng cao hiệu quả phòng bệnh

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU BỆNH DO PARVOVIRUS GÂY RA TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM

Bệnh viêm ruột tiêu chảy do Parvovirus (Canine Parvovirus type 2 - CPV 2)

là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm của loài chó có tỉ lệ chết cao Biểu hiện lâm sàng đặc trưng là hiện tượng viêm dạ dày ruột có xuất huyết Bệnh xảy ra khắp nơi trên thế giới trong đó có Việt Nam Bệnh hay xảy ra với các giống chó: Bergie, Labrador, Rottweiler, Dorberman, Yorshire terriers,

2.1.1 Tình hình nghiên cứu bệnh do Parvovirus gây ra trên thế giới

Đầu năm 1970, CPV 2 được phát hiện trên chó con với các triệu chứng bệnh tích như sốt cao, nôn mửa, tiêu chảy, phân lỏng lẫn máu, viêm dạ dày, viêm

cơ tim, Bệnh thường xảy ra ở dạng dịch địa phương hoặc nhiều ổ dịch xảy ra cùng một lúc Bệnh xuất hiện vào mùa thu năm 1977 ở Texas và đến mùa hè năm

1978 đã xảy ra nhiều vùng khác nhau ở Hoa Kỳ và Canada Đầu năm 1979, bệnh

đã xuất hiện ở Úc, Bỉ, Hà Lan, Anh và Pháp

Theo các kết quả nghiên cứu của nhiều tác giả, tỷ lệ chó nhiễm CPV 2 là khác nhau ở các quốc gia, như báo cáo về tình hình chó bị nhiễm Parvovirus

tại Nigeria là 40,00% (Chollom et al., 2013), tại Hungary là 84,00% (Csagola

et al., 2014)

Kết quả nghiên cứu gần đây của Kaur et al (2015) về tỷ lệ nhiễm CPV 2

theo lứa tuổi chó, khi sử dụng kỹ thuật Nested PCR (Polymerase Chain Reaction) chẩn đoán bệnh CPV 2 cho thấy, tỷ lệ nhiễm CPV 2 trên chó từ 0 đến 3 tháng tuổi là 60,00%, 3 đến 6 tháng tuổi là 30,00%, 6 đến 9 tháng tuổi là 24,00%, trên

9 tháng tuổi là 6,00%

Theo các nghiên cứu cho thấy CPV-2 là một virus sợi đơn DNA, không có

vỏ bọc, kích thước khoảng 5.2kp, bao gồm 2 khung đọc mở chính, một khung là

mã hóa 2 capsid protein [VP1] và [VP2] và một khung là mã hóa 2 protein không cấu trúc [NS1] và [NS2] Sau đó, một loại Parvovirus mới đã được phân lập

trong nuôi cấy tế bào (Burtonboy et al.,1979; Johnson and Spradbrow,

1979;Kelly, 1978) Loại virus này được đặt tên là Canine Parvovirus loại 2 (CPV-2), để phân biệt nó với mô tả trước Parvovirus Canine Munite Virus (CMV hoặc CPV-1), đó là kháng nguyên không liên quan đến CPV-2 (Carmichael and

(Allen and 1998; D Buonavoglia et al., 2000; Mochizuki Harasawa, andNakatani, 1993; Steinel et al.,2000)

Hai biến thể kháng nguyên, CPV-2a và CPV-2b, hiện đang được phân phối trên toàn thế giới (Truyen U., 2006) Biến thể CPV thứ ba, có vị trí axit amin Glu-426 đột biến và sau đó được đặt tên thành CPV-2c, đã được phát hiện tại Ý năm 2000 (C Buonavoglia et al., 2001) và hiện đang lưu hành tại nước đó cùng

với các loại 2a và 2b (Decaro et al., 2007; Martella et al., 2004).) Các biến thể mới 2c cũng đã được báo cáo trong Việt Nam bởi Nakamura et al (2004)

2.1.2 Tình hình dịch bệnh do Parvovirus gây ra tại Việt Nam

Bệnh viêm ruột tiêu chảy do Parvovirus đã được ghi nhận lần đầu tiên ở nước ta vào năm 1990 trên chó nghiệp vụ (Trần Ngọc Bích và cs., 2013) Ở Việt Nam, cũng như ở các quốc gia khác ở châu Á, các chủng CPV-2a và CPV-2b khá phổ biến từ những đợt bùng phát dịch đầu tiên Bệnh được công bố lần đầu tiên ở Việt Nam vào năm 1994

Chó ở mọi lứa tuổi đều nhạy cảm với bệnh, thông thường hầu hết các con trưởng thành đều có kháng thể, tỷ lệ mắc bệnh và tỷ lệ tử vong trên chó con từ 6-

12 tuần tuổi rất đáng kể do có sự huỷ bỏ kháng thể mẹ truyền Bệnh có khả năng lây lan nhanh Tỷ lệ mắc bệnh có thể lên đến 50%, tỷ lệ tử vong trên chó con từ 50-100% (Trần Ngọc Bích và cs., 2013)

Theo kết quả nghiên cứu gần đây nhất của Nguyễn Thị Yến Mai và cs (2018) cho thấy tỷ lệ chó tiêu chảy phân lẫn máu do Parvovirus ở Tiền Giang, Đồng Tháp và Thành phố Cần Thơ là 30,00%; 34,00% và 30,00% Chó từ ở độ tuổi từ 1 đến 3 tháng tuổi có tỷ lệ nhiễm bệnh cao ở cả ba tỉnh với tỷ lệ lần lượt là (60,00%; 58,82%; 60,00%) và khác biệt có ý nghĩa thống kê với chó ở độ tuổi >6 tháng tuổi ở cả 3 tỉnh Tiền Giang, Đồng Tháp và Thành phố Cần Thơ (6,67%; 5,88%; 0,00%) Chó được tiêm ngừa vacxin phòng bệnh thì tỷ lệ bệnh thấp hơn

so với chó không được tiêm ngừa vacxin ở 3 tỉnh là (6,67% so với 93,33%; 5,88% so với 94,12%; 13,33% so với 86,67%;) Hiệu quả điều trị bệnh Parvovirus trên chó ở tỉnh Tiền Giang và Thành phố Cần Thơ là tương đương nhau với tỷ lệ là 86,67% và 58,82%

2.2 ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA PARVOVIRUS

2.2.1 Đặc điểm hình thái, cấu trúc hệ gen của Parvovirus

Parvovirus thuộc họ Parvoviridae, giống Parvovirus, loài Canine Parvovirus

Hình 2.1 Cấu tạo của Parvovirus

 Hình thái và cấu trúc:

+ Theo Phạm Sỹ Lăng và cs (2006), Parvovirus là virus có kích thước nhỏ, gây bệnh nhiều loài thú (chó, mèo, chuột, lợn, trâu, bò) Parvovirus ở mỗi loài động vật khác nhau là khác nhau Chúng có kích thước 18– 24nm, nhân chứa DNA sợi đơn, không có vỏ bọc, bộ gen 5323 nucleotide

+ Capsid có kích thước rất nhỏ (20nm), dạng khối đa diện, gồm 32 capsome với 60 tiểu đơn vị VP (viral protein) là VP1, VP2 (chiếm 90% tiểu đơn vị protein) (Reed, Jones, & Miller, 1988)

+ Lõi: DNA đơn, dạng thẳng Hầu hết là DNA (-), ở hai đầu có đoạn palindrom (đoạn DNA mạch kép có trình tự nucleotide trên mỗi sợi giống nhau nhưng

trái chiều nhau) tạo thành các nút kẹp tóc, có một đầu 3’-OH thay cho mồi

2.2.2 Phân loại và phân bố các type Parvovirus

Hình 2.2 Sự phân bố của CPV-2a\2b\2c trên thế giới

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5376324/

Từ bản đồ sự phân bố của các chủng CPV-2a/2b/2c trên toàn thế giới ta có thể nhận thấy Parvovirus phân bố trên khắp thế giới với các chủng khác nhau Cụ thể, chủng CPV-2a phân bố nhiều ở khu vực Châu Á và Nam Phi một phần ở vùng Nam Mỹ, chủng CPV-2b có thể thấy xuất hiện ở hầu hết các châu lục, riêng chủng CPV-2c thì tập trung nhiều ở châu Mỹ Latinh và Châu Âu

Đến năm 1984 trở đi thì có thêm sự xuất hiện của chủng CPV-2b Trong khoảng thời gian 1986-1996 thì chủng CPV-2a lưu hành phổ biến Từ sau năm 1996

có thêm sự xuất hiện của chủng CPV-2c, chủng CPV-2b có xu hướng giảm, các

chủng CPV-2a và CPV-2c đang thịnh hành trên thế giới (Zhou P et al, 2017)

Hình 2.3 Tỷ lệ phần trăm và sự xuất hiện của các chủng CPV-2/CPV-2-like,

thể tồn tại hơn 6 tháng ở nhiệt độ phòng Nó đề kháng với tác động của ete, chloruaform, axit và nhiệt độ (56oC trong 30 phút) Dễ bị tiêu diệt bởi ánh sáng mặt trời, tồn tại kéo dài vào mùa đông (ôn đới) Theo Tô Du và cs (2006), virus

có thể tồn tại 1 – 2 tuần ở nhiệt độ 15 – 25oC

2.2.4 Đặc tính nuôi cấy

Virus chỉ nhân lên trong nhân tế bào và gây bệnh tích tế bào trên tế bào tim chó con còn bú hay trên tế bào ruột Theo Tô Du và cs (2006), virus phát triển tốt trên môi trường tế bào thận chó, thận khỉ, chúng gây bệnh tích tế bào nên

người ta thường phân lập virus từ nuôi cấy trên các môi trường này

2.2.5 Đặc tính kháng nguyên

Sự nhân lên của Parvovirus ở chó làm xuất hiện kháng thể gây ức chế phản ứng ngưng kết hồng cầu và phản ứng trung hoà huyết thanh Kháng thể ức chế phản ứng ngưng kết hồng cầu xuất hiện vào ngày thứ hai hoặc ngày thứ ba sau khi nhiễm Phản ứng này được sử dụng trong chẩn đoán huyết thanh học Phản ứng trung hoà huyết thanh rất khó thực hiện trong phòng thí nghiệm (Nguyễn

Như Pho, 2003)

2.2.6 Khả năng miễn dịch

Sau khi nhiễm bệnh, chó có miễn dịch kéo dài trong 3 năm, hiệu giá kháng thể trung hòa hay ngăn trở ngưng kết hồng cầu trên những chó này sẽ lên rất cao Những chó con sinh ra trong khoảng thời gian này cảm nhiễm lúc 9 - 12 tuần tuổi Sau 2 - 3 năm thì hiệu giá kháng thể sẽ giảm thấp, chó con sinh ra có thể cảm nhiễm Parvovirus sớm hơn vào lúc 5 - 6 tuần tuổi

Miễn dịch thụ động ở chó con có được do kháng thể mẹ truyền cho, kháng thể này tồn tại khoảng 9 ngày và thường sẽ giảm đi vào khoảng tuần thứ 10 hay

11 sau khi sinh

Ở chó con còn bú có một thời kỳ nhạy cảm với sự xâm nhiễm virus nhưng lượng kháng thể còn sót lại đủ để trung hoà virus vacxin đưa vào Ở “thời kỳ khủng hoảng” này, chó con không thể được tiêm chủng hiệu quả trong khi nó cảm thụ hoàn toàn với sự xâm nhiễm tự nhiên

Một số kháng nguyên tương đồng giữa những dòng Parvovirus khác nhau ở động vật như virus Feline Panleukopenia (FPV), virus gây viêm ruột ở chồn (MEV) Sự tương đồng này có thể được phát hiện bởi phản ứng trung hoà và phản ứng HI Mặc dù có sự tương đồng kháng nguyên nhưng nó có những giới

hạn riêng biệt trong tự nhiên, FPV chỉ gây nhiễm cho mèo, MEV chỉ gây nhiễm

cho chồn và CPV chỉ gây nhiễm cho chó (Zhou et al., 2017).

2.2.7 Đường xâm nhập và cách truyền bệnh

Chất chứa căn bệnh: Dịch nôn, phân, nước tiểu, nước bọt nhưng nhiều nhất

là phân

Cách truyền lây: Lây gián tiếp qua sự tiếp xúc với môi trường vấy bẩn phân của động vật mắc bệnh hoặc trực tiếp từ chó bệnh sang chó khoẻ

Đường xâm nhập: chủ yếu bằng đường hô hấp, tiêu hóa

Vật cảm thụ: Giống Parvovirus chỉ gây nhiễm cho họ chó: chó nhà, chó sói, sói có lông bờm cổ Chó ở mọi lứa tuổi đều mắc, chủ yếu là chó non từ 1 - 5 tháng tuổi mẫn cảm nhất Ở chó trưởng thành, thông thường bệnh ít gây tác hại, nhưng đó là nguồn dịch nguy hiểm trong tự nhiên (Tô Du và cs., 2006)

Tính cảm thụ: 100% đối với những quần thể chó chưa nhiễm Bệnh thường được biểu hiện trên chó con, gây chết hàng loạt chó con vì chó trưởng thành được tiêm phòng hoặc cảm thụ tự nhiên Bệnh có khả năng lây lan nhanh Tỷ lệ mắc bệnh cao, tỷ lệ tử vong trên chó con từ 50 - 100%

Mùa mắc: Bệnh thường xảy ra quanh năm nhưng thường xuất hiện nhiều khi thời tiết thay đổi đặc biệt mưa nhiều, độ ẩm cao

Cơ chế sinh bệnh: Virus xâm nhập bằng đường miệng và mũi, thải ra ngoài qua phân Sau khi xâm nhập, đầu tiên virus nhân lên tại các mô lympho, gây nhiễm trùng huyết Trong quá trình gây nhiễm trùng huyết, virus đồng thời nhân lên ở tế bào lympho và tế bào tuỷ xương dẫn đến giảm thiểu số lượng bạch cầu, hậu quả là làm suy giảm miễn dịch Virus nhân lên trong tế bào ruột dẫn đến hoại

tử biểu mô ruột, bào mòn nhung mao ruột, gây viêm ruột, giảm hấp thu và tiêu chảy rồi chết (Stanford university, 2000)

Theo Stephen J.E et al.(1995), sự có mặt đồng thời của các virus như

Parvovirus, Adenovirus, Coronavirus, Rotavirus, Paramyxovirus, sẽ làm tổn thương niêm mạc ruột, làm suy giảm sức đề kháng của cơ thể gây ra ỉa chảy dạng cấp tính với tỉ lệ chết cao

Ở những chó con không có kháng thể mẹ truyền, virus thường gây bệnh tích trên cơ tim

Hình 2.4 Cơ chế sinh bệnh của Parvovirus trên chó 2.2.8 Triệu chứng

Thời gian nung bệnh khoảng 5-7 ngày Bệnh thường biểu hiện ở 3 dạng chủ yếu như sau:

 Dạng điển hình (viêm dạ dày ruột xuất huyết):

Đây là dạng phổ biến nhất, thường mắc ở chó 6 ÷ 12 tuần tuổi

Virus xâm nhập qua đường tiêu hóa

Virus vào máu

Virus gây thiệt hại nghiêm trọng đến đường ruột, chúng phân chia trong các

tế bào biểu mô ruột, gây hoại tử, viêm loét bong tróc các tế bào niêm mạc, vì thế gây hiện tượng tiêu chảy - xuất huyết Niêm mạc thường theo phân ra ngoài, hợp lại với các chất chứa trong ruột tạo nên một mùi hôi tanh khó chịu Khi ruột bị tổn thương tạo điều kiện thuận lợi cho các nhiễm trùng thứ cấp khi các vi khuẩn

đường ruột như Salmonella, E.coli, Coronavirus, C perfringens, Campylobacter

và các ký sinh trùng khác có thể xâm nhập vào mạch máu nhiều hơn qua những vùng niêm mạc bị bong tróc, từ đó tạo nên quá trình nhiễm trùng thứ cấp

Theo Tô Du và cs (2006), dạng này gặp phổ biến ở chó 6 tuần đến 1 năm tuổi Thời gian ủ bệnh ngắn từ 1 – 2 ngày Lúc đầu, chó sốt nhẹ: 39 – 39,5 độ C, cơn sốt kéo dài 1 – 2 ngày, chó mệt, ăn kém hoặc bỏ ăn, uống nước nhiều, nôn mửa liên tục Sau đó, chó mệt lả vì ỉa chảy nặng và nhiều Phân loãng dần, có nhiều máu đỏ nâu, màu hồng, có lẫn niêm mạc ruột lầy nhầy và có mùi tanh khắm đặc trưng Khi ỉa chảy cũng là lúc chó bị hạ nhiệt dưới mức bình thường (37OC) Chó gầy sút rất nhanh vì mất nước, mất máu, sốc do nội độc tố hoặc nhiễm trùng thứ phát

Hình 2.5 Triệu chứng lâm sàng của chó bị Parvovirus

Huyết học: Chó bị bệnh thường bị mất nước trầm trọng, tăng thân nhiệt (50%), giảm thiểu lượng bạch cầu (60 – 70% tổng số các trường hợp), chủ yếu giảm bạch cầu trung tính và tế bào lympho đôi khi còn ít hơn 400 – 500 bạch

Thể quá cấp tính: Con vật chết sau 3 ngày do trụy tim mạch

Thể cấp tính: Chết sau 5 – 6 ngày do hạ huyết áp và do tác động bội nhiễm

của vi khuẩn

Tỷ lệ tử vong cao trên chó từ 6 – 10 tuần tuổi, chó đã qua 5 ngày mắc bệnh thì thường có kết quả điều trị khả quan

 Dạng viêm cơ tim:

Dạng này hay gặp ở chó con 4 – 8 tuần tuổi

Thể này ít phổ biến hơn thể đường ruột

Bệnh thường rất nặng, chó bị suy tim cấp do virus tấn công gây hoại tử cơ tim Con vật thường chưa biểu hiện triệu chứng gì đã lăn ra chết đột ngột do suy

hô hấp trong thời gian ngắn vì phổi bị phù Do những biến đổi về bệnh tích ở van tim và cơ tim, từ đó xuất hiện những tạp âm ở tim hay những biến đổi về điện tim

đồ (Nguyễn Như Pho, 2003)

Những trường hợp khác có thể thấy chó biểu hiện thiếu máu nặng, niêm mạc nhợt nhạt, nhão Lớp mỡ vàng và cơ tim có xuất huyết, chó chết nhanh từ

1 – 2 ngày (Phạm Sỹ Lăng và cs., 2006) Những ổ chó bệnh dạng này có thể chết 50%

Chó con tồn tại được sẽ có sẹo trong cơ tim Thể bệnh này có thể hoặc không đi kèm với các dấu hiệu và triệu chứng của thể đường ruột Tuy nhiên thể này bây giờ đã hiếm trên thế giới

2.2.9 Các phương pháp chẩn đoán

 Chẩn đoán lâm sàng

Chẩn đoán bệnh trước tiên phải khám lâm sàng, dựa vào các triệu chứng và yếu tố dịch tễ của bệnh: Mức độ gây nhiễm lớn; triệu chứng lâm sàng phần lớn chó nhiễm bệnh có biểu hiện viêm ruột xuất huyết; sốt kéo dài từ khi phát bệnh đến khi chó bị ỉa chảy nặng; nôn mửa, ủ rũ, bỏ ăn; đi ỉa chảy, phân thối những ngày sau đó phân có màu hồng hoặc có lẫn máu tươi, có lẫn cả niêm mạc ruột và chất keo nhầy, mùi tanh rất đặc trưng Sau đó chó hôn mê, mất nước và sút cân nhanh Chết do ỉa chảy mất nước, mất cân bằng điện giải, sốc do nội độc tố hoặc nhiễm trùng thứ phát Tỷ lệ tử vong cao, trên 50%

Cần chẩn đoán phân biệt với các bệnh gây viêm ruột khác trên chó:

Viêm ruột do Coronavirus: Bệnh lây lan rất rộng nhưng không nguy hiểm nhiều cho chó bệnh, tiêu chảy từ 6 – 14 ngày, con vật mất nước, tỷ lệ tử vong thấp Viêm ruột do Rotavirus: Bệnh gây tiêu chảy nhưng cách sinh bệnh chưa được biết một cách rõ ràng

Viêm ruột trong bệnh Care: Chó bệnh có triệu chứng hô hấp và thần kinh đặc trưng, thường sốt cao trong nhiều ngày (40 – 410C), viêm phổi, viêm ruột (hiếm khi

có máu tươi), có thể gặp nhiều những nốt sài, mụn mủ ở vùng da ít lông

Viêm dạ dày ruột trong bệnh do Leptospira gây ra: Tiến trình bệnh xảy ra

nhanh với đặc điểm gây suy thận và nhiễm trùng huyết

Ngoài ra còn gặp các trường hợp viêm ruột ỉa chảy do ký sinh trùng (cầu trùng trên chó, giun lươn, giun đũa, giun móc )

 Phương pháp mổ khám

Khi virus vào trong cơ thể sẽ theo đường máu tới các cơ quan bộ phận và gây tổn thương các cơ quan đó Dựa trên cơ sở đó những ca bệnh chết không xác định được nguyên nhân có thể mổ khám quan sát bệnh tích đại thể chẩn đoán bệnh

 Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

 Kỹ thuật PCR để phát hiện DNA của CPV trong các mẫu bệnh phẩm

Kỹ thuật PCR có ưu điểm cho kết quả nhanh và độ chính xác cao, sẽ tốn ít thời gian để phát hiện hơn so với phương pháp nuôi cấy tế bào

 Phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch

Nhuộm hóa mô miễn dịch (Immunohistochemistry – IHC) là phương pháp

có độ chính xác cao cho phép phát hiện kháng nguyên tồn tại trong tổ chức Phương pháp này được thực hiện dựa trên nguyên lý là sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể đặc hiệu và bằng chất chỉ thị màu theo nghiên cứu của Lan

và cs (2006)

Nguyên lý: Phương pháp hóa mô miễn dịch sử dụng phản ứng kháng nguyên

- kháng thể đặc hiệu áp dụng cho các mảnh cắt đã chuyển đúc parafin Các mảnh cắt (của các mẫu bệnh phẩm) sau khi đã khử sạch Parafin được phủ kín kháng thể lên bề mặt Nếu trong mô bệnh phẩm có kháng nguyên tương ứng với kháng thể, phức hợp kháng nguyên - kháng thể sẽ hình thành Phức hợp này được nhận biết nhờ hệ thống khuếch đại tín hiệu bao gồm kháng thể bắc cầu (kháng kháng thể) và hoạt chất nhuộm màu DAB (3,39 diaminobenzidine tetraclorua)

Phương pháp mổ khám và hóa mô miễn dịch sử dụng trong trường hợp con bệnh chết Phương pháp chẩn đoán lâm sàng, xét nghiệm máu, phương pháp chẩn đoán huyết thanh học sử dụng trong trường hợp con vật còn sống Mỗi phương pháp đều có ưu nhược điểm riêng Tuy nhiên việc chẩn đoán lâm sàng, và sử dụng test CPV là không thể thiếu để chẩn đoán bệnh sớm nhằm nâng cao hiệu quả điều trị

 Phương pháp ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay- xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme)

Nguyên lý: Phương pháp ELISA có rất nhiều dạng mà đặc điểm chung là đều dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, trong đó kháng thể được gắn với một enzyme Khi cho thêm cơ chất thích hợp (thường là nitrophenol phosphate) vào phản ứng, enzyme sẽ thủy phân cơ chất thành một chất có màu Sự xuất hiện màu chứng tỏ đã xảy ra phản ứng đặc hiệu giữa kháng thể với kháng nguyên và thông qua cường độ màu mà biết được nồng độ kháng

nguyên hay kháng thể cần phát hiện Kĩ thuật này khá nhạy và đơn giản, cho phép ta xác định kháng nguyên hoặc kháng thể ở một nồng độ rất thấp (khoảng 0,1 ng/ml) Trên thực tế người ta thường dùng test ELISA để chẩn đoán (Vương Đức Chất và Lê Thị Tài 2004)

Lấy mẫu phân để làm phản ứng ELISA: các phương pháp ELISA có thể thực hiện ở ngày đầu tiên của bệnh cho đến 3 hoặc 4 ngày sau đó Các phương pháp ELISA có thể là âm tính giả nếu chạy quá sớm trong quá trình bệnh

bị, để tạo thành hợp chất kép hoàn chỉnh “kháng thể- kháng nguyên- kháng thể” (theo ELISA sandwich) Kết quả xét nghiệm có thể được biểu lộ qua sự xuất hiện các vạch chữ C và vạch mẫu T do thiết bị sử dụng “Phép sắc ký miễn dịch”

Hình 2.7 Kit thử nhanh Canine Parvovirus (CPV) Ag

 Soi trên kính hiển vi điện tử

Trong trường hợp bệnh cấp tính, virion parvoviral có thể tìm thấy trong phân bằng cách sử dụng soi trực tiếp bằng kính hiển vi điện tử

 Phản ứng HA (haemagglutination)

Nguyên lý: Do trên capxit của virus có một bán kháng nguyên HN (Haemagglutinin Neuraminidaza) có khả năng gắn với thụ thể của hồng cầu làm các hồng cầu dính kết với nhau, rồi sau đó cắt đứt các thụ thể hồng cầu để chúng lại rời nhau ra

Mục đích: Xác định virus có khả năng gây ngưng kết hồng cầu Xác định nồng độ virus cao hay thấp Xác định đơn vị ngưng kết dùng cho phản ứng HI

Thí nghiệm hemaglutination được thực hiện như mô tả của Carmichael et

al.,1980 Các mẫu được pha loãng theo thứ tự trong đĩa đáy-V Đầu tiên, 50μl

PBS đã được thêm vào mỗi giếng của đĩa Trong cột đầu tiên, đã thêm 50μl mẫu (huyền phù phân hoặc dịch nuôi cấy tế bào) Mẫu được trộn đều, và 50μl được chuyển sang giếng tiếp theo, cho đến dãy giếng thứ 10 thì loại bỏ 50µl, 2 dãy cuối chỉ có PBS làm đối chứng, tổng thể tích các giếng là 50µl Thử nghiệm HA được thực hiện bằng hồng cầu lợn (0,5%) Các đĩa được phủ nắp và ủ ở 4-7°C trong 2-4 giờ Phản ứng dương tính: Hồng cầu ngưng kết nằm rải đều thành mảng ở đáy lỗ Khi đó hiệu giá ngưng kết là độ pha loãng virus lớn nhất mà tại

đó vẫn có hiện tượng ngưng kết hồng cầu rõ Phản ứng âm tính là khi hồng cầu lắng xuống đáy thành một cục màu đỏ, nước bên trên trong

 Phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu HI (haemagglutination inhibition) Nguyên lý : Kháng thể đặc hiệu với virus có trong huyết thanh, gặp kháng nguyên tương ứng, phản ứng trung hoà xảy ra Virus bị kháng thể trung hoà, không còn khả năng gây ngưng kết hồng cầu.Phản ứng HI (haemagglutination inhibition) cũng được sử dụng để phát hiện ra CPV Kháng thể có thể phát hiện bởi HI sau khi bị nhiễm bệnh vào ngày thứ 3 hoặc 4

Kháng thể CPV cũng được xác định bằng cách sử dụng xét nghiệm HI, như

mô tả bởi (Carmichael L et al., 1980; Moraillon R et al., 1993) Tất cả các xét

nghiệm được thực hiện ở 4°C sử dụng 1% hồng cầu lợn và 8HAU của CPV Huyết thanh được xử lý trước với kaolin và hồng cầu lợn để loại bỏ nếu không đặc hiệu Huyết thanh được pha loãng trong dung dịch muối đệm phosphate (pH

= 7,2), bắt đầu bằng pha loãng 1:10 Các màng được biểu hiện bằng sự nghịch đảo của độ pha loãng huyết thanh cao nhất đã ức chế hoàn toàn sự ngưng kết máu Huyết thanh có độ nhiễm HI từ 1:80 trở lên được xem là dương tính với CPV, và những huyết thanh có độ âm HI dưới 1:40 được coi là âm tính với CPV

2.3 TỔNG QUAN VỀ NUÔI CẤY TẾ BÀO

Nuôi cấy tế bào là kĩ thuật duy trì và phát triển các tế bào ở ngoài cơ thể sống nhưng vẫn thực hiện đầy đủ các chức năng biến dưỡng và chức năng chuyên biệt của tế bào Quá trình nuôi cấy tế bào cho phép mỗi tế bào đóng vai trò như những tế bào độc lập, nó có thể phân chia nhờ quá trình nguyên phân và quần thể tế bào tiếp tục phát triển cho đến khi bị giới hạn bởi bề mặt nuôi cấy hay

sự cạn kiệt dinh dưỡng Kĩ thuật nuôi cấy tế bào được tiến hành lần đầu tiên vào năm 1907 bởi Harrison Ngày nay kĩ thuật này đã được ứng dụng rộng rãi trong y học và thú y để nghiên cứu sự tác động của các chất lên tế bào hay nghiên cứu virus để phân lập, giám định, chuẩn độ virus, xác định tính chất huyết thanh học, quan sát hình thái siêu cấu trúc của virus và đặc biệt là sản xuất vacxin Quá trình nuôi cấy tế bảo thường gồm những tế bào thuộc cùng một loại

2.3.1 Một số đặc điểm của tế bào động vật

Tính cơ học yếu: tế bào động vật không vách và kích thước tế bào khá lớn (khoảng 10μm) nên tính bền cơ học yếu Do đó, khi nuôi cấy, tế bào động vật rất

dễ vỡ do các lực tác động khi thao tác trên tế bào như khuấy trộn để tách tế bào,

di chuyển mẫu tế bào

Tăng trưởng và phân chia chậm: thời gian tăng trưởng gấp đôi của tế bào trung bình là 30 giờ Trong khi đó thời gian này của vi khuẩn chỉ khoảng 30 phút Tính cần giá đỡ: hầu hết tế bào động vật cần bám vào giá đỡ để có thể sống

và phân chia Thông thường, tế bào phát triển tốt khi gắn vào bề mặt rắn Tuy vậy một số tế bào như tế bào ung thư có thể sinh trưởng và phân chia ở trạng thái

lơ lửng không cần giá đỡ

Tế bào động vật có thể được bảo quản trong Nitơ lỏng ở nhiệt độ -196⁰C, ở nhiệt độ này tế bào có thể giữ được khả năng sống không hạn định và sẽ phát triển trở lại trên môi trường nuôi cấy khi phục hồi

Ngoài ra tế bào còn có các đặc tính khác như: kém thích nghi với môi trường, nhạy cảm với các ion kim loại và đa số tế bào động vật cần huyết thanh, hormone tăng trưởng để phân chia

2.3.2 Thành phần dinh dưỡng của môi trường nuôi cấy tế bào

Môi trường nuôi cấy tế bào phức tạp và giàu chất dinh dưỡng để tạo điều kiện tốt nhất cho sự phát triển của tế bào Môi trường có thể được cung cấp dưới dạng dung dịch để sử dụng ngay hay dưới dạng dung dịch đậm đặc hoặc dạng bột Dạng dung dịch đậm đặc có thể sử dụng sau khi pha loãng với nước cất tiệt trùng, trong khi dạng bột phải được hòa tan trong nước và tiệt trùng bằng cách lọc qua lưới lọc 0,22μm

Thành phần cơ bản của môi trường nuôi cấy:

Carbonhydrate: glucose (5-10mM) được dùng trong hầu hết các công thức

để cung cấp nguồn năng lượng cũng như tiền chất cho tổng hợp sinh học, như ribose cần cho tổng hợp acid nucleic Có thể dùng fructose thay thế cho glucose Glucose có trong hầu hết môi trường là nguồn ly giải tạo pyruvate vào chu trình acid citric và sinh ra CO2

Amino acid (0,1- 0,2mM) cũng được dùng như là nguồn tiền chất cho tổng hợp protein Người ta thường dùng glutamine, tuy nhiên, ammoniac được thành lập từ chuyển hóa glutamine có thể ức chế sinh trưởng trong một số quá trình nuôi cấy

Muối cũng được dùng để làm cho môi trường nuôi cấy có tính đẳng trương, duy trì sự cân bằng với phần bên trong tế bào