1. Trang chủ
  2. » Luận Văn - Báo Cáo

Khảo sát một số đặc điểm bệnh lý của bệnh cầu trùng ở gà và nghiên cứu chế tạo chế phẩm sinh học sử dụng trong phòng trị luận án tiến sĩ

135 14 0

Đang tải... (xem toàn văn)

Tài liệu hạn chế xem trước, để xem đầy đủ mời bạn chọn Tải xuống

THÔNG TIN TÀI LIỆU

Thông tin cơ bản

Định dạng
Số trang 135
Dung lượng 3,9 MB

Các công cụ chuyển đổi và chỉnh sửa cho tài liệu này

Cấu trúc

  • TRANG BÌA

  • MỤC LỤC

  • TRÍCH YẾU LUẬN ÁN

  • PHẦN 1. MỞ ĐẦU

    • 1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

    • 1.2. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI

    • 1.3. PHẠM VI NGHIÊN CỨU

    • 1.4. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI

    • 1.5. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI

  • PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

    • 2.1. GIỚI THIỆU VỀ BỆNH CẦU TRÙNG GÀ

      • 2.1.1. Căn bệnh cầu trùng

        • 2.1.1.1. Phân loại cầu trùng ở gà

        • 2.1.1.2. Vòng đời phát triển của cầu trùng

        • 2.1.1.3. Tính chuyên biệt của cầu trùng

        • 2.1.1.4. Một số kháng nguyên của cầu trùng gà

      • 2.1.2. Đặc điểm dịch tễ

        • 2.1.2.1. Nguồn bệnh

        • 2.1.2.2. Con đường truyền lây

      • 2.1.3. Sinh bệnh học

      • 2.1.4. Triệu chứng lâm sàng và bệnh tích của gà bị bệnh cầu trùng

        • 2.1.4.1. Triệu chứng lâm sàng

        • 2.1.4.2. Bệnh tích của gà bị bệnh cầu trùng

      • 2.1.5. Các phương pháp chẩn đoán bệnh cầu trùng gà

      • 2.1.6. Điều trị bệnh cầu trùng gà

      • 2.1.7. Miễn dịch chống cầu trùng ở gà

        • 2.1.7.1. Miễn dịch tế bào

        • 2.1.7.2. Miễn dịch dịch thể

      • 2.1.8. Vắc xin phòng bệnh cầu trùng gà

        • 2.1.8.1. Nghiên cứu chế tạo và sử dụng vắc xin cầu trùng sống

        • 2.1.8.2. Nghiên cứu chế tạo và sử dụng vắc xin chết

        • 2.1.8.3. Nghiên cứu chế tạo và sử dụng vắc xin thế hệ mới

    • 2.2. TỔNG QUAN VỀ CÔNG NGHỆ ADN TÁI TỔ HỢP

      • 2.2.1. Giới thiệu chung về công nghệ ADN tái tổ hợp

      • 2.2.2. Đặc điểm của hệ thống vector pET, pGEM-T Easy, tạo dòng và biểu hiện gene trong E. coli

        • 2.2.2.1. Đặc điểm của hệ thống vector pET

        • 2.2.2.2. Đặc điểm của hệ thống vector tạo dòng pGEM-T-Easy

        • 2.2.2.3. Tạo dòng và biểu hiện gene trong tế bào E. coli khả biến

    • 2.3. CÔNG NGHỆ CHẾ TẠO KHÁNG THỂ LÒNG ĐỎ TRỨNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP GÂY MIỄN DỊCH CHO GÀ MÁI

      • 2.3.1. Trọng lượng phân tử và tính chất lý hóa của IgY (Yolk Immunoglobulin

      • 2.3.2. Cấu trúc của IgY

      • 2.3.3. Độ bền của IgY

      • 2.3.4. Lợi thế của công nghệ sản xuất IgY

      • 2.3.5. Tách chiết IgY từ lòng đỏ trứng gà

        • 2.3.5.1. Các phương pháp tách chiết và tinh sạch IgY

        • 2.3.5.2. Tách phân đoạn hòa tan của IgY từ lòng đỏ trứng

        • 2.3.5.3. Tách chiết và tinh sạch IgY từ phân đoạn hòa tan

      • 2.3.6. Những ứng dụng của IgY

        • 2.3.6.1. Ứng dụng của IgY trong chẩn đoán

        • 2.3.6.2. Những ứng dụng của IgY trong phòng và điều trị bệnh

  • PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

    • 3.1. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU

    • 3.2. THỜI GIAN NGHIÊN CỨU

    • 3.3. VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU

      • 3.3.1. Vật liệu nghiên cứu

      • 3.3.2. Thiết bị và hóa chất dùng cho nghiên cứu

    • 3.4. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

      • 3.4.1. Khảo sát các đặc điểm bệnh lý của bệnh cầu trùng ở gà

      • 3.4.2. Nghiên cứu tách dòng gene mã hóa kháng nguyên, tạo plasmid mang gene kháng nguyên, biến nạp vào tế bào E. coli

      • 3.4.3. Nghiên cứu biểu hiện gene kháng nguyên, tách chiết, tinh khiết và định lượng kháng nguyên tái tổ hợp

      • 3.4.4. Kiểm tra độ tinh khiết và tính đặc hiệu của kháng nguyên tái tổ hợp

      • 3.4.5. Nghiên cứu sản xuất bột lòng đỏ trứng gà có kháng thể phòng trị bệnh

    • 3.5. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

      • 3.5.1. Phương pháp theo dõi triệu chứng lâm sàng và xác định bệnh tích đại thể, vi thể của gà mắc cầu trùng

        • 3.5.1.1. Phương pháp xác định tỷ lệ nhiễm, cường độ nhiễm và theo dõi triệu chứng lâm sàng

        • 3.5.1.2. Phương pháp xác định bệnh tích đại thể

        • 3.5.1.3. Phương pháp xác định bệnh tích vi thể

      • 3.5.2. Phương pháp xác định chỉ tiêu huyết học của gà mắc bệnh cầu trùng

      • 3.5.3. Phương pháp tách chiết ADN để xác định loài cầu trùng gây bệnh ở gà

        • 3.5.3.1. Thu thập và tinh sạch Oocyst cầu trùng gà

        • 3.5.3.2. Phương pháp tách ADN tổng số của cầu trùng gà

        • 3.5.3.3. Phương pháp PCR xác định các loài cầu trùng gà

      • 3.5.4. Phương pháp phân lập gene mã hóa kháng nguyên 3-1E

        • 3.5.4.1. Thiết kế mồi phân lập gene mã hóa kháng nguyên 3-1E

        • 3.5.4.2. Tách chiết ARN tổng số

        • 3.5.4.3. Quy trình phản ứng tổng hợp sợi ADN bổ sung

        • 3.5.4.5. Tinh sạch sản phẩm PCR

        • 3.5.4.6. Kỹ thuật điện di kiểm tra sản phẩm ARN, PCR

      • 3.5.5. Nghiên cứu tạo dòng gene mã hóa kháng nguyên trong vector tạo dòng và biến nạp vào tế bào vật chủ E. coli TOP10

        • 3.5.5.1. Gắn sản phẩm PCR có chứa gene 3-1E vào vector tạo dòng pGEM® - T Easy

        • 3.5.5.2. Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào E. coli TOP10

        • 2.5.5.3. Chọn lọc khuẩn lạc dương tính

        • 3.5.5.4. Tách ADN plasmid tái tổ hợp

        • 3.5.5.5. Kiểm tra ADN plasmid tái tổ hợp

      • 3.5.6. Nghiên cứu tạo dòng gene 3-1E trong vector pET200/D-TOPO và biểu hiện gene kháng nguyên 3-1E

        • 3.5.6.1. Nghiên cứu tạo dòng gene 3-1E trong vector pET200/D-TOPO và biến nạp vào tế bào vật chủ E. coli BL21 (DE3

        • 3.5.6.2. Nghiên cứu biểu hiện gene kháng nguyên 3-1E

        • 3.5.6.3. Phương pháp điện di SDS-PAGE

      • 3.5.7. Phương pháp tách chiết tinh khiết, xác định tính đặc hiệu và định lượng của kháng nguyên 3-1E tái tổ hợp

        • 3.5.7.1. Tách chiết tinh khiết kháng nguyên 3-1E

        • 3.5.7.2. Kiểm tra tính đặc hiệu của kháng nguyên tái tổ hợp

      • 3.5.8. Phương pháp chế tạo chế phẩm sinh học sử dụng trong phòng và trị bệnh cầu trùng gà

        • 3.5.8.1. Phương pháp xác định liều lượng kháng nguyên thích hợp để gây miễn dịch

        • 3.5.8.2. Phương pháp chọn tá chất thích hợp gây miễn dịch cho gà

        • 3.5.8.3. Phương pháp ELISA xác định kháng thể

        • 3.5.8.4. Tách chiết IgY từ lòng đỏ trứng

        • 3.5.8.5. Đông khô bột lòng đỏ trứng

      • 3.5.9. Phương pháp đánh giá hiệu quả phòng và điều trị bệnh cầu trùng của chế phẩm

        • 3.5.9.1. Phương pháp đánh giá hiệu quả phòng bệ

        • 3.5.9.2. Phương pháp đánh giá hiệu quả điều trị

      • 3.5.10. Phương pháp xử lý số liệu

  • PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

    • 4.1. TỶ LỆ NHIỄM, CƯỜNG ĐỘ NHIỄM, TRIỆU CHỨNG LÂM SÀNG VÀ BỆNH TÍCH ĐẠI THỂ, VI THỂ Ở GÀ MẮC CẦU TRÙNG

      • 4.1.1. Tỷ lệ và cường độ nhiễm cầu trùng gà nuôi tại huyện Phú Vang, Thừa Thiên Huế

      • 4.1.2. Tỷ lệ nhiễm cầu trùng theo lứa tuổi ở gà từ 1 đến 42 ngày tuổi

      • 4.1.3. Triệu chứng lâm sàng chủ yếu ở gà mắc bệnh cầu trùng

      • 4.1.4. Bệnh tích đại thể chủ yếu ở gà mắc bệnh cầu trùng

      • 4.1.5. Bệnh tích vi thể chủ yếu ở một số cơ quan của gà mắc bệnh cầu trùng

    • 4.2. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CÁC CHỈ TIÊU HUYẾT HỌC CỦA GÀMẮC BỆNH CẦU TRÙNG

      • 4.2.1. Một số chỉ tiêu hồng cầu ở gà từ 1-42 ngày tuổi mắc bệnh cầu trùng

      • 4.2.2. Kết quả nghiên cứu các chỉ tiêu hệ bạch cầu ở gà mắc bệnh cầu trùng (35-42 ngày tuổi

      • 4.2.3. Kết quả nghiên cứu hàm lượng protein huyết thanh ở gà mắc bệnh cầutrùng (35-42 ngày tuổi

    • 4.3. KẾT QUẢ PHÂN LẬP GENE MÃ HÓA KHÁNG NGUYÊN 3-1E

      • 4.3.1. Thu và tinh sạch Oocyst cầu trùng gà

      • 4.3.2. Xác định loài cầu trùng bằng phương pháp PCR

      • 4.3.3. Kết quả tách chiết ARN tổng số

      • 4.3.4. Kết quả thực hiện PCR

      • 4.3.5. Tinh sạch sản phẩm PCR

    • 4.4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU TẠO DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GENE 3-1E

      • 4.4.1. Kết quả tạo dòng gene kháng nguyên 3-1E vào vector tách dòng

      • 4.4.2. Phân tích trình tự gene 3-1E

      • 4.4.3. Kết quả tạo dòng gene mã hóa kháng nguyên 3-1E vào vector biểu hiện pET200/D-TOPO

      • 4.4.4. Kết quả về tinh khiết và khả năng liên kết của kháng nguyên 3-1E cùng đuôi dung hợp 6His với cột Ni2+

    • 4.5. TỐI ƯU ĐIỀU KIỆN BIỂU HIỆN CỦA KHÁNG NGUYÊN 3-1E TÁI TỔ HỢP

      • 4.5.1. Kết quả sinh trưởng của E. coli BL21 (DE3) tái tổ hợp mang gene mã hóa kháng nguyên 3-1E

      • 4.5.2. Kết quả về khảo sát đường cong sinh trưởng

      • 4.5.3. Kết quả về tỷ lệ tiếp giống tối ưu

      • 4.5.4. Kết quả tốc độ lắc tối ưu lên khả năng sinh trưởng của vi khuẩn E. coli chủng BL21 (DE3)

      • 4.5.5. Kết quả về môi trường biểu hiện tối ưu

      • 4.5.6. Nồng độ tối ưu của chất cảm ứng IPTG

      • 4.5.7. Thời gian cảm ứng của chất cảm ứng tối ưu

      • 4.5.8. Nhiệt độ cảm ứng tối ưu

      • 4.5.9. Mật độ tế bào tối ưu

    • 4.6. TÁCH CHIẾT, TINH SẠCH, ĐỊNH LƯỢNG VÀ XÁC ĐỊNH TÍNH ĐẶC HIỆU CỦA KHÁNG NGUYÊN 3-1E TÁI TỔ HỢP

      • 4.6.1. Tách chiết, tinh sạch và định lượng kháng nguyên tái tổ hợp 3-1E

      • 4.6.2. Tính đặc hiệu của kháng nguyên tái tổ hợp

    • 4.7. CHẾ TẠO CHẾ PHẨM SINH HỌC SỬ DỤNG TRONG PHÒNG VÀ TRỊ BỆNH CẦU TRÙNG GÀ

      • 4.7.1. Xác định liều lượng kháng nguyên thích hợp để gây miễn dịch cho gà

      • 4.7.2. Nghiên cứu lựa chọn tá chất gây miễn dịch cho gà

      • 4.7.3. Định lượng kháng thể IgY

      • 4.7.4. Xác định hiệu giá kháng thể trong chế phẩm lòng đỏ

      • 4.7.5. Đánh giá hiệu quả phòng bệnh của chế phẩm

      • 4.7.6. Đánh giá hiệu quả điều trị của chế phẩm

  • PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

    • 5.1. KẾT LUẬN

    • 5.2. KIẾN NGHỊ

  • DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ

  • TÀI LIỆU THAM KHẢO

    • Tiếng Việt:

    • Tiếng Anh

Nội dung

TRÍCH YẾU LUẬN ÁN Họ và tên nghiên cứu sinh: Huỳnh Văn Chương Tên luận án: Khảo sát một số đặc điểm bệnh lý của bệnh cầu trùng ở gà và nghiên cứu chế tạo chế phẩm sinh học sử dụng trong

Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Địa điểm nghiên cứu

Địa điểm lấy mẫu: Các trang trại và hộ chăn nuôi gia đình tại huyện Phú Vang - Thừa Thiên Huế

Phòng Thí nghiệm bộ môn Bệnh lý, Khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Trâu Quỳ - Gia Lâm - Hà Nội

Phòng Thí nghiệm Bộ môn Miễn dịch học và vắc xin- Viện công nghệ sinh học - Đại học Huế, Phú Vang - Thừa Thiên Huế.

Thời gian nghiên cứu

Vật liệu, hóa chất và thiết bị nghiên cứu

Mẫu phân, máu, xác gà mắc bệnh cầu trùng các lứa tuổi, các đoạn ruột của gà mắc bệnh cầu trùng sau khi chết gồm: ruột non (tá tràng, không tràng, hồi tràng) và ruột già (manh tràng, kết tràng, trực tràng)

Gà mái đẻ trứng chuyên dụng 17-18 tuần tuổi, được tiêm đầy đủ các loa ̣i vắc xin, không mắc bệnh cầu trùng

Oocyst (noãn nang) cầu trùng được phân lập từ phân gà bị mắc bệnh cầu trùng

Gà 30 ngày tuổi dùng để thí nghiệm đánh giá hiệu quả phòng trị của chế phẩm sinh học có chứa kháng thể kháng cầu trùng gà

Giấy Whatman, túi thẩm tích, đĩa ELISA, ống fancol 15ml, 50ml, eppendorf 1,5ml và một số vật liệu thiết yếu khác

3.3.2 Thiết bị và hóa chất dùng cho nghiên cứu

Máy ly tâm cho ống Eppendorf, hệ thống máy đông khô lạnh Thermo Savant, máy Vortex - genic 2, máy ELISA tự động, khuấy từ IKA C-MAG HS 7, máy đúc Block, máy cắt Microton, máy phân tích huyết học tự động Cell Dyn

3700, máy soi gel Dolphin - Doc, máy lắc có điều nhiệt để nuôi tế bào

Thiết bị điện di, buồng điện di SDS-PAGE, cân phân tích, tủ lạnh, nồi hấp, tủ sấy, kớnh hiển vi quang học, buồng đếm Mc Master, micropipet 2-1000àl, một số máy móc và thiết bị thiết yếu khác

Ngoài các trang thiết bị trên, hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu này bao gồm:

Dung dịch muối NaCl bão hòa, Kali Dichromate (K2Cr2O7) 2,5%, môi trường dùng để bảo quản mẫu bệnh phẩm (formol 10%), hóa chất dùng để nhuộm tiêu bản: Cồn ở các nồng độ, xylen, parafin, thuốc nhuộm Haematoxylin, Eosin Vector pET200/D-TOPO, chủng E coli TOP10, BL21(DE3), Kit

ProBond TM tinh sạch protein của hãng Invitrogen (USA)

Bộ Kit tách chiết ARN tổng số “SV Total RNA Isolation System”, Z3100, Kit tổng hợp sợi AND bổ sung “First Strand cDNA Synthesis” của hãng Fermentas (Nhật Bản), các cặp mồi dùng cho phản ứng RT-PCR, PCR, bộ Kit dùng cho phản ứng PCR (Invitrogen), Kit tinh sạch sản phẩm PCR, “Wizard ® SV Gel and PCR CleanUp System” (Promega)

Yeast Extract (Difco - Mỹ), Trypton (Difco - Mỹ), EDTA (Sigma - Mỹ), axit acetic (Merk - Đức), Kanamycin, Ampicillin (Merk - Đức), X-gal (Sigma - Mỹ), agarose (Sigma - Mỹ), cồn tuyệt đối (Prolabo - Pháp), IPTG (Bio - Rad -

Mỹ, Môi trường dinh dưỡng SOC được cung cấp cùng với bộ “TA-cloning KIT” và “Vector pET200/D-TOPO”

Môi trường LB: 0,5% dịch chiết nấm men, 1% tryptone và 1% NaCl; Môi trường SOB: 2% peptone, 0,5% dịch chiết nấm men, 10mM NaCl, 2,5mM KCl, 10mM MgCl2 và 10mM MgSO4; Môi trường SOC: môi trường SOB và 20mM glucose; Môi trường TB: 1,2% peptone, 2,4% dịch chiết nấm men, 72mM

K2HPO4, 17mM KH2PO4 và 0,4% glycerol

Môi trường YJ: 2% glycerol, 1,5% tryptone, 2% dịch chiết nấm men, 0,25%

K2HPO4.12H2O, 0,016% KH2PO4, 0,05% NaCl và 0,025% MgSO47H2O

Môi trường M9ZB cải tiến: 1% N2HPO4.12H2O, 0,3% KH2PO4, 0,05% NaCl, 1% (NH4)2SO4, 0,2% MgSO4.7H2O, 1,5% glucose, 1% tryptone và 1% dịch chiết nấm men; Môi trường HSG: 1,49% glycerol, 0,7% dịch chiết nấm men, 1,35% tryptone, 0,014% MgSO4.H2O, 0,15% KH2PO4, 0,23% K2HPO4 và 0,5% glycine

Bộ Kit tách dòng “vector pGEM ® -T Easy Vector System”, Kit tách plasmid tái tổ hợp “PureLink ® Quick Plasmid DNA Miniprep” của hãng Invitrogen, Kit tách dòng: Champion™ pET Directional TOPO ® Expression, Kit tinh sạch protein ProBond TM Purification System của hãng Invitrogen

Chỉ thị phân tử protein “SDS-PAGE Molecular Weight Standards, Low Rang”, (Bio-RAD-Mỹ) Kháng nguyên tái tổ hợp 3-1E được sản xuất tại phòng miễn dịch học và vắc xin, Viện công nghệ sinh học Đại học Huế Các chất bổ trợ và hóa chất dùng trong phản ứng ELISA.

Nội dung nghiên cứu

3.4.1 Khảo sát các đặc điểm bệnh lý của bệnh cầu trùng ở gà

- Tỷ lệ nhiễm, cường độ nhiễm

- Bệnh tích đại thể và vi thể

- Chỉ tiêu huyết học của gà mắc bệnh cầu trùng

3.4.2 Nghiên cứu tách dòng gene mã hóa kháng nguyên, tạo plasmid mang gene kháng nguyên, biến nạp vào tế bào E coli

- Nghiên cứu tách dòng gene kháng nguyên

- Nghiên cứu tạo plasmid mang gene kháng nguyên

- Nghiên cứu biến nạp vào tế bào E coli

3.4.3 Nghiên cứu biểu hiện gene kháng nguyên, tách chiết, tinh khiết và định lượng kháng nguyên tái tổ hợp

- Nghiên cứu biểu hiện gene kháng nguyên và tối ưu điều kiện biểu hiện kháng nguyên

- Nghiên cứu tách chiết, tinh khiết kháng nguyên tái tổ hợp

- Nghiên cứu định lượng kháng nguyên tái tổ hợp

3.4.4 Kiểm tra độ tinh khiết và tính đặc hiệu của kháng nguyên tái tổ hợp

- Kiểm tra độ tinh khiết của kháng nguyên tái tổ hợp

- Kiểm tra tính đặc hiệu của kháng nguyên tái tổ hợp

3.4.5 Nghiên cứu sản xuất bột lòng đỏ trứng gà có kháng thể phòng trị bệnh

- Nghiên cứu liều lượng kháng nguyên thích hợp để tối miễn dịch cho gà

- Nghiên cứu lựa chọn tá chất gây miễn dịch cho gà

- Nghiên cứu tách chiết kháng thể từ lòng đỏ trứng gà

- Nghiên cứu định lượng kháng thể trong 1 đơn vị lòng đỏ trứng gà

- Đánh giá hiệu quả điều trị và phòng bệnh bằng bột lòng đỏ trứng gà có kháng thể.

Phương pháp nghiên cứu

3.5.1 Phương pháp theo dõi triệu chứng lâm sàng và xác định bệnh tích đại thể, vi thể của gà mắc cầu trùng

3.5.1.1 Phương pháp xác định tỷ lệ nhiễm, cường độ nhiễm và theo dõi triệu chứng lâm sàng

Các mẫu phân được xét nghiệm theo phương pháp phù nổi, đánh giá mức độ cảm nhiễm của gà Cường độ nhiễm được tính bằng mật độ Oocyst trên vi trường kính hiển vi: vi trường có từ 1-3 Oocyst 1 (+); 4-6 Oocyst 2 (+); 7-10 Oocyst 3 (+); trên 10 Oocyst 4 (+)

Triệu chứng lâm sàng của gà mắc bệnh cầu trùng bằng phương pháp quan sát, theo dõi và ghi chép hằng ngày các biểu hiện chung của đàn gà như: Gà ăn, uống (nhiều hay ít), dáng đi đứng, hoạt động của đàn gà, biểu hiện trạng thái của lông, màu sắc của mào, tích và trạng thái, màu sắc của phân

3.5.1.2 Phương pháp xác định bệnh tích đại thể

Tất cả các gà nhỏ và gà lớn ốm chết nghi mắc cầu trùng đều tiến hành mổ khám để kiểm tra bệnh tích đại thể bằng phương pháp mổ khám không toàn diện của Skrjabin để kiểm tra đường tiêu hóa ở ba đoạn: Manh tràng, ruột non và trực tràng, nạo niêm mạc soi tươi dưới kính hiển vi để tìm và quan sát Oocyst

3.5.1.3 Phương pháp xác định bệnh tích vi thể

Gà nghi mắc bệnh được tiến hành giải phẩu để thu mẫu ở các bộ phận như: Ruột non, hạch màng treo ruột, manh tràng, gan, thận, lách, phổi cho vào lọ vô trùng, ghi thông tin trên mỗi lọ để ký hiệu mẫu và được bảo quản trong Formol

10 % trước khi làm tiêu bản vi thể và soi kính Tiêu bản vi thể được làm theo quy trình tấm đúc bằng Parafin, nhuộm tiêu bản bằng Haematoxylin - Eosin (HE) tại

Bộ môn Bệnh lý, Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam Đọc kết quả dưới kính hiển vi quang học, chụp ảnh và mô tả

3.5.2 Phương pháp xác định chỉ tiêu huyết học của gà mắc bệnh cầu trùng

Máu gà lấy vào buổi sáng trước khi cho ăn cho vào ống có chứa chất chống đông để phân tích các chỉ tiêu về hệ hồng cầu gồm: Số lượng hồng cầu (triệu/mm 3 máu); Hàm lượng Hemoglobin (g/l); Tỷ khối huyết cầu (%); Nồng độ huyết sắc tố trung bình của hồng cầu (g/dl); Lượng huyết sắc tố trung bình của hồng cầu (pg) và thể tích trung bình của hồng cầu (fl), các chỉ tiêu về hệ bạch cầu: Số lượng bạch cầu (nghìn/mm 3 ), công thức bạch cầu (%) và hàm lượng protein huyết thanh được xác định bằng máy tự động Celldyn -3700

3.5.3 Phương pháp tách chiết ADN để xác định loài cầu trùng gây bệnh ở gà

3.5.3.1 Thu thập và tinh sạch Oocyst cầu trùng gà

Mẫu phân gà nghi nhiễm Eimeria được thu nhận trên địa bàn Huyện Phú

Oocyst của ký sinh trùng được thu theo phương pháp phù nổi sử dụng nước muối NaCl bão hòa, sau đó soi dướ i kính hiển vi quang học với độ phóng đại 10x để khẳng đi ̣nh sự có mă ̣t của cầu trùng Di ̣ch thu được từ phương pháp phù nổi được xử lý với chất diệt khuẩn NaClO 5,7% sau đó được rửa lại nhiều lần bằng nước cất vô trùng và một lần với phosphat buffer saline 1X (PBS 1X) (Ding et al., 2012)

3.5.3.2 Phương pháp tách ADN tổng số của cầu trùng gà

ADN được tách từ Oocyst cầu trùng theo phương pháp của Carvalho et al

(2010) có sự cải tiến, Oocyst cầu trùng từ phân được thu nhận bằng phương pháp phù nổi và lắng cặn, tiếp theo bổ sung 1ml dung dịch NaClO 5,75%, ủ trên đá lạnh

30 phút Sau đó bổ sung một khối lượng tương đương hạt thủy tinh (0,1mM) trộn mạnh trong 2 phút để làm vỡ lớp vỏ ngoài của Oocyst ADN tổng số sau khi tách chiết được kết tủa với 2 thể tích của ethanol 100% lạnh, ủ ở - 20ºC trong 30 phút, ly tâm 15.000 vòng/phút trong 15 phút loại bỏ dịch nổi Tủa ADN được rửa với 70% ethanol lạnh, ly tâm 12.000 vòng/phút trong 5 phút (lặp lại 3 lần) Cuối cùng phần kết tủa được hũa tan bằng 50 àl dung dịch TE (50mM Tris-HCl, 10mM EDTA), pH: 7,2) hoặc nước cất vô trùng, ADN được bảo quản -20ºC trước khi tiến hành các thí nghiệm tiếp theo

3.5.3.3 Phương pháp PCR xác định các loài cầu trùng gà

ADN tổng số được sử dụng làm khuôn mẫu để thực hiện phản ứng PCR xác định sự có mặt của các loài cầu trùng Các cặp mồi đặc hiệu cho từng loài cầu trùng giống Eimeria được tham khảo theo (Carvalho et al., 2011)

3.5.4 Phương pháp phân lập gene mã hóa kháng nguyên 3-1E

3.5.4.1 Thiết kế mồi phân lập gene mã hóa kháng nguyên 3-1E

Vùng gene mã hóa tạo protein 3-1E của Eimeria được chọn làm vùng đích để thiết kế cặp mồi thu nhận gene 3-1E (có mã số trên GenBank là AF113613) Trình tự CACC được thêm vào ở đầu 5’ giúp tạo dòng định hướng cho sản phẩm PCR trong vector, 4 nucleotide này được thiết kế bổ sung cho phần lồi ra

(overhang) GTGG của vector pET200/D-TOPO Cặp mồi có trình tự như sau Topo3-1E.F:5’-CACCATGGGTGAAGAGGCTGATAC-3’; topo3-1E.R: 5’- TTAGAAGCCGCCCTGGTACA-3’ được thiết kế dự trên trình tự gene 3-1E đã công bố trên ngân hàng gene, mã số (AF13613)

3.5.4.2 Tách chiết ARN tổng số

ARN tổng số của cầu trùng gà Eimeria được tách chiết bằng Kit “SV Total

RNA Isolation System” Sợi ADN bổ sung đầu tiên được tổng hợp dựa trên Kit

“First Strand cDNA Synthesis” Sản phẩm ARN sau khi tách chiết được ghi kí hiệu mẫu và bảo quản -70ºC để sử dụng cho các thí nghiệm sau

3.5.4.3 Quy tri ̀nh phản ứng tổng hợp sợi ADN bổ sung

Sử dụng bộ Kit của hãng Fermentas (Nhật Bản) và được thực hiện như sau: Chuẩn bị thành phần phản ứng trong ống đặt trên đá gồm: ARN tổng số (0,1- 5,0àg), mồi oligo (dT) 1àl, DEPC (diethylpyro carbonat) 0,1%: bổ sung vào cho đủ 11àl, trộn và ly tõm nhẹ từ 3-5 giõy Ủ mẫu 70ºC trong 5 phỳt, để nguội mẫu trên đá và ly tâm nhẹ để thu dịch đọng trên thành ống eppendorf Đặt ống eppendorf trờn đỏ và thờm vào đệm phản ứng 4 àl (5x), ribonuclease 1àl (20 U/àl), 10mM hỗn hợp dNPT 2àl, trộn và ly tõm nhẹ Ủ ở 37ºC trong 5 phỳt sau đú bổ sung enzyme phiờn mó ngược 2àl (20 U/àl), ủ ở 37ºC trong 60 phỳt, dừng phản ứng bằng cách ủ ở 70ºC trong 10 phút, sau đó để nguội trên đá

3.5.4.4 Quy tri ̀nh phản ứng PCR phân lập gene 3-1E

Sợi ADN bổ sung thứ nhất sau khi được tổng hợp sử dụng làm khuôn mẫu cho phản ứng PCR phân lập gene mã hóa tạo kháng nguyên 3-1E với cặp mồi topo3-1E.F và topo3-1E.R

Thành phần PCR bao gồm: 3àl ADN, 25àl 2ì PCR master mix (2,4mM dNTP mỗi loại, 0,3 đơn vị Taq ADN polymerase (Thermo Fisher Scientific), 20 pmol mồi xuụi, 20 pmol mồi ngược, 2,5àl DMSO và bổ sung nước cất vụ trựng để đạt thể tớch phản ứng là 50àl PCR được thực hiờ ̣n trong mỏy luõn nhiệt (iCycler, Bio-Rad) theo quy trình sau: biến tính genome 95 o C/5 phút; tiếp đến là

Ngày đăng: 12/06/2021, 12:07

Nguồn tham khảo

Tài liệu tham khảo Loại Chi tiết
4. Đinh Thị Bích Lân, Phùng Thăng Long, Nguyễn Hoàng Lộc, Hoàng Tấn Quảng, Trần Thúy Lan, Lê Quốc Việt, Đặng Thanh Long, Lê Công Thịnh, Huỳnh Văn Chương và Đặng Thị Thu Giang (2014). Cải thiện mức độ biểu hiện kháng nguyên tái tổ hợp Cryptosporidium parvum Cp23 trong Escherichia coli BL21 (DE3). Tạp chí Khoa học Kỹ thuật thú y. 6 (21). tr. 35-42 Sách, tạp chí
Tiêu đề: Cryptosporidium parvum" Cp23 trong "Escherichia coli
Tác giả: Đinh Thị Bích Lân, Phùng Thăng Long, Nguyễn Hoàng Lộc, Hoàng Tấn Quảng, Trần Thúy Lan, Lê Quốc Việt, Đặng Thanh Long, Lê Công Thịnh, Huỳnh Văn Chương và Đặng Thị Thu Giang
Năm: 2014
5. Đinh Thị Bích Lân, Phùng Thăng Long, Nguyễn Hoàng Lộc, Giang Thanh Nhã, Nguyễn Quang Vinh và Trần Thúy Lan (2009). Nghiên cứu sản xuất que chẩn đoán nhanh bệnh do Toxoplasma gondii gây ra ở người và gia súc. Tạp chí Khoa học Kỹ thuật thú y. 6. tr. 56-61 Sách, tạp chí
Tiêu đề: Toxoplasma gondii
Tác giả: Đinh Thị Bích Lân, Phùng Thăng Long, Nguyễn Hoàng Lộc, Giang Thanh Nhã, Nguyễn Quang Vinh và Trần Thúy Lan
Năm: 2009
10. Hoàng Trung Kiên, Đỗ Khắc Đại, Nguyễn Ngọc Tuấn, Đỗ Minh Trung, Nguyễn Thị Hòa, Dương Hương Giang và Lê Văn Đông (2010). Nghiên cứu chế tạo kháng thể kháng Edwardsiella ictaluri gây bệnh mủ gan ở cá tra bằng công nghệ tạo kháng thể IgY ở gà. Tạp chí Thông tin Y dược. tr. 71-76 Sách, tạp chí
Tiêu đề: Edwardsiella ictaluri
Tác giả: Hoàng Trung Kiên, Đỗ Khắc Đại, Nguyễn Ngọc Tuấn, Đỗ Minh Trung, Nguyễn Thị Hòa, Dương Hương Giang và Lê Văn Đông
Năm: 2010
13. Lê Văn Đông và Dương Hương Giang (2011). Nghiên cứu chế tạo kháng thể từ lòng đỏ trứng gà (IgY) kháng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh mủ gan ở cá tra. Tạp chí Y- Dược học quân sự. (1). tr. 1-7 Sách, tạp chí
Tiêu đề: Edwardsiella ictaluri
Tác giả: Lê Văn Đông và Dương Hương Giang
Năm: 2011
15. Nguyễn Hoàng Lộc, Nguyễn Thị Khánh Quỳnh, Hoàng Tấn Quảng, Trần Thúy Lan, Lê Mỹ Tiểu Ngọc, Đinh Thị Bích Lân và Phùng Thăng Long (2014). Nghiên cứu cải thiện mức độ biểu hiện của kháng nguyên bám dính K88 tái tổ hợp phân lập từ Escherichia coli mang độc tố đường ruột của lợn con cai sữa. Tạp chí Công nghệ sinh học. 35 (1). tr. 120-125 Sách, tạp chí
Tiêu đề: Escherichia coli
Tác giả: Nguyễn Hoàng Lộc, Nguyễn Thị Khánh Quỳnh, Hoàng Tấn Quảng, Trần Thúy Lan, Lê Mỹ Tiểu Ngọc, Đinh Thị Bích Lân và Phùng Thăng Long
Năm: 2014
25. Trần Thanh Vân (2007). Một số đặc điểm sinh học và khả năng sinh trưởng của gà địa phương “Lục trảo - Đán Khao” - Cao Lộc, Lạng Sơn. Tạp chí Khoa học và Công nghệ. 4 (44). tr. 103-108.Tiếng Anh Sách, tạp chí
Tiêu đề: Lục trảo - Đán Khao
Tác giả: Trần Thanh Vân
Năm: 2007
30. Allen P. C. and R. H. Fetterer (2002). Recent advances in biology and immuno biology of Eimeria species and in diagnosis and control of infection with these coccidian parasites of poultry. Cliinical Microbiology Review. Vol. 15 (1). pp. 58-65 Sách, tạp chí
Tiêu đề: Eimeria
Tác giả: Allen P. C. and R. H. Fetterer
Năm: 2002
35. Carvalho F. S., A. A. Wenceslau, M. Teixeira and G. R. Albuquerque (2010). Molecular diagnosis of Eimeria species affecting naturally infected Gallus gallus.GMR Genetics and Molecular research. Vol. 10. pp. 996-1005 Sách, tạp chí
Tiêu đề: Eimeria
Tác giả: Carvalho F. S., A. A. Wenceslau, M. Teixeira and G. R. Albuquerque
Năm: 2010
39. Choi J. H., K. C. Keum and S. Y. Lee (2006). Production of recombinant proteins by high cell density culture of Escherichia coli. Chemical Engineering Science.Vol. 61 (3). pp. 876-885 Sách, tạp chí
Tiêu đề: Escherichia coli
Tác giả: Choi J. H., K. C. Keum and S. Y. Lee
Năm: 2006
40. Choi K. D. and H. S. Lillehoj (2000). Role of chicken IL-2 on gammadelta T-cells and Eimeria acervulina-induced changes in intestinal IL-2 mRNA expression and gammadelta T-cells. Vet Immunol Immunopathol. Vol. 73 (3-4). pp. 309-321 Sách, tạp chí
Tiêu đề: Eimeria acervulina
Tác giả: Choi K. D. and H. S. Lillehoj
Năm: 2000
41. Choi K. D., H. S. Lillehoj and D. S. Zalenga (1999). Changes in local IFN-gamma and TGF-beta4 mRNA expression and intraepithelial lymphocytes following Eimeria acervulina infection. Vet Immunol Immunopathol. Vol. 71 (3-4). pp. 263-275 Sách, tạp chí
Tiêu đề: Eimeria acervulina
Tác giả: Choi K. D., H. S. Lillehoj and D. S. Zalenga
Năm: 1999
42. Constantinoiu C. C., J. B. Molloy, W. K. Jorgensen and G. T. Coleman (2007). Development and validation of an ELISA for detecting antibodies to Eimeria tenella in chickens. Vet Parasitol. Vol. 150 (4). pp. 306-313 Sách, tạp chí
Tiêu đề: Eimeria tenella
Tác giả: Constantinoiu C. C., J. B. Molloy, W. K. Jorgensen and G. T. Coleman
Năm: 2007
44. Dalloul R.A., H. S. Lillehoj, T. A. Shellem and J.A. Doerr (2003). Enhanced mucosal immunity against Eimeria acervulina in broilers fed a Lactobacillus- based probiotic. Poult Sci. Vol. 82 (1). pp. 62-66 Sách, tạp chí
Tiêu đề: Eimeria acervulina
Tác giả: Dalloul R.A., H. S. Lillehoj, T. A. Shellem and J.A. Doerr
Năm: 2003
49. Ding J., W. Qian and Q. Liu (2012). Multi-epitope recombinant vaccine induces immunoprotection against mixed infection of Eimeria spp. Parasitol Res. Vol. 110 (6). pp. 2297-2306 Sách, tạp chí
Tiêu đề: Eimeria
Tác giả: Ding J., W. Qian and Q. Liu
Năm: 2012
50. Ding X., H. S. Lillehoj, R. A. Dalloul, W. Min, T. Sato, A. Yasuda and E. P. Lillehoj (2005). In ovo vaccination with the Eimeria tenella EtMIC2 gene induces protective immunity against coccidiosis. Vaccine. Vol. 23 (28). pp. 3733-3740 Sách, tạp chí
Tiêu đề: Eimeria tenella
Tác giả: Ding X., H. S. Lillehoj, R. A. Dalloul, W. Min, T. Sato, A. Yasuda and E. P. Lillehoj
Năm: 2005
55. Finlay R. C., S. J. Roberts and A. C. Hayday (1993). Dynamic response of murine gut intraepithelial T cells after infection by the coccidian parasite Eimeria. J Sách, tạp chí
Tiêu đề: Eimeria
Tác giả: Finlay R. C., S. J. Roberts and A. C. Hayday
Năm: 1993
63. Ikemori Y., M. Kuroki, R. C. Peralta, H. Yokoyama and Y. Kodama (1992). Protection of neonatal calves against fatal enteric colibacillosis by administration of egg yolk powder from hens immunized with K99-piliatedenterotoxigenic Escherichia coli. AmJ Vet Res. Vol. 53 (11). pp. 2005-2008 Sách, tạp chí
Tiêu đề: Escherichia coli
Tác giả: Ikemori Y., M. Kuroki, R. C. Peralta, H. Yokoyama and Y. Kodama
Năm: 1992
68. Kollberg H., D. Carlander, H. Olesen, P. E. Wejaker, M. Johannesson and A. Larsson (2003). Oral administration of specific yolk antibodies (IgY) may prevent Pseudomonas aeruginosa infections in patients with cystic fibrosis. a phase I feasibility study. Pediatr Pulmonol. Vol. 35 (6). pp. 433-440 Sách, tạp chí
Tiêu đề: Pseudomonas aeruginosa
Tác giả: Kollberg H., D. Carlander, H. Olesen, P. E. Wejaker, M. Johannesson and A. Larsson
Năm: 2003
70. Laurent F., C. Bourdieu, M. Kazanji, P. Yvoré and P. Péry (1994). The immunodominant Eimeria acervulina sporozoite antigen previously described as p160/p240 is a 19-kilodalton antigen present in several Eimeria species. Molecular Biochemical Parasitology. Vol. 63 (1). pp. 79-86 Sách, tạp chí
Tiêu đề: Eimeria acervulina
Tác giả: Laurent F., C. Bourdieu, M. Kazanji, P. Yvoré and P. Péry
Năm: 1994
71. Lee H. W., S. J. Yoon, H. K. Kim, K. M. Park, T. K. Oh and J. K. Jung (2000). Overexpression of an alkaline lipase gene from Proteus vulgaris K80 in Escherichia coli BL21/pKLE. Biotechnology Letters. 22. pp. 1543-1547 Sách, tạp chí
Tiêu đề: Escherichia coli
Tác giả: Lee H. W., S. J. Yoon, H. K. Kim, K. M. Park, T. K. Oh and J. K. Jung
Năm: 2000

TỪ KHÓA LIÊN QUAN

TRÍCH ĐOẠN

Những ứng dụng của IgY

TÀI LIỆU CÙNG NGƯỜI DÙNG

TÀI LIỆU LIÊN QUAN

🧩 Sản phẩm bạn có thể quan tâm

w