Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu biểu hiện gen GmCHI1A liên quan đến tổng hợp isoflavone phân lập từ cây đậu tương (Glycine max (L.) Merill)

Mục đích nghiên cứu đề tài là biểu hiện được gen GmCHI1A trên cây đậu tương chuyển gen và tạo được dòng đậu tương chuyển gen GmCHI1A có hàm lượng isoflavone cao hơn đối chứng không chuyển gen. Mời các bạn cùng tham khảo!

Trang 1

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

LÊ THỊ HỒNG TRANG

NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN GmCHI1A

LIÊN QUAN ĐẾN TỔNG HỢP ISOFLAVONE PHÂN

LẬP TỪ CÂY ĐẬU TƯƠNG [Glycine max (L.) Merill]

Ngành: Di truyền học

Mã số: 9420121

T M TẮT LUẬN N TIẾN S SINH HỌC

TH I NGUYÊN - 2020

Trang 2

Công trình được hoàn thành tại:

ĐẠI HỌC TH I NGUYÊN – TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

Người hướng dẫn khoa học: GS.TS Chu Hoàng Mậu

Có thể tìm hiểu luận án tại:

1 Thư viện Quốc gia Việt Nam

2 Trung tâm học liệu Đại học Thái Nguyên

3 Thư viện Trường Đại học Sư phạm – Đại học Thái Nguyên

Trang 3

C C CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN N

1 Huu Quan Nguyen, Thi Hong Trang Le, Thi Ngoc Lan Nguyen, Thu Giang Nguyen, Danh Thuong Sy, Quang Tan Tu, Thi Thu Thuy Vu, Van Son Le, Hoang Mau Chu, Thi Kim Lien Vu (2020),

“Overexpressing GmCHI1A increases the isoflavone content of transgenic soybean (Glycine max (L.) Merr.) seeds“, In Vitro Cellular & Developmental Biology – Plant, (SCIE, Q2)

https://doi.org/10.1007/s11627-020-10076-x

2 Lê Thị Hồng Trang, Chu Hoàng Mậu, Nguyễn Hữu Quân (2019),

“Chuyển gen Glycine max chalcone isomerase 1A vào cây thuốc lá thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens: Một mô hình cho tăng cường biểu hiện gen GmCHI1A ở cây đậu tương”, Tạp chí Khoa học&Công nghệ Đại học Thái Nguyên 207(14), tr 195-200

3 Lê Thị Hồng Trang, Hồ Mạnh Tường, Lê Văn Sơn, Chu Hoàng Mậu

(2018), “Thiết kế vector chuyển gen mang gen GmCHI phân lập từ

cây đậu tương”, Proceedings Hội nghị CNSH toàn quốc 2018, Nxb Khoa học tự nhiên Công nghệ tr 83-87

4 Lê Thị Hồng Trang, Trần Thị Thanh Vân, Hồ Mạnh Tường, Phạm Thanh Tùng, Lê Văn Sơn, Chu Hoàng Mậu (2016), “Đặc điểm của

gen GmCHI phân lập từ các giống đậu tương khác nhau về hàm lượng isoflavone”, TAP CHI SINH HOC 38(2), tr 236-242

Các trình tự gen đăng ký trên Ngân hàng gen quốc tế

1 Le,T.H.T., Ho,T.M., Hoang,H.P., Le,S.V and Chu,M.H.(2016),

“Glycine max mRNA for chalcone isomerase RNA (chalcone isomerase(CHI) gene), cultivar DT26”, GenBank: LT594994.1

“Glycine max mRNA for chalcone isomerase RNA (chalcone isomerase (CHI) gene), cultivar DT51”, GenBank: LT594995.1

Trang 4

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Flavonoid là sản phẩm tự nhiên quan trọng có vai trò bảo vệ thực vật và sức khỏe con người Isoflavone thuộc nhóm flavonoid chứa nhiều trong hạt đậu tương, biểu hiện các đặc tính chống oxy hóa, chống ung thư, kháng khuẩn và chống viêm Isoflavone trong hạt đậu tương dễ sử dụng cho người, còn một số hợp chất có thành phần tương tự như isoflavone ở cỏ

ba lá, cỏ linh lăng, cây dong, … lại rất khó sử dụng

Isoflavone được t ng hợp từ một nhánh của con đường phenylpropanoid Quá trình chuyển hóa t ng hợp isoflavone có nhiều enzyme tham gia, trong đó CHI là enzyme chìa khóa xúc tác cho phản ứng

từ phân tử naringenin chalcone mạch hở được đóng vòng để hình thành các naringenin Naringenin được chuyển hóa thành nhiều loại flavonoid chính như: flavanone, flavonol và anthocyanin CHI được phân thành hai loại chính là CHI loại I và CHI loại II Các CHI loại I được tìm thấy trong hầu hết các loại thực vật, nhưng các CHI loại II chỉ có ở cây họ đậu Gen

GmCHI1A ở đậu tương thuộc CHI loại II nằm trên nhiễm sắc thể số 20, mã

hóa enzyme CHI1A Các kết quả nghiên cứu biểu hiện gen CHI đều khẳng

định sự biểu hiện mạnh gen CHI đều làm tăng hàm lượng isoflavonoid t ng

số ở cây chuyển gen nhiều lần so với cây không chuyển gen Như vậy việc tác động đến enzyme CHI có thể làm tăng tích lũy isoflavone và các flavonoids khác Đến nay mới chỉ có nghiên cứu của Lyle Ralston et al (2005) về biểu hiện gen GmCHI ở nấm men và của Vu và cs (2018) phân tích biểu hiện gen GmCHI1A ở cây Talinum paniculatum, mà chưa tìm thấy nghiên cứu nào đề cập đến kết quả phân tích sự biểu hiện của gen

GmCHI1A ở cây đậu tương theo hướng tiếp cận tạo dòng cây chuyển gen

có hàm lượng isoflavone cao

Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) là loại cây trồng có vị trí

quan trọng trong sản xuất nông nghiệp của nhiều quốc gia trên thế giới Hạt đậu tương có giá trị dinh dưỡng cao Ngoài ra, đậu tương còn là loại cây trồng có giá trị kinh tế và là cây cải tạo đất Đáng chú ý là trong hạt đậu

Trang 5

tương chứa isoflavone, đặc biệt là dạng aglucone được hệ tiêu hóa người hấp thu nhanh, nhưng hàm lượng lại rất thấp Đây là lý do thu hút được sự quan tâm nghiên cứu trong việc cải thiện hàm lượng isoflavone trong hạt đậu tương

Xuất phát từ những cơ sở trên chúng tôi đã chọn và tiến hành đề tài:

“Nghiên cứu biểu hiện gen GmCHI1A liên quan đến tổng hợp isoflavone phân lập từ cây đậu tương (Glycine max (L.) Merill)” nhằm làm sáng tỏ

mối liên hệ giữa việc tăng cường biểu hiện gen GmCHI1A với sự tăng hàm

lượng isoflavone trong mầm hạt đậu tương chuyển gen

2 Mục tiêu nghiên cứu

Biểu hiện được gen GmCHI1A trên cây đậu tương chuyển gen và tạo được dòng cây đậu tương chuyển gen GmCHI1A có hàm lượng isoflavone cao

hơn cây đối chứng không chuyển gen

3 Nội dung nghiên cứu

3.1 Nghiên cứu đặc điểm của gen GmCHI1A của cây đậu tương

i) Khảo sát hàm lượng isoflavone của một số giống đậu tương trồng ph biến ở miền Bắc Việt Nam

ii) Nghiên cứu thông tin của gen GmCHI của cây đậu tương, thiết kế cặp mồi PCR và nhân bản đoạn mã hóa của gen GmCHI1A từ giống đậu tương

iii) Tách dòng, giải trình tự nucleotide và phân tích đặc điểm của gen

GmCHI1A phân lập từ cây đậu tương

3.2 Thiết kế vector chuyển gen thực vật mang gen GmCHI1A và đánh giá

hoạt động của vector chuyển gen đã thiết kế

3.3 Phân tích biểu hiện gen GmCHI1A trên cây đậu tương chuyển gen i) Nghiên cứu chuyển cấu trúc mang gen chuyển GmCHI1A vào giống đậu

tương DT2008

ii) Phân tích sự hợp nhất của gen chuyển GmCHI1A vào hệ gen cây đậu

tương bằng PCR và Southern blot

Trang 6

iii) Phân tích sự biểu hiện protein tái t hợp GmCHI1A ở cây đậu tương chuyển gen bằng Western blot và ELISA

iv) Đánh giá sự thay đ i hàm lượng isoflavone ở cây chuyển gen

GmCHI1A so với đối chứng không chuyển gen

4 Những đóng góp mới của luận án

Luận án là công trình nghiên cứu mới ở Việt Nam và trên thế giới đã

chứng minh sự biểu hiện mạnh của gen GmCHI1A làm tăng hàm lượng

isoflavone ở mầm hạt đậu tương chuyển gen Luận án là công trình có hệ thống với nội dung được trình bày từ phân lập gen đến thiết kế vector chuyển gen thực vật, phân tích biểu hiện gen và tạo dòng cây chuyển gen

Cụ thể là:

1) Gen GmCHI1A được phân lập từ cây đậu tương Việt Nam có kích thước

của vùng mã hóa là 657 nucleotide, mã hóa 218 amino acid, thuộc phân họ

II nằm trên nhiễm sắc thể số 20 của đậu tương

2) Lần đầu tiên gen GmCHI1A được phân tích biểu hiện và sự biểu hiện mạnh của gen chuyển GmCHI1A đã làm tăng hàm lượng enzyme CHI ở

cây đậu tương

3) Tạo được 4 dòng đậu tương chuyển gen ở thế hệ T2 có hàm lượng daidzein tăng từ 166,46% đến 187,23% và genistein tăng từ 329,80%-463,93% so với cây không chuyển gen

5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài luận án

Về mặt khoa học, kết quả của luận án đã chứng minh được sự tăng cường biểu hiện gen mã hóa enzyme chìa khóa trong con đường sinh t ng hợp isoflavone của đậu tương đã làm tăng hàm lượng isoflavone trong mầm hạt đậu tương Kết quả nghiên cứu là cơ sở khoa học để cải thiện hàm lượng các hợp chất thứ cấp trong cây trồng bằng kỹ thuật biểu hiện gen Kết quả đăng tải trên các bài báo khoa học và các trình tự gen đăng ký trên GenBank là tài liệu có giá trị tham khảo trong nghiên cứu

và giảng dạy

Trang 7

Về mặt thực tiễn, các dòng đậu tương chuyển gen GmCHI1A làm vật

liệu phục vụ chọn giống đậu tương có hàm lượng isoflavone cao Kết quả nghiên cứu của luận án có thể áp dụng vào các giống cây họ đậu và các loài thực vật khác trong định hướng nâng cao hàm lượng isoflavone trong mầm hạt nhằm nghiên cứu các thực phẩm chức năng phục vụ công tác chăm sóc sức khỏe cộng đồng

6 Cấu trúc của luận án

Luận án có 139 trang (kể cả phụ lục), được chia thành các chương, phần: Mở đầu (5 trang); Chương 1: T ng quan tài liệu (36 trang); Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu (15 trang); Chương 3: Kết quả và thảo luận (43 trang); Kết luận và đề nghị (2 trang); Các công trình công bố liên quan đến luận án (2 trang); Tài liệu tham khảo (16 trang); Phụ lục (6 trang) Luận án

có 14 bảng, 36 hình, 3 phụ lục và tham khảo 126 tài liệu và một số trang web

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Luận án đã tham khảo và t ng kết 126 tài liệu và một số trang web, trong đó có 17 tài liệu tiếng Việt, 109 tài liệu tiếng Anh về ba vấn đề cơ bản, đó là: (1) Cây đậu tương và isoflavone trong hạt đậu tương; (2) Enzyme CHI và gen mã hoá CHI; (3) Chuyển gen ở đậu tương và phân

tích biểu hiện gen CHI

Hạt Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) chứa protein và lipid với

hàm lượng cao, chứa nhiều amino acid không thay thế, các muối khoáng

Ca, Fe, Mg, P, K, Na và các vitamin (B1, B2, C, E, K ) cần thiết cho cơ

thể người và động vật Đáng chú ý là trong hạt đậu tương chứa isoflavone Isoflavone là chất chuyển hóa thứ cấp, có các chức năng sinh học đa dạng Isoflavone và các hợp chất tương tự như isoflavone tìm thấy ở đậu tương

và một số loại thực vật, như cỏ ba lá, cỏ linh lăng, cây dong, …Isoflavone trong hạt đậu tương dễ sử dụng cho người, trong khi isoflavone có nguồn gốc từ các loài thực vật khác rất khó sử dụng Isoflavone trong đậu tương

có tác dụng chống oxy hóa, chống ung thư, ngăn ngừa các bệnh về tim mạch, cải thiện sức khỏe của phụ nữ và có thể tác động tích cực đến quá

Trang 8

trình sinh lý khác Hàm lượng isoflavone trong đậu tương thấp, vì thế hướng nghiên cứu nâng cao hàm lượng isoflavone trong đậu tương, đặc biệt là mầm hạt là vấn đề được quan tâm nghiên cứu

Hàm lượng isoflavone trong hạt tương đối thấp, khoảng từ 50 – 3000 µg/g và tồn tại ở hai dạng chính là β-glucoside (daidzin, genistin, glycitin)

và aglucone (daidzein, genistein, glycitein) Dạng glycoside có trọng lượng phân tử lớn được cho là hấp thụ hạn chế trong hệ tiêu hóa người, trong khi

đó, dạng aglucone được hấp thụ nhanh hơn, nhưng hàm lượng lại rất thấp Isoflavone được t ng hợp từ con đường phenylpropanoid có trong tất

cả các loài thực vật và chalcone isomerase (CHI) là enzym rất quan trọng vì

nó xúc tác cho phản ứng từ phân tử naringenin chalcone và isoliquiritigenin mạch hở được đóng vòng để hình thành các naringenin và liquiritigenin, đây là hai tiền chất của nhiều hợp chất flavonoid và isoflavonoid Enzyme CHI ở đậu tương được phân thành 4 loại dựa trên cơ sở tương đồng và cơ chất đặc hiệu, đó là CHI1, CHI2, CHI3, CHI4 Các CHI loại I được tìm thấy trong hầu hết các loại thực vật, còn các CHI loại II chỉ có ở cây họ đậu CHI gồm khoảng 220 amino acid, gồm 7 chuỗi xoắn α và 7 phiến gấp

β Vị trí hoạt động của enzyme CHI phần lớn là amino acid không phân cực

từ phiến gấp β3a, phiến gấp β3b, chuỗi xoắn α4 và chuỗi xoắn α6 Làm rõ

vị trí then chốt enzyme chalcone isomerase trong con đường phenylpropanoid cũng như cấu trúc và vị trí hoạt động của nó có vai trò quan trọng trong việc cải thiện hàm lượng flavonoid và isoflavonoid trong thực vật Bước đầu xác định được 12 gen CHI trong hệ gen cây đậu tương

và được xếp trong 4 phân họ gen Gen CHI1A ở đậu tương được xếp vào CHI loại II Gen CHI1A ở đậu tương có bốn exon và ba intron, đoạn mã hóa có kích thước 657 bp mã hóa cho 218 axit amin Gen CHI mã hóa

chalcone isomerase là enzyme chìa khóa cho sinh t ng hợp flavonoid bằng việc xúc tác cho phân tử naringenin chalcone mạch hở và isoliquiritigenin mạch hở được đóng vòng để hình thành các naringenin và liquiritigenin – hai tiền chất của nhiều hợp chất flavonoid và isoflavonoid Cách tiếp cận tăng cường biểu hiện gen mã hóa enzyme chìa khóa trong con đường t ng

Trang 9

hợp phenylpropanoid là kỹ thuật được ứng dụng để làm tăng hàm lượng isoflavone ở nhiều loài thực vật khác nhau

Các nghiên cứu chuyển gen nhờ A.tumefaciens ở đậu tương đều sử

dụng lá mầm hạt chín là vật liệu nhận gen Khả năng tiếp nhận gen của đậu

tương bằng cách gây t n thương nách lá mầm và lây nhiễm A.tumefaciens

tái t hợp đã được nghiên cứu và khẳng định hiệu quả cao hơn các phương pháp biến nạp khác Nhiều tác giả đã ứng dụng kỹ thuật này theo hướng cải thiện hàm lượng các chất thứ cấp, nâng cao khả năng chịu hạn, tăng

cường tính kháng sâu, kháng virus, …Các nghiên cứu chuyển gen CHI từ

loài này sang loài khác cho kết quả là cây chuyển gen có sự tích lũy flavonoid tăng và tăng hơn cây không chuyển gen rất nhiều lần Nghiên cứu biểu hiện tăng cường gen CHI của chính loài đó còn ít được đề cập

Gen GmCHI1A của đậu tương đã được phân tích biểu hiện ở nấm

men, cây Sâm đất, tuy nhiên, nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật chuyển gen

với gen GmCHI1A để cải thiện hàm lượng CHI1A tái t hợp trong định

hướng nâng cao hàm lượng isoflavone ở mầm hạt đậu tương còn chưa

được nghiên cứu Hướng nghiên cứu biểu hiện mạnh gen GmCHI1A (overexpression of GmCHI1A gene) ở cây đậu tương nhằm tạo nguyên liệu

phục vụ chọn giống đậu tương có sự tích lũy isoflavone cao, tạo nguyên liệu phục vụ sản xuất các chế phẩm sinh học đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng của công tác chăm sóc và bảo vệ sức khỏe con người ở nước ta

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PH P NGHIÊN CỨU 2.1 VẬT LIỆU, H A CHẤT, THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU

Các giống đậu tương sử dụng trong nghiên cứu: Năm giống đậu tương

ĐT51, ĐT26, DT90, DT84, DT2008 được sử dụng trong các thí nghiệm trong luận án Hai giống ĐT51 và ĐT26 do Trung tâm nghiên cứu và phát triển đậu đỗ, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam cung cấp; ba giống DT90, DT84, DT2008 do Viện Di truyền Nông nghiệp cung cấp

Các vector và chủng vi khuẩn: Các vector sử dụng trong nghiên cứu bao

gồm: vector tách dòng pBT, vector pRTRA7/3 chứa promoter 35S và đuôi

cmyc, vector chuyển gen pCB301 Chủng vi khuẩn E.coli DH5α sử dụng

Trang 10

trong tách dòng và chủng Agrobacterium tumefaciens CV58 sử dụng trong

chuyển gen Các vector và chủng vi khuẩn do Phòng Công nghệ Tế bào thực vật - Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam cung cấp

Các cặp mồi PCR sử dụng trong nghiên cứu gồm

CHI-NcoI-F/CHI-NotI-R ; CHI-NcoI-F/ CHI-SacI-R; nptII-F/nptII-R; pUC18-F/pUC18-R

Bảng 2.1 Trình tự nucleotide của các cặp mồi sử dụng trong PCR và kích

thước sản phẩm DNA dự kiến

nptII-R

GAGGCTATTCGGCTATGACTG

963 ATCGGGAGCGGCGATACCGTA

pUC18-F/

pUC18-R

GTAAAACGACGGCCAGT

838 CAGTATCGACAAAGGAC

Hóa chất: Các loại kít thao tác phân tử từ các hãng Fermentas, Bio-Neer

Các loại enzyme sử dụng của hãng Fermentas: BamHI, NotI, NcoI, HindIII, SacI, T4 ligase Các hoá chất: Bacto pepton, Yeast extract, Agarose,

Sucrose, Glucose, Trypton, X-gal, KCl, Tris HCl, EDTA, NaOH, MgSO4, MgCl2, Glycerol, CaCl2; các loại kháng sinh kanamycin, rifamycine, cefotaxime, carbenicillin của các hãng Fermentas, Invitrogen, Sigma, Amersham và một số hãng khác

Thiết bị: Máy PCR System 9700 (Appied Biosystem, Mỹ), máy điện di

Powerpac300 (Bio-Rad, Mỹ), máy soi DNA (Mini-transllumminatior, Bio-Rad, Mỹ), máy Voltex (Mimishaker, IKA, Đức), máy ly tâm, máy xung điện Plulser, máy xác định hàm lượng nucleic acid NanoDrop, thiết bị giải trình tự nucleotide tự động ABI PRISM 3100 Advant Genetic Analyzer (Applied Biosystem) và các thiết bị hiện đại khác

Trang 11

2.2 PHƯƠNG PH P NGHIÊN CỨU

Luận án đã sử dụng các nhóm phương pháp nghiên cứu, bao gồm: 1) nhóm phương pháp phân tích hàm lượng isoflavone; 2) nhóm phương pháp

phân lập gen; 3) nhóm phương pháp thiết kế vector chuyển gen thực vật; 4)

nhóm phương pháp tạo cây chuyển gen và phân tích cây chuyển gen; và 5) phân tích, xử lý số liệu Sơ đồ các thí nghiệm thực hiện trong luận án được thể hiện ở hình 2.1

Hình 2.1 Sơ đồ t ng quát các thí nghiệm thực hiện trong luận án 2.2.1 Nhóm phương pháp phân tích hàm lượng isoflavone

Hạt đậu tương nảy mầm được 3 ngày tu i, thu mầm làm nguyên liệu

để chiết rút daidzein và genistein Định lượng daidzein và genistein được thực hiện theo phương pháp AOAC Official 2008.03 và Chen và cs (2001)

Trang 12

2.2.2 Nhóm phương pháp phân lập gen

Thiết kế cặp mồi PCR nhân gen GmCHI1A: Từ thông tin về trình tự gen

CHI của đậu tương mang mã số NM_001248290 trên GenBank, cặp mồi CHI-NcoI-F/CHI-NotI-R đã được thiết kế nhân bản đoạn mã hóa của gen

GmCHI1A

Tách chiết RNA tổng số và tổng hợp cDNA: RNA t ng số được tách từ

mầm đậu tương sử dụng kit Trilzol Regents (Invitrogen) tiến hành theo chỉ dẫn của nhà sản xuất Sử dụng bộ kít Maxima® First Strand cDNA Synthesis của hãng Fermantas để t ng hợp cDNA từ RNA t ng số đã tách chiết theo quy trình chỉ dẫn của nhà sản xuất

Nhân bản gen GmCHI1A: Gen GmCHI1A được khuếch đại từ cDNA

bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi CHI-NcoI-F/CHI-NotI-R

Điện di kiểm tra: Sản phẩm PCR được điện di trên gel agrose 1% trong

đệm 1X TAE Gel được nhuộm trong dung dịch ethidium bromide với nồng độ 0,1 g/ml

Tách dòng và xác định trình tự gen GmCHI1A: Kỹ thuật tách dòng gen

được thực hiện theo Sambrook và cs

Phân tích trình tự gen: Sử dụng các phần mềm BLAST trong NCBI,

BioEdit, Lasergene, MEGA trong phân tích dữ liệu về gen GmCHI1A, phân

tích đa dạng dựa trên trình tự nucleotide, trình tự amino acid suy diễn

2.2.3 Nhóm phương pháp thiết kế vector chuyển gen GmCHI1A

Các thí nghiệm thiết kế vector được thực hiện theo sơ đồ hình 2.3

Hình 2.3 Sơ đồ thiết kế vector chuyển gen pCB301_GmCHI1A

Trang 13

2.2.4 Nhóm phương pháp phân tích hoạt động của vector chuyển gen

trên cây thuốc lá

Biến nạp cấu trúc mang gen chuyển GmCHI1A thông qua A tumefaciens vào mảnh lá và tái sinh cây thuốc lá chuyển gen được thực

hiện như mô tả của Topping (1998) Tách chiết DNA t ng số từ lá thuốc lá thực hiện theo Saghai-Maroof và cộng sự (1992) Xác định sự có mặt của

gen chuyển GmCHI1A trong hệ gen của các cây thuốc lá chuyển gen ở thế

hệ T0 được phân tích bằng PCR Phân tích sự biểu hiện của gen chuyển

GmCHI1A ở mức phiên mã bằng kỹ thuật RT-PCR

2.2.5 Nhóm phương pháp biến nạp và phân tích cây đậu tương chuyển gen

Phương pháp chuyển gen ở đậu tương nhờ A.tumefaciens qua nách lá

mầm thực hiện dựa trên nghiên cứu của Olhoft và cs (2006) [128] và Nguyễn Thu Hiền (2014) [3] Cây chuyển gen tái sinh từ chồi trong ống nghiệm chuyển ra trồng trong bầu và sau đó trồng trong nhà lưới gọi là T0; hạt của cây chuyển gen T0 nảy mầm thành cây được gọi là T1; hạt của cây chuyển

gen T1 nảy mầm thành cây được gọi là T2

Xác nhận sự hiện diện và hợp nhất của gen chuyển vào hệ gen cây đậu tương: Xác nhận sự có mặt của gen chuyển GmCHI1A trong các cây

chuyển gen T0 bằng PCR với cặp mồi đặc hiệu CHI-NcoI-F/ CHI-SacI-R

Kiểm tra sự hợp nhất của gen chuyển GmCHI1A vào hệ gen cây chuyển gen bằng kỹ thuật Southern blot

Phân tích sự biểu hiện của protein tái tổ hợp rCHI1A: Protein t ng số

được chiết xuất từ lá đậu tương chuyển gen và các cây không chuyển gen được tách bằng điện di trên gel 10% SDS-PAGE (Laemmli 1970) Xác định sự biểu hiện protein tái t hợp bằng Western blot và định lượng protein CHI tái t hợp bằng ELISA như được mô tả của Sun et al (2006)

2.2.6 Xử lý dữ liệu sinh học

Các dữ liệu hàm lượng isoflavone của các mẫu nghiên cứu được xử

lý bằng phần mềm Microsoft Excel, phần mềm Statistical Package for the Social Science (SPSS) ở mức ý nghĩa α = 0,05 Kiểm định trị số thống kê theo Duncan ở mức ý nghĩa α bằng 0,05

2.3 ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU

Các thí nghiệm được thực hiện từ tháng 8/2015 đến tháng 11/2018

Định dạng
Số trang	27
Dung lượng	1,1 MB