Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ sản xuất bột nấm men giàu kẽm làm nguyên liệu sản xuất thực phẩm bổ sung

Ảnh hưởng của việc bổ sung MgSO4 tới khả năng sinh trưởng và tích lũy kẽm trong sinh khối nấm men .... Ảnh hưởng của việc bổ sung KH2PO4 tới khả năng sinh trưởng và tích lũy kẽm trong si

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ CÔNG THƯƠNG

VIỆN CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM

NGUYỄN THỊ TRANG

NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT BỘT NẤM MEN GIÀU KẼM

LÀM NGUYÊN LIỆU SẢN XUẤT THỰC PHẨM BỔ SUNG

LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số chuyên ngành: 62.42.02.01 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Lê Đức Mạnh

TS Nguyễn Thị Minh Khanh

Hà Nội - 2019

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi và một số kết quả nghiên cứu hợp tác với các cộng sự khác

Các số liệu, kết quả trong Luận án là trung thực, khách quan, một phần đã được tôi công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành trong nước và quốc tế, phần còn lại chưa được ai công bố trên bất cứ công trình nghiên cứu nào

Hà Nội, ngày tháng năm 2019

Nghiên cứu sinh

Nguyễn Thị Trang

LỜI CẢM ƠN

Trong thời gian học tập và nghiên cứu tại Viện Công nghiệp thực phẩm, bằng

sự biết ơn và kính trọng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Lãnh đạo, Hội đồng Khoa học và Đào tạo, Phòng Kế hoạch Khoa học và Hợp tác quốc tế, Trung tâm Hóa sinh công nghiệp và Môi trường - Viện Công nghiệp Thực phẩm đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành luận án tiến sĩ này.

Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Lê Đức Mạnh và TS

Nguyễn Thị Minh Khanh là những người thầy đã tận tình hướng dẫn, định hướng,

động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận án

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS Chu Đình Bính và các cán bộ khoa Hóa Phân tích Trường đại học Bách Khoa Hà Nội đã giúp đỡ tôi trong quá trình phân tích mẫu

Tôi xin cảm ơn các bạn đồng nghiệp trong và ngoài Viện đã tạo điều kiện thuận lợi, động viên, khuyến khích tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu

Cuối cùng, tôi xin gửi tấm lòng ân tình tới gia đình, chồng và các con là nguồn động viên, truyền nhiệt huyết giúp tôi hoàn thành luận án./

Hà Nội, ngày tháng năm 2019

Nghiên cứu sinh

Nguyễn Thị Trang

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Giới thiệu nguyên tố vi lượng kẽm 4

1.1.1 Tầm quan trọng của nguyên tố vi lượng kẽm 4

1.1.2 Nhu cầu kẽm của cơ thể 5

1.1.3 Tình hình thiếu kẽm trên thế giới và Việt Nam 5

1.1.4 Những dạng hợp chất phổ biến của kẽm và sự hấp thu vào cơ thể 7

1.2 Đặc tính ưu việt của nấm men trong sản xuất công nghiệp 9

1.3 Khả năng hấp thụ kim loại và cơ chế tích lũy kẽm trong tế bào nấm men 11

1.3.1 Khả năng hấp thụ kim loại của nấm men 11

1.3.2 Cơ chế tích lũy kẽm trong tế bào nấm men 12

1.3.3 Vị trí tích lũy của kẽm trong tế bào nấm men 16

1.3.4 Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình tích lũy kẽm của nấm men 17

1.3.4.1 Ảnh hưởng của các nguồn muối kẽm 17

1.3.4.2 Ảnh hưởng của các nguồn khoáng 18

1.3.4.3 Ảnh hưởng của các nguồn cacbon 18

1.3.4.4 Ảnh hưởng của nguồn nitơ 20

1.3.4.6 Ảnh hưởng của một số yếu tố khác 21

1.4 Các phương pháp lên men sử dụng trong sản xuất sinh khối nấm men giàu kẽm 23

1.4.1 Phương pháp lên men gián đoạn (batch fermentation) 23

1.4.2 Phương pháp lên men gián đoạn bổ sung cơ chất (fed-batch fermentation) 24

1.5 Các nghiên cứu về nấm men giàu kẽm 26

1.6 Các phương pháp phá tế bào nấm men 27

1.6.1 Phương pháp cơ học 27

1.6.2 Phương pháp phi cơ học 29

1.6.3 Sử dụng kết hợp các phương pháp 32

1.7 Các sản phẩm chức năng giàu kẽm trên thế giới 34

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 37

2.1 Vật liệu và hóa chất 37

2.2 Dụng cụ và thiết bị 38

2.3 Phương pháp nghiên cứu 38

2.3.1 Phương pháp phân tích 38

2.3.2 Phương pháp nghiên cứu 44

2.3.3 Phương pháp xử lí số liệu 53

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 54

3.1 Phân lập, tuyển chọn các chủng nấm men có khả năng tích lũy kẽm cao từ tự nhiên và Sưu tập VSVCN – Viện CNTP 54

3.1.1 Phân lập các chủng nấm men 54

3.1.2 Nghiên cứu sàng lọc chủng nấm men có khả năng tích lũy kẽm cao 57

3.1.3 Xác định đặc tính chủng nấm men tuyển chọn được 65

3.2 Nghiên cứu các điều kiện lên men tạo sinh khối nấm men giàu kẽm 70

3.2.1 Nghiên cứu xác định điều kiện phù hợp cho quá trình nuôi cấy nhân giống chủng nấm men đã lựa chọn 70

3.2.2 Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình lên men tạo sinh khối nấm men giàu kẽm 76

3.2.3 Nghiên cứu nâng cao hiệu quả lên men tạo sinh khối nấm men giàu kẽm bằng phương pháp lên men bổ sung cơ chất (Fed-batch fermentation) 98

3.3 Nghiên cứu công nghệ thu hồi tạo sản phẩm bột nấm men giàu kẽm 105

3.3.1 Nghiên cứu lựa chọn phương pháp phá tế bào nấm men 105

3.3.2 Phương pháp nâng cao chất lượng cảm quan (giảm màu, mùi của dịch thủy phân nấm men) 114

3.3.3 Nghiên cứu lựa chọn các thông số của quá trình sấy phun dịch nấm men 118

3.4 Xây dựng quy trình công nghệ và sản xuất bột nấm men giàu kẽm hữu cơ quy mô thực nghiệm 123

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 130

Tài liệu tham khảo 133

PHỤ LỤC 151

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Thành phần axit amin, khoáng chất và vitamin của nấm men 10

Bảng 1.2 Những protein vận chuyển kẽm tham gia vào quá trình cân bằng nội bào kẽm 14

Bảng 1.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hiệu quả tự phân của nấm men 31

Bảng 1.4 Một số sản phẩm bổ sung kẽm trên thị trường 35

Bảng 3.1 Đặc điểm khuẩn lạc, hình thái tế bào, khả năng lên men rượu và sinh khí CO2 của các chủng nấm men phân lập 55

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của nồng độ Zn(NO3)2 tới hàm lượng kẽm trong sinh khối khô của các chủng nấm men (mg/g) 58

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của nồng độ Zn(NO3)2 tới khối lượng sinh khối khô của các chủng nấm men (g/100 ml) 59

Bảng 3.4 Hàm lượng kẽm hữu cơ tồn tại trong 12 chủng nấm men giàu kẽm 62

Bảng 3.5 Khả năng phát triển trên các điều kiện khác nhau 66

Bảng 3.6 Khả năng đồng hóa nguồn cacbon của 2 chủng nấm men 67

Bảng 3 7 Ảnh hưởng của nồng độ yeast extract tới sự sinh trưởng và phát triển của S cerevisiae A112 72

Bảng 3.8 Ảnh hưởng của pH tới sự sinh trưởng của S cerevisiae A112 73

Bảng 3.9 Ảnh hưởng của các nguồn muối kẽm tới khả năng tích lũy kẽm trong sinh khối nấm men 77

Bảng 3.10 Ảnh hưởng của nguồn cacbon tới hàm lượng kẽm tích lũy và lượng sinh khối khô của chủng nấm men S cerevisiae A112 78

Bảng 3.11 Ảnh hưởng của các nguồn nitơ tới hàm lượng kẽm tích lũy và lượng sinh khối khô của chủng nấm men S cerevisiae A112 80

Bảng 3.12 Ảnh hưởng của việc bổ sung MgSO4 tới khả năng sinh trưởng và tích lũy kẽm trong sinh khối nấm men 83

Bảng 3.13 Ảnh hưởng của việc bổ sung KH2PO4 tới khả năng sinh trưởng và tích lũy kẽm trong sinh khối nấm men S cerevisiae A112 84

Bảng 3.14 Kết quả bổ sung muối Fe2(SO4)3 và hàm lượng kẽm tích lũy trong sinh khối nấm men 85

Bảng 3.15 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới quá trình tích lũy kẽm trên chủng S cerevisiae

A112 88

Bảng 3.16 Ảnh hưởng của pH tới quá trình tích lũy kẽm trên chủng S cerevisiae A112 89

Bảng 3.17 Ảnh hưởng của chế độ lắc tới quá trình tích lũy kẽm trên chủng 91

Bảng 3.18 Hàm lượng kẽm và khối lượng sinh khối sau lên men ở các điều kiện khác nhau 93

Bảng 3.19 Ảnh hưởng của nồng độ oxi tới quá trình tạo sinh khối nấm men giàu kẽm 101

Bảng 3.20 Ảnh hưởng của tỷ lệ bi và sinh khối nấm men 105

Bảng 3.21 Ảnh hưởng của tỷ lệ sinh khối nấm men và dung dịch đệm 106

Bảng 3.22 Ảnh hưởng của thời gian nghiền bi tới khả năng thu hồi kẽm 106

Bảng 3.23 Ảnh hưởng của tỷ lệ sinh khối và dung dịch đệm 107

Bảng 3.24 Ảnh hưởng của thời gian phá mẫu tới khả năng thu hồi kẽm 108

Bảng 3.25 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới hiệu quả tự phân 108

Bảng 3.26 Ảnh hưởng của pH tới hiệu quả tự phân 109

Bảng 3.27 Ảnh hưởng của thời gian tới quá trình tự phân 110

Bảng 3 28 Ảnh hưởng của thời gian tới quá trình thủy phân 112

Bảng 3 29 Kết quả sử dụng các phương pháp thu hồi dịch chiết nấm men 115

Bảng 3 30 Ảnh hưởng của nồng độ than hoạt tính đến quá trình khử màu, mùi dịch chiết nấm men 116

Bảng 3 31 Ảnh hưởng của thời gian đến quá trình khử màu, mùi dịch thủy phân 117

Bảng 3 32 Ảnh hưởng của nồng độ maltodextrin quá trình sấy phun 119

Bảng 3 33 Ảnh hưởng của nồng độ dịch chiết tới hiệu xuất thu hồi và giá trị cảm quan của sản phẩm 120

Bảng 3.34 Ảnh hưởng của nhiệt độ đầu vào tới hiệu quả sấy phun 121

Bảng 3.35 Phân tích chất lượng của bột nấm men giàu kẽm 122

Bảng 3 36 Kết quả sản xuất bột nấm men giàu kẽm quy mô thực nghiệm 126

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Tình trạng thiếu kẽm hiện nay trên thế giới 6

Hình 1.2 Hình ảnh tế bào nấm men S.cerevisiae 9

Hình 1.3 Sơ đồ vận chuyển kẽm trong tế bào nấm men 14

Hình 2.1 Quy trình tách các phân đoạn của kẽm trong mẫu 40

Hình 3.1 Kết quả thống kê về khả năng tích lũy kẽm của các chủng nấm men 61

Hình 3.2 Sắc ký đồ phân tích dạng kẽm trong sinh khối nấm men 4087 62

Hình 3.3 Sắc ký đồ phân tích dạng kẽm trong sinh khối nấm men A112 63

Hình 3.4 Hình thái khuẩn lạc và tế bào của 2 chủng nấm men tích kẽm cao 65

Hình 3 5 Trình tự 26S rDNA của chủng A112 69

Hình 3.6 Vị trí phân loại của chủng A112 và một số loài họ hàng gần 69

Hình 3.7 Ảnh hưởng của glucose tới sự sinh trưởng của S cerevisiae A112 71

Hình 3.8 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới sự sinh trưởng của S.cerevisiae A112 73

Hình 3.9 Ảnh hưởng của tốc độ lắc tới sự sinh trưởng và phát triển của S.cerevisiae A112 74

Hình 3.10 Ảnh hưởng của thời gian nhân giống tới sự sinh trưởng và phát triển của S cerevisiae A112 75

Hình 3.11 Ảnh hưởng của nồng độ glucose tới hàm lượng kẽm tích lũy và khối lượng sinh khối khô của chủng nấm men S cerevisiae A112 79

Hình 3.12 Ảnh hưởng của nồng độ yeast extract tới hàm lượng kẽm tích lũy và lượng sinh khối khô của chủng nấm men S cerevisiae A112 81

Hình 3.13 Ảnh hưởng của tỉ lệ tiếp giống tới sự tích lũy kẽm trong sinh khối nấm men 86

Hình 3.14 Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung muối kẽm tới sự tích lũy kẽm trong sinh khối nấm men 87

Hình 3.15 Ảnh hưởng của thời gian lên men tới quá trình tích lũy kẽm trên chủng S cerevisiae A112 92

Hình 3.16 Kết quả phân tích JMP về hàm lượng kẽm trong sinh khối và các hệ số hồi quy thu được từ thực nghiệm 94

Hình 3.17 Ảnh hưởng của hàm lượng glucose tới lượng sinh khối thu được 95

Hình 3.18 Điều kiện tối ưu và hiệu suất dự kiến bởi phần mềm JMP 96 Hình 3.19 Động học của quá trình tạo sinh khối nấm men giàu kẽm theo phương pháp lên men gián đoạn 97 Hình 3.20 Ảnh hưởng của tốc độ bổ sung cơ chất đến quá trình lên men tạo sinh khối nấm men giàu kẽm 99 Hình 3.21 Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung cơ chất tới quá trình tạo sinh khối nấm men giàu kẽm 100 Hình 3.22 Động học của quá trình lên men tạo sinh khối nấm men giàu kẽm bằng phương pháp lên men bổ sung cơ chất 103

Hình 3.23 Hình ảnh tế bào S cerevisiae trên kính hiển vi điện tử quét 104

Hình 3.24 Ảnh hưởng bổ sung enzyme vào quá trình phá tế bào 112 Hình 3.25 Quy trình công nghệ sản xuất bột nấm men giàu kẽm quy mô thực nghiệm 123 Hình 3.26 Hình ảnh sản phẩm viên nấm men giàu kẽm 126 Hình 3.27 Nồng độ kẽm trong huyết thanh (A) và các mô (B) của chuột thí nghiệm sau khi uống ZnY, ZnSO4 liều 4 mg/kgP 127

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ TỪ VIẾT TẮT

Kí hiệu/

viết tắt

AAS Atomic Absorption Spectrophotometric Quang phổ hấp thụ nguyên tử

ADN Deoxyribonucleic acid Axit đêôxyribônuclêic

AOAC Association of Official Analytical

Chemists

Hiệp hội các nhà hoá phân tích

CFU Colony Forming Units Đơn vị hình thành khuẩn lạc

EDTA Ethylen Diamin Tetraacetic Acid Axít Etylen Diamin Tetra Acetic FOS Fructooligosaccharide Chất xơ hòa tan

HPLC High Performance Liquid

Chromatography

Sắc kí lỏng hiệu năng cao

ICP-MS Inductively-Coupled Plasma - Mass

PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi PCR

SEM Scanning Electron Microscope Kính hiển vi điện tử quét

MỞ ĐẦU Tính cấp thiết của đề tài nghiên cứu

Ngày nay, kinh tế xã hội ngày càng phát triển, đời sống nhân dân ngày càng được cải thiện thì vấn đề chăm sóc sức khỏe cộng đồng và nâng cao tầm vóc người Việt luôn được quan tâm sâu sắc Tuy nhiên, tình trạng thiếu kẽm vẫn đang là vấn đề khá phổ biến trong cộng đồng Theo ước tính có khoảng 30% dân số thế giới bị thiếu kẽm, trẻ em dưới 5 tuổi là đối tượng có nguy cơ cao Ở trẻ em, thiếu kẽm gây gia tăng nhiễm trùng và tiêu chảy làm khoảng 800.000 trẻ em thiệt mạng mỗi năm trên toàn cầu Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng, tỷ lệ thiếu kẽm ở trẻ em Việt Nam khá cao: 25-40% tùy địa phương, nhóm tuổi và khoảng 33% nam giới bị thiếu kẽm Phụ nữ mang thai và cho con bú, người cao tuổi cũng nằm trong đối tượng có nguy cơ cao [81]

Nhiều công trình nghiên cứu đã chứng minh, dinh dưỡng có vai trò rất quan trọng cho sự phát triển chiều cao của trẻ Trong các vi chất dinh dưỡng, kẽm là một

vi khoáng được chứng minh có vai trò quan trọng đặc biệt đối với phát triển chiều cao, cơ bắp và miễn dịch của trẻ những năm đầu đời Bởi lẽ, kẽm có trong thành phần của ít nhất 160 loại enzyme khác nhau, đặc biệt có trong hệ thống enzyme vận chuyển, thủy phân, đồng hóa, xúc tác phản ứng gắn kết các chuỗi trong phân tử ADN, xúc tác phản ứng ôxy hóa cung cấp năng lượng [56] Do đó, các hệ cơ quan như hệ thần kinh trung ương, da và niêm mạc, hệ tiêu hóa, tuần hoàn rất nhạy cảm với sự thiếu hụt kẽm Chính vì vậy, việc bổ sung kẽm vào chế độ dinh dưỡng trong cộng đồng là hết sức cần thiết

Có thể bổ sung kẽm cho cơ thể dưới 2 dạng vô cơ hoặc hữu cơ Tuy nhiên, dạng kẽm hữu cơ được đánh giá có khả năng hấp thu tốt hơn kẽm vô cơ, vì dạng liên kết này làm giảm sự hình thành các hợp chất kẽm không tan trong đường tiêu hóa Kẽm sunphat có vị đắng, gây ra một số phản ứng phụ cho người sử dụng Đối với kẽm gluconat cơ thể hấp thu tốt hơn nhưng khả năng mang tải kẽm thấp và giá thành cao hơn Có rất nhiều phương pháp để tạo ra các hợp chất của kẽm như: tổng hợp hóa học, chiết xuất từ tự nhiên, nhờ vi sinh vật… Tuy nhiên, phương pháp tổng hợp hóa học có hạn chế như: dễ sinh ra các sản phẩm phụ, khó kiểm soát, gây ảnh hưởng tới sức khỏe con người Phương pháp chiết xuất hợp chất kẽm từ tự nhiên an toàn hơn

nhưng chi phí sản xuất cao Vì vậy, hiện nay trên thế giới đang tập trung nghiên cứu

sử dụng nấm men là đối tượng nghiên cứu nhằm chuyển hóa ion kim loại (Zn, Cr, Se…) từ môi trường thành dạng hợp chất hữu cơ và tích lũy trong nấm men Trong

đó, kẽm được liên kết với các phân tử protein, axit amin, polysacarit làm tăng khả năng hấp thu kẽm Các nghiên cứu so sánh khả năng hấp thu và chuyển hóa giữa 2 dạng kẽm vô cơ và kẽm hữu cơ trên động vật đã chỉ ra rằng động vật được bổ sung kẽm ở dạng hữu cơ có nồng độ kẽm huyết thanh và hàm lượng kẽm dự trữ trong xương, thịt, các cơ quan nội tạng cao hơn khi được bổ sung kẽm ở dạng vô cơ [171]

Nấm men từ lâu đã được xem là một trong các đối tượng nghiên cứu chính của ngành Công nghiệp thực phẩm Trong đó, hướng nghiên cứu sử dụng chính sinh khối nấm men là một trong những hướng nghiên cứu tiềm năng Bản thân sinh khối nấm men đã là một nguồn dinh dưỡng phong phú có đầy các yếu tố dinh dưỡng cơ bản, các nguyên tố vi lượng và nguồn vitamin dồi dào Đồng thời, nhờ vào khả năng hấp thu và đồng hóa một số kim loại một như nguyên tố vi lượng kẽm để tạo ra dòng sản phẩm nấm men giàu kẽm, sẽ là nguồn thực phẩm chức năng có giá trị dinh dưỡng cao, đảm bảo vệ an toàn thực phẩm Do đó, sản phẩm bột nấm men giàu kẽm sẽ là một sản phẩm tiềm năng phục vụ nhu cầu lớn từ thị trường, hỗ trợ chống suy dinh dưỡng cho trẻ em, nâng cao thể chất và sức đề kháng cho nhiều đối tượng người già, phụ nữ, nam giới, trẻ thành niên… Việc nghiên cứu khoa học để tạo ra quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm bột nấm men giàu kẽm có thành phần dinh dưỡng đa dạng, cân đối, đảm bảo vệ sinh an toàn làm nguyên liệu cho quá trình sản xuất thực phẩm chức năng là rất cần thiết Những căn cứ và nhu cầu thực tiễn nêu trên là cơ sở để đề

tài: “Nghiên cứu công nghệ sản xuất bột nấm men giàu kẽm làm nguyên liệu sản

xuất thực phẩm bổ sung” được thực hiện

Mục tiêu nghiên cứu

 Xây dựng quy trình công nghệ sản xuất bột nấm men giàu kẽm hữu cơ làm nguyên liệu sản xuất thực phẩm bổ sung

Nội dung nghiên cứu

 Phân lập và tuyển chọn chủng nấm men có khả năng tích lũy kẽm cao từ tự nhiên và Sưu tập giống VSVCN – Viện Công nghiệp thực phẩm

 Nghiên cứu xác định các điều kiện thích hợp cho quá trình nhân giống chủng nấm men đã lựa chọn

 Nghiên cứu tối ưu hóa các điều kiện lên men tạo sinh khối nấm men giàu kẽm

 Nghiên cứu nâng cao hiệu quả lên men bằng phương pháp lên men bổ sung môi trường

 Nghiên cứu công nghệ thu hồi tạo sản phẩm bột nấm men giàu kẽm Phân tích đánh giá chất lượng sản phẩm

 Xây dựng quy trình công nghệ và triển khai sản xuất thử nghiệm bột nấm men giàu kẽm tại Viện CNTP

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

 Luận án đã tiến hành phân lập, khai thác và ứng dụng được nguồn vi sinh vật

S.cerevisiae của Việt Nam để sản xuất bột nấm men giàu kẽm hữu cơ

 Luận án đã xây dựng được quy trình sản xuất bột nấm men giàu kẽm hữu cơ,

có ý nghĩa về khoa học và thực tiễn, để sản xuất thực phẩm bổ sung kẽm từ nấm men với chất lượng, giá thành thấp hơn nhiều so với các sản phẩm ngoại nhập

 Tạo được viên nấm men giàu kẽm hữu cơ đã góp phần làm phong phú thêm

về số lượng, chủng loại các sản phẩm bổ sung vi chất dinh dưỡng cho người tiêu dùng góp phần vào công cuộc chăm sóc và nâng cao sức khỏe cộng đồng

Những đóng góp mới của luận án

 Phân lập mới được chủng nấm men S cerevisiae A112 có khả năng tích lũy

kẽm hữu cơ cao

 Phân tích được tỉ lệ kẽm hữu cơ và một số dạng kẽm tồn tại trong sinh khối nấm men

 Xây dựng được quy trình công nghệ sản xuất bột nấm men giàu kẽm và triển khai sản xuất thử nghiệm tại Viện Công nghiệp thực phẩm Đây là công trình đầu tiên của Việt Nam nghiên cứu một cách có hệ thống về sản xuất bột nấm men giàu kẽm, từ việc nghiên cứu điều kiện sinh trưởng, tối ưu hóa quá trình lên men tạo sinh khối nấm men giàu kẽm, đến việc thu hồi dịch chiết, tạo chế phẩm nấm men giàu kẽm dạng bột

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu nguyên tố vi lượng kẽm

1.1.1 Tầm quan trọng của nguyên tố vi lượng kẽm

Nguyên tố vi lượng kẽm là một trong những yếu tố quan trọng đối với cơ thể con người Kẽm tham gia vào thành phần cấu trúc tế bào, tác động đến hầu hết các quá trình sinh học trong cơ thể Kẽm có trong thành phần của ít nhất 160 loại enzyme khác nhau như: hệ thống enzyme vận chuyển, thủy phân, đồng hóa, xúc tác phản ứng gắn kết các chuỗi trong phân tử ADN, xúc tác phản ứng ôxy hóa cung cấp năng lượng [56] Ngoài ra, kẽm còn hoạt hóa nhiều enzyme như amylase, creatinase Do vậy, kẽm có vai trò sinh học rất quan trọng, tác động chọn lọc lên quá trình tổng hợp, phân giải acid nucleic và protein - những thành phần quan trọng nhất của sự sống [81, 154] Các cơ quan như hệ thần kinh trung ương, da và niêm mạc, hệ tiêu hóa, tuần hoàn rất nhạy cảm với sự thiếu hụt kẽm

Kẽm tham gia điều hòa chức năng của hệ thống nội tiết, có trong thành phần các hormon như hormon tuyến yên, tuyến thượng thận, tuyến sinh dục [34] Các công trình nghiên cứu cho thấy, kẽm có vai trò làm giảm độc tính của các kim loại nặng như: asen (As), cadimi (Cd) Kẽm góp phần làm giảm quá trình lão hóa [35], tăng cường miễn dịch cho cơ thể [136] Kẽm tham gia vào cơ chế đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào, thiếu kẽm làm ảnh hưởng không tốt tới sự phát triển và chức năng của hầu hết các tế bào miễn dịch: tế bào lympho T, B và đại thực bào [98, 138] Kẽm có chức năng bảo vệ tế bào, ức chế con đường chính dẫn tới quá trình apoptosis Kẽm trực tiếp điều hòa apoptosis thông qua việc suy giảm kẽm nội bào Đây là quá trình liên quan mật thiết tới cơ chế gây ung thư [152] Kẽm không chỉ quan trọng trong hoạt động sống với vai trò độc lập mà còn tham gia vào quá trình hấp thu và chuyển hóa các nguyên tố vi lượng khác như đồng (Cu), mangan (Mn), magnesium (Mg) Do vậy, khi cơ thể thiếu kẽm sẽ gây rối loạn chuyển hóa của nhiều yếu tố, ảnh hưởng rất lớn đến tình trạng sức khỏe như mất cân bằng lượng đường trong máu, tỷ

lệ trao đổi chất chậm, quá trình phân chia tế bào và tổng hợp ADN cũng sẽ bị thay đổi Khi thiếu kẽm, trẻ thường biếng ăn, rối loạn giấc ngủ, hay bị mắc các bệnh nhiễm

trùng đường hô hấp và tiêu hoá, chậm phát triển chiều cao, tóc rụng, xơ xác, trên móng tay có các vệt trắng, móng tay giòn dễ gãy…

1.1.2 Nhu cầu kẽm của cơ thể

Ở người trưởng thành, cơ thể chứa khoảng 2g kẽm, được phân bố ở xương và các cơ quan nội tạng, 20% kẽm nằm ở da và tóc [21] Kẽm được dung nạp vào cơ thể con người chủ yếu qua đường tiêu hoá Phần lớn kẽm được hấp thụ ở ruột non, chủ yếu tại tá và hỗng tràng, một ít tại hồi tràng [26] Axit dạ dày giúp tăng cường khả năng hấp thu kẽm trong hệ tiêu hoá Trong điều kiện chuẩn, nồng độ kẽm tối đa đạt được sau 2-3 giờ bổ sung kẽm [146]

Với các vai trò quan trọng như vậy thì con người cần phải bổ sung một lượng kẽm nhất định hàng ngày Đối với trẻ em, kẽm cần thiết cho sự phát triển, đối với người trưởng thành, kẽm đảm bảo cho quá trình duy trì sức khỏe hàng ngày Tuy nhiên, với mỗi đối tượng khác nhau tùy vào độ tuổi và trạng thái sinh lý thì nhu cầu kẽm hàng ngày hoàn toàn khác nhau Nhu cầu kẽm lớn nhất ở phụ nữ mang thai và cho con bú Ở trẻ dưới 1 tuổi cần khoảng 2,8 - 3,4 mg/ngày, trẻ 1 - 15 tuổi cần khoảng 2,5 - 8,5 mg/ngày, thanh thiếu niên và người trưởng thành khoảng 11,2 - 13,5 mg/ngày đối với nam và 10,1 - 12,1 mg/ngày đối với nữ, phụ nữ mang thai và cho con bú cần từ 12,6 - 16,4 mg/ngày [133]

Thiếu vi chất dinh dưỡng có ảnh hưởng không tốt đến sự tăng trưởng và phát triển Chính vì vậy, việc bổ sung thêm các nguyên tố vi lượng như kẽm, canxi, sắt là một giải pháp để hỗ trợ tăng cường phát triển chiều cao ở trẻ em Có rất nhiều phương pháp bổ sung kẽm và các vi chất khác như: đa dạng hóa khẩu phần dinh dưỡng, bổ sung vi chất dinh dưỡng… Quan điểm phòng chống thiếu vi chất dinh dưỡng hiện nay là kết hợp đồng thời giữa các giải pháp Do vậy, khi bổ sung kẽm không nên bổ sung kẽm đơn mà cần kết hợp cùng với các chất dinh dưỡng khác như: Ca, Mg, vitamin A, B, C, D… nhằm phát huy tốt nhất tác động của kẽm, tránh tình trạng thiếu

đa chất kết hợp

1.1.3 Tình hình thiếu kẽm trên thế giới và Việt Nam

Trong những năm gần đây, tình trạng thiếu kẽm ở trẻ em là vấn đề sức khỏe cộng đồng đang được quan tâm ở nhiều nước Đặc biệt là các nước đang phát triển

với khoảng 2 tỉ người bị thiếu kẽm [126] Theo ước tính có khoảng 30% dân số thế giới bị thiếu kẽm, trẻ em dưới 5 tuổi là đối tượng có nguy cơ cao Ở trẻ em, thiếu kẽm gây gia tăng nhiễm trùng và tiêu chảy làm 1,5 triệu trẻ em chết mỗi năm vì tiêu chảy, 800.000 người trong đó có 450.000 trẻ em có nguy cơ tử vong mỗi năm do thiếu kẽm (hình 1.1) [79, 81]

Hình 1.1 Tình trạng thiếu kẽm hiện nay trên thế giới [79, 81]

Tại Việt Nam, theo đánh giá thì tỷ lệ thiếu kẽm ở trẻ em tại cộng đồng dựa vào nồng độ kẽm huyết thanh thấp (< 10,7 μmol/l) dao động trong khoảng 25 – 40 % tùy theo địa phương và nhóm tuổi nghiên cứu Điều tra về tình hình thiếu vi chất năm

2010 trên 586 trẻ từ 6 đến 75 tháng tuổi cho thấy tỷ lệ thiếu kẽm là 51,9 % Nhóm trẻ nhỏ nhất (6 - 17 tháng) có nguy cơ bị thiếu kẽm cao nhất khi so sánh với các nhóm tuổi khác Kết quả điều tra ở học sinh từ 11-17 tuổi tại Hà Nam cho thấy, có khoảng 26,5% trẻ có mức kẽm huyết thanh thấp Đặc biệt, ở trẻ em bị suy dinh dưỡng và tiêu chảy kéo dài vào viện tại Hà Nội và Thành phố Hồ Chí Minh, tỷ lệ thiếu kẽm huyết thanh còn rất cao, vào khoảng 50% - 90% tùy theo mức độ [4]

Việt Nam có dân số hơn 90 triệu người, ước tính trong số đó có khoảng 7,1 triệu trẻ em ở độ tuổi dưới 5 tuổi Tuy nhiên, theo nghiên cứu của Viện Dinh dưỡng Quốc gia năm 2013, chế độ ăn điển hình của trẻ sơ sinh, trẻ nhỏ không cung cấp đủ năng

lượng, chất dinh dưỡng và vi chất dinh dưỡng để trẻ có thể tăng trưởng và phát triển tối ưu [13]

1.1.4 Những dạng hợp chất phổ biến của kẽm và sự hấp thu vào cơ thể

Kẽm thường được bổ sung vào cơ thể dưới 2 dạng hữu cơ và vô cơ Ở dạng hữu

cơ, kẽm được gắn kết với các phân tử hữu cơ như protein, vitamin, axit amin, polisaccharit hay các hợp chất hữu cơ khác… Ở dạng vô cơ, kẽm được gắn kết với các thành phần vô cơ, phổ biến nhất là muối kẽm sulphat, kẽm nitơrat, kẽm oxit…

Đã có rất nhiều nghiên cứu đánh giá, so sánh khả năng hấp thu và chuyển hóa giữa 2 dạng kẽm vô cơ và kẽm hữu cơ trên động vật [36, 85, 162] Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng, động vật được bổ sung kẽm ở dạng hữu cơ có nồng độ kẽm nội tạng cao hơn khi được bổ sung kẽm ở dạng vô cơ Zhang và cộng sự (2014) đã nghiên cứu so sánh dược động học và hoạt tính sinh học của nấm men giàu kẽm, kẽm sulphate (ZnSO4) khi cho chuột hấp thụ với cùng một lượng kẽm là 4mg Zn/kgP Kết quả cho thấy, nồng độ Zn trong huyết thanh chuột khi sử dụng nấm men giàu kẽm đạt nồng độ là 3,87 µg/ml, trong khi đó ZnSO4 là 2,81 µg/ml Đồng thời, khi so sánh hoạt tính sinh học giữa 2 hợp chất này thì nấm men giàu kẽm đạt 138,4% Hoạt tính sinh học của nấm men giàu kẽm cao hơn rất nhiều so với kẽm sulphate [171] Các nghiên cứu khác cũng cho rằng, hợp chất kẽm hữu cơ nói chung được đánh giá là có hoạt tính sinh học cao hơn kẽm vô cơ [19, 28, 117]

Chính vì vậy, các hướng nghiên cứu tạo hợp chất kẽm hữu cơ đang được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu để cho ra thị trường dòng sản phẩm bổ sung nguyên tố vi lượng kẽm dễ hấp thu, có chất lượng cao Một trong các hướng nghiên cứu đó là sử dụng nấm men là đối tượng nghiên cứu nhằm chuyển hóa ion kim loại (Zn, Cr, Se…) từ môi trường thành dạng hợp chất kim loại hữu cơ và tích lũy trong nấm men [84, 108, 130, 142, 145] Không phải tất cả các nguyên tố kim loại được tích lũy trong nấm men đều ở dạng hữu cơ mà chỉ có con đường chuyển hóa sinh học thông qua kích thích hình thành liên kết ion kim loại với các loại protein, polysacarit trong tế bào nấm men mới ở dạng hữu cơ [108] Do đó, việc tiến hành sàng lọc để

chọn ra các chủng nấm men có khả năng tích lũy kẽm hữu cơ với hàm lượng cao là hết sức cần thiết

Trước nhu cầu cấp thiết của việc bổ sung nguyên tố vi lượng kẽm cho cơ thể, hiện trên thị trường đã có rất nhiều dòng sản phẩm chức năng giàu kẽm nhằm phục

vụ thị hiếu người tiêu dùng có bản chất là kẽm vô cơ, hữu cơ Dưới đây là một số dạng kẽm được sử dụng để bổ sung kẽm vào cơ thể:

Chelated zinc: là một dạng kết hợp của kẽm với axit amin hay vitamin Dạng

tồn tại này không đơn thuần là sự kết hợp giữa phân tử ion kim loại với phân tử hữu

cơ mà là khả năng phân tử hữu cơ mang điện tích phù hợp, thu hút tích cực các khoáng chất Nói cách khác, mỗi phân tử hữu cơ có thể mang nhiều phân tử kim loại, điều này giúp cho việc hấp thu các khoáng chất đạt hiệu quả hơn [18] Dạng hợp chất này

có ưu điểm nổi trội như: dễ hòa tan trong nước, không độc hại và bị biến tính trong môi trường axit dạ dày, không ảnh hưởng đến môi trường axit dạ dày và chịu được tác động bởi nhiều loại vi sinh vật khác nhau Các dạng chelated của kẽm có thể kể đến như kẽm picolinate (dạng hợp chất của kẽm với axit amin picolinic), kẽm orotate (dạng kết hợp với axit orotic hay vitamin B3) Kẽm orotate là một trong các dạng trung hòa so với các hợp chất khác của kẽm Điều này cho phép chúng có thể hấp thụ

dễ dàng qua màng tế bào, làm tăng nồng độ kẽm trong tế bào Kẽm orotic có khả năng chống oxi hóa, bảo vệ cơ thể, là một trong các dạng kẽm dễ hấp thu nhất

Kẽm gluconate: là dạng hợp chất kẽm phổ biến trong chế độ ăn uống được tạo

ra bởi quá trình sản xuất công nghiệp, thực chất là quá trình lên men glucose Tuy nhiên, dạng tồn tại này cho khả năng mang tải kẽm và sinh khả dụng trong cơ thể thấp [172]

Kẽm acetate: là một dạng hợp chất hóa học của kẽm có khả năng hấp thu tốt

hơn dạng kẽm gluconate

Kẽm oxide: là dạng hợp chất kẽm vô cơ được sử dụng phổ biến trong thuốc bôi

ngoài da, sử dụng trong trường hợp da bị bỏng nhẹ hay kích ứng Đây cũng là một thành phần phổ biến trong kem chống nắng Tuy nhiên, vẫn còn nhiều ý kiến trái chiều về khả năng hấp thụ của kẽm oxit trong cơ thể

Kẽm sulfat: là dạng hợp chất kẽm vô cơ tan trong nước Các nghiên cứu cho kết

quả khác nhau về khả năng hấp thụ và chuyển hóa hợp chất kẽm này của cơ thể [59,

171, 172]

1.2 Đặc tính ưu việt của nấm men trong sản xuất công nghiệp

Nấm men là nhóm nấm cơ thể đơn bào hoặc tập hợp đơn bào, nhân chuẩn Vào năm 1939, Meyen đã phát hiện ra một số loài nấm men có khả năng lên men rượu,

bia và đặt tên là chủng nấm men Saccharomyces Đây là chủng có bào tử túi, thường

có 1 – 4 bào tử, có khi đến 8 bào tử Tế bào nấm men có dạng hình cầu, dài, elip không có khuẩn ty, không tạo bào tử bắn, không tạo váng, khuẩn lạc có dạng bột nhão, hơi bóng So với các vi sinh vật khác (như vi khuẩn) nấm men có kích thước tương đối lớn Một số nấm men được sử dụng trong công nghệ thực phẩm thường có kích thước khoảng 3 ÷ 5 × 5 ÷ 10µm Kích thước này thay đổi nhiều tuỳ thuộc vào điều kiện môi trường sống Nảy chồi là cách sinh sản vô tính điển hình của nấm men [1] Tế bào nấm men trong tự nhiên có thể đứng riêng lẻ hoặc sau khi nảy chồi vẫn

dính vào nhau tạo thành chuỗi (hình 1.2) S.cerevisiae thuộc nhóm sinh vật ưa ấm

(mesophile), sinh trưởng tốt ở điều kiện nhiệt độ từ 25-35oC Chủng sinh trưởng hiếu khí tùy tiện, trong điều kiện môi trường giàu oxi, nấm men sinh trưởng phát triển tốt,

ưu tiên tạo sinh khối, trong điều kiện thiếu oxi, nấm men chuyển hóa đường thành

rượu Nấm men S cerevisiae có khả năng sinh trưởng tốt trong môi trường axit yếu,

pH từ 4-5,5

Hình 1.2 Hình ảnh tế bào nấm men S.cerevisiae [177]

Phần lớn nấm men được sử dụng trong công nghiệp thuộc giống

Saccharomyces, trong lớp nấm túi và vài giống thuộc lớp nấm bất toàn Trong đó, loài Saccharomyces cerevisiae được dùng nhiều trong công nghiệp thực phẩm Một

số chủng của nấm men này dùng làm men nở bánh mì, một số khác dùng trong công nghiệp rượu, bia, rượu vang, sản xuất glyxerol hoặc enzyme invertase Hiện nay, nhiều nước trên thế giới đã sản xuất thu nhận sinh khối nấm men sử dụng phổ biến trong chăn nuôi hoặc tách chiết tinh sạch protein dùng trong dinh dưỡng cho người làm thức ăn nhân tạo, bổ sung vào các nguồn chế biến thực phẩm [8-10, 160]

* Đặc điểm sinh khối nấm men: Sinh khối của nấm men rất giàu protein, lipid, các vitamin và khoáng chất Theo khảo sát của các nhà nghiên cứu trên thế giới thì tỷ

lệ protein của nấm men khô vào khoảng 44 - 45%, glucid 25 - 35%, lipid chiếm khoảng 1,5 - 5%, các chất chiết xuất vô đạm khoảng 22 - 40%, các chất khoáng khoảng 6 - 12% Điều này chứng tỏ rằng, giá trị dinh dưỡng của nấm men rất lớn Đặc biệt là hàm lượng acid amin, vitamin nhóm B trong nấm men rất cao, dễ tiêu hóa

và hấp thụ Đây là một lợi thế để sử dụng chúng như một nguồn thực phẩm bổ sung dinh dưỡng [6, 10]

Bảng 1.1 Thành phần axit amin, khoáng chất và vitamin của nấm men [7]

Acid amin Thành

phần (%)

Khoáng chất

Thành phần (%) Vitamin

Hàm lượng (mg/kg)

Acid glutamic 6,74 Hydro 3,54 B9 (acid folic) 4,2 Phenylalanin 2,01 P2O5 2,34 B2 (riboflavin) 50

Nấm men tổng hợp được protein, vitamin và các hợp chất quý giá nhanh gấp hàng trăm lần thực vật và hàng nghìn lần động vật Hiệu suất chuyển hóa cao, với hydratcacbon được chuyển hóa tới 50% thành chất khô của tế bào Mặt khác, sản suất sinh khối nấm men có những ưu điểm như: dễ triển khai sản xuất ở quy mô công nghiệp, sử dụng được các nguồn nguyên liệu rẻ tiền với hiệu suất chuyển hóa cao Các nguyên liệu thường là phế phụ phẩm của các ngành khác như rỉ đường, dịch kiềm sulfit… [6, 10]

1.3 Khả năng hấp thụ kim loại và cơ chế tích lũy kẽm trong tế bào nấm men 1.3.1 Khả năng hấp thụ kim loại của nấm men

Theo quan điểm của Agate (2003) đặc tính quan trọng quyết định đến khả năng hấp thu kim loại của vi sinh vật là tính kháng kim loại của các sinh vật đó Do đó, vi sinh vật phải phản ứng, kết hợp với kim loại và duy trì được hoạt động chuyển hóa kim loại này [17] Kết quả việc tuyển chọn, phân lập các chủng vi sinh vật có khả năng kháng kim loại chính là bước quan trọng để tìm ra các chủng có khả năng tích lũy kim loại với hàm lượng cao Hầu hết các chủng vi sinh vật có khả năng sinh trưởng trong điều kiện môi trường có nồng độ kim loại cao đều có khả năng liên kết hiệu quả với kim loại đó Đây là điều kiện tiên quyết để tăng cường khả năng tích lũy sinh học và đẩy mạnh quá trình hấp thụ hiệu quả hơn [112]

Kim loại có thể hấp thụ vào tế bào nấm men thông qua các con đường như: sản xuất các protein gắn với kim loại, hiện tượng metalloprotein, khoáng hóa và dự trữ kim loại ở không bào [58, 60, 163] Đầu tiên, là quá trình hấp phụ còn gọi là “liên kết

bị động”, không phụ thuộc vào quá trình trao đổi chất của vi sinh vật Các cation kim loại sẽ được giữ lại trên bề mặt thành tế bào [157] Sau đó, là quá trình hấp thụ sinh học hay “liên kết chủ động” Quá trình này phụ thuộc vào quá trình trao đổi chất trong

tế bào vi sinh vật, tuy chậm hơn nhưng có khả năng hấp thụ lớn hơn lượng cation Ion kim loại sẽ qua màng tế bào, liên kết với các chất vận chuyển chuyên biệt và được

dự trữ tạm thời ở không bào [33]

S cerevisiae là tác nhân mang và tích lũy kim loại (Pb, Hg, Cr, Mn, Cu Zn,

Cd…) vào tế bào cơ thể với mức độ khác nhau khi sinh trưởng trong môi trường có mặt các kim loại này Các kim loại Cu, Zn, Mn có ảnh hưởng dương tính lên hoạt

động hô hấp và tốc độ phát triển của S cerevisiae Độc tính của kim loại nặng đến vi

sinh vật giảm theo trật tự Hg2+>Cd2+>Cu2+>Ni2+>Zn2+>Pb2+ [169]

Quá trình hấp thụ Cu, Zn, Pb ở tế bào nấm men S cerevisiae được giải thích

như sau: trước tiên, Cu sẽ tham gia vào quá trình tổng hợp metallo-thionein, sau đó

metallo-thionein bao quanh kim loại và bảo vệ S cerevisiae khỏi độc tính của kim loại nặng Sức đề kháng của S cerevisiae với ion Cu2+ liên quan đến sự tạo thành liên kết kim loại - protein (metallo-thionein), sự khoáng hóa và sự tích tụ tạm thời tại không bào [155] Cu và Zn có vai trò tham gia vào cấu trúc của Cu, Zn - peoxit dismutase, enzyme này được mã hóa bởi gen nằm trong nhân SOD1 Đây là enzyme đảm nhiệm vai trò khử độc của tế bào, ảnh hưởng lớn tới hoạt động hô hấp và tốc độ phát triển của nấm men [15, 48, 88, 119] Chì là nguyên tố không cần thiết cho vi sinh vật Chì được tích lũy ở cả tế bào sống và tế bào chết, đều liên quan đến hiện tượng bề mặt mà không có hoặc rất ít liên quan đến hiện tượng hấp thu nội bào (trao đổi chất) trừ khi khuếch tán [169]

1.3.2 Cơ chế tích lũy kẽm trong tế bào nấm men

Kẽm tham gia vào cấu trúc của nhiều yếu tố quan trọng của tế bào nấm men như không bào, ty thể, nhân, màng tế bào Nguyên tố này có trong thành phần của nhiều loại enzyme xúc tác cho các quá trình trao đổi chất, cần thiết để duy trì chức năng của hơn 3% hệ protein trong tế bào nấm men [61] Hàm lượng kẽm trung bình trong các

tế bào nấm men được xác định là 0,12 g.kg- 1 khối lượng sinh khối khô Giá trị này bị biến đổi, phụ thuộc vào sự tăng trưởng của tế bào nấm men Tình trạng thiếu kẽm sẽ làm giảm sự phát triển của nấm men Khi đó tế bào có xu hướng trương lên và hình thành các cụm [120] Tuy nhiên, kẽm dư thừa có thể gây trở ngại cho hoạt động của enzyme aconitase ty thể làm giảm hô hấp, tế bào sinh trưởng phát triển chậm [47] Ở nồng độ dư thừa, không bào hấp thụ và lưu trữ một lượng Zn lớn để duy trì sự trao đổi chất bình thường của tế bào [49] Khi tế bào tích lũy một lượng lớn kẽm sẽ gây

ra sự giải phóng các ion K+, Mg2+, H+, Na+ từ sinh khối Đây có thể là cơ chế sinh hóa để cân bằng ion trong tế bào hoặc biểu hiện của sự tổn thương màng tế bào không

có khả năng phục hồi [71, 118, 122] Là một nguyên tố vi lượng thiết yếu nhưng lại

có độc tính tự nhiên nên việc vận chuyển, hấp thu kẽm đòi hỏi một cơ chế điều hòa

cân bằng nội môi chính xác

Ion kẽm khi tồn tại trong dung dịch là một ion mang điện tích, không thể vận chuyển qua màng tế bào bằng sự khuếch tán thụ động Do đó, kẽm phải được vận

chuyển bởi các protein hay chất vận chuyển Nấm men S.cerevisiae được chứng minh

có một lượng lớn gen có chức năng vận chuyển ion kim loại Nồng độ kẽm được duy trì cân bằng nội môi thông qua hoạt động điều hòa của các protein vận chuyển trên màng các bào quan và màng tế bào Quá trình này được tiến hành trung gian qua cả

2 cấp độ phiên mã và hậu dịch mã để đáp ứng với những thay đổi về nồng độ kẽm trong tế bào Cấp độ phiên mã hoạt động khi mức kẽm nội bào vừa phải từ 0,01 đến 0,07 nmol Zn/triệu tế bào Cấp độ dịch mã hoạt động khi mức độ kẽm nội bào trên 0,07 nmol Zn/triệu tế bào [77, 174] Ở cấp độ phiên mã, có ít nhất 3 hệ thống hấp thụ được biết đến để kiểm soát sự hấp thụ kẽm trong đó bao gồm:

- Hệ thống ái lực cao (Kd = 10 nmol/l) hoạt động khi tế bào có nhu cầu về kẽm hạn chế Hệ thống ái lực này sử dụng protein vận chuyển là Zrt1, nó được kích hoạt tăng hoạt động lên gấp 100 lần trong môi trường thiếu hụt kẽm [176]

- Hệ thống ái lực thấp (Kd = 100 nmol/l) hoạt động khi tế bào cần sử dụng lượng kẽm lớn Hệ thống ái lực này sử dụng protein vận chuyển là Zrt2 [175]

- Hệ thống protein vận chuyển Fet4

Trong các hệ thống vận chuyển kẽm này, hệ thống ái lực cao và hệ thống ái lực thấp hoạt động rất nghiêm ngặt, chỉ tham gia vào quá trình hấp thu kẽm, không tham gia vào quá trình hấp thu các kim loại khác Mỗi protein vận chuyển sẽ hoạt động cho

1 trong 2 hệ thống: Zrt1 chỉ cho hệ thống ái lực cao và Zrt2 chỉ cho hệ thống ái lực thấp [62] Zrt1 và Zrt2 đều nằm trên màng tế bào để điều hòa hấp thụ kẽm Đối với

hệ thống protein vận chuyển Fet4, chúng không chỉ tham gia vào sự hấp thu kẽm mà còn tham gia vào sự hấp thu sắt và đồng [161]

Protein Zrt1, Zrt2 và Fet4 thuộc họ ZIP (ZIP lấy tên từ những chữ cái đầu tiên được viết tắt Zinc Iron-regulated transporter Protein) ZRT1 và ZRT2 là các gen mã hóa cho protein Zrt1 và Zrt2, tương ứng như vậy gen FET4 mã hóa cho protein Fet4 Các protein vận chuyển ion kẽm được tổng hợp trong bảng 1.2

Bảng 1.2 Những protein vận chuyển kẽm tham gia vào quá trình cân bằng

nội bào kẽm [135]

Protein Vị trí Họ Tình trạng kẽm trong tế bào

Zrt1 Màng nguyên sinh chất ZIP Cạn kiệt

Zrt3 Không bào ZIP Trạng thái dư thừa sang cạn kiệt Zrcl Không bào CDF Trạng thái cạn kiệt sang dư thừa

Msc2 Mạng lưới nội chất CDF Trạng thái bình thường

Cơ chế vận chuyển và tích lũy ion kẽm trong nội bào, tế bào nấm men được

mô tả trong hình 1.3 Khi kẽm được vận chuyển vào tế bào, kim loại này tham gia vào hoạt động trao đổi chất trong tế bào chất, chứa trong một số bào quan bao gồm ti thể và lưới nội chất Nếu lượng kẽm vượt quá nhu cầu của tế bào, một số cơ chế khác

sẽ được kích hoạt để lưu trữ kẽm trong không bào cho đến khi nó được sử dụng Không bào nấm men có chức năng tích lũy một số cation hóa trị hai như Zn2+, Ca2+,

Fe2+… và các các cation hoá trị một như: K+, Li+, Cs+… [164]

Hình 1.3 Sơ đồ vận chuyển kẽm trong tế bào nấm men [114] [86,

100, 110, 114]

Sự vận chuyển kẽm vào không bào được kiểm soát bởi 3 protein vận chuyển: Zrc1, Cot1, Zrt3 Trong khi vai trò của Zrc1 và Cot1 ngăn không cho kẽm vào bởi endocystosis, thì Zrt3 có vai trò huy động kẽm tại các “kho” tích trữ kẽm ở không bào khi tế bào trong môi trường thiếu kẽm Zrc1 được xác định là một yếu tố quyết định khả năng kháng kẽm [25-27] Vì vậy, sự biểu hiện quá mức của Zrc1 sẽ làm tăng khả năng chịu đựng của các tế bào với nồng độ kẽm cao Đột biến Zrc1 làm tăng độ nhạy cảm với lipid hydroperoxides và làm giảm nồng độ glutathione khoảng 40% [94] Gen Cot1 đầu tiên được biết đến là yếu tố làm giảm độc tính coban nhưng sau

đó được chứng minh là yếu tố đề kháng kẽm [45] Sự xáo trộn Zrc1 hoặc Cot1 làm tăng độ nhạy với hàm lượng kẽm Chính vì vậy, các gen này có vai trò đặc biệt quan trọng trong việc vận chuyển kẽm vào không bào, nơi kẽm được dự trữ dưới dạng ít độc tính hơn [127]

Theo nghiên cứu của Gaither và cộng sự (2001), kẽm được vận chuyển tạm thời vào không bào thông qua hoạt động của Zrc1 và Cot1 định vị trên màng không bào [72] Ngược lại, kẽm dự trữ được giải phóng ra từ không bào trong điều kiện môi trường thiếu kẽm là do biểu hiện của Zrt3 Đột biến gen Zrt3 gây nên những biểu hiện mạnh về tăng trưởng, sự tích lũy kẽm trong tế bào, không bào [62, 109]

Một protein vận chuyển thứ tư được biết đến là Msc2 có ảnh hưởng đến sự cân bằng kẽm nội bào [100], nó được phân bố ở mạng lưới nội chất, có chức năng điều hoà việc cung cấp kẽm cho chính mạng lưới nội chất này [64] Đột biến gen Msc2 gây nên những thay đổi về nồng độ kẽm, làm tăng nồng độ kẽm dự trữ trong các khoang chứa trong tế bào [100]

Ngoài ra, còn có protein vận chuyển Zip7 có vai trò vận chuyển kẽm từ tế bào chất tới bộ máy Golgi khi tế bào nấm men được nuôi trong môi trường cạn kiệt kẽm [86] Khi các tế bào nấm men đang thiếu kẽm đột ngột được bổ sung một lượng kẽm cao, sẽ xảy ra hiện tượng “sốc kẽm” [110] Khi đó, kẽm nhanh chóng đi qua màng nguyên sinh chất để tích luỹ trong tế bào chất và dự trữ ở không bào Kết quả là các gen mã hoá quy định việc vận chuyển kẽm qua màng nguyên sinh chất được điều chỉnh giảm hoạt động, protein Zrt1 bị bất hoạt Cơ chế này xảy ra nhằm ngăn ngừa

sự hấp thụ kẽm quá mức vào tế bào Đồng thời, các gen mã hoá cho việc vận chuyển kẽm ở không bào được điều chỉnh tăng cường hoạt động

Nấm men S cerevisiae được chứng minh có một lượng lớn gen có chức năng

vận chuyển ion kim loại Một vài protein tương đồng của người và nấm men có liên quan đến vận chuyển sắt và đồng, phổ biến nhất các protein được biết đến theo con đường này là chất vận chuyển ion kim loại được mã hóa bởi hệ gen SMF Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng SMF1 là chất vận chuyển ion kim loại chung, không chỉ vận chuyển

Mn2+, Zn2+, Cu2+ mà còn vận chuyển Cd2+, Ni2+, Co2+ Trong tế bào nấm men còn có thêm 2 gen trong hệ này là: SMF2, SMF3 Các nghiên cứu về sản phẩm của gen này cho thấy chúng có chức năng và đặc tính khác với SMF1

1.3.3 Vị trí tích lũy của kẽm trong tế bào nấm men

Kẽm được hấp thụ vào tế bào nấm men, tích lũy và định vị trên các bào quan trong tế bào như không bào, ti thể, thành tế bào, màng tế bào [132] Khi hàm lượng kẽm vượt quá ngưỡng cho phép, không bào hấp thụ để duy trì hoạt động chuyển hóa bình thường của tế bào, liên kết với kim loại này bằng các yếu tố chelat và tích lũy chúng ở dạng hữu cơ [49] Kẽm cũng liên kết với các ligand trong bào quan của tế bào gồm các polyphotphat các anion hữu cơ như: glutamate, citrate… góp phần làm tăng khả năng tích lũy sinh học dưới nồng độ cao của muối này [93]

Kết quả nghiên cứu của White và cộng sự (1987) cho rằng 56% kẽm được dự trữ dưới dạng hòa tan trong không bào, 39% liên kết với thành tế bào và chỉ khoảng

5% được tìm thấy trong tế bào chất ở S cerevisiae [164] Theo Turto và cộng sự

(2007) trong tổng số kẽm được tích lũy thì có 5% kẽm được tìm thấy ở tế bào chất, 37% được hấp thụ trên thành tế bào, màng tế bào và 5% được phát hiện trên bề mặt

tế bào [153]

Khi được nuôi dưỡng trong môi trường ưu trương, chứa nồng độ kẽm cao hơn nồng độ kẽm trong nội bào, tế bào sinh vật có xu hướng co lại và giảm thể tích của chúng Do chênh lệch về áp suất thẩm thấu, chúng có thể giảm tới 60% so với thể tích ban đầu [111] Khả năng tích lũy sinh học tối đa của kẽm phụ thuộc vào thể tích của

tế bào [52] Mặt khác, trong tế bào S cerevisiae không bào là nơi chuyển hóa và dự

trữ kẽm chính [51] Do đó, nấm men có thể tích tế bào nhỏ hơn, không bào nhỏ thì khả năng tích lũy kẽm sẽ thấp hơn so các tế bào có thể tích lớn Ngoài ra, khả năng tích tụ Zn ở nồng độ cao có thể phụ thuộc vào các yếu tố khác như sự hiện diện của thành phần trong không bào liên kết với Zn như các polyphosphat… [88] Kích thước

của khoang nội bào quyết định hoạt động của permease, một protein vận chuyển màng

ngăn cản sự hấp thu của cơ chất hay ion kim loại Do đó, khi khoang nội bào lớn hơn, các phân tử permease sẽ bị vô hiệu hoá nhiều hơn, khả năng tích lũy kẽm cao hơn [68]

Việc sản xuất nấm men giàu kẽm không chỉ đánh giá dựa trên hàm lượng kẽm trong tế bào mà còn xem xét vào lượng sinh khối Lượng kẽm trong tế bào cao thì lượng sinh khối nấm men thu được thấp và ngược lại Điều này đã được chứng minh trong nghiên cứu của Duszkiewicz – Reinhard và cộng sự (2005) khi nghiên cứu khả năng hấp thu Mg của nấm men [57]

1.3.4 Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình tích lũy kẽm của nấm men

1.3.4.1 Ảnh hưởng của các nguồn muối kẽm

Để sản xuất sinh khối nấm men giàu kẽm, các nghiên cứu trên thế giới đã tiến hành khảo sát đánh giá việc bổ sung các nguồn muối vô cơ khác nhau vào môi trường nuôi cấy như: kẽm nitơrat, kẽm sunphat, kẽm clorua, kẽm acetat và bột kẽm … Kết quả cho thấy, với mỗi nguồn muối kẽm khác nhau thì sự hấp thu kẽm vào trong sinh khối nấm men và sinh khối thu được sau lên men là khác nhau [38, 143] Bổ sung bột kẽm cho khả năng tích lũy kẽm trong sinh khối thấp nên ít được sử dụng trong việc tạo sinh khối nấm men giàu kẽm Có mối tương quan tuyến tính giữa nồng độ muối kẽm bổ sung vào môi trường nuôi cấy và hàm lượng kẽm tích lũy trong sinh khối [25] Tuy nhiên, khi bổ sung muối kẽm ở nồng độ càng cao sẽ gây ức chế càng mạnh tới sự sinh trưởng và phát triển của nấm men, gây giảm khối lượng sinh khối thu

được Kết quả nghiên cứu về khả năng tích lũy kẽm trên chủng nấm men S cerevisiae

của Sillerova và cộng sự (2012) cho thấy, chủng nghiên cứu có thể sinh trưởng phát triển trong môi trường YPD (10g/l yeast extract, 20g/l peptone, 35g/g glucose) ở nồng

độ muối kẽm dưới 2000 mg/l Ở nồng độ 2000 và 3000 mg/l chúng không có khả năng sinh trưởng và phát triển trên cả 3 loại kẽm nitơrat, kẽm sunphat và kẽm clorua

[143] Như vậy, việc sản xuất nấm men giàu kẽm không chỉ đánh giá dựa trên hàm lượng kẽm trong tế bào mà còn xem xét tương quan với lượng sinh khối thu được Chính vì vậy, việc tìm ra nồng độ kẽm phù hợp để thu được lượng lớn sinh khối nấm men tích lũy kẽm với hàm lượng cao là hết sức cần thiết [38, 143]

1.3.4.2 Ảnh hưởng của các nguồn khoáng

Để sinh trưởng và phát triển tốt tế bào cần được cung cấp đủ các nguyên tố khoáng như K, P, Mg, Ca, Zn, Mn… Các nguyên tố khoáng tham gia vào thành phần

tế bào, cấu trúc của các enzyme, hoạt hóa các enzyme xúc tác cho các phản ứng sinh

lí của tế bào [2] Hàm lượng kẽm tích lũy trong sinh khối tăng lên khi bổ sung các nguồn muối kẽm vào môi trường nuôi cấy Đồng thời, sự có mặt của các ion kim loại khác có ảnh hưởng tới sự tích lũy kẽm trong tế bào Sự loại bỏ một ion kim loại có thể chịu tác động bởi sự có mặt của các ion kim loại khác Nghiên cứu của Boch (2008) đã chỉ ra rằng Cd2+ ức chế sự hấp thu Zn trên Schizosaccharomyces trong khi

đó Fe2+ và Mn2+ không ảnh hưởng tới sự hấp thu Zn trên chủng nấm men này [31] Kết quả tương tự cũng được ghi nhận trong các nghiên cứu khác khi nghiên cứu khả

năng hấp thu sinh học trên chủng S cerevisisae, khi bổ sung muối kẽm ở nồng độ từ

0,08 đến 0,8 mmol/L môi trường nuôi cấy thì hàm lượng kẽm tích lũy trong sinh khối đạt được từ 74,8 – 654,8 µmol/g [41]

K2HPO4 được sử dụng trong môi trường nuôi cấy vi sinh vật với vai trò làm tác nhân đệm và là nguồn cung cấp photphate cần thiết cho tế bào tăng trưởng Tuy nhiên,

sự có mặt của ion này lại gây tác động ức chế tới sự hấp thu kẽm trong nghiên cứu của Cha và Cho Điều này thể hiện ở hàm lượng kẽm tích lũy trong sinh khối giảm 3 lần so với đối chứng không bổ sung K2HPO4 Tuy nhiên, việc bổ sung FeSO4 lại giúp tăng hiệu quả hấp thu Zn trong sinh khối gấp 1,4 lần Các muối khác như: CaCl2, MnSO4, NaCl… có tác dụng ức chế tới quá trình hấp thu kẽm [38, 132]

1.3.4.3 Ảnh hưởng của các nguồn cacbon

Vi sinh vật sử dụng một cách chọn lọc các nguồn cacbon Đường nói chung là nguồn cacbon và nguồn năng lượng tốt cho vi sinh vật Tuy nhiên, tuỳ từng loại đường

mà vi sinh vật có khả năng sử dụng khác nhau Chẳng hạn như Saccharomyces lên

men rượu sử dụng glucose, fructose, sacacrose, maltose và galactose Với raffinose

chúng sử dụng được một phần và hoàn toàn không sử dụng được lactose, melibiose, pentose, tinh bột [10] Nguồn cacbon có ảnh hưởng trực tiếp đến sự sinh trưởng của nấm men cũng như khả năng tích lũy kẽm Cha và Cho (2009) khi nghiên cứu ảnh hưởng của 7 nguồn cacbon: glucose, fructose, maltose, sucrose và galactose, lactose

và tinh bột tới quá trình tích lũy kẽm và tốc độ phát triển của tế bào S cerevisiae

FF-10 Kết quả cho thấy, khả năng tích lũy kẽm giảm dần theo thứ tự sau: glucose > sucrose > fructose > galactose > tinh bột Đồng thời, sử dụng đường glucose, sucrose không những hàm lượng kẽm tích lũy đạt cao nhất mà khối lượng sinh khối thu được cũng cao hơn Lượng sinh khối thu được giảm dần theo trật tự như sau: sucrose > glucose > fructose > galactose > tinh bột Nhóm tác giả đã thu được sinh khối nấm men với hàm lượng kẽm đạt cao nhất là 15 mg/g với lượng sinh khối tương ứng đạt

8 g/l trong môi trường có chứa 2% glucose, 5% yeast extract, 400 mg/l ZnCl2 ở 30oC, chế độ lắc 110 vòng/phút [38] Ở các nghiên cứu khác, glucose và sucrose cũng là hai nguồn cacbon được sử dụng phổ biến để tạo sinh khối nấm men giàu kẽm [137, 139,

143, 159]

Glucose là nguồn năng lượng thúc đẩy mạnh quá trình tích lũy kẽm Khi nuôi nấm men trong môi trường YPD với các nồng độ đường khác nhau, kết quả cho thấy nấm men có khả năng phát triển và tích lũy kẽm cao hơn khi được nuôi cấy ở nồng

độ đường cao (5%) hơn là được nuôi cấy ở môi trường có nồng độ đường thấp (0,1%) Điều này có thể giải thích, nồng độ glucose ở mức độ phù hợp có tác dụng cung cấp năng lượng thúc đẩy sự tích tụ của kẽm trong tế bào Tác dụng kích thích quá trình hấp thụ kẽm của glucose là do sự ức chế các chất ức chế chuyển hóa như: antimycin

A [116], potassium cyanide, 2,4-dinitrophenol (DNP), DCCD, diethylstilboestrol (DES) và 2-deoxyglucose [135, 164]

Để nâng cao hiệu quả kinh tế cho quá trình sản xuất nấm men giàu kẽm, tận dụng nguồn bã thải của nông nghiệp, nhóm nghiên cứu của Roepcke và cộng sự (2011) đã tiến hành sử dụng soybean molasses là nguồn cung cấp cacbon cho môi

trường lên men chủng Pichia guilliermondii Thành phần môi trường nuôi cấy có

chứa: soybean molasses 5oBx; (NH4)2SO4 5 g/l; yeast extract 5g/l; KH2PO4 5 g/l; MgSO4 0,5 g/l; Fe2(SO4)3 0,1 g/l; ZnSO4 10 g/l Quá trình nuôi cấy được thực hiện

trên hệ thống lên men 2l Kết quả cho thấy, hàm lượng kẽm trong sinh khối đạt tới 96,03 mg/g sinh khối với lượng sinh khối khô tương ứng đạt khoảng 28 g/l [132] Wang và cộng sự (2011) đã tiến hành so sánh ảnh hưởng của 6 loại môi trường

tới khả năng tích kẽm và hàm lượng sinh khối sau lên men chủng S.cerevisiae LN17

Các loại môi trường bao gồm: YEPD (10g yeast extraxt, 10g peptone, 20g glucose), YEPS (10g yeast extraxt, 10g peptone, 20g sucrose), YEPM (10g yeast extraxt, 10g peptone, 20g maltose), môi trường Wort có dịch đường tổng số 10oBx và rỉ đường có chứa 40g/l dịch rỉ đường (48% sucrose), 0,5g/l (NH4)2SO4 Kết quả cho thấy, không

có sự khác biệt về khả năng tích kẽm trong sinh khối giữa các loại môi trường trên Tuy nhiên, lượng sinh khối thu được khi sử dụng môi trường Wort và YMPD cao hơn 4 môi trường còn lại Xét về hiệu quả kính tế, nhóm tác giả đã lựa chọn môi trường Wort để làm môi trường cơ bản cho quá trình tối ưu Các thông số cho quá trình tối ưu được lựa chọn như sau: môi trường có dịch đường tổng số 10oBx, pH 6

có bổ sung 100mg FeSO4, 120 mg Zn SO4 với chế độ lắc 200 vòng/phút ở 30oC trong 60h Kết quả là sau lên men hàm lượng kẽm trong sinh khối nấm men đạt tới 4,796 mg/g, Fe đạt 7,854 mg/g [159]

1.3.4.4 Ảnh hưởng của nguồn nitơ

Nguồn nitơ rất cần thiết cho quá trình sinh tổng hợp protein, acid nucleic và cho

sự phát triển của tế bào nấm men Nấm men có thể sử dụng cả hai nguồn nitơ vô cơ

và hữu cơ từ môi trường như: các nguồn muối amoni của axit vô cơ cũng như hữu

cơ, đó là amoni sulphat, phosphat rồi đến các muối axetat, lactat, malat và sucxinat Nấm men còn sử dụng được ure và peptone Nguồn nitơ hữu cơ có thể sử dụng bao gồm: cao nấm men, bột đậu, casein, cao ngô Trên thực tế, để thu sinh khối

Saccharomyces được tốt, trong môi trường nên có mặt cả nguồn nitơ vô cơ và hữu cơ

[10]

Nghiên cứu của Cha và Cho (2009) tiến hành đánh giá ảnh hưởng của các nguồn nitơ: cao nấm men, tryptone, peptone, nước chiết malt, cao thịt bò, NH4Cl, (NH4)2SO4

tới khả năng tích lũy kẽm Kết quả nghiên cứu cho thấy, cao nấm men là nguồn cung

cấp nitơ tốt nhất cho S cerevisiae FF10 Đồng thời, bổ sung cao nấm men vào môi

trường nuôi cấy ở nồng độ 5 % thì tốc độ phát triển và khả năng tích lũy kẽm trong

sinh khối đạt giá trị cao nhất Ở nồng độ cao hơn, cao nấm men thể hiện tác động ức chế sự phát triển cũng như hàm lượng tích lũy kẽm trong sinh khối nấm men [38] Nồng độ bổ sung cao nấm men phù hợp được lựa chọn trong nghiên cứu này cao hơn rất nhiều so với các nghiên cứu khác

Roepcke và cộng sự (2011) chỉ bổ sung cao nấm men ở nồng độ 5 g/l vào môi trường có chứa soybean molasses 5oBx; (NH4)2SO4 5 g/l; KH2PO4 5 g/l; MgSO4 0,5 g/l; Fe2(SO4)3 0,1 g/l; ZnSO4 10 g/l khi lên men tạo sinh khối Pichia guilliermondii

giàu kẽm [132] Barbulescu và cộng sự (2010) tối ưu hóa quá trình tạo sinh khối nấm men giàu Cu, Zn và Mn chỉ sử dụng môi trường YMS có chứa cao nấm men ở nồng

độ 0,5% [29]

1.3.4.5 Ảnh hưởng của pH

pH được coi là yếu tố quan trọng trong quá trình hấp thu Giá trị pH ảnh hưởng tới tính chất hóa học của kim loại trong dung dịch, hoạt động của các nhóm chức trong sinh khối và sự cạnh tranh của các ion kim loại [169] Nhìn chung, trong môi trường mang tính axit, các kim loại tồn tại dưới dạng ion tự do nhưng trong môi trường pH kiềm tính, các ion cation kim loại có xu hướng kết tủa như các hydroxit, cacbonat hoặc oxit không hòa tan Hầu hết các hydroxit của các kim loại nặng không tan Giá trị pH thấp tăng khả năng hòa tan của các cation kim loại, trong khi pH cao làm giảm tính tan của các ion này [33, 70]

Mỗi chủng nấm men đều sinh trưởng và phát triển tốt ở một giá trị pH nhất định Trong quá trình lên men thu sinh khối, giá trị pH ảnh hưởng trực tiếp tới tốc độ phát triển, khối lượng và hàm lượng kẽm tích lũy trong sinh khối Đối với các chủng nấm men bia, giá trị pH thích hợp cho lên men bia dao động trong khoảng 4,5 – 5,5; các chủng lên men rượu vang chịu được độ axit cao hơn vào khoảng 2,8 – 3,8 Tuy nhiên, theo các nghiên cứu trong lên men thu sinh khối nấm men giàu kẽm giá trị pH thích hợp để chủng cho khả năng tích lũy kẽm cao vào khoảng 5,8 - 7 [38, 41, 132, 143, 159]

1.3.4.6 Ảnh hưởng của một số yếu tố khác

Nhiệt độ lên men và sinh trưởng của nấm men tương đối thích hợp là 25-35oC, tối thích là 28-32oC đối với lên men rượu nói chung Kết quả nghiên cứu của Wang

và cộng sự (2011) cho thấy, ở 30oC tốc độ sinh trưởng và sự hấp thu kẽm của nấm men đạt tốt nhất Tuy nhiên, trong khoảng nhiệt độ từ 25-30oC, ảnh hưởng của nó tới khả năng tích lũy kẽm trong sinh khối là không rõ rệt [159]

Nấm men có khả năng lên men các loại đường để tạo thành rượu trong điều kiện yếm khí thiếu oxi, còn trong điều kiện hiếu khí có đủ oxi hòa tan trong môi trường thì chúng ưu tiên tạo sinh khối tế bào Trong quá trình lên men trên máy lắc hay các thiết bị lên men có cánh khuấy, khi tăng tốc độ lắc, khuấy làm tăng nồng độ oxi hòa tan trong môi trường Nấm men tiêu thụ oxi thông qua hệ thống enzyme oxidase: cytochrome oxidase, alternative oxidase… các giai đoạn sinh trưởng khác nhau thì nhu cầu cung cấp oxi khác nhau, ở pha logarit cần nhiều hơn pha cân bằng Thông số này cũng ảnh hưởng trực tiếp tới tốc độ phát triển của nấm men và hàm lượng kẽm

trong sinh khối Khi tạo nấm men giàu kẽm, sắt trên chủng S cerevisiae LN-17, kết

quả nghiên cứu của Wang và cộng sự (2011) cho thấy khi tăng tốc độ khuấy từ 100 đến 250 vòng/phút thì hàm lượng kẽm và sắt tích lũy trong sinh khối cũng tăng dần

và đạt giá trị cao nhất tại 200 vòng/phút với hàm lượng sắt là 7,354 ± 0,121 mg/g và kẽm là 4,886 ± 0,097 mg/g [159] Tuy nhiên, Cha và Cho (2009) lại cho rằng điều

kiện phù hợp cho sự tích lũy kẽm trên chủng S cerevisiae FF10 đạt được ở tốc độ lắc

100 vòng/phút, pH tại 7 với nhiệt độ là 30oC [38]

Ngoài ra, sự hấp thu kẽm còn ảnh hưởng bởi lượng sinh khối trong dung dịch,

sự tiếp xúc của tế bào nấm men và ion kim loại, khả năng hấp thu tăng lên khi tăng tần số tiếp xúc giữa sinh khối tế bào vi sinh vật và ion kim loại nặng…

Như vậy, các yếu tố môi trường và điều kiện nuôi cấy, có ảnh hưởng tới quá trình tích lũy kẽm Nguồn cacbon, nitơ có ảnh hưởng tích cực tới quá trình sinh trưởng của nấm men Nồng độ muối kẽm bổ sung vào môi trường nuôi cấy càng cao thì khả năng tích lũy kẽm trong sinh khối càng lớn nhưng lượng sinh khối thu được càng thấp Chính vì vậy, quá trình nghiên cứu tạo sinh khối nấm men giàu kẽm cần xác định mục tiêu cụ thể về hàm lượng kẽm tích lũy trong sinh khối cần bao nhiêu Từ

đó, xác định các điều kiện phù hợp nhất để đạt được mục tiêu sao cho lượng sinh khối thu được càng cao càng tốt

1.4 Các phương pháp lên men sử dụng trong sản xuất sinh khối nấm men giàu kẽm

Có nhiều cách để phân loại các phương pháp lên men, dựa vào cách nạp liệu

và thu hồi bán thành phẩm sau khi lên men, người ta chia ra lên men gián đoạn, liên tục và bán liên tục Dựa vào thành phần đồng nhất hay không đồng nhất của canh trường người ta chia ra lên men bề mặt, lên men chìm, và bán rắn Hiện nay trên thế giới, quá trình lên men tạo sinh khối nấm men giàu kẽm thường sử dụng chủ yếu phương pháp lên men gián đoạn (batch fermentation) và phương pháp lên men gián đoạn bổ sung môi trường (fed batch fermentation)

1.4.1 Phương pháp lên men gián đoạn (batch fermentation)

Phương pháp lên men gián đoạn hay còn gọi là phương pháp lên men theo chu

kì hoạt động như một hệ đóng kín Ở phương pháp này, giống được tạo ra theo từng cấp cho đến khi đủ lượng vi sinh vật cần thiết, sau đó được bổ sung vào dịch lên men Trong suốt quá trình lên men không bổ sung hay rút bớt dịch Do đó, môi trường dinh dưỡng được chuẩn bị ngay từ đầu với đầy đủ thành phần cần thiết cho sự sinh trưởng

và phát triển của vi sinh vật Kết thúc quá trình lên men, toàn bộ dịch lên men được rút ra để bắt đầu một mẻ mới

Cha và Cho (2009) đã tiến hành nghiên cứu tạo sinh khối nấm men giàu kẽm

bằng phương pháp lên men gián đoạn trên chủng S cerevisiae F10 có bổ sung muối

kẽm clorua ở nồng độ 4000 ppm Kết quả cho thấy, hàm lượng kẽm tích lũy trong sinh khối đã tăng 445 lần so với môi trường cơ bản đạt 150892 ppm [38]

Roepcke và cộng sự (2011) tiến hành lên men gián đoạn trên thiết bị lên men

2L để tạo sinh khối nấm men giàu kẽm trên chủng P guilliermondii Wickerham LPB

063, sử dụng các thông số tối ưu cho quá trình lên men đã được lựa chọn Kết quả nồng độ kẽm hữu cơ sau 144h lên men đã đạt được 96mg/g, với lượng sinh khối khô tương ứng là 30 g/l [132]

Phương pháp lên men gián đoạn có ưu điểm là thiết bị không phức tạp, dễ làm, khi nhiễm dễ xử lí Chính vì vậy, nó là phương pháp khá phổ biến trong nhiều nghiên cứu và là phương pháp thông dụng nhất trong sản xuất ở quy mô công nghiệp Bởi

lẽ, nguồn đầu tư cho thiết bị sản xuất liên tục rất tốn kém, không phải xưởng sản xuất nào cũng có thể trang bị

1.4.2 Phương pháp lên men gián đoạn bổ sung cơ chất (fed-batch fermentation)

Đây được xem là hệ thống trung gian giữa quá trình nuôi cấy gián đoạn và nuôi cấy liên tục Thuật ngữ lên men gián đoạn bổ sung được dùng để mô tả cách nuôi cấy

mẻ được cung cấp dinh dưỡng liên tục (hoặc nối tiếp nhau) bằng môi trường mới mà không bỏ dịch nuôi cấy Trong quá trình lên men, một lượng lớn cơ chất trong môi trường có thể gây stress tế bào, ức chế sinh trưởng của vi sinh vật [105] Tuy nhiên, một lượng vừa đủ cơ chất là cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển của chúng Vì vậy, quá trình lên men theo cách bổ sung dần môi trường sẽ cung cấp duy trì một lượng cơ chất vừa đủ trong suốt quá trình lên men để đảm bảo điều kiện sinh trưởng tốt cho vi sinh vật thay vì cung cấp một lượng lớn cơ chất ngay từ thời điểm đầu của quá trình lên men Hơn nữa, một số cơ chất trong môi trường lên men nếu ở nồng độ cao sẽ tạo ra độ nhớt cao, làm giảm lượng oxi hòa tan trong môi trường, các vi sinh vật sẽ chết nhanh hơn so với sự phát triển, điều này là không mong muốn Việc sử dụng phương pháp fed-batch cho phép độ nhớt và mức oxi trong hệ thống được kiểm soát phù hợp cho sinh trưởng lý tưởng [20]

Khi nuôi cấy nấm men thu sinh khối, nấm men cần cơ chất glucose cho sinh trưởng và phát triển Lượng glucose cần thiết cho sinh trưởng tăng sinh khối tốt nhất của nấm men bia nằm trong khoảng từ 80 đến 120g/l [24] Tuy nhiên, nếu hàm lượng glucose quá cao, ethanol sẽ được sinh ra đến mức nào đó sẽ gây ức chế ngược tới quá trình sinh trưởng và phát triển của nấm men Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng, nấm men giảm khả năng sinh trưởng và sống sót khi nồng độ đường trong môi trường nuôi cấy tăng từ 120 lên 180 g/l, nồng độ đường cao hơn 180 g/l gây trở ngại cho sinh trưởng của nấm men [87, 167] Do vậy, việc bổ sung dần môi trường trong lên men sẽ thúc đẩy tăng trưởng của nấm men và giảm thiểu ethanol gây hại cho nấm men là rất cần thiết

Xét về mặt công nghệ phương pháp lên men gián đoạn bổ sung môi trường quy mô hơn phương pháp lên men gián đoạn rất nhiều Phương pháp lên men này đòi hỏi đầu tư về thiết bị để tránh khả năng tạp nhiễm ảnh hưởng đến kết quả lên men

Tuy nhiên, phương pháp này có ưu điểm làm gia tăng khả năng thu sinh khối cũng như các chất chuyển hóa hơn phương pháp lên men gián đoạn [123]

Demirci và cộng sự (1999) đã nghiên cứu sử dụng phương pháp lên men bổ

sung môi trường để tăng cường khả năng tích lũy selen hữu cơ trong sinh khối S cerevisiae trên thiết bị lên men 5L Natri selenate được bổ sung vào môi trường nuôi

cấy với 2 mức liều cao và thấp, bằng 2 phương thức bổ sung là 1 lần duy nhất và bổ sung một cách liên tục Kết quả cho thấy, lên men với natri selenate nồng độ cao (63,2 g/L trong môi trường bổ sung mật mía) 1 lần duy nhất đã thu được 24g/L sinh khối khô với hàm lượng selen trong sinh khối đạt 1382 µg/g Trong khi đó, bổ sung môi trường một cách liên tục đã thu được 40 g/L sinh khối khô với hàm lượng selen đạt

1491 µg/g Khi lên men với có bổ sung natri selenate ở nồng độ thấp (31,6 g/L) cũng cho kết quả tương tự nhưng thu được lượng sinh khối và hàm lượng selen tích lũy trong sinh khối cao hơn khi bổ sung selen ở nồng độ cao Như vậy, khi bổ sung môi trường chứa nguồn dinh dưỡng và selen một cách liên tục cho kết quả về hàm lượng selen trong sinh khối và lượng sinh khối thu được lớn hơn khi bổ sung môi trường 1 lần duy nhất Tiến hành sản xuất thực nghiệm trên thiết bị lên men 100L bằng phương pháp lên men bổ sung môi trường một cách liên tục, với các thông số đã được kiểm chứng trên quy mô nhỏ, nhóm tác giả đã thu được lượng sinh khối nấm men là 45,9 g/L với hàm lượng selen đạt 2384 µg/g [54]

Rajashree và cộng sự (2013) đã lên men tạo sinh khối nấm men giàu selen hữu

cơ bằng phương pháp lên men bổ sung thêm môi trường trên thiết bị lên men 10L Môi trường bổ sung dinh dưỡng có chứa muối natri selenate ở nồng độ 100 ppm, glucose 150g/l được bổ sung một cách liên tục sau 8h tiếp giống Kết thúc lên men

đã thu được 32,09 g/l sinh khối khô có chứa 3758 ± 6,5 ppm selen hữu cơ [128] Arakaki và cộng sự (2011) đã tiến hành nghiên cứu động học của quá trình tích

lũy đồng và tạo sinh khối trên chủng nấm men Candida pelliculosa BARU 05 bằng

2 phương pháp lên men gián đoạn và lên men có bổ sung môi trường Kết quả cho thấy, phương pháp lên men bổ sung môi trường đã làm tăng lượng sinh khối và khả năng tích lũy đồng Cụ thể, với phương pháp lên men gián đoạn khả năng tích lũy đồng đạt 91,98% với lượng sinh khối đạt 38,85 g/l Trong khi đó, với phương pháp

lên men có bổ sung môi trường khả năng tích lũy đồng đạt 100% với lượng sinh khối lên tới 57,54g/l [23]

1.5 Các nghiên cứu về nấm men giàu kẽm

Với công nghệ lên men truyền thống kết hợp với các phương pháp công nghệ hiện đại, để tăng hàm lượng kẽm vào sinh khối nấm men các nhà khoa học hiện nay

đã tiến hành bổ sung các loại muối kẽm vô cơ như là: zinc nitrate, zinc sulphate, zinc chloride…vào môi trường nuôi cấy với tỷ lệ thích hợp và thu hồi sinh khối nấm men

ở những loại muối có khả năng tích lũy kẽm cao nhất [25, 116, 143] Wang và cộng

sự (2011) đã kiểm chứng khả năng tích lũy muối sulphate kẽm vào trong sinh khối

của chủng S cerevieces LN 17, ở điều kiện tối ưu có thể đạt tới 4,976 mg/g sinh khối

tế bào [159] Azad và cộng sự (2014) cũng sử dụng muối sulphate kẽm để tạo sinh khối nấm men giàu kẽm, kết quả cho thấy hàm lượng kẽm được tích lũy trong tế bào nấm men có thể tăng gấp 24 lần trong môi trường nuôi cấy tối ưu giàu kẽm (đạt tới 4132,34 µg/g sinh khối tế bào) so với môi trường nuôi cấy cơ bản (171,9 µg/g sinh khối tế bào) [25] Sillerova và cộng sự (2012) đã nghiên cứu ảnh hưởng của việc bổ sung 3 nguồn muối kẽm vào môi trường nuôi cấy ở các nồng độ khác nhau tới quá trình tích lũy kẽm trong sinh khối Kết quả cho thấy, nồng độ muối kẽm quyết định tới tốc độ sinh trưởng và phát triển của nấm men và lượng kẽm tích lũy trong sinh khối Lượng kẽm tích lũy cao nhất trong sinh khối đạt được khi bổ sung muối kẽm nitơrat ở nồng độ 2000 mg/l trong môi trường YPD, đạt 18,5 mg/g sinh khối khô [143]

Ở Việt Nam, hiện chưa có các nghiên cứu hướng tới xây dựng quy trình công nghệ sản xuất bột nấm men giàu kẽm Tuy nhiên, đã có một vài công trình nghiên cứu về nấm men giàu selen, crom Nguyễn Quang Thường và cộng sự (2002) đã tiến hành đề tài nghiên cứu khoa học cấp bộ Đề tài đã nghiên cứu khả năng tích lũy selen

cao của chủng nấm men S cerevisiae từ môi trường nuôi cấy Sản phẩm của đề tài là

chế phẩm nấm men giàu selen có nhiều ứng dụng trong Y Dược cũng như đối với ngành sản xuất thực phẩm chức năng [12]

Từ Sưu tập VSVCN - Viện Công nghiệp thực phẩm, đã có những đánh giá sơ

bộ về khả năng tích lũy một số kim loại của nấm men Trên cơ sở đó, các đề tài nghiên

cứu với đối tượng chính là nấm men S cerevisiae đã được tiến hành Nguyễn Thị

Hoài Trâm và cộng sự đã tiến hành đề tài “Nghiên cứu công nghệ sản xuất thực phẩm chức năng bổ sung từ vi sinh vật” Kết quả cho thấy, khả năng hấp thụ Crom ở chủng

nấm men S cerevisiae có thể đạt tới 2 mg/g sinh khối khô Vũ Nguyên Thành và cộng

sự (2014) cũng đi sâu khai thác khả năng tích lũy kim loại của nấm men để tạo sinh khối nấm men giàu selen bằng phương pháp lên men bổ sung môi trường Kết quả

nghiên cứu cho thấy, chủng nấm men S cerevisiae CNTP 7912 có khả năng tích lũy

selen hữu cơ đạt tới 800 đến 1200 ppm ở điều kiện nuôi cấy tối ưu là: Nồng độ selen trong môi trường nuôi cấy là 115µg/ml, lượng men giống là 8%, nồng độ cơ chất dịch nuôi cấy là 13%, thời gian nuôi cấy là 17h và bổ sung dịch nuôi cấy 3 lần [11]

1.6 Các phương pháp phá tế bào nấm men

Nấm men có chứa nhiều thành phần dinh dưỡng phong phú protein, vitamin và các nguyên tố khoáng vi lượng… Tuy nhiên, cấu tạo thành tế bào nấm men lại vô cùng vững chắc bởi hai lớp phân tử bao gồm 90% là hợp chất glucan và mannan, phần còn lại là protein, lipit, glucozamin Cấu trúc thành tế bào này gây trở ngại cho hoạt động của các enzyme tiêu hóa và hấp thu nguồn dưỡng chất trong tế bào [66, 96] Vì vậy, việc sử dụng các phương pháp công nghệ nhằm phá vỡ thành tế bào nấm men nhằm giải phóng chất dinh dưỡng và các chất có hoạt tính sinh học là việc làm hết sức cần thiết [102] Tế bào nấm men có thể được phá vỡ dựa trên 2 nhóm phương pháp chính là các phương pháp cơ học và phi cơ học Nhóm phương pháp cơ học bao gồm: phương pháp đồng hóa áp lực cao [44], nghiền bi hoặc siêu âm [40] Nhóm phi

cơ học như dùng sốc điện, vật lí, hóa học, phương pháp sử dụng enzyme [168]… Các nghiên cứu hiện nay đang có xu hướng kết hợp nhiều phương pháp với nhau để đạt được hiệu quả phá tế bào cao, ít ảnh hưởng tới hoạt tính sinh học của sản phẩm đích [140] Ngoài ra, một số phương pháp mới tập trung nghiên cứu sử dụng công nghệ laser [113], bức xạ ion hoá, xử lí bằng các hạt nano SiO2, Al2O3 [42] đang nổi lên nhanh chóng, nhằm phá vỡ tế bào một cách tốt hơn

1.6.1 Phương pháp cơ học

*Phương pháp đồng hóa áp suất cao

Phương pháp đồng hóa áp suất cao là công nghệ phổ biến để phá vỡ tế bào vi sinh vật, được ứng dụng nhiều trong công nghệ chế biến sữa Tế bào bị nén ở áp suất cao, bị phá vỡ bởi sự va chạm và thay đổi áp suất đột ngột Công suất của hệ thống

có thể đạt từ 50 – 5000 lít/giờ Sự phá vỡ tế bào phụ thuộc rất nhiều vào pha tăng trưởng của tế bào và áp lực phá Áp suất cao với sự lặp lại của các chu kì phá có ảnh hưởng tới hiệu quả phá tế bào [66]

Ekpeni và cộng sự (2014) đã sử dụng hệ thống đồng hóa áp lực cao 10S, áp suất lên đến 100 MPa với hai chu kì đồng nhất cho hiệu quả phá tế bào cao [63, 140] Áp suất cần thiết để phá vỡ tế bào vi khuẩn vào khoảng 55 Mpa, tế bào nấm men thường từ 60 – 336 Mpa [140] Hiệu quả phá tế bào có thể lên đến 95,7% ở điều kiện áp suất 336 Mpa Áp xuất cao làm nhiệt độ tăng khoảng 2,2oC cho mỗi 10 MPa và bất hoạt enzyme Do vậy, việc bố trí hệ thống làm lạnh là cần thiết [55] Có thể xác định hiệu quả phá tế bào một cách trực tiếp qua đếm tế bào hoặc gián tiếp qua mức độ protein được giải phóng [144]

GYB40-*Phương pháp nghiền bi

Đây là phương pháp phá tế bào thực hiện trên thiết bị đồng hóa sử dụng hạt nghiền bead mills, dịch sinh khối nấm men được bổ sung các hạt kim loại hay thủy tinh nhỏ có đường kính 0,2-1mm [75] Thông thường hệ thống các đĩa tròn bố trí đối xứng đem lại hiệu quả tốt hơn so với hệ thống bất đối xứng Khi các thông số như kích thước bi, tốc độ dòng và mật độ tế bào được tối ưu hóa, hiệu suất phá tế bào có thể đạt tới 90%

Trong quá trình phá tế bào bằng nghiền bi, có rất nhiều thông số ảnh hưởng tới mức độ phá tế bào như: tốc độ quay, kích thước và số lượng bi Mức độ phá vỡ tế bào tăng khi tăng tốc độ dòng và số lượng hạt Ảnh hưởng bởi nồng độ tế bào trong dung dịch tới hiệu quả phá tế bào cũng được khảo sát bởi một vài nghiên cứu Khi nồng độ tế bào trong dung dịch phá thấp, kích thước hạt nhỏ cho hiệu quả phá cao hơn do làm tăng sự va chạm giữa các hạt Tuy nhiên, khi nồng độ tế bào trong dung dịch lớn thì các hạt nhỏ có xu hướng nổi lên trên dung dịch, làm giảm hiệu quả phá

tế bào [75] Phương pháp nghiền bi cho hiệu quả phá tế bào cao nhưng sẽ sản sinh

nhiệt trong quá trình phá Do vậy, để bảo toàn hoạt tính của các protein, chất có tác dụng sinh học thì đòi hỏi phải có hệ thống làm mát [78]

*Phương pháp sử dụng sóng siêu âm

Siêu âm là phương pháp phá vỡ tế bào cơ học phổ biến dựa trên lực cắt mạnh gây ra bởi sóng siêu âm tần số cao Tế bào khi tiếp xúc với sóng siêu âm >18 kHz sẽ

bị bất hoạt, hình thành các bóng khí, các bong bóng khí lớn dần, vỡ ra tạo nên áp lực mạnh làm phá hủy tế bào [40] Hiệu quả phá tế bào phụ thuộc vào các thông số: công suất phá, chu kỳ phá và chế độ nhiệt [74, 103, 170]

Kết quả nghiên cứu của Liu và cộng sự (2013) cho thấy hiệu suất phá vỡ tế bào

và giải phóng protein tăng lên khi tăng công suất và chu kì phá mẫu [103] Garcia và cộng sự (2013) đã sử dụng sóng siêu âm phá tế bào nấm men rượu với cường độ 90% trong 3 phút cho hiệu quả thu hồi cao polysaccharides và glycoproteins [74] Nhiệt

độ tăng cao sẽ làm giảm sức đề kháng của vi sinh vật trong xử lí mẫu Zhang và cộng

sự (2014) đã sử dụng siêu âm cường độ cao 20 kHz nhằm phá vỡ tế bào của nấm men, nhiệt độ có ảnh hưởng lớn nhất đến tính chọn lọc Khả năng biến tính và tủa protein

ở nhiệt độ cao dẫn đến giảm sự giải phóng protein [170] Sự giải phóng polysacharide thành tế bào và protein trong tế bào không phụ thuộc và thể tích của hỗn dịch tế bào Tuy nhiên, sự giải phóng các chất này tăng lên khi tăng nồng độ tế bào ban đầu [165] Ảnh hưởng của sóng siêu âm đến hoạt tính hay sự ổn định của các hoạt chất phụ thuộc rất nhiều vào các thông số của quá trình phá mẫu bằng siêu âm

1.6.2 Phương pháp phi cơ học

Một số phương pháp phi cơ học sử dụng để phá vỡ tế bào nấm men như dùng xung điện, tác nhân hoá học, tự phân và enzyme

* Phương pháp dùng xung điện

Đây là phương pháp đặc biệt hiệu quả để phá tế bào vi sinh vật Hiệu quả phá

tế bào và thu hồi sản phẩm mong muốn phụ thuộc vào các thông số như: điện thế, thời gian xử lý, năng lượng sử dụng, dạng sóng xung… Sử dụng xung điện có thể phá hủy cấu trúc màng ngoài dễ dàng nhưng không gây phá hủy tới màng trong và các thành phần của tế bào [80] Chính vì vậy, sử dụng phương pháp này để phá tế bào sẽ thu được các hoạt chất sinh học mong muốn một cách chọn lọc, thuận lợi cho quá

trình tinh sạch sản phẩm Ganeva và cộng sự (2015) đã thu được 70% protein nội bào một cách chọn lọc và hiệu quả từ nấm men nhờ sự kết hợp sử dụng xung điện kết hợp với enzyme lytic, mà không làm mất hoạt tính beta-galactosidase [73, 147]

* Phương pháp hóa học

Các chất hóa học có thể được sử dụng để phá vỡ tế bào nấm men như: axit, bazơ (HCl, NaOH) [131], các chất tẩy rửa (Triton X) [91], tác nhân phá tế bào (chaotrope,

urea, guanidine…) sử dụng các dung môi hữu cơ như toluen, benzen

Axit, bazơ thường được sử dụng cho phá tế bào là NaOH và HCl đậm đặc [173] HCl có thể thủy phân các protein trong nấm men, phức hệ glucan và lipid gây

hư hỏng mạng lưới cấu trúc của thành tế bào Sau đó, hỗn hợp sẽ được trung hòa bằng NaOH Sản phẩm được sản xuất bằng phương pháp này thường ở dạng paste hay dạng bột, có nồng độ muối cao và được sử dụng làm chất phụ gia trong thực phẩm để tạo hương vị thịt Phương pháp này có hạn chế là gây ô nhiễm môi trường, dễ hình thành các sản phẩm phụ do tương tác với HCl ở nhiệt độ cao gây ảnh hưởng tới sức khỏe con người

* Phương pháp tự phân

Là quá trình xảy ra khi tế bào nấm men chết, thành tế bào bị phá hủy bởi chính các enzyme trong tế bào Ngày nay, trong hầu hết các nhà máy sản xuất chiết xuất nấm men đều dùng phương pháp tự phân Quá trình tự phân của nấm men gồm 2 giai

đoạn: quá trình proteolyse và sự phá hủy thành tế bào

- Quá trình proteolyse: Tế bào nấm men có chứa một lượng lớn các enzyme thủy phân protein, những enzyme này thường tập trung trong không bào Khi tế bào chết các enzyme này được giải phóng ra khỏi không bào và tiếp xúc với cơ chất của nó Những enzyme thuộc nhóm protease sẽ thủy phân các liên kết peptide và phá vỡ cấu trúc protein tạo thành các peptide và acid amin

- Quá trình phá vỡ cấu trúc thành tế bào: thành tế bào chiếm khoảng 15-20% trọng lượng khô của tế bào Thành tế bào chứa khoảng 80-90% polysacharide chiếm chủ yếu là manan, glucan và một lượng nhỏ chitin Manan liên kết với protein gọi là mannanprotein là thành phần cấu trúc quan trọng của thành tế bào Các enzyme trong quá trình tự phân như glucanase, protease, và nuclease đóng vai trò quan trọng trong