Khóa luận tốt nghiệp đại học ngành Dược học: Nghiên cứu phân lập các hợp chất flavonoid từ loài Bùm bụp [Mallotus apelta (Lour.) Muell. –Arg.]

Nội dung của khóa luận tốt nghiệp bao gồm: Chiết xuất, phân lập một số hợp chất flavonoid từ loài M. apelta bằng các phương pháp sắc ký; Xác định cấu trúc của các hợp chất đã phân lập được bằng các phương pháp vật lý và hóa học. Mời các bạn tham khảo!

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

[Mallotus apelta (Lour.) Muell – Arg.]

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

HÀ NỘI - 2020

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

[Mallotus apelta (Lour.) Muell – Arg.]

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

KHÓA: QH2015.Y

NGƯỜI HƯỚNG DẪN: PGS.TS NGUYỄN XUÂN NHIỆM

ThS HÀ THỊ THANH HƯƠNG

HÀ NỘI- 2020

LỜI CẢM ƠN

Khóa luận tốt nghiệp này được hoàn thành tại phòng Nghiên cứu cấu trúc, Viện Hóa sinh biển - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Trong quá trình nghiên cứu, em đã nhận được nhiều sự giúp đỡ quý báu của các thầy cô, các nhà khoa học, bạn bè và gia đình

Em xin trân trọng bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc tới Ban lãnh đạo Viện Hóa sinh biển cùng tập thể cán bộ của Viện về sự quan tâm, ủng hộ to lớn và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Em xin chân thành cảm ơn thầy cô trong khoa Y Dược – Đại học Quốc gia

Hà Nội đã tạo điều kiện và tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, dạy bảo em trong suốt quá trình học tập ở trường và hoàn thiện khóa luận

Em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành, sự cảm phục và kính trọng nhất tới PGS.TS Nguyễn Xuân Nhiệm và ThS Hà Thị Thanh Hương - những người Thầy

đã tận tâm hướng dẫn khoa học, động viên, khích lệ và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho em trong suốt thời gian thực hiện khóa luận tốt nghiệp

Em trân trọng và biết ơn sâu sắc tới tất cả mọi người trong gia đình, bạn bè

đã động viên, khích lệ giúp em trong quá trình học tập và làm khóa luận

Trong quá trình làm khóa luận tốt nghiệp này, mặc dù đã hết sức cố gắng nhưng chắc chắn còn có những thiếu sót Vì vậy, em kính mong nhận được sự đóng góp ý kiến của quý thầy, cô và các bạn để khóa luận em được hoàn chỉnh hơn

Em xin chân thành cảm cảm ơn!

Hà Nội, tháng 06 năm 2020

Sinh viên Sinh Nguyễn Thị Sinh

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

13C-NMR Carbon -13 nuclear magnetic

Virut viêm gan B trên vịt

ESI-MS Electrospray ionization mass

spectrum

Phổ khối lượng ion hóa phun

mù điê ̣n tử Glc Glucose

HepG2 Hepatocyte carcinoma cell Tế bào ung thư gan

HL-60 Human promyelocytic leukemia cell Tế bào ung thư máu người HMBC Heteronuclear mutiple bond

RD

TLC

Rhabdosarcoma

Thin layer chromatography

Ung thư màng tim

Sắc ký lớp mỏng

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU………1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Giới thiệu về chi Mallotus 3

1.1.1 Đặc điểm thực vật 3

1.1.2 Tình hình sử dụng trong y học cổ truyền các loài thuộc chi Mallotus 4

1.2 Giới thiệu về loài M apelta 4

1.2.1 Đặc điểm thực vật 4

1.2.2 Sinh thái và phân bố 5

1.2.3 Thành phần hóa học 5

1.2.3.1 Các hợp chất diterpen 5

1.2.3.2 Các hợp chất coumarinolignoid 7

1.2.3.3 Các hợp chất benzopyran 8

1.2.3.4 Các hợp chất flavonoid 11

1.2.3.5 Các hợp chất alcaloid 12

1.2.3.6 Các hợp chất steroid 12

1.2.3.7 Các hợp chất triterpenoid 13

1.2.4 Tác dụng sinh học 14

1.2.4.1 Tác dụng hỗ trợ và điều trị ung thư 14

1.2.4.2 Hoạt tính kháng viêm, kháng khuẩn 15

1.2.4.3 Tác dụng chống oxy hóa, bảo vệ gan, ức chế miến dịch 15

1.2.5 Công dụng 16

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.1 Mẫu thực vật 17

2.2 Phương pháp nghiên cứu 17

2.2.1 Phương pháp phân lập các hợp chất 17

2.2.1.1 Sắc ký lớp mỏng (TLC) 17

2.2.1.2 Sắc ký cột (CC) 17

2.2.2 Phương pháp xác định cấu trúc 17

2.2.2.1 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) 17

2.2.2.2 Điểm nóng chảy (M p ) 18

2.2.3 .Dụng cụ và thiết bị tách chiết 18

2.2.4 Dụng cụ và thiết bị xác định cấu trúc hóa học của hợp chất 18

2.3 Hóa chất 18

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 20

3.1 Kết quả chiết xuất và phân lập hợp chất 20

3.1.1 Chiết xuất cao toàn phần và phân đoạn 20

3.1.1 Phân lập các hợp chất 20

3.2 Kết quả xác định cấu trúc của các hợp chất đã phân lập được 21

3.2.1 Hợp chất MA1: Vitexin 21

3.2.2 Hợp chất MA2: apigenin-7-O-β-D-glucosid 23

3.2.3 Hợp chất MA3: apigenin 7-O-β-D-apiofuranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranosid 25 3.3 Thảo luận kết quả 27

3.3.1 Vitexin……… 27

3.3.2 Apigenin-7-O-β-D-glucosid 28

3.3.3 Apigenin 7-O-β-D-apiofuranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranosid 28

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 29

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Các loài thuộc chi Mallotus đặc hữu của Việt Nam 3

Bảng 1.2 Các hợp chất diterpen (1-5) từ loài M apelta 6

Bảng 1.3 Các hợp chất coumarinolignoid (6-12) từ loài M apelta 7

Bảng 1.4 Các hợp chất benzopyran (13-24) từ loài M apelta 8

Bảng 1.5 Các hợp chất flavonoid (25-26) 11

Bảng 1.6 Các hợp chất alcaloid (27-28) 12

Bảng 1.7 Các hợp chất steroid (29-32) 12

Bảng 1.8 Các hợp chất triterpenoid (33-35) 13

Bảng 3.1 Số liệu phổ NMR của hợp chất MA1 và hợp chất tham khảo 22

Bảng 3.2 Số liệu phổ NMR của chất MA2 và chất tham khảo 24

Bảng 3.3 Số liệu phổ NMR của chất MA3 và chất tham khảo 25

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Hình ảnh loài M apelta 4

Hình 1.2 Cấu trúc các hợp chất diterpen (1-5) 7

Hình 1.3 Cấu trúc các hợp chất coumarinolignoid (6-12) 8

Hình 1.4 Cấu trúc các hợp chất benzopyran (13-24) 11

Hình 1.5 Cấu trúc các hợp chất flavonoid (25-26) 11

Hình 1.6 Cấu trúc các hợp chất alcaloid (27-28) 12

Hình 1.7 Cấu trúc các hợp chất steroid (29-32) 13

Hình 1.8 Cấu trúc các hợp chất triterpenoid (33-35) 14

Hình 3.1 Sơ đồ chiết, phân lập các hợp chất từ loài M apelta 21

Hình 3.2 Cấu trúc và các tương tác HMBC chính của hợp chất MA1 22

Hình 3.3 Cấu trúc hóa học của hợp chất MA2 24

Hình 3.4 Cấu trúc hóa học của hợp chất MA3 25

1

MỞ ĐẦU

Điều kiện tự nhiên và khí hậu đặc trưng và đa dạng giữa vùng miền, đã đem lại cho đất nước Việt Nam một hệ sinh thái thực vật phong phú Bên cạnh

đó, Việt Nam cũng là một trong những quốc gia có nền y học cổ truyền lâu đời

sử dụng nhiều loại thảo dược trong điều trị bệnh và tăng cường sức khoẻ Theo các nhà khoa học, Việt Nam có khoảng 12.000 loài thực vật bậc cao Trong đó, hơn 4.000 loài được sử dụng làm dược liệu và thuốc chữa bệnh [1] Vai trò của nguồn tài nguyên cây thuốc ngày càng được nâng cao do có tiềm năng to lớn trong việc nghiên cứu phát triển các loại thuốc trong điều trị bệnh

Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), việc sử dụng các loại thuốc thảo dược truyền thống đã trở nên quan trọng hơn, ngay cả trong y học phương Tây [27] Hướng nghiên cứu tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính sinh học từ các cây thuốc truyền thống đang là lĩnh vực được nhiều nhà khoa học quan tâm Đó là những nghiên cứu cơ bản về xác định thành phần hóa học và tìm ra hoạt chất thể hiện hoạt tính tác dụng chữa bệnh và nâng cao sức khỏe con người Cho đến nay, trên thế giới

đã tìm ra nhiều hợp chất có nguồn gốc tự nhiên sử dụng làm thuốc để điều trị và nâng cao sức khỏe

Chi Ba bét (Mallotus) là một chi khá lớn, gồm khoảng 150 loài, phân bố tại

các khu vực từ Ấn Độ, Sri Lanka đến các nước Đông Nam Á.Trên thế giới, một số

loài thuộc chi Mallotus được sử dụng trong y học cổ truyền để điều trị các loại bệnh khác nhau Ở Trung Quốc, loài bục núi cao M japonicus được sử dụng để chữa

bệnh viêm loét dạ dày, tá tràng và điều hòa các chức phận của bộ máy tiêu hóa nói

chung Loài bục trườn M repandus được sử dụng tại Thái Lan để chữa bệnh viêm

dạ dày, viêm đau gan, viêm đau khớp và chữa rắn độc cắn Ở nước ta, loài bai bái

M contubernalis làm thuốc chữa các bệnh thấp khớp, u phong, mụn nhọt và

ngứa [5] Các nghiên cứu dược lý hiện đại cho thấy các loài thuộc chi Mallotus

chứa nhiều hợp chất nhóm flavonoid có hoạt tính tốt như: kháng nấm, kháng ký sinh trùng, gây độc tế bào, chống oxy hóa,…[24]

Xuất phát từ các cơ sở trên, việc nghiên cứu và khai thác các chất có hoạt tính sinh học ứng dụng trong lĩnh vực Y-Dược từ các nguồn dược liệu ở Việt Nam

là rất cần thiết và có ý nghĩa về mặt khoa học cũng như thực tiễn Vì vậy, em đã lựa

chọn loài M apelta thuộc chi Mallotus, họ Thầu dầu (Euphorbiaceae) làm đối tượng

nghiên cứu cho đề tài: “Nghiên cứu phân lập các hợp chất flavonoid từ loài Bùm

bụp [Mallotus apelta (Lour.) Muell –Arg.]” Với mục đích nghiên cứu thành phần

2

flavonoid có trong loài Bùm bụp và xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất đã được phân lập

Nội dung của khóa luận tốt nghiệp bao gồm:

1 Chiết xuất, phân lập một số hợp chất flavonoid từ loài M apelta bằng các

phương pháp sắc ký;

2 Xác định cấu trúc của các hợp chất đã phân lập được bằng các phương pháp vật lý và hóa học

3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Giới thiệu về chi Mallotus

1.1.1 Đặc điểm thực vật

Chi Mallotus (Ba bét) thuộc bộ Malpighiales (Sơ ri), họ Euphorbiaceae

(Thầu dầu), phân họ Acalyphoidae (Tai tượng)

Chi Mallotus là loại cây bụi, bụi trườn hoặc gỗ nhỏ đến cây gỗ; cây thường

đơn tính, khác gốc hoặc cùng gốc Lá xếp xoắn ốc hoặc mọc đối Cụm hoa đơn tính, mọc ở đầu cành hay nách lá; thường là chùm hoặc bông, ít khi là chùy Hoa đơn tính; đài 2 – 4 (5) thùy, không cánh tràng Quả nang nhẵn hoặc có lông hình sao hoặc nhẵn, khi khô nứt làm 3 mảnh Hạt gần hình cầu hay hình trứng, vỏ nhẵn, bóng màu đen [5]

Mallotus là chi tương đối lớn trong họ Euphorbiaceae, gồm khoảng 150 loài

[5, 24], phân bố rải rác ở vùng nhiê ̣t đới Nam Á và Đông Nam Á như ở Malaysian

có 75 loài, Trung Quốc có 40 loài,…[7] Nơi tập trung sự đa dạng cao nhất của chi này là vùng nhiệt đới Nam Á và Đông Nam Á [1]

Ở Việt Nam, theo thống kê có 40 loài thuộc chi Mallotus [7, 24] với 7 loài đặc

hữu [7]

Bảng 1.1 Các loài thuộc chi Mallotus đặc hữu của Việt Nam

3 Mallotuseberhardtii Gagnep Đỏ đọt, ngoát,

ngút

Các tỉnh miền Trung và miền Nam như Thừa Thiên Huế, Kiên Giang

4

7 Mallotus cuneatus Ridl var

glabratus Thin

Ba bét nhẵn Các tỉnh phía Bắc

1.1.2 Tình hình sử dụng trong y học cổ truyền các loài thuộc chi Mallotus

Trên thế giới, một số loài thuộc chi Mallotus được sử dụng trong y học cổ truyền để điều trị các loại bệnh khác nhau Ở Trung Quốc, loài bục núi cao M

japonicus được sử dụng để chữa bệnh viêm loét dạ dày, tá tràng và điều hòa các chức

phận của bộ máy tiêu hóa nói chung Loài bục trườn M repandus được sử dụng tại

Thái Lan để chữa bệnh viêm dạ dày, viêm đau gan, viêm đau khớp và chữa rắn độc

cắn Ở nước ta, loài bai bái M contubernalis làm thuốc chữa các bệnh thấp khớp, u

phong, mụn nhọt và ngứa [2, 4, 5]

1.2 Giới thiệu về loài M apelta

1.2.1 Đặc điểm thực vật

Hình 1.1 Hình ảnh loài M apelta

Tên khoa học: Mallotus apelta (Lour.) Muell.-Arg [1]

Tên Việt Nam: Bùm bụp, bông bét, lá cám, cây ruông, may tap chỉ (Tày), co

5

Bộ Sơ ri: Malpighiales

Họ Thầu dầu: Euphorbiaceae

Chi: Mallotus

Cây bụi hoặc cây gỗ nhỡ cao 1 – 6 m [21] Cành non có lông màu vàng nhạt

Lá mọc so le, hình bầu dục hay hình trứng, nguyên hoặc chia 3 thùy nông, dài khoảng 20 cm, rộng 12 cm, mép nguyên hoặc khía răng thưa không rõ ràng, gốc hình tim hoặc gần bằng, mặt trên màu lục, mặt dưới phủ lông mềm và phấn màu trắng, gân lá hình mạng rõ, có 3 – 5 cái tỏa từ gốc, cuống lá dài 10 – 20 cm, có lông Hoa đơn tính khác gốc mọc thành bông đuôi sóc, thõng xuống, dài 20 – 50 cm; cụm hoa đực đôi khi phân nhánh, hoa không cuống, dài có 4 răng, hơi dính nhau ở gốc, không có tràng, nhị rất nhiều, chỉ nhị nhẵn, không có nhụy lép; cụm hoa cái có đài hợp, 4 – 5 răng, có lông trắng, vòi nhụy 3 – 4, bầu có gai mềm [24] Quả nang có nhiều gai mềm phủ đầy lông hình sao màu trắng nhạt, khi chín nứt làm 3 mảnh; hạt hình trứng, màu nâu đen Ra hoa tháng 4 – 6, có quả tháng 7 – 9 [5]

1.2.2 Sinh thái và phân bố

Cây thường mọc ở ven rừng, ven đường, trên sườn đồi núi sau nương rẫy, trên bãi đất hoang, lên tới độ cao 700 m (so với mực nước biển) Khả năng tái sinh bằng hạt mạnh, nhất là ở những nơi đất còn tốt và chiếu sáng nhiều, cây mọc từ hạt sau 2 năm đã có thể ra hoa [1, 5]

Cây phân bố rộng rãi ở miền Nam Trung Quốc và ở các nước Đông Nam Á

Ở Việt Nam, cây phân bố tại Sơn La, Bắc Cạn, Thái Nguyên, Lạng Sơn, Phú Thọ, Vĩnh Phúc, Bắc Giang, Hòa Bình, Ninh Bình, Hà Nam… đến các tỉnh Tây Nguyên, Đồng Nai, Bà Rịa – Vũng Tàu… [5, 21]

1.2.3 Thành phần hóa học

Theo những công trình đã được công bố cho thấy, thành phần hóa học của

loài M apelta, bao gồm các nhóm chất chính như: diterpenoid, coumarin, triterpene,

steroid, benzopyran, flavonoid và alcaloid [21, 22] Các hợp chất hóa học được phân lập từ các bộ phận khác nhau của loài này

1.2.3.1 Các hợp chất diterpen

Các nghiên cứu về hóa thực vật loài M apelta đã được các nhà khoa học

Trung Quốc quan tâm nghiên cứu khá sớm Năm 1999, nhóm nghiên cứu của các

8

Hình 1.3 Cấu trúc các hợp chất coumarinolignoid (6-12)

1.2.3.3 Các hợp chất benzopyran

Có 12 hợp chất benzopyran (13-24) đã được các nhà khoa học phân lập và

xác định cấu trúc từ loài M apelta (Bảng 1.3, Hình 1.4)

Bảng 1.4 Các hợp chất benzopyran (13-24) từ loài M apelta

10

apelta như một số hợp chất terpen, benzopyran, coumarinolignoid, flavonoid và

steroid Điều này góp phần tạo cơ sở khoa học lý giải công dụng chữa bệnh theo y học cổ truyền Việt Nam, Trung Quốc và các quốc gia khác

1.2.4 Tác dụng sinh học

1.2.4.1 Tác dụng hỗ trợ và điều trị ung thư

Hoạt tính sinh học của một số hợp chất được phân lập từ các loài thuộc chi

Mallotus có hoạt tính gây độc tế bào ung thư in vitro trên các dòng tế bào ung thư

màng tim (RD), ung thư gan (Hep-2), ung thư biểu mô (KB)[8, 16, 24]

Hai hợp chất benzopyran 2,2-dimethyl-2H-1-benzopyran (23) và 6-(1'-Oxo-3'(R)-methoxy-butyl)-5,7-

6-(1'-Oxo-3'(R)-hydroxy-butyl)-5,7-dimethoxy-dimethoxy-2,2-dimethyl-2H-1-benzopyran (24) được phân lập từ lá của loài M

apelta có hoạt tính gây độc tế bào Kết quả nghiên cứu cho thấy hợp chất

6-(1'-Oxo-3'(R)-methoxy-butyl)-5,7-dimethoxy-2,2-dimethyl-2H-1-benzopyran (24) có

15

tác dụng gây độc tế bào mạnh trên 2 dòng tế bào ung thư Hep-2 và RD với giá trị IC50 lần lượt là 0,49 và 0,54 µg/ml, trong khi đó hợp chất 6-(1'-Oxo-3'(R)-hydroxy-

butyl)-5,7-dimethoxy-2,2-dimethyl-2H-1-benzopyran (23) cho tác dụng vừa phải

trên dòng tế bào ung thư Hep-2 với giá trị IC50 là 4,22 µg/ml [16]

Nghiên cứu cho thấy hợp chất malloapelta B (22)cho thấy tác dụng gây độc

tế bào mạnh đối với 2 dòng tế bào ung thư gan (Hep-2) và ung thư biểu mô (KB) với giá trịIC50 lần lượt là 0,49 µg/m và 0,54 µg/m [23]

1.2.4.2 Hoạt tính kháng viêm, kháng khuẩn

Nghiên cứu công bố năm 1993 của tác giả Feng L cho thấy 4 hợp chất

erythrodiol-3-acetate (34), β-sitosterol (29), 3β,29-dihydroxylupane (33) và axit acetylursolic (35) có hoạt tính kháng khuẩn Nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn cho thấy, các hợp chất (29), (33-35) thể hiện hoạt tính kháng các chủng vi khuẩn

Staphulococus aureus, Bacillus subtilis, Escherichia coli, và Bacillus pyocyaneum

[25]

Nhóm các tác giả An T Y đã tiến hành nghiên cứu đánh giá hoạt tính kháng

sinh trên các chủng Staphulococus aureus, Micrococus lutens, Pseudomonas

aeruginosa và Escherichia coli của 7 dẫn xuất benzopyran là

chủng M lutens với giá trị nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) là 7,34 µg/ml [8]

Hợp chất malloapleta B có hoạt tính ức chế yếu tố gây viêm NF-B với giái trị IC50 = 5,0 µM [23]

1.2.4.3 Tác dụng chống oxy hóa, bảo vệ gan, ức chế miến dịch

Theo nghiên cứu, hợp chất astilbin (26) có hoạt tính chống oxy hóa, bảo vê ̣

gan, ứ c chế miễn di ̣ch [6]